CN111154878A - 一组miRNA在制备作为用于早期乳腺癌筛查的标志物中的应用 - Google Patents
一组miRNA在制备作为用于早期乳腺癌筛查的标志物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一组miRNA在制备作为用于早期乳腺癌筛查的标志物中的应用，首次发现在人母乳中存在着完整性和相对丰度与乳腺细胞非常一致游离miRNA。通过比较已有研究确认的乳腺癌异常表达异常miRNA，分析出一组可潜在应用于早期乳腺癌筛查的母乳游离miRNA，其中在早期乳腺癌发生发展过程中预期会上调的有26种，预期下调的12种。并提出了理论可行的应用检测方案。以母乳作样本，本发明通过检测母乳中乳腺癌相关游离miRNA标志物丰度变化，来检测早期乳腺癌罹患风险。
Description
技术领域
本发明涉及miRNA，具体涉及一组可潜在应用于早期乳腺癌筛查的母乳游离miRNA及其应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的癌症。国家癌症中心发布的2018年全国最新乳腺癌报告显示，中国女性乳腺癌发病例数和死亡例数分别占全球发病和死亡的11.2％和9.2％,在世界范围位居前列。女性乳腺癌发病和死亡分别位居我国女性恶性肿瘤发病和死亡的第1位和第5位。
乳腺癌5年生存率相对比较高，大概在80％左右；早期乳腺癌的治愈率可高达90％。因此对于乳腺癌，早发现、早治疗是关键。目前常用的40岁以下的乳腺B超和40岁以上乳腺钼靶X线检查，都是有可疑肿块、囊肿等异常才能发现。而仪器可辨识瘤块发生之前，极早期的乳腺癌潜伏发展过程目前仍没有办法进行检测。
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约16～29个核苷酸，在细胞内对基因的表达起到重要的调节作用。成熟的miRNAs通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻止靶mRNA的翻译。miRNAs的表达变化及其对靶基因的综合调控的作用与乳腺癌发生发展、特殊肿瘤表型的形成及肿瘤的预后有着深远影响。近年来，通过检测特定组织来源的血浆循环miRNA(Circulating MicroRNA)进行早期癌症患病风险筛查被广泛关注。游离miRNA作为血清中的生物标志物，比常用的蛋白肿瘤标志物有着更高的灵敏度与特异性。通过特异游离miRNA早筛，有可能让肿瘤的发生被更早、更有效地辨别出来。但实际真正作为肿瘤标志物并不多，原因在于作为肿瘤标志物，必须具有特异性和可靠性，但很多miRNA虽然在肿瘤高表达，实际上其在癌旁或正常组织也有表达，其特异性低和可靠性差，尤其是肿瘤早期筛查期间，易造成误诊或延误病情，故实际临床上miRNA作为肿瘤标志物的产品很少。
血浆循环miRNA中来源于乳腺组织细胞的份额是很少的，来自癌变早期的变异细胞的miRNA就更少。因此在早期乳腺癌发生过程中，通过监测血浆循环miRNA的水平来筛查变异细胞中发生的miRNA丰度变化的难度很大，且检测灵敏度和可靠性也是极大的挑战。与血浆相比，更为理想的极早期乳腺癌筛查无创样本应该是母乳，因为母乳直接来源于乳腺。若乳汁中也含有类似于血浆里的游离miRNA，那么这些miRNA应该多数是直接来源于乳腺相关的脱落细胞，相比血浆miRNA只有极少部分可能是来自于乳腺，母乳miRNA的优势一目了然。
本发明针对于现有技术存在的对于常规血浆难以检测早期乳腺癌的miRNA的技术难题，提出检测母乳中miRNA，母乳游离miRNA可以作为乳腺癌无创早期筛查的肿瘤标志物。
发明内容
本发明所解决的技术问题：为克服现有技术的不足，本发明提供一种检测方法，其检测早期乳腺癌发生发展过程中上调的有26种miRNA，下调的12种miRNA，可以作为乳腺癌早期筛查的标志物。
解决技术问题采用的技术方案：
一组miRNA在制备作为用于早期乳腺癌筛查的标志物中的应用，miRNA包括如下：
其中在早期乳腺癌发生发展过程中预期会上调的有26种：
hsa-miR-25-5p_R+2,hsa-miR-34a-3p_R+1,hsa-miR-92a-2-5p,hsa-miR-103a-2-5p,hsa-miR-125b-1-3p,hsa-miR-133a-3p_L-1R+1,hsa-miR-155-3p,hsa-miR-191-3p_R-3,hsa-miR-192-3p_R+1,hsa-miR-195-3p_R-2,hsa-miR-199a-5p_R-1,hsa-miR-200c-5p,hsa-miR-202,hsa-miR-215-5p_R+1,hsa-miR-222-p5,hsa-miR-299,hsa-miR-373,hsa-miR-375-5p,hsa-miR-376c,hsa-miR-382-5p,hsa-miR-382-3p_R+1,hsa-miR-409-5p_R-1,hsa-miR-409-3p_L+1,hsa-miR-523-3p_L-1R-2,hsa-miR-526b-5p_R-1,hsa-miR-625-5p_R-1；
其中在早期乳腺癌发生发展过程中预期会下调的有12种：
hsa-let-7a-5p,hsa-let-7b-5p,hsa-miR-30a-5p,hsa-miR-30b-5p,hsa-miR-141-3p_R-1,hsa-miR-148a-3p,hsa-miR-148b-3p_R-1,hsa-miR-200c-3p,hsa-miR-200b-3p,hsa-miR-200a-3p_R+1,hsa-miR-335-5p_R-2,hsa-miR-375-3p。
进一步的，miRNA为
其中在正常乳汁中几乎检测不到，在乳腺癌发生发展过程中预期最强上调的11种miRNA：hsa-miR-125b-1-3p，hsa-miR-155-3p，hsa-miR-191-3p_R-3，hsa-miR-195-3p_R-2，hsa-miR-215-5p_R+1，hsa-miR-222-p5，hsa-miR-382-3p_R+1，hsa-miR-409-5p_R-1，hsa-miR-523-3p_L-1R-2，hsa-miR-526b-5p_R-1，hsa-miR-625-5p_R-1，
