CN111138514B - 一种腰果多肽及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽技术领域，公开了一种腰果多肽，本发明还公开了一种腰果多肽的制备方法，本发明还公开了一种腰果多肽在制备抗过敏保健食品和药品中的应用。本发明从腰果蛋白中获得了纯度高、分子量低且具有显著的抗过敏效应的腰果多肽，本发明在脱脂处理中充分将腰果破碎，提高了腰果的利用率，本发明的提取方法对环境友好，安全性好，无溶剂残留，能耗和成本均较低，且条件温和，提取体系中的降解产物一般不会与提取物发生反应，能够有效地保护可利用成分的品质和生物功能；本发明所需要的设备简单且操作安全，提取温度低，蛋白质不易变性，制备的腰果多肽可作为保健食品和医药品的原料，具有显著的经济、环境和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及多肽技术领域，具体涉及一种腰果多肽及其提取方法和应用。
背景技术
腰果的营养十分丰富，富含脂肪、蛋白质、碳水化合物和多种维生素和矿物质，腰果具有抗氧化、防衰老、抗肿瘤和抗心血管病的作用。腰果中所含的蛋白质是一般谷类作物的2倍之多，并且所含氨基酸的种类与谷物中氨基酸的种类互补。刘义军和叶婧等的研究表明除色氨酸外，腰果蛋白中富含17种氨基酸，其中包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸等7种人体必需氨基酸，且含量皆高于FAO/WHO/UNO成人推荐标准；非必需氨基酸中的谷氨酸和精氨酸含量较高，且其氨基酸组成比例与WHO建议的人体氨基酸模式非常接近，优于其它坚果类产品如杏仁、榛子、核桃等。目前市场上的动物源多肽占大多数，植物源多肽的成本优势使植物源多肽成为研究的新亮点，腰果蛋白便可作为优质植物蛋白资源进行开发利用，腰果多肽具有很高的市场价值。
多肽是介于大分子蛋白质和氨基酸之间的一种易吸收、具有生理功能的营养物质。它们大多以非活性状态存在于蛋白质长链中，一旦成为一定长度的肽，就可表现出一定的生理活性，并保持低过敏性。
多肽的制备方法有溶剂提取法、酸水解法、固相合成法和酶解法等。溶剂提取法可制备存在于生物体内的激素、酶抑制剂等功能性肽，该方法适用热不稳定或挥发性成分，也适用含淀粉或粘液质多的成分，但其提取多肽的时间长，效率低，有溶剂残留和回收不便的缺陷；酸水解法工艺简单、成本低，但存在腐蚀设备和多肽得率低的缺点，并且由于水解过程难以控制而使其应用受到限制；固相合成法虽可获得任意多肽，但其存在成本高和残留化合物多的缺点。相对而言，酶解法的生产条件温和、安全性高、成本低、水解过程容易控制，有利于从蛋白中得到具有生理功能的多肽。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种腰果多肽及其提取方法和应用，本发明采用酶解法从腰果蛋白中获得纯度高、分子量低的腰果多肽，该腰果多肽具有显著的抗过敏效应，可用于新型抗过敏药品的开发和应用。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种腰果多肽，腰果多肽的氨基酸序列为：IleIleAlaIleProAlaGlyValAlaHis。
为解决以上技术问题，本发明还提供了一种腰果多肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：脱脂处理
破碎新鲜腰果，按溶剂比1:6加入石油醚，常温下连续搅拌处理4h，抽滤后40℃烘干后再破碎一次，60目过筛得到脱脂腰果粉；
S2：提取腰果蛋白
将步骤S1中的脱脂腰果粉与水按溶剂比1:40在40℃且pH为10的条件下处理2h，离心去除沉淀并得到上清液，调节上清液的pH至4.5后静置30min，离心15min，收集沉淀，冷冻干燥得腰果蛋白；
S3：将步骤S2中得到的腰果蛋白用碱性蛋白酶酶切后，用沸水浴灭酶10min，5000r/min离心20min后取上清，冷冻干燥得粗腰果多肽粉；
S4：将步骤S3中得到的粗腰果多肽粉经3kDa超滤膜、葡聚糖凝胶层析柱和C18柱分离纯化，冷冻干燥得腰果多肽。
