CN111157745A

CN111157745A - 人snrpa蛋白在肺癌复发或转移监测中的用途

Info

Publication number: CN111157745A
Application number: CN202010053544.XA
Authority: CN
Inventors: 陶生策; 李阳; 李鹤成; 李成强
Original assignee: Shanghai Jiaotong University; Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Current assignee: Shanghai Jiaotong University; Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2020-05-15

Abstract

本发明公开了一种人SNRPA蛋白在肺癌复发或转移监测中的用途，所述人SNRPA蛋白可作为生物标志物用于指示肺癌复发或转移。本发明通过免疫方法检测临床样本中抗人SNRPA蛋白的抗体，比较病人治疗前和治疗后该抗体的水平确定是否适用；若适用，则可持续监测该抗体水平，进而发挥复发和转移监测的作用。本发明可适用于约16％的肺癌人群，并可联合其它类似标志物，进一步提高应用的覆盖率。

Description

人SNRPA蛋白在肺癌复发或转移监测中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及可用于肺癌复发或转移监测的生物标志物及其使用方法，尤其涉及一种人SNRPA蛋白在肺癌复发或转移监测中的用途。

背景技术

肺癌在所有恶性肿瘤中发病率和死亡率均居全球第一。根据我国国家癌症中心2018年公布的癌症调查报告，2014年我国肺癌新发病例约为78.2万，死亡病例约为62.6万，在所有恶性肿瘤中亦均处于首位。虽然近年来肺癌的治疗手段取得了很大的进展，但是，全球范围内肺癌的5年生存率仍仅为20％左右。非小细胞肺癌是肺癌的主要类型，占据全部肺癌患者的～80％，对于早中期非小细胞肺癌患者(I-IIIA)，手术是主要的治疗手段，但是，即便是早期病人，手术治疗后的复发率亦可达20-30％，且复发和远端器官转移是导致患者死亡的主要原因。早期、及时的术后复发转移监测，有助于及时进行二次治疗，从而提高整体生存率。但是，目前临床仍缺少有效的手段来实现术后复发转移的早期、及时地检测，因此发现高质量的血清学标志物以及建立行之有效的监测方法意义重大。

肿瘤相关自身抗体水平因与肿瘤进程相关而具有预后或复发监测的潜力。尽管有报道发现p53抗体阳性的病人呈现更高的复发率和死亡率，但是，也有研究呈现相反的结论或是无显著性影响，而肿瘤自身抗体标志物浓度的变化在术后复发监测过程中可能发挥更大的作用。自身抗体依赖于肿瘤的持续刺激而存在，因此，肿瘤被切除后，由于缺乏抗原的持续刺激，相应的自身抗体逐渐减少，维持在低浓度状态，并在复发时再次升高，因此自身抗体具有复发监测的价值。

SNRPA蛋白为U1小核核糖核蛋白A，其在专利文献CN109061174A中被记载可用于诊断系统性硬化症。而目前未有任何报道显示其与肺癌的复发或转移有关。

蛋白质芯片自出现以来已成为探究生物分子-蛋白质相互作用和筛选生物标志物的有力工具，它通过一定方式将大量蛋白质分子按照预设排列顺序点制并固定在固相载体表面形成微阵列，将待分析样品与芯片进行孵育，洗去未能与芯片上蛋白质结合的成分，然后用荧光标记的抗体进行孵育，最后在荧光扫描仪下读取各点的荧光信号值。血清中蛋白质的含量非常不均一，而自身抗体往往丰度都很低，普通质谱难以解决不同样品中自身抗体表达差异巨大的问题，但是蛋白质芯片则以其全局性、无偏性、高通量的特点可克服常规质谱的缺陷。利用蛋白质芯片可以在短时间内确定病人与健康人之间的差异，高效地寻找血清标志物。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种人SNRPA蛋白在肺癌复发或转移监测中的用途。本发明以人SNRPA蛋白作为生物标志物，通过检测肺癌病人治疗前、治疗后体液样本中SNRPA抗体的水平，根据其动态变化以确定是否适用于该病人；若适用，则可在治疗后以一定时间间隔持续监测该病人体液样本中SNRPA抗体的水平，当出现显著升高时，提示已经出现了复发或转移，或具有较大复发或转移的风险。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种人SNRPA蛋白在制备用以监测肺癌治疗后的复发或转移的产品中的应用。