在正常乳汁中丰度极高，在乳腺癌发生发展过程中预期最强下调的6种miRNA：hsa-let-7a-5p，hsa-let-7b-5p，hsa-miR-30a-5p，hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-200a-3p_R+1，hsa-miR-375-3p。
即根据QPCR验证结果和NGS结果一致性分析，本发明进一步得到17个可能是有更大潜在应用性的miRNA组。上述17中miRNA，其中11种为正常乳汁中几乎检测不到，乳腺癌发生发展过程中预期最强上调的；6种为正常乳汁中丰度极高，乳腺癌发生发展过程中预期最强下调的。
进一步的，通过二代测序或qRT-PCR检测母乳中权利要求1所述的miRNA。
进一步的，通过如下步骤实现：
(1)样本的确定及采集；
(2)母乳中游离RNA(cfRNA)提取即检测；
(4)用二代测序数据或qRT-PCR分析母乳中权利要求1所述的miRNA；
(5)计算乳腺癌风险因子Breast Cancer Burden，BCB，其中BCB1代表预期上调组miRNA的，BCB2代表预期下调组miRNA的；具体如下：
BCB1＝0.8×(11种预期最强上调miRNA的-ΔCt的均值)+0.2×(其余15种预期上调miRNA的-ΔCt的均值)
BCB2＝0.8×(6种预期最强下调miRNA的-ΔCt的均值)+0.2×(其余6种预期下调miRNA的-ΔCt的均值)；
其中–ΔCt＝–(Ct目的基因–Ct内参基因)；
BCB1≥-2或者BCB2≤-1，满足其中一条可提出乳腺癌风险早期预警；若同时满足，提示乳腺癌风险强预警。
进一步的，步骤(4)中qRT-PCR中采用的特异qRT-PCR正向引物，核苷酸序列如下：
创新点
1、本发明首次提出以母乳作样本，通过检测母乳中相关游离miRNA标志物丰度变化，来检测早期乳腺癌罹患风险。
2、本发明得到了一组可潜在应用于早期乳腺癌筛查的母乳游离miRNA，其中在早期乳腺癌发生发展过程中预期会上调的有26种，预期下调的12种，通过检测上述miRNA丰度，并根据评价标准，预期早期乳腺癌罹患风险。
本发明有益效果
1、本发明首次检测乳汁中26对miRNA(早期乳腺癌发生发展过程中预期会上调)和12对miRNA(早期乳腺癌发生发展过程中预期会下调)作为早期乳腺癌的标志物。
现有技术只是报道了单个miRNA可能与癌症发生发展相关，但并没有作为早期肿瘤标志物应用，并没有将38对放在一起检测的报道。miRNA一般都是证明了其在组织中表达情况，即现有报道的都是基于癌症和癌旁组织检测的数据，并无文献报道相关miRNA在乳汁中表达和正常人乳腺组织miRNA。
miRNA在癌症组织、癌旁组织、正常组织及乳汁的表达有很大不确定性，通常来说一种miRNA在心，肝，脾，肺，肾，癌症组织等分布不均一，有的miRNA在某种组织是高表达，在另外一些组织是不表达或低表达。这种不确定性给基因检测或依据miRNA进行风险评估带来巨大不确定性，故单个miRNA难以作为肿瘤标志物应用于临床。
作为肿瘤标志物的基本要求是准确性和可靠性，上述单个miRNA目前难以满足要求。因为如此，需要大量数据去伪存真。此外作为早期预测肿瘤发生和发展，其实检测相对难度会更大，原因在于，肿瘤早期发生或发展，肿瘤细胞处于快速增殖过程，其增殖过程受到众多细胞因子调控，导致大量的miRNA处于一种低丰度或动态跳跃状态，其容易与其他RNA相互混淆，并且难以检测，这也解释了为什么目前早期诊断试剂盒偏少的原因。
本发明首次检测乳汁中26对miRNA(早期乳腺癌发生发展过程中预期会上调)和12对miRNA(早期乳腺癌发生发展过程中预期会下调)作为早期乳腺癌的标志物，就是为了提高准确性和可靠性，并不是随机选择某种与肿瘤相关miRNA实现本发明目的。
本发明首次证明母乳中游离miRNA与正常乳腺组织细胞miRNA的含量丰度高度一致，并用母乳miRNA样本通过二代测序分析正常乳腺细胞的miRNA本底表达普，结合乳腺癌组织miRNA表达情况筛选出的这38种潜在的早期乳腺癌miRNA标志物。现有研究也有期望用血浆游离miRNA来进行乳腺癌早期筛查的，但现实是血浆miRNA中来源于乳腺组织细胞的份额是很少的，来自癌变早期的变异细胞的miRNA就更少。因此在早期乳腺癌发生过程中，通过监测血浆miRNA的水平来筛查变异细胞中发生的miRNA丰度变化的难度很大，且检测灵敏度和可靠性也是极大的挑战。
与血浆相比，母乳是更为理想的极早期乳腺癌筛查无创样本，因为母乳miRNA直接来源于乳腺，检测结果更可靠。miRNA表达情况异常复杂，在肿瘤早期发生或发展中，早期变异细胞的微量miRNA表达丰度的变化体现在乳汁miRNA中并能被检出，也是存在很大的不确定性。故寻找特异性好，可靠性高的miRNA作为标志物成为本领域技术难题，发明人通过数据分析，首次获得健康人母乳与乳腺癌组织有显著表达差异的38种miRNA，其特异性高，可靠性好。
具体来说：
通过本发明研究发现，母乳中含有丰富的游离核酸，包括游离DNA(cfDNA)和游离RNA(cfRNA)。母乳cfRNA中包含了基本和乳腺细胞一样完整的miRNA群体，而且各种miRNA的相对丰度也是一致的。
目前乳腺癌发病呈现年轻化的趋势，我国女性乳腺癌发病率在20岁后随年龄增长迅速上升，并于45-55岁年龄达到一个高峰。因此25-40岁的女性是乳腺癌早期无症状发展的高风险群体，而25-40岁这一年龄段也是女性生育和泌乳的高峰期。因此若能通过检测母乳中的miRNA分子标志物的早期异化来监测极早期乳腺癌的风险，不仅对所有哺乳期女性来说将是普惠的，而且对于乳腺癌早期预防也有重要的意义。
