CN111153960B

CN111153960B - 一种a型肉毒毒素抑制剂及其制备方法与应用

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Publication number: CN111153960B
Application number: CN202010022029.5A
Authority: CN
Inventors: 戴秋云; 沈锦涛; 余硕; 刘佳; 余云舟
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2040-01-09
Also published as: CN111153960A

Abstract

本发明公开了一类新型A型肉毒毒素轻链多肽类抑制剂及其制备方法与应用。所述多肽类抑制剂的结构式如式I所示。本发明通过Fmoc‑固相肽合成法得到线性肽，然后酰胺化关环，纯化后得到目标物。各抑制剂对A型肉毒毒素轻链抑制IC₅₀处于0.37～3.1μM，能显著延长A型肉毒毒素中毒小鼠的死亡时间。本发明对A型肉毒毒素的中毒治疗具有应用价值。

Description

一种A型肉毒毒素抑制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种A型肉毒毒素抑制剂及其制备方法及其应用。

背景技术

肉毒毒素(Botulinum neurotoxins，BoNTs)是由革兰氏阳性菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)分泌的外毒素，是迄今为止人类发现的毒性最强的生物毒素，被列为重要的生物战剂之一。人类发现的肉毒毒素分为7种血清型(A～G)，其中A、B、E、F型可引起人群中毒，以A型毒性最强且最为常见。其结构可分为重链与轻链。重链可与靶细胞膜表面特异性受体结合，介导轻链进入靶细胞。轻链为其毒性成分，可特异性切割SNARE家族蛋白，阻止乙酰胆碱递质的释放，阻断了神经冲动的传导，引起肌肉麻痹(Duplantier AJ，et al.Curr Top in Chem 2016；16(21):2330-49)。

人类肉毒毒素中毒类型可分为四种(Atassi MZ，et al.Crit Rev Immunol 1999；19(3):219-60)：(1)食源性肉毒毒素中毒；(2)婴儿肉毒毒素中毒；(3)吸入性中毒；(4)创伤性肉毒毒素中毒。目前食源性及婴儿肉毒中毒事件仍时有发生。随着A型肉毒毒素(BoNT/A)在医疗和美容的广泛应用，因使用不当导致的肉毒中毒事件时有发生。

目前A型肉毒中毒采取马抗进行治疗，然而马抗存在过敏反应、生产成本高以及低温储存等缺点，且抗毒素只能中和体液、血液中游离毒素，对细胞内的毒素则无抑制效果。肉毒毒素往往在中毒数小时内便可进入神经元，能在神经元中存在数天甚至数月，持续性切割SNARE家族蛋白，阻断乙酰胆碱递质的释放。胞内毒素只能通过人体自身降解被清除，使得病人的治疗周期很长(Thanongsaksrikul J，et al.Toxins 2011；3(5):469-88)。因此，有必要开发小分子抑制剂用于A型肉毒中毒治疗。

CPI-1(序列：Dab-(C)RWTKCL-NH₂)是目前已知的活性最强BoNT/A轻链多肽类抑制剂(K_i＝39.2±4.6nmol/L)，为含7个天然氨基酸与一个非天然氨基酸Dab(L-2,4-二氨基丁酸)的环肽(Adler M，et al.Bioorg Med Chem,2015,23(22):7264-73)。具有作用靶点专一，亲和力较高，水溶性好等优点。然而CPI-1二硫键容易在体内被还原而导致活性丧失。

发明内容

为解决CPI-1易在体内还原且抗酶解活性较差的缺点，本发明提供了一类新型抑制剂，该类抑制剂比CPI-1的抗酶解能力更强，体外抑制BoNT/A轻链的活性比CPI-1稍低(见表1)，但体内对BoNT/A的解毒显著效果优于CPI-1(见表2)。同时，对多肽进行改造，在其C端引入疏水氨基酸或碱性氨基酸，进一步提高了突变肽的抑制活性(见表1)。