优选地，所述人SNRPA蛋白为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加形成的氨基酸序列组成的蛋白。

本发明提供了一种用以监测肺癌治疗后的复发或转移的生物标志物，所述生物标志物为人SNRPA蛋白。

本发明还提供了一种用以监测肺癌治疗后的复发或转移的检测试剂盒，包括生物标志物人SNRPA蛋白。

本发明通过检测病人体液中的人SNRPA的抗体(包括IgM，IgG和IgA，优选IgM型抗体)，比较肺癌病人治疗前和治疗后的人SNRPA抗体的水平及其变化以确定适用范围；并对于可适用的病人，在治疗后以一定时间间隔持续地监测人SNRPA抗体的水平，显著升高则提示复发或转移的发生或预警。

所述检测的样本包括但不限于全血、血清、血浆、组织液、尿液以及肺泡灌洗液，优选为血清或血浆样本；

所述的治疗前和治疗后，具体样本采集时间为：首次治疗前的样本所采集的时间点为治疗前0-15天；治疗后的样本采集的时间点为首次治疗或治疗结束后1-2个月。

对比于治疗前SNRPA抗体水平，治疗后出现显著降低。

本发明所采用的SNRPA抗体检测方法包括但不限于酶联免疫吸附检测(ELISA)、化学发光、电化学发光、液相芯片以及蛋白质芯片技术。根据不同检测方法，所呈现的具体数值或有较大差异，但不影响其变化趋势。

具体检测方法可以是以SNRPA重组蛋白直接固定于固相载体(或微珠)，然后与待检测样本孵育，再用酶标或荧光标记的二抗检测；

或者是以SNRPA重组蛋白的抗体固定于固相载体(或微珠)，首先与SNRPA蛋白结合，然后与待检测样本孵育，再用酶标或荧光标记的二抗检测。

本发明中所述的肺癌包含肺癌腺、肺鳞癌、大细胞肺癌以及小细胞肺癌等所有肺癌类型；肺癌治疗方法包含手术切除、化疗、放疗、免疫治疗以及上述多种治疗方式的联合治疗。

所述的复发或转移包括病理类型相同的肿瘤再次发生于肺部或发生淋巴转移、骨转移、肝转移等。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明提供的血清标志物可适用于～16％的肺癌病人；

2、本发明可采用血清，可直接嫁接于各种常规免疫方法，操作简便，可执行性强；

3、本发明可联合其它类似标志物，进一步提高覆盖率和适用范围。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明采用蛋白质芯片的方法检测1位病人的血清SNRPA抗体变化情况；

图2为SNRPA抗体在肺癌和健康对照中信号强度的统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1采用蛋白质芯片技术检测血清样本中SNRPA的水平及变化

1、蛋白质芯片的制备

1)人SNRPA重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)购买自美国CDIlaboratories公司，具体为通过酵母菌表达系统重组表达，再通过GST标签亲和纯化而获得；

2)人SNRPA重组蛋白样本、阴性对照(GST蛋白)和阳性对照(Human-IgG，anti-Human-IgG，Human-IgM，anti-Human-IgM)以及位置对照(Cy3，Cy5)按顺序置于384孔板中。基片使用PATH基片；

3)使用Super Marathon微阵列点样仪，设置程序，每张芯片点制14(2x 7)个重复阵列，相邻阵列第一个点的间距设定为9mm；每个阵列中蛋白重复3个点，点间距为300μm；

4)运行仪器，参数采用默认设置；

5)点样完成后，将芯片置于4℃过夜，后密封置于-80℃冻存。

2、实验所需试剂：

1)洗涤液：pH 7.4的PBST溶液，组成如下表1所示。

表1

2)封闭液：3％BSA的pH 7.4PBS溶液，组成如下表2所示。

表2

3)样本稀释液：1％BSA,1x PBST(pH 7.4)。

3、基于蛋白质芯片检测血清SNRPA IgM抗体水平的实施步骤。

1)封闭：在可放置4张芯片的芯片清洗盒中准备30mL封闭液。将步骤1制备的芯片从-80℃取出置于4℃15min后置于室温15min以复温。将芯片正面朝下，先将一侧浸入封闭液，另一侧缓慢向下压(1-2min)，使得芯片上的样本点缓慢接触水面，这样可防止出现拖尾。完全进入后，快速平行晃动芯片，并反转置于封闭液中。室温，侧摆摇床20-30rpm，室温3h。然后倒弃封闭液，分别使用1X PBS,0.2X PBS和ddH2O清洗1次，每次5min；然后离心干燥。安装围栏待用。