本发明通过二代测序对母乳中miRNA检测，并进一步与以往报道过的在乳腺癌组织中表达丰度发生变化的miRNA进行比较分析，本发明筛选出38种可潜在用于极早期乳腺癌变异的miRNA。这其中，有26种是在正常乳汁里表达量极低，几乎检测不到，但被报道在乳腺癌组织中表达上升的；12种是在正常母乳里丰度极高，而被报道在乳腺癌组织中表达下调的。从数据的一致性来分析，这些miRNA很可能在早期乳腺癌发生发展过程中表现出明显的上调或下调。那么在后续研究数据的积累及根据大量正常人群丰度水平划出阈值的基础上，本发明可通过二代测序或者荧光定量PCR的手段，来检测母乳miRNA中这38种或者其中的部分(若后续研究发现有少数miRNA与早期乳腺癌发生的强关联性)miRNA的水平与正常人群相比是否存在显著丰度差异，从而判断个体早期乳腺癌发生的风险。当然，这些需要后期大量测序分析数据的研究支持。
然而，就目前的数据分析结果看，母乳游离miRNA是非常理想的乳腺癌无创早期筛查样本。未来通过大样本数据积累及随访跟踪研究，极有可能在这些miRNA中发现与乳腺癌发生发展高度关联的早期监测标志物。
乳腺癌的发展是一个缓慢而渐进的过程，从零星分散的异常细胞开始，需要10-20年的时间才能成为可被现有手段检测到的瘤块。在如此长的潜伏发展过程里目前没有有效的方法进行检测。本研究发现在人母乳中存在稳定丰富的游离miRNA，其完整性和相对丰度都与乳腺细胞miRNA非常一致，而且正常个体间的差异很小。这提示母乳游离miRNA是理想的检测早期乳腺癌相关miRNA表达异常的无创样本。进一步地，通过比较既往报道，本发明分析出了一组可潜在应用于早期乳腺癌筛查的母乳游离miRNA，并提出可能的检测应用场景。在后续的深入研究里，可以根据更大样本数据积累及随访跟踪调查，从中筛选更强关联的检测靶标miRNA，进而开发有效的体外诊断产品，将为更早期的乳腺癌风险筛查提供新的可能。
附图说明
图1.表达谱芯片检测母乳细胞(BM)和白细胞(WBC)的RNA表达；结果显示母乳细胞BM和白细胞WBC的RNA表达一致性完全不同，而不同个体间母乳细胞表达谱很一致。(A)各RNA样本的质量评价，结果显示所有样本检测到的基因完全性很齐平，表明样本质量没有大的差异；(B)Pearson相关系数分析结果显示，不同个体间母乳细胞表达相似性极高，而与白细胞间差异较大；(C)具体对比结果同样显示，不同个体间(Donor1和Donor2)BM和WBC对应表达的RNA一致性很高，但BM与白细胞相比表达RNA差异极大，是完全不同的表达模式；D同样支持C的结论，同种个体中，WBC和BM过表达的RNA区别大，无交集，不同个体间BM和WBC对应表达的RNA一致性很高；图中Donor为健康哺乳期母亲。
图2.室温放置0天、7天的母乳中游离RNA(cfRNA)的毛细管电泳图谱；结果显示，母乳cfRNA主要是小分子条带，而且室温放置7天后小分子cfRNA仍未减少。(A)为室温0天(乳汁采集后6小时内)的母乳中的cfRNA的凝胶样图谱和电泳图谱；(B)为室温7天的母乳中cfRNA的毛细管电泳图谱。
图3.qRT-PCR检测母乳细胞RNA、白细胞RNA，母乳游离RNA(cfRNA)中乳腺、导管上皮特异高表达基因、白细胞特异高表达基因的相对mRNA表达丰度；本发明用经典的(-ΔΔCt)法来评价样本1相对于样本2的目的基因mRNA表达丰度，计算公式为：-ΔΔCt＝(-ΔCt样本1)-(-ΔCt样本2)，其中ΔCt＝Ct目的基因–Ct内参基因。例如本图中，母乳游离RNA(BMcfRNA)相对于白细胞RNA(WBC RNA)，LALBA基因的mRNA丰度-ΔΔCt值为22，那么说明LALBA基因mRNA表达丰度在BMcfRNA中比在WBC RNA中高2的22次方倍。
结果显示，母乳细胞RNA和母乳cfRNA表达极为相似，而与白细胞RNA的表达相差甚远。(A)乳腺及导管高表达基因的qRT-PCR检测结果，明显可见母乳cfRNA比白细胞表达高出成百倍，而母乳cfRNA和细胞RNA差异很小；(B)白细胞特异高表达基因的qRT-PCR检测结果，明显可见白细胞比母乳cfRNA的丰度高出成百倍，而母乳cfRNA和细胞RNA差异很小；图示为-ΔΔCt的均值±标准误，n＝3。
图4.miRNA二代测序结果示意图；结果显示母乳细胞RNA(cellular RNA)与母乳游离RNA(cfRNA)中miRNA的种类一致性几乎完全一致，而且不同个体间的检测一致性也极高。A为BM3母乳细胞RNA和BM4母乳游离RNA(cfRNA)比较；B为BM3母乳游离RNA(cfRNA)和BM3母乳细胞RNA比较；C为BM3母乳游离RNA(cfRNA)和BM4母乳细胞RNA比较；
其中绿色椭圆代表3号母乳细胞RNA样本测序reads数大于50的miRNA，共计有329种，粉红色代表4号母乳细胞RNA样本可以检测到这329种miRNA的328种，黄色代表3号母乳游离cfRNA样本可以检测到这329种miRNA的320种，蓝色代表4号母乳cfRNA样本可以检测到这329种miRNA的319种。细节分析发现，其他样本未检测到的几个miRNA丰度也很低，在3号样本母乳细胞样测得的Reads数都是小于100的。
图5.用miRNA特异的qRT-PCR法检测筛选出的38种miRNA在正常母乳游离RNA(cfRNA)中的表达丰度；图示为每种miRNA的-ΔCt(即CtU6内参-CtmiRNA)均值±标准误，n＝3。结果显示，本发明设计的特异引物qRT-PCR检测结果跟二代测序结果整体趋势是一致的。
具体实施方式
实施例1
1、样本的确定及采集
前期研究样本来源于10位哺乳期的母亲，无罹患癌症及其他重大疾病既往史，实验用途及样本采集均已取得捐赠者的知情同意。母乳的采集为捐赠者用吸乳设备自行吸出并于2小时内转交至发明人。
2、母乳中总游离RNA(cfRNA)提取及检测
分别将母乳样本于1500g离心10分钟，离心后吸弃乳脂，将上清液转移至新的离心管中，管底部的细胞沉淀直接用提取总RNA，提取方法采用SUMZolRNA提取试剂(SummerBio)。将分离出的上清液再于10000g离心10分钟，再去除最上层乳脂，然后采用cfRNA纯化试剂盒(SummerBio)对母乳cfRNA进行分离，按照制造商说明书中的分离过程进行。新鲜母乳及加防腐剂后室温放置7天的母乳做都做cfRNA提取后进行毛细管电泳检测。结果显示母乳cfRNA主要是小分子条带，而且室温放置7天后小分子cfRNA仍未减少(图2)。