本发明还提供了上述抑制剂在制备A型肉毒毒素解毒剂中的应用。

本发明所采取的技术方案为通过设计一个包含胱硫醚或双氨基的linker，对CPI-1序列中半胱氨酸的位置进行替换，引入碳碳键或碳硫键替换二硫键作为骨架结构，进一步在多肽的C端引入疏水氨基酸及碱性氨基酸。

本发明所提供的新型环状多肽抑制剂的序列通式如下：

Dab-RWTK-X-L-Z-NH₂

其中：Dab代表L-2,4-二氨基丁酸，R代表精氨酸，W代表色氨酸，T代表苏氨酸，K代表赖氨酸，L代表亮氨酸；

X为实验室前期合成的linker分子；所述X选自下述X₁、X₂和X₃中除去All保护基、Aloc保护基及Fmoc保护基的剩余基团中的任意一个基团：

Z选自色氨酸、精氨酸、亮氨酸中的任意一个或空缺。

通式具体为以下多肽，其序列如下：

多肽1：Dab-RWTK-X₁-L-NH₂；

多肽2：Dab-RWTK-X₂-L-NH₂；

多肽3：Dab-RWTK-X₃-L-NH₂；

多肽4：Dab-RWTK-X₁-L-W-NH₂；

多肽5：Dab-RWTK-X₁-L-R-NH₂；

多肽6：Dab-RWTK-X₁-L-L-NH₂。

以上任一所述多肽为C末端乙酰化修饰的多肽。

为了更清楚的表述所述多肽抑制剂中各基团的连接关系，本发明所提供的新型多肽抑制剂的结构通式如式I所示：

其中，X、Y均选自CH₂和S中的任一种，但X、Y不同时为S；

Z选自下述基团中的任一种：色氨酸酰氨基(Trp-NH₂)、精氨酸酰氨基(Arg-NH₂)、亮氨酸酰氨基(Leu-NH₂)、氨基。

更具体的，所述多肽抑制剂为下述任一所述的多肽：

1)X＝CH₂，Y＝S，Z＝NH₂；(多肽1)

2)X＝S，Y＝CH₂，Z＝NH₂；(多肽2)

3)X＝CH₂，Y＝CH₂，Z＝NH₂；(多肽3)

4)X＝CH₂，Y＝S，Z＝Trp-NH₂；(多肽4)

5)X＝CH₂，Y＝S，Z＝Arg-NH₂；(多肽5)

6)X＝CH₂，Y＝S，Z＝Leu-NH₂；(多肽6)

本发明还提供了上述多肽抑制剂的制备方法。

所述多肽抑制剂的合成原料均为Fmoc(芴甲氧羰酰基)保护氨基酸：L为Fmoc-Leu-OH；C为Fmoc-Cys(Trt)-OH；K为Fmoc-Lys(Boc)-OH；T为Fmoc-Thr(tBu)-OH；R为Fmoc-Arg(Pbf)-OH；W为Fmoc-Trp(Boc)-OH；Dab为Boc-Dab(Fmoc)-OH。

本发明所提供的制备新型多肽抑制剂的方法，包括下述步骤：

1)采用Fmoc固相合成法合成线性肽，所述线性肽的序列如下：Dab-RWTK-X-L-Z-NH₂；其中，X、Z的定义同式I；所述线性肽为N端带Fmoc保护的肽树脂；所述线性肽的N端为Dab端；

2)多肽的环化：Pd加氢催化脱去所述线性肽中X侧链的All保护基及Aloc保护基，然后在碱性条件下脱去N端的Fmoc保护基，经内酰胺反应环化得到环肽；

3)多肽的裂解：将所述环肽经裂解脱去其余侧链保护基及树脂得到粗肽。

上述使用的氨基酸原料均为Fmoc保护氨基酸：L为Fmoc-Leu-OH；K为Fmoc-Lys(Boc)-OH；T为Fmoc-Thr(tBu)-OH；R为Fmoc-Arg(Pbf)-OH；W为Fmoc-Trp(Boc)-OH；Dab为Boc-Dab(Fmoc)-OH。