2)样本孵育：将待测的血清样本从-80℃取出，置于冰上或4℃融解，待完全融解。4℃离心，12000rpm，20min，取上清进行样本检测(离心后常见表面附有一层白色物质，可能是脂类，尽量先吸除这些物质，再取清澈的淡黄色的血清)。用蛋白质芯片孵育液稀释上清，稀释比例为1：20或1：80，并按200μL体积加入封闭后的芯片中，然后置于湿盒中，侧摆摇床20-30rpm，4℃过夜。备注：加样可用排枪。可将样本分别置于0.5mL EP管，再按顺序摆放至96深孔板(96深孔板空间距、排枪枪头间距、7x 2芯片围栏孔间距相同，均为0.9cm)。

3)清洗：孵育后保持围栏安装在芯片上，用排枪吸出反应液，再逐一清洗各孔3次，每次300μL芯片清洗液。再用清洗液冲洗一次，摘除围栏，置于加入有30mL清洗液的芯片清洗盒中，剧烈晃动10-15次，并更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次；再次更换清洗液20-25mL，置于水平摇床上，100-110rpm，每次10min，清洗3次。

4)荧光标记IgM二抗孵育：提前准备二抗稀释液(1：1000)。二抗稀释液的体积根据芯片数而定。若一张芯片，可用芯片专用孵育盒，按照3mL体积二抗稀释液配置；若3-4张，可放置清洗盒，准备15mL体积二抗稀释液。将二抗稀释液加入芯片，侧摆摇床20-30rpm，避光，室温1h进行孵育。

5)清洗：将步骤4)孵育后的芯片置于加入有30mL清洗液(PBST)的芯片清洗盒中，剧烈晃动10-15次，并更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次；再次更换清洗液20-25mL，置于水平摇床上，100-110rpm，每次10min，清洗3次。清洗时避光。

6)完成步骤5)的清洗后用ddH2O清洗2次，每次5min，并冲洗10s。

7)干燥：将芯片置于芯片甩干仪，离心干燥。

8)扫描：使用晶芯LuxScan 10K-B芯片扫描仪进行扫描，参数设定：选择cy5和cy3两个通道，Power设置为95％，PTM设置为550。扫描完成的图像保存为TIF图。

9)数据提取：将对应GAL文件打开，将芯片图像和GAL文件每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存GPR文件。

4、一位肺癌病人随访血清SNRPA抗体检测结果

通过上述实验方案，初步对1位肺癌病人手术治疗前、治疗后以及随访3个月的血清样本进行了跟踪检测，结果如图1所示。每位病人的左边是蛋白质芯片检测的实际图片，旁边标注了手术治疗后的时间，其中0天为手术治疗当天(手术前)样本；右侧为对应的荧光信号强度。可以看出，治疗后，SNRPA的抗体水平出现了显著且持续的下降趋势。由于随访时间较短，两位病人均未出现复发或转移，SNRPA的抗体信号亦未见升高。

除此之外，为了评估该发明的适用范围，进一步采用50例肺癌患者和46例健康对照的血清样本，进行了SNRPA抗体水平的检测，如图2所示，以健康对照组的信号为基准设置合适的阈值，可以发现，SNRPA抗体水平在肺癌组显著提高，并在～16％的肺癌病人中呈现阳性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims

1.一种人SNRPA蛋白在制备用以监测肺癌治疗后的复发或转移的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人SNRPA蛋白为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

3.一种用以监测肺癌治疗后的复发或转移的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为人SNRPA蛋白。

4.根据权利要求3所述的用以监测肺癌治疗后的复发或转移的生物标志物，其特征在于，所述人SNRPA蛋白为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

5.一种用以监测肺癌治疗后的复发或转移的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的生物标志物人SNRPA蛋白。