之前的报道用传统流式细胞表面抗原检测的结果显示，母乳中的细胞有一部分是来源于白细胞的，但是具体的占多大比例没有确切的研究。理论上母乳中白细胞来源的比例越少，用母乳作为核酸检测的样本来源评估乳腺癌风险就越可靠。因此本发明首先用基因表达普芯片分析，以及qRT-PCR检测乳腺特异及白细胞特异表达基因的mRNA相对丰度来确认母乳细胞RNA(BM cellular RNA)、母乳游离RNA(BMcfRNA)与白细胞RNA(WBC RNA)是否有很大的一致性。
本发明用qRT-PCR检测母乳细胞RNA、母乳游离RNA(cfRNA)以及白细胞RNA中乳腺及导管上皮特异高表达基因及白细胞特异高表达基因的相对mRNA表达丰度。结果显示，母乳细胞RNA和母乳游离RNA(cfRNA)表达极为相似，而与白细胞RNA的表达相差甚远(图3)。本发明的表达谱芯片检测实验结果也已经验证，母乳细胞RNA表达谱与白细胞表达谱完全不同，母乳细胞-中高丰度mRNA主要是乳腺及导管上皮特异高表达基因(图1，表1)。这说明母乳细胞RNA和母乳游离RNA(cfRNA)主要来源于乳腺及导管上皮的脱落细胞，可以代表正常乳腺组织表达谱。
表1.表达谱芯片结果中白细胞和母乳细胞最显著表达差异的基因列表.P-value的计算方法是chi-square检验。结果显示母乳细胞最显著高表达的，基本都是乳腺细胞、导管上皮细胞相关的基因；而白细胞中高表达的特异标志基因在母乳细胞里表达很低。
3、用母乳总cfRNA样本做miRNA二代测序(NGS)文库构建并测序
应用VAHTSTM Small RNALibrary Prep Kit for 
试剂盒(Vazyme NR801)进行miRNA文库的构建，实验方法均按说明书中标注的方法进行。
文库构建完成后于Illumina Hiseq 2500上进行单端测序(36bp或50bp)。原始读数据经Illumina pipeline flter(Solexa 0.3)处理后，运用ACGT101-miR(LC Sciences)程序对数据集进行去除接头二聚体、杂物、低复杂度、常见RNA(rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA)和重复序列的进一步处理。随后，通过BLAST搜索将长度在18～26个核苷酸中的独特序列比对miRBase 22.0中的人miRNA前体，以识别已知的miRNA和异常的3p-和5p-衍生的miRNA。在序列在3’和5’末端或序列内部出现单碱基不匹配都是允许的。发卡结构臂能比对到人类成熟的miRNA上的单一序列被认为是已知的miRNA。与含有miRNA的成熟臂相对的已知人类物种前体发夹结构的另一个臂的独特序列被认为是异常的5p-或3p-衍生miRNA候选体。通过BLAST搜索将剩余的序列比对到miRBase 22.0中选择的其他物种前体(排除人类物种)上，并将映射的pre-miRNAs与人类基因组进行进一步的BLAST搜索以确定其基因组位置，本发明将上述两种定义为已知的miRNA。
4、用二代测序数据分析miRNA在母乳中的稳定性及母乳miRNA与乳腺细胞miRNA一致性根据二代测序数据，本发明分析的结果显示，不同个体来源的母乳miRNA之间、以及自体的母乳细胞miRNA和游离miRNA的可检测到的完整性和相对丰度都非常一致的(图4)。从图4本发明可以看到，可有效检测到的miRNA种类个数在不同样本间几乎无差异。而且表2显示各个检出miRNA相对丰度都很一致。更理想的是，乳汁样本进行防腐处理后，室温(25-30℃)放置1周，可检测到的游离miRNA的完整性和相对丰度仍然跟新鲜冻存的样本基本一样(图4，表2)。这些结果提示，母乳游离miRNA有很好的稳定性，并可代表来源个体的乳腺组织miRNA的表达普，因为母乳里的细胞绝大多数来源于脱落的乳腺及导管上皮细胞。这就给本发明一个极强的期望，即检测母乳游离miRNA很有可能可以发现早期乳腺癌相关的miRNA表达变化，而且是完全无创的方法。
表2.miRNA二代测序结果部分reads数据。从每种miRNA在不同个体以及同一个体乳汁细胞RNA和乳汁cfRNA中的测序reads数比较看，miRNA的丰度特异性是非常相似的。注：Normalized reads是二代测序结果的标准表示方法，是将需相互比较的不同样本的测序原始reads数换算成相同数据量后的均一化reads数，从而避免了因为不同样本测序数据量不同导致的结果比较的不准确。每种miRNA的Normalized reads数越大，表示样本中含此miRNA的丰度越高。
5、二代测序数据与以往报道过的在乳腺癌组织中表达丰度发生变化的miRNA进行比较分析
通过对比既往研究报道的，与正常或癌旁组织比较，在乳腺癌组织中表达丰度发生变化的miRNA(表4)，本发明筛选出26种是在正常乳汁里丰度极低，几乎检测不到，但被报道在乳腺癌组织中表达上升的miRNA；12种是在正常母乳里丰度极高，而被报道在乳腺癌组织中表达下调的miRNA(表3)。根据本发明的数据，乳汁miRNA与正常乳腺细胞的的丰度及完整性是极为一致的。因此，乳汁中的丰度可以认为代表正常乳腺组织中的相对表达丰度。那么在正常乳汁中几乎检测不到，而乳腺癌中高表达的，或者正常乳汁中表达很高而乳腺癌中明显下调的这一组miRNA(或者其中的部分miRNA)有很大机率可以作为乳腺癌早期筛查的潜在分子标志物。尤其是正常乳汁中几乎检测不到的这26种miRNA，因为方法学上，从无到有的检测的可行性、可靠性、灵敏度都是更有希望的。
表3.筛选出的一组可潜在应用于早期乳腺癌筛查的母乳游离miRNA，其中26种在正常母乳cfRNA中丰度极低，乳腺癌发生过程预期升高；12种在正常母乳cfRNA中丰度极高，乳腺癌发生过程预期降低。
表4.对113种既往研究报道在乳腺癌组织里表达显著变化的miRNA的数据一致性的分析，并与本发明的miRNA二代测序数据进行比对，从而筛选可潜在用于乳腺癌早期筛查的miRNA种类。