所有上述反应均在固相载体上完成。

上述方法步骤2)中，所述环化在DMF溶剂中进行。

所述环化的具体条件为：向合成管中加入PyBoP、HoBt，NMM、DMF，其中，PyBoP、HoBt，NMM与肽的摩尔比依次为5:5:10。

上述方法步骤3)中，所述裂解采用的裂解液由TFA(三氟乙酸)/H₂O/DTT(二硫苏糖醇)/TIS(三异丙基硅烷)组成，其配比依次为：4.4mL/0.25g/0.25g/0.1mL。

粗肽经反向色谱柱纯化后得到产物。

纯化过程具体为：流动相由流动相A与流动相B组成；流动相A：含0.1％TFA的去离子水，流动相B：含0.1％TFA的乙腈。梯度洗脱：0-1min，流动相B占流动相的体积分数为10％；1-25min，流动相B占流动相的体积分数由10％线性上升至50％；25-28min，流动相B占流动相的体积分数由50％线性上升至95％。230nm波长处监测出峰情况，收集目标峰。然后，旋蒸除去大部分乙腈，冻干即为多肽产物。

本发明通过溶液高通量筛选法对制备的新型抑制剂的体外抑制活性进行了测定，结果表明：新型抑制剂对A型肉毒毒素轻链切割底物均具有微摩尔级抑制作用(表1)：多肽1的IC₅₀值为1.064μM，95％置信区间为0.873～1.295μM；多肽2的IC₅₀值为1.316μM，95％置信区间为1.056～1.639μM；多肽3的IC₅₀值为3.094μM，95％置信区间为1.96～4.884μM；多肽4的IC₅₀值为0.816μM，95％置信区间为0.648～1.027μM；多肽5的IC₅₀值为0.368μM，95％置信区间为0.318～0.424μM；多肽6的IC₅₀值为0.619μM，95％置信区间为0.501～0.767μM。多肽1-4活性与CPI-1活性稍低(0.412μM，95％置信区间为0.339～0.499μM)，多肽5与6活性与CPI-1相当或稍高。

本发明采用胰蛋白酶对新型抑制剂的稳定性进行考察，结果表明：在100ng/mL的胰蛋白酶作用下，作用时间为8h时，CPI-1的降解率为73.4％；除多肽5外的其它新型抑制剂在8h的降解率仅为23.6％～58.8％，与CPI-1相比稳定性提升1～2倍。

本发明采用KM小鼠测定新型抑制剂对BoNT/A的解毒效果，结果表明，新型抑制剂的体内解毒效果优于CPI-1，BoNT/A(2LD₅₀/只)与新型抑制剂(5mg/只)共孵育后腹腔注射入小鼠体内，24h时小鼠的存活率为62.5％～100％，72h时小鼠存活率约为25％；而CPI-1组则24h内全部死亡。

附图说明

图1为多肽1的合成路线图；

图2为linker分子合成路线；

图3为linker分子的质谱图；

图4为linker分子的核磁氢谱图；

图5为部分新型抑制剂纯化后HPLC分析图；

图6为CPI-1及新型抑制剂对ALC424的抑制活性图；

图7为CPI-1及新型抑制剂与胰酶作用的降解率-时间分析图；

图8为CPI-1及新型抑制剂与BoNT/A共孵育后腹腔攻毒的生存曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中使用材料列表：

linker合成用试剂：高丝氨酸、9-芴甲氧琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-OSu)、叔丁基-2,2,2-三氯乙酰亚胺酯(CCl₃C(NH)O^tBu)、氯甲酸烯丙酯(Aloc-Cl)、烯丙基溴(All-Br)、三异丙基硅烷、L-半胱氨酸-(S-三苯甲基)、四丁基溴化铵、碘化镍(NiI₂)，联硼酸频那醇酯(B2Pin₂)，甲醇锂(LiOMe)、吡啶-3-甲醛、钯碳(Pd/C)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)均购买自北京伊诺凯科技有限公司。其他常规化学试剂均购自国药试剂有限公司。