进一步的，步骤S3中的碱性蛋白酶是由地衣芽胞杆菌经发酵提炼而成的蛋白水解酶，主要成分为地衣芽胞杆菌蛋白酶，蛋白酶活为200000U/g。
进一步的，步骤S3中的酶切条件如下：酶切时间为3-5h，温度为35-65℃，pH为9-12.5，底物腰果蛋白的浓度为30-70g/L，碱性蛋白酶的加酶量为5-8％。
进一步的，步骤S3中的酶切条件如下：酶切时间为5h，温度为42.5℃，pH为11.5，底物腰果蛋白的浓度为40g/L，碱性蛋白酶的加酶量为8％。
进一步的，步骤S4中的葡聚糖凝胶层析柱为Sephadex-G50凝胶层析柱，使用时用2倍柱体积的超纯水平衡Sephadex-G50凝胶层析柱，并采用2倍柱体积超纯水洗脱，洗脱流速为0.8mL/min，粗腰果多肽粉的上样浓度为100mg/mL，上样体积为1mL。
为解决以上技术问题，本发明还提供了一种腰果多肽在制备抗过敏药品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用酶解法从腰果蛋白中获得了纯度高、分子量低的腰果多肽，该腰果多肽具有显著的抗过敏效应，可用于新型抗过敏药品的开发和应用；本发明在脱脂处理中，采用粉碎-脱脂-再粉碎-过筛的方法，可充分将腰果破碎，提高了腰果的利用率；本发明采用的腰果多肽的提取方法对环境友好，安全性好，无溶剂残留，能耗和成本均较低，且条件温和，提取体系中的降解产物一般不会与提取物发生反应，能够有效地保护可利用成分的品质和生物功能；本发明所需要的设备简单且操作安全，提取温度低，提取的蛋白质不易变性，制备的腰果多肽可作为医药品的原料，具有显著的经济、环境和社会效益。
附图说明
图1为本发明的实施例中的不同因素对TCA-YSP和DH的影响的结果图；
图2为本发明的实施例中的粗腰果多肽经Sephadex G-50凝胶柱层析分离后的谱图；
图3为本发明的实施例中的F1-a组分经C18柱液相分离后的谱图；
图4为本发明的实施例中的F1-a-1组分的RP-HPLC图谱；
图5为本发明的实施例中的F1-a-1组分的紫外吸收图谱；
图6为本发明的实施例中的F1-a-1组分的红外光谱图；
图7为本发明的实施例中的F1-a-1组分对IgE-抗原复合物刺激的P815细胞β-氨基己糖苷酶胺释放率的影响结果图；
图8为本发明的实施例中的F1-a-1组分对IgE-抗原复合物刺激的P815细胞组胺释放的影响结果图；
图9为本发明的实施例中的温度和pH对TCA-YSP的相互作用结果图；
图10为本发明的实施例中的底物浓度和温度对的TCA-YSP的相互作用结果图；
图11为本发明的实施例中的pH和底物浓度对的TCA-YSP的相互作用结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例：
本实施例的腰果多肽的氨基酸序列为：IleIleAlaIleProAlaGlyValAlaHis。
上述腰果多肽的制备方法包括如下步骤：
S1：脱脂处理
用破碎机破碎新鲜腰果，取100g得到的腰果粉，腰果粉和石油醚按溶剂比1:6(g:mL)混合，常温下连续搅拌处理4h，抽滤后40℃烘干后再破碎一次，60目过筛得到脱脂腰果粉，于-20℃保存备用；
S2：提取腰果蛋白
将步骤S1中的脱脂腰果粉与水按溶剂比1:40(g:mL)在40℃且pH为10的条件下提取2h，离心去除沉淀并得到上清液，用0.1mol/L的HCl将上清液的pH调至4.5后静置30min，随后离心15min，收集沉淀，冷冻干燥得腰果蛋白；
S3：将步骤S2中得到的腰果蛋白用碱性蛋白酶酶切，本实施例中的碱性蛋白酶是由地衣芽胞杆菌经发酵提炼而成的蛋白水解酶，主要成分为地衣芽胞杆菌蛋白酶，蛋白酶活为200000U/g；此步骤的酶切条件为：酶切时间为3-5h，温度为35-65℃，pH为9-12.5，底物腰果蛋白的浓度为30-70g/L，碱性蛋白酶的加酶量为5-8％；本实施例的酶切条件为：酶切时间为5h，温度为42.5℃，pH为11.5，底物腰果蛋白的浓度为40g/L，碱性蛋白酶的加酶量为8％；酶切结束后用沸水浴灭酶10min，5000r/min离心20min后取上清，冷冻干燥得粗腰果多肽粉；