实施例2
用逆转录-荧光定量PCR方法检测miRNA作为早期乳腺癌筛查标志物中的应用
1、母乳游离RNA(cfRNA)的提取
使用游离DNA提取试剂盒(SummerBioSUM66001)进行母乳中cfRNA的提取，操作步骤参照试剂盒说明书进行。提取的cfRNA进行浓度检测后-20℃保存备用。
2、cDNA第一链合成
采用PloyA法进行miRNA第一链的合成，反应体系为20μl。实验使用的是商品化的SUMi miRNA cDNA第一链合成试剂盒(PolyA尾法)(SummerBioSUM0201)，具体反应体系配制如下。
表5PloyA法PCR的反应体系
移液器轻轻混匀配制的反应液，短暂离心后于PCR仪中进行miRNA的逆转录反应(热盖开启)，下列条件进行反应：
表6 PCR反应条件
3、逆转录产物进行QPCR检测
1)QPCR检测使用商品化的SUMi miRNA荧光定量检测试剂盒(SummerBioSUM0203)来进行。逆转录产物稀释100倍后，按照下表配制反应体系为20μl的反应液：
表7 QPCR反应体系
其中Uni-RPrimer为通用序列Forward Primer为特异性引物，具体每个miRNA的Forward Primer的序列见表6。
其中Uni-RPrimer为通用序列，Forward Primer为特异性引物，其中Uni-R Primer为通用序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGTGTCGTGGAG-3’；
Forward Primer的序列见表8。
表8.针对筛选出的38种可可潜在应用于早期乳腺癌筛查的母乳游离miRNA设计的特异qRT-PCR检测引物。
2)用移液枪混匀反应液，混匀后转至QPCR仪中进行下述条件反应：
表9 QPCR反应条件
图5为用本发明设计的miRNA特异引物做qRT-PCR，检测这38种miRNA在正常母乳cfRNA中的表达丰度。结果显示，本发明设计的特异引物qRT-PCR检测结果跟二代测序结果整体趋势是一致的。基本验证了用qRT-PCR方法快速检测母乳miRNA的可行性。
4.本发明设计了一种根据Ct值的乳腺癌风险因子(Breast Cancer Burden，BCB)评分方法，分为代表预期上调组miRNA的BCB1，和代表预期下调组miRNA的BCB2。具体如下：
BCB1＝0.8×(11种最强一致性预期上调miRNA的(-ΔCt)的均值)+0.2×(其余15种miRNA的(-ΔCt)的均值)，其中(–ΔCt)＝–(Ct目的基因–Ct内参基因)
BCB2＝0.8×(Ct 6种最强一致性miRNA的(-ΔCt)的均值)+0.2×(其余6种miRNA的(-ΔCt)的均值)，其中(–ΔCt)＝–(Ct目的基因–Ct内参基因)
给出标准：：BCB1≥-2或者BCB2≤-1，满足其中一条可提出乳腺癌风险早期预警；若同时满足，提示乳腺癌风险强预警。
根据这个评分公式，本发明计算了3个正常乳汁样本的BCB值，如下表9。
表9正常乳汁样本的BCB值
| 1#样品 | 2#样品 | 3#样品 | |
| BCB1 | -5.75 | -5.66 | -6.91 |
| BCB2 | 1.89 | 1.65 | 3.03 |
结果显示，BCB1都是负值，BCB2都是正值。结果比较一致。
根据这个评分公式，本发明计算了3个乳腺癌组织样本的BCB值，如下表10。
表10乳腺癌组织样本的BCB值
| 1#样品 | 2#样品 | 3#样品 | |
| BCB1 | 0.68 | -1.66 | -1.91 |
| BCB2 | -2.18 | -2.62 | -1.33 |
证明上述结论的可靠性好。
但目前为止本发明也只是对用这组miRNA作为靶标，通过检测母乳cfRNA样本来进行乳腺癌风险的早期筛查的可行性进行了分析和应用场景验证。未来还需要大量的工作来对这些可潜在应用的miRNA进行大样本数据积累及随访跟踪等研究，来进一步验证或从中筛选出更强关联的检测靶标miRNA，来确定正常人群母乳游离miRNA丰度阈值等等。这些后续工作对提高准确性和可操作性尤为重要。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员的公知技术。
序列表
<110> 北京粒基生物科技有限公司 宋庆贺
<120> 一组miRNA在制备作为用于早期乳腺癌筛查的标志物中的应用
<160> 76
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
aggcggagac ttgggcaatt gct 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
caatcagcaa gtatactgcc ctt 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
gggtggggat ttgttgcatt ac 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
agcttcttta cagtgctgcc ttg 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
acgggttagg ctcttgggag ct 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
ttggtcccct tcaaccagct gt 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
ctcctacata ttagcattaa ca 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
gctgcgcttg gatttcgtc 19
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