多肽固相合成用试剂：多肽Rink树脂(取代率0.6mmol/g)购自天津南开合成有限公司；Fmoc保护氨基酸、HBTU、HoBt均购自上海吉尔生化有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)、哌啶、二氯甲烷(DCM)、无水甲醇(MeOH)、无水乙醚均购自国药基团化学试剂有限公司；二异丙基二乙胺(DIEA)、三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、三苯基磷四钯(Pd(PPh₃)₄)、苯基硅烷(PhSiH₃)购自北京伊诺凯有限公司；二硫苏糖醇(DTT)、二乙基二硫代氨基甲酸钠、(苯并三唑-1-基-氧基)三(1-吡咯烷基)膦六氟磷酸盐(PyBoP)购自阿拉丁有限公司；N-甲基吗啡啉(NMM)购自上海化学试剂有限公司。Linker分子由本实验参照文献的方法合成。

多功能酶标仪及Optiplate384孔黑板购自铂金埃尔默公司；胰蛋白酶购自NEB公司；KM小鼠购自维通利华有限公司(6～8周龄，体重为18～22g，许可证号：SCXK京2016-0011)。底物肽(SNAPtide)购自北京泰泽瑞达科技有限公司。A型肉毒毒素轻链(BoNT/ALC424)(95％)由本课题组制备并保存，该轻链的氨基酸序列及其编码的核苷酸序列见序列表。

缓冲液用试剂：HEPES购自Sigma公司，甘油、Tween-20购自国药基团化学试剂有限公司。

活性测试用工作液：称取11.92g HEPES、量取1.5ml甘油、1ml Tween-20溶于1000ml dd H₂O中，调节pH至7.2，定容至1L。

实施例1：新型抑制剂的制备

1.linker的合成

linker分子参照文献合成(Cui HK，et al.Angew Chem Int Ed,2013；52(36):9558-62)，具体的合成见附图2。

linker分子的质谱结果见附图3，氢谱结果见附图4。

X₁：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝7.91(d,J＝7.6Hz,2H),7.82(d,J＝8Hz,1H),7.73(d,J＝7.2Hz,2H),7.54(m,1H),7.44(t,J＝7.2Hz,2H),7.35(t,J＝7.2Hz,2H),5.96–5.87(m,2H),5.36–5.29(m,2H),5.24–5.18(m,2H),4.61(d,J＝4Hz,2H),4.50(d,J＝4.4Hz,2H),4.30(d,J＝5.2Hz,2H),4.25(d,J＝6.4Hz,2H),4.10–3.99(m,1H),2.96–2.88(m,1H),2.83–2.75(m,1H),2.66–2.52(m,2H),2.03–1.81(m,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ175.11,170.40,156.15,155.83,143.80,143.62,141.28,133.35,132.23,127.71,127.07,125.07,119.96,119.24,118.08,67.18,66.46,66.13,53.74,52.85,47.12,34.43,31.96,29.67,28.44.HRMS(ESI)m/z calculated for C₂₉H₃₂N₂O₈S[M+Na]⁺591.18,found 591.18。

X₂：¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ＝7.72(d,J＝7.2Hz,2H),7.57(d,2H),7.39(t,J＝7.5Hz,2H),7.30(t,J＝7.8Hz,2H),5.92–5.79(m,3H),5.69(d,J＝7.2Hz,1H),5.33–5.12(m,4H),4.61(d,J＝5.4Hz,2H),4.60–4.42(m,4H),4.20(d,J＝6.6Hz,2H),4.23(t,J＝6.6Hz,1H),3.13–2.94(m,2H),2.71–2.52(m,2H),2.12(s,1H),1.95(s,1H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)173.48,171.59,156.07,155.96,143.75,143.65,141.25,132.35,131.30,127.69,127.06,125.10,119.93,119.16,118.04,67.34,66.28,66.10,53.48,53.03,47.06,34.38,32.55,30.87,28.51.HRMS(ESI)m/z calculated for C₂₉H₃₂N₂O₈S[M-H]^-567.19,found 567.11。