S4：将步骤S3中得到的粗腰果多肽粉经3kDa超滤膜、葡聚糖凝胶层析柱和C18柱分离纯化，冷冻干燥得腰果多肽；本实施例中的葡聚糖凝胶层析柱为Sephadex-G50凝胶层析柱，使用时用2倍柱体积的超纯水平衡Sephadex-G50凝胶层析柱，并采用2倍柱体积超纯水洗脱，洗脱流速为0.8mL/min，粗腰果多肽粉的上样浓度为100mg/mL，上样体积为1mL；为了更好的分离腰果多肽中具有抗过敏效应的成分，本实施例利用C18柱将经过葡聚糖凝胶层析柱的组分进行了再一次的纯化。
上述腰果多肽可应用于制备抗过敏药品，具有显著的经济、环境和社会效益。
本实施例对制备粗腰果多肽工艺条件的优化实验如下：
(1)确定粗腰果多肽制备的影响因素
以DH(水解度)和TCA-YSP(多肽得率)为评价指标，采用单因素实验研究腰果蛋白的酶解条件，单因素实验的参数及相关水平见表1：
表1单因素实验的参数及其水平
实验结果参见附图1，从附图1A中可看出，当酶解pH为11.5和12时，酶解液的DH和TCA-YSP达到最大值；从附图1B中可看出，当酶解时间为5h时，酶解液的DH和TCA-YSP达到最大值；从附图1C中可看出，当加酶量为8％时，酶解液的DH达到最大值，而加酶量变化时，TCA-YSP变化不显著；从附图1D中可看出，当酶解温度为40和45℃时，酶解液的DH达到最大值，而酶解温度为40℃时，TCA-YSP达到最大值；从附图1E中可看出，当底物浓度为30g/L和40g/L时，酶解液的DH达到最大值，而底物浓度为40g/L时，TCA-YSP达到最大值。
(2)确定粗腰果多肽的制备条件
基于上述单因素实验的结果，TCA-YSP的三个影响因素有：温度(35～50℃)、pH(10.5～12.5)和底物浓度(30～50g/L)，因此进行了响应面实验，得到的实验数据如表2和表3所示：
表2TCA-YSP中心复合设计的实验数据
表3响应面方法回归与方差分析
**表示不同因素对多肽得率的极显著性差异(p<0.01)，*不同因素对多肽得率的表示显著性差异(p<0.05)。
所得到的三维响应面图见附图9、附图10和附图11，其中附图9表示温度和pH对TCA-YSP的相互作用，附图10表示底物浓度和温度对的TCA-YSP的相互作用，附图11表示pH和底物浓度对的TCA-YSP的相互作用。
结果显示，二次回归方程模型具有很高的显著性(p<0.01)，而二次回归方程模型失拟项不显著(p>0.05)，模型的相关系数为0.9350，说明该模型具有较高的精度，可用于分析和预测不同设计条件下温度、底物浓度和pH对TCA-YSP的影响。本实验由Design-Expert8.0.5设计分析，TCA-YSP的二次多项式回归方程如下：
Y＝25.35-0.94A+1.06B-1.50C-2.08AB+0.89AC+0.31BC+0.14A2-1.38B2–0.62C2
当F值越大，P值越小，相应变量的显著程度越高；使用方差分析评估模型系数的显著性，温度与pH(AB)的交互作用对TCA-YSP的影响极显著(p<0.01)，但温度与底物浓度(AC；p>0.05)之间无明显的交互作用，pH和底物浓度之间也没有显著差异(BC；p>0.05)。温度(A)对TCA-YSP的影响显著(p<0.05)，而pH(B)和底物浓度(C)的影响非常显著(p<0.01)。通过F值法计算底物浓度、pH、温度对TCA-YSP的影响得出底物浓度>pH>温度。
本实施例将制得的粗腰果多肽粉以超纯水配制成浓度为100mg/mL的溶液，向Sephadex-G50凝胶层析柱上样，上样体积为1mL，紫外检测器的波长设定为220nm，SephadexG-50凝胶柱层析分离后的谱图结果见附图2，收集得到了两个组分F1-a和F1-b。
称取适量分离纯化得到的F1-a多肽，用含0.1％三氟乙酸的超纯水溶解，用C18柱纯化，上样浓度为100mg/mL，并用0.45μm滤膜过滤，所用色谱条件如下：
色谱柱：ODS HYPERSIL制备柱(5um 250×10mm)
上样量：1mL
流速：0.8mL/min
紫外检测器：检测波长220nm
流动相A：含0.05％TFA的乙腈；流动相B：含0.05％TFA的超纯水