ctgccaattc cataggtcac agt 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
ccaatattgg ctgtgctgct 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 11
cccagtgttc agactacctg tt 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 12
cgtcttaccc agcagtgttt gg 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 13
agaggtatag cgcatgggaa 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 14
atgacctatg aattgacaga ca 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 15
aaggtgtagg taccctcaat 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 16
tggtttaccg tcccacatac at 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 17
gaagtgcttc gattttgggg tgt 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 18
gcgacgagcc cctcgcacaa acc 23
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 19
aacatagagg aaattccacg t 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 20
gaagttgttc gtggtggatt cg 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 21
aatcattcac ggacaacact tt 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 22
aggttacccg agcaactttg ca 22
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 23
cgaatgttgc tcggtgaacc cct 23
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 24
aacgcgcttc cctatagagg 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 25
ctcttgaggg aagcactttc tg 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 26
agggggaaag ttctatagtc 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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tgaggtagta ggttgtatag tt 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
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<400> 28
tgaggtagta ggttgtgtgg tt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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tgtaaacatc ctcgactgga ag 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 30
tgtaaacatc ctacactcag ct 22
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 31
taacactgtc tggtaaagat g 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 32
tcagtgcact acagaacttt gt 22
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 33
tcagtgcatc acagaacttt g 21
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 34
taatactgcc gggtaatgat gga 23
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 35
taatactgcc tggtaatgat ga 22
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 36
taacactgtc tggtaacgat gtt 23
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 37
tcaagagcaa taacgaaaaa t 21
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 38
tttgttcgtt cggctcgcgt ga 22