X₃：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)7.92(d,J＝7.6Hz,2H),7.74(t,J＝7.4Hz,2H),7.44(t,J＝7.2Hz,2H),7.28-7.32(t,J＝7.4Hz,2H),5.98-5.85(m,2H),5.39-5.13(m,4H),4.68-4.42(m,4H),4.47-4.19(m,4H),4.09-4.00(m,1H),3.96-3.81(m,1H),1.76-1.56(m,4H),1.47-1.34(m,4H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)175.06,172.25,155.97,143.85,143.70,141.28,136.12,135.22,128.60,128.50,128.31,127.68,127.04,119.94,115.34,67.17,67.07,66.99,58.46,53.71,53.15,47.15,32.29,31.97,24.57,24.51.HRMS(ESI)m/zcalculated for C₃₀H₃₄N₂O₈[M+H]⁺551.23,found 551.24。

2.线形肽的合成

采用Fmoc(芴甲氧羰酰基)固相合成法合成线形肽，合成原料均为Fmoc保护氨基酸，偶联体系为HBTU+HoBt+DIEA，Fmoc脱除试剂为20％(v/v)哌啶/DMF混合液，树脂、Fmoc氨基酸的当量比为1:5，Fmoc氨基酸、HBTU、HoBt、DIEA的当量比为1:1.2:1.2:2.4。偶联的时间为90min，脱保护两次，时间均为15min。偶联反应或脱Fmoc反应结束后，按DMF、DCM、DMF的洗涤顺序洗去多余试剂。

重复脱保护、洗涤、缩合、洗涤的步骤，依次连接其它氨基酸，直到获得N端带Fmoc保护的肽树脂。

须注意：线形肽合成完毕后，N端Fmoc保护基不进行脱除。

3.多肽的环化

(1)脱除Aloc和All保护基团：向合成管中加入2equiv Pd(PPh₃)₄，10equivPhSiH₃，10mL 50％(v/v)DMF/DCM混合液，避光反应。茚三酮反应检测树脂显蓝色后抽干反应试剂，0.5％的二乙基二硫代氨基甲酸钠DMF液洗涤若干次，直至树脂呈淡黄色，DMF洗涤三遍。

(2)脱除Fmoc保护基团：向合成管中加入脱保护试剂，脱保护两次，每次15min。按DMF、DCM、DMF的洗涤顺序洗去多余脱保护试剂。

(3)环化：向合成管中加入5equiv PyBoP，5equiv HoBt，10equiv NMM，10ml DMF，室温反应，HPLC检测反应进程直至反应完全。

4.多肽的裂解

配制5ml裂解液：TFA/H₂O/DTT/TIS分别为：4.4mL/0.25g/0.25g/0.1mL。将晾干的肽树脂加入裂解液中，室温反应3h。过滤收集滤液，减压浓缩滤液，加入预冷的无水乙醚使多肽析出，4℃沉淀1h。过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤数次后抽干，获得粗肽。

5.多肽的纯化

纯化采用高效液相色谱仪(Waters 625)及C18半制备柱(Kromasil，5μm)分离，每次进样约3mg。色谱条件：流动相A：含0.1％TFA的去离子水，流动相B：含0.1％TFA的乙腈；流速：2.5ml/min；检测波长：230nm。洗脱梯度为：0-1min，5％-10％B；1-25min，10％-50％B；25-28min，50％-95％B。230nm波长处监测出峰情况，收集目标峰，减压浓缩后冻干，-20℃保存。

分析纯度，结果见图5，各多肽产物纯度均大于95％。

多肽质谱由国家生物仪器分析中心测定，采用傅里叶变换质谱仪(FT-MS)，离子源为MALDI。结果见表1，各肽实测值与理论分子量大小一致。

表1各抑制剂对ALC424的半数抑制浓度IC₅₀(μM)