梯度洗脱：0～15min，0～30％的有机相A、15～25min，30～35％的有机相A、25～40min，35～40％的有机相A
F1-a多肽经过C18柱纯化得到两个组分F1-a-1和F1-a-2，该纯化方法能对粗腰果多肽各组分进行有效分离，分离结果见附图3。F1-a-1组分经反相高效液相色谱(RP-HPLC)鉴定纯度，鉴定结果见附图4，用紫外吸收光谱和红外光谱对F1-a-1组分进行定性测定，测定结果见附图5和附图6，鉴定结果显示其为腰果多肽。
本实施例通过检测F1-a-1腰果多肽对P815肥大细胞组胺和β-氨基己糖苷酶释放量的影响，判断其抗过敏效应，结果见附图7和附图8，结果显示腰果多肽可显著抑制肥大细胞组胺和β-氨基己糖苷酶的释放量，说明该腰果多肽具有抗过敏效应，可以用于开发抗过敏效应的药品。
经过对上述F1-a-1腰果多肽进行氨基酸测序，得到其氨基酸序列为：IleIleAlaIleProAlaGlyValAlaHis(IIAIPAGVAH)。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 海南大学
<120> 一种腰果多肽及其提取方法和应用
<130> 2019
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> cashew
<400> 1
Ile Ile Ala Ile Pro Ala Gly Val Ala His
1 5 10
Claims (4)
1.一种腰果多肽，其特征在于，腰果多肽的氨基酸序列为：IleIleAlaIleProAlaGlyValAlaHis。
2.权利要求1所述的一种腰果多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：脱脂处理
破碎新鲜腰果，按溶剂比1:6加入石油醚，常温下连续搅拌处理4h，抽滤后40℃烘干后再破碎一次，60目过筛得到脱脂腰果粉；
S2：提取腰果蛋白
将步骤S1中的脱脂腰果粉与水按溶剂比1:40在40℃且pH为10的条件下处理2h，离心去除沉淀并得到上清液，调节上清液的pH至4.5后静置30min，离心15min，收集沉淀，冷冻干燥得腰果蛋白；
S3：将步骤S2中得到的腰果蛋白用碱性蛋白酶酶切后，用沸水浴灭酶10min，5000r/min离心20min后取上清，冷冻干燥得粗腰果多肽粉；
S4：将步骤S3中得到的粗腰果多肽粉经3kDa超滤膜、葡聚糖凝胶层析柱和C18柱分离纯化，冷冻干燥得腰果多肽；
步骤S3中，所述碱性蛋白酶是由地衣芽胞杆菌经发酵提炼而成的蛋白水解酶，主要成分为地衣芽胞杆菌蛋白酶，蛋白酶活为200000U/g，酶切时间为3-5h，温度为35-65℃，pH为9-12.5，底物腰果蛋白的浓度为30-70g/L，碱性蛋白酶的加酶量为5％-8％；
步骤S4中，粗腰果多肽粉以超纯水配制成浓度为100mg/mL的溶液，向Sephadex-G50凝胶层析柱上样，上样体积为1mL，紫外检测器的波长设定为220nm，Sephadex G-50凝胶柱层析分离后收集得到了两个组分F1-a和F1-b；
称取适量分离纯化得到的F1-a多肽，用含0.1％三氟乙酸的超纯水溶解，用C18柱纯化，上样浓度为100mg/mL，并用0.45μm滤膜过滤，所用色谱条件如下：
色谱柱：ODS HYPERSIL制备柱，型号为5um,250×10mm；
上样量：1mL；
流速：0.8mL/min；
紫外检测器：检测波长220nm；
流动相A：含0.05％TFA的乙腈；流动相B：含0.05％TFA的超纯水；
梯度洗脱：0～15min，0～30％的有机相A、15～25min，30～35％的有机相A、25～40min，35～40％的有机相A。
3.根据权利要求2所述的一种腰果多肽的制备方法，其特征在于，步骤S3中的酶切条件如下：酶切时间为5h，温度为42.5℃，pH为11.5，底物腰果蛋白的浓度为40g/L，碱性蛋白酶的加酶量为8％。
4.权利要求1所述的一种腰果多肽在制备抗过敏药品中的应用。
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