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 39
gcgagaggcg gagacttgg 19
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 40
atcagcaagt atactgccct t 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 41
gtgcagggtg gggatttgtt g 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 42
cttctttaca gtgctgcctg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 43
gcgagacggg ttaggctctt 20
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 44
gagggtcccc ttcaaccag 19
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 45
tcggagctcc tacatattag catt 24
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 46
gtgcagctgc gcttggattt c 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 47
tgccaattcc ataggtcaca g 21
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 48
gccgagccaa tattggctgt gc 22
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 49
cccagtgttc agactacctg 20
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 50
cgtcttaccc agcagtgttt g 21
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 51
agaggtatag cgcatggg 18
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 52
gtatgaccta tgaattgaca gac 23
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 53
aaggtgtagg taccctcaat 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 54
gtttaccgtc ccacatacat 20
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 55
agtgcttcga ttttggggt 19
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 56
cgacgagccc ctcgcacaaa c 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 57
gctgaacata gaggaaattc c 21
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 58
gtcgcagaag ttgttcgtgg tgg 23
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 59
gcttcacgga caacacttt 19
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 60
gtgcaaggtt acccgagcaa c 21
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 61
gaatgttgct cggtgaacc 19
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 62
cgcgcttccc tatagagg 18
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 63
gtgcactctt gagggaagca ct 22
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 64
gccagagggg gaaagttcta ta 22
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 65
gtgaggtagt aggttgtata gt 22
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 66
gccagtgagg tagtaggttg tg 22
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 67
gccgagtgta aacatcctcg actg 24
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 68
gcaggtgtaa acatcctaca 20
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 69
gccgagtaac actgtctggt aaag 24