多肽编号	理论分子量	实测[M+H]<sup>+</sup>	出峰时间(min)	IC<sub>50</sub>(μM)	95％C.I.(μM)
						CPI-1	1005.5	1006.51	12.8	0.412	0.339～0.499
多肽1	987.54	988.55	12.5	1.064	0.873～1.295
						多肽2	987.54	988.55	11.9	1.316	1.056～1.639
多肽3	969.59	970.59	11.6	3.094	1.960～4.884
						多肽4	1174.61	1175.58	15.3	0.816	0.648～1.027
多肽5	1143.63	1144.53	14.9	0.368	0.318～0.424
						多肽6	1101.35	1102.37	11.6	0.619	0.501～0.767

实施例2：新型抑制剂的体外抑制活性的测定

本实施例中采用荧光共振能量转移法(FRET)测试新型抑制剂活性。反应液总体积为50μL，ALC424的终浓度为40nM，SNAPtide的终浓度为2μM，抑制剂预先稀释至不同浓度，均采用工作液进行稀释。

加样顺序为：工作液、ALC424、抑制剂及SNAPtide(待抑制剂与ALC424共孵育半小时后加入)。

实验设置阴性组(10μL SNAPtide+40μL工作液)、阳性组(10μL SNAPtide+10μLALC424+30μL工作液)及实验组(10μL SNAPtide+10μL ALC424+10μL抑制剂+20μL工作液)。

37℃下测定荧光值变化。检测条件：激发波长490nm，发射波长523nm，检测间隔时间2min，检测时间为90min。

以523nm处荧光发射值对时间做图，以阴性对照所测数值作为基线进行扣除，直线的斜率代表着反应速率。

计算得不加抑制剂时的反应速率为V₀，加入抑制剂后反应的速率为V_i，抑制率＝(1-V_i/V₀)×100％。实验数据以

表示(n＝3)，并通过Graphpad Prism 5.0进行拟合。

不同抑制剂浓度下的抑制率见图6，CPI-1及新型抑制剂的IC₅₀值见表1。结果表明：新型抑制剂对肉毒毒素轻链切割底物均具有微摩尔级抑制作用。多肽1的IC₅₀值为1.064μM，95％置信区间为0.873～1.295μM；多肽2的IC₅₀值为1.316μM，95％置信区间为1.056～1.639μM；多肽3的IC₅₀值为3.094μM，95％置信区间为1.96～4.884μM；多肽4的IC₅₀值为0.816μM，95％置信区间为0.648～1.027μM；多肽5的IC₅₀值为0.368μM，95％置信区间为0.318～0.424μM。多肽6的IC₅₀值为0.619μM，95％置信区间为0.501～0.767μM。多肽1～4活性与CPI-1活性稍低，多肽5与6活性与CPI-1相当或稍高。

实施例3：新型抑制剂的体外稳定性测定

本实施例中选取胰蛋白酶考察新型抑制剂的稳定性，具体操作步骤如下：取150μL的胰蛋白酶贮存液(200ng/ml)与150μL的多肽抑制剂(0.5mmol/L)混合，37℃孵育。于0，1，2，4，8小时，分别取样50μL，迅速与100μL乙腈混合静置3min，然后加入50μL去离子水，14000r/min离心10min，-20℃保存待集中分析。

样品上样量为100μL。分析梯度为：0-15min，5％-50％B；15-18min，50％-95％B。

降解率计算公式为：降解率(degradation rate)％＝(S₀-S_t)/S₀×100％(S₀：0min时样品峰面积；S_t：t min时样品峰面积)

不同时间点CPI-1及新型抑制剂与胰酶作用后的降解率见图7，结果表明：在100ng/mL的胰蛋白酶作用下，作用时间为8h时，CPI-1的降解率为73.4％；除多肽5外的其它新型抑制剂在8h的降解率仅为23.6％～58.8％，与CPI-1相比稳定性提升1～2倍。多肽5含有胰酶识别底物Arg，加快了降解速率，但体内活性仍较高。

实施例4：新型抑制剂的小鼠保护效果的测定

将待测抑制剂用纯水配置成1mM储存液，BoNT/A预先稀释至10²LD₅₀/ml。

将小鼠随机分成生理盐水组、CPI-1组及新型抑制剂组，每组8只。BoNT/A的剂量为2LD₅₀/只，抑制剂剂量为5mg/kg，毒素与抑制剂混合30min后腹腔注射，给药体积为200μL/只。观察给药后3天内小鼠的生存情况。

利用GraphPad Prism 5软件，采用乘积极限法(Kaplan-Meier)计算小鼠生存率及绘制生存曲线，检验水准为0.05。并对实验组与生理盐水组数据之间进行Log-rank检验，采用Bonferroni法对P值进行校正。

CPI-1及新型抑制剂对小鼠的保护结果见表2，绘制生存曲线结果见图8。结果表明，生理盐水组与CPI-1组在攻毒一天后，均全部死亡。新型抑制剂组24h时小鼠的存活率为75％～100％，72h时小鼠存活率约为25％，与CPI-1组相比存在显著性差异(P＜0.05)。

表2各抑制剂对A型肉毒毒素(2*LD₅₀)中毒小鼠的解毒活性

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种A型肉毒毒素抑制剂及其制备方法与应用

<130> GNCZJ200176

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1272

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgccatttg ttaataaaca atttaattat aaagatcctg taaatggtgt tgatattgct 60

tatatcaaaa ttccaaatgc aggacaaatg caaccagtaa aggcttttaa aattcataat 120

aaaatctggg ttattccaga acgcgataca tttacaaatc ctgaagaagg agatttaaat 180

ccaccaccag aagcaaaaca agttccagtt tcatattatg attcaacata tttaagtaca 240

gataatgaaa aagataatta tttaaaggga gttacaaaat tatttgagcg catttattca 300

actgatcttg gacgcatgtt gttaacatca attgtacgtg gaatcccatt ttggggtgga 360

agtacaatcg atacagaatt aaaagttatt gatactaatt gtattaatgt gattcaacca 420

gatggtagtt atcgctcaga agaacttaat ctggtaatca tcggaccgtc agctgatatt 480

attcagtttg aatgtaagag ctttggacat gaagttttga atcttacgcg caatggttat 540

ggctctactc aatacattcg ctttagccca gattttacat ttggttttga ggagtcactt 600

gaagttgata caaatcctct tttaggtgca ggcaaatttg ctacagatcc agcagtaaca 660

ttagcacatg aacttatcca tgctggacat cgcttatatg gaattgcaat taatccaaat 720

cgtgttttta aagtaaatac taatgcctat tatgaaatga gtgggttaga agtcagcttt 780

gaggaacttc gcacatttgg gggacatgat gcaaagttta ttgatagttt acaggaaaac 840

gaatttcgtc tgtattatta taataagttt aaagatattg caagtacact taataaagct 900

aaatcaattg taggtactac tgcttcatta cagtatatga aaaatgtttt taaagagaaa 960

tatctcctgt ctgaagatac atctggaaaa tttagcgtag ataaattaaa atttgataag 1020

ttatacaaaa tgttaacaga gatttacaca gaggataatt ttgttaagtt ttttaaagtc 1080

cttaaccgca aaacatattt gaattttgat aaagccgtat ttaagatcaa tatcgtacct 1140

aaggtaaatt acacaatcta tgatggattt aatttacgca atacaaattt agcagcaaac 1200

tttaatggtc aaaatacaga aattaataat atgaatttta ctaaactgaa aaattttact 1260

ggattgtttg aa 1272

<210> 2

<211> 424

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu

420

Claims

1.结构通式如式I所示的多肽：

(式I)

式I中，X=CH₂，Y=S，Z= Trp-NH₂。

2.权利要求1所述多肽在制备A型肉毒毒素抑制剂中应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抑制剂抑制A型肉毒毒素轻链。

4.权利要求1所述多肽在制备预防和/或治疗A型肉毒毒素中毒的药物中应用。

5.一种A型肉毒毒素抑制剂，其活性成分为权利要求1中所述的多肽。

6.一种预防和/或治疗A型肉毒毒素中毒的药物，其活性成分为权利要求1中所述的多肽。