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 70
gtcgcgtcag tgcactacag aact 24
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 71
cagtgcatca cagaactttg 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 72
cgaggtaata ctgccgggta 20
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 73
gtgcctaata ctgcctggta atga 24
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 74
gcgagtaaca ctgtctggta acg 23
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 75
gcgaagagca ataacgaaaa at 22
<210> 76
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 76
gtgcatttgt tcgttcggct cgcg 24
Claims (6)
1.一组miRNA在制备作为用于早期乳腺癌筛查的标志物中的应用，其特征在于，miRNA包括如下：
其中在早期乳腺癌发生发展过程中预期会上调的有26种：
hsa-miR-25-5p_R+2,hsa-miR-34a-3p_R+1,hsa-miR-92a-2-5p,hsa-miR-103a-2-5p,hsa-miR-125b-1-3p,hsa-miR-133a-3p_L-1R+1,hsa-miR-155-3p,hsa-miR-191-3p_R-3,hsa-miR-192-3p_R+1,hsa-miR-195-3p_R-2,hsa-miR-199a-5p_R-1,hsa-miR-200c-5p,hsa-miR-202,hsa-miR-215-5p_R+1,hsa-miR-222-p5,hsa-miR-299,hsa-miR-373,hsa-miR-375-5p,hsa-miR-376c,hsa-miR-382-5p,hsa-miR-382-3p_R+1,hsa-miR-409-5p_R-1,hsa-miR-409-3p_L+1,hsa-miR-523-3p_L-1R-2,hsa-miR-526b-5p_R-1,hsa-miR-625-5p_R-1；
其中在早期乳腺癌发生发展过程中预期会下调的有12种：
hsa-let-7a-5p,hsa-let-7b-5p,hsa-miR-30a-5p,hsa-miR-30b-5p,hsa-miR-141-3p_R-1,hsa-miR-148a-3p,hsa-miR-148b-3p_R-1,hsa-miR-200c-3p,hsa-miR-200b-3p,hsa-miR-200a-3p_R+1,hsa-miR-335-5p_R-2,hsa-miR-375-3p。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，miRNA为
其中在正常乳汁中几乎检测不到，在乳腺癌发生发展过程中预期最强上调的11种miRNA：
hsa-miR-125b-1-3p，hsa-miR-155-3p，hsa-miR-191-3p_R-3，hsa-miR-195-3p_R-2，hsa-miR-215-5p_R+1，hsa-miR-222-p5，hsa-miR-382-3p_R+1，hsa-miR-409-5p_R-1，hsa-miR-523-3p_L-1R-2，hsa-miR-526b-5p_R-1，hsa-miR-625-5p_R-1，
在正常乳汁中丰度极高，在乳腺癌发生发展过程中预期最强下调的6种miRNA：hsa-let-7a-5p，hsa-let-7b-5p，hsa-miR-30a-5p，hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-200a-3p_R+1，hsa-miR-375-3p。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，通过二代测序或qRT-PCR检测母乳中如权利要求1所述的miRNA。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过如下步骤实现：
(1)样本的确定及采集；
(2)母乳中游离RNA(cfRNA)提取即检测；
(4)用二代测序数据或qRT-PCR分析母乳中权利要求1所述的miRNA；
(5)计算乳腺癌风险因子Breast Cancer Burden，BCB，其中BCB1代表预期上调组miRNA的，BCB2代表预期下调组miRNA的。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(5)具体如下：
BCB1＝0.8×(11种预期最强上调miRNA的-ΔCt的均值)+0.2×(其余15种预期上调miRNA的-ΔCt的均值)；
BCB2＝0.8×(6种预期最强下调miRNA的-ΔCt的均值)+0.2×(其余6种预期下调miRNA的-ΔCt的均值)；
其中–ΔCt＝–(Ct目的基因–Ct内参基因)；
BCB1≥-2或者BCB2≤-1，满足其中一条可提出乳腺癌风险早期预警；若同时满足，提示乳腺癌风险强预警。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(4)中qRT-PCR中采用的特异qRT-PCR正向引物，核苷酸序列如下：
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200515 |
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