CN111135805A

CN111135805A - 一种用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111135805A
Application number: CN202010068211.4A
Authority: CN
Inventors: 吕海霞; 朱熠门; 刘志
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2040-01-21
Also published as: CN111135805B

Abstract

本发明公开了一种用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料及其制备方法和应用，其通过“巯基‑烯”点击化学反应，将交联剂，高亲水有机聚合单体，二元致孔剂，PAEs核酸适配体均匀混合制备成预聚液，然后通过一步热聚合法直接形成萃取材料。本发明所制备的萃取材料骨架结构均匀，核酸适配体反应效率高，特异识别性较好，可良好地用于实际饮用水样品中PAEs的高特异性检测分析，并能检测到矿泉水中浓度为0.38 ng/mL‑2.01 ng/mL的邻苯二甲酸酯类物质，为邻苯二甲酸酯类物质的特异性识别分离提供了新途径。

Description

一种用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料及其制备方法和应用。

背景技术

邻苯二甲酸酯（Phthalic acid esters，PAEs）已成为环境中最常见的化学污染物，广泛存在于水，食物，土壤，污泥和空气中。大面积使用和永久性排放导致它们很容易从环境中浸出进入人体，导致内分泌系统紊乱，影响生殖器的发育，甚至会在肝脏，肾脏和睾丸上导致不良反应。因此，建立一种简单、准确、高灵敏度的检测方法显得十分必要和迫切。

目前检测PAEs的最常用方法是基于色谱技术。然而，由于相对较低的浓度和实际样品的复杂性，很难直接分析PAEs；因此，在样品进行色谱分析之前，预处理和富集过程至关重要且必不可少。迄今为止，已经开发了许多技术用于预处理和富集PAEs，其中，固相萃取技术（Solid-phase extraction，SPE）由于具有消耗有机溶剂少、操作简单等优点常常作为首选。但是，传统的固相萃取技术缺乏特异性，因此需要开发一种新型的固相萃取材料来提高对目标物的选择性。目前用于对PAEs的选择性萃取吸附材料主要是分子印迹聚合物，高瑞霞等人（Food Anal. Methods. 2016, 9, 2026–2035）合成了涂覆在乙烯基官能化多壁碳纳米管表面的新型分子印迹聚合物，并与气相色谱-质谱法（GC/MS）结合用于选择性分离和测定邻苯二甲酸二辛酯（DOP），在饮料样品中的回收率达到88.6%-93%。尽管分子印迹材料能在复杂样品中实现对邻苯二甲酸酯类物质的选择性吸附，但是其选择性还有待提高，同时还伴有模板渗出等问题的出现。考虑到上述问题，越来越多的研究人员开始寻找一种更具有特异性、更高效的萃取材料来代替分子印迹材料。

核酸适配体（APT）是一段通过SELEX方法筛选出的短链DNA或RNA序列，对靶分子具有高度的亲和性和高度的特异性。将固相萃取技术和核酸适配体技术相结合能够简单、高效的实现对目标分子的选择性吸附。阿纳尔萨（Food Chemistry. 2011, 127, 1378–1384）等人通过凝胶与赭曲霉毒素A（OTA）适配体偶联用于固相萃取柱的制备，然后对小麦进行液相色谱（HPLC）和荧光检测（FLD）分析。本杰明（Anal Bioanal Chem. 2011, 400, 1199–1207）等人通过共价结合（溴化氰活化琼脂糖凝胶）或非共价结合（链霉亲和素激活琼脂糖）将OTA的核酸适配体固定在固相萃取小柱中，并用来检测红酒中的OTA。除此之外，还开发了多种其他形式核酸适配体结合的固相萃取材料来提高固相萃取材料的特异性。但是到目前为止，还没有利用核酸适配体结合固相萃取技术检测PAEs的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料。该核酸适配体功能萃取材料骨架结构均匀，核酸适配体反应效率高，特异性识别能力强，负载量大，机械性能稳定，制备方法简便快捷。是由通过“一步聚合”的方式，采用“巯基-烯”点击化学反应，在预聚合体系中引入核酸适配体，利用自由基聚合反应制备了核酸适配体功能萃取材料。所得到的核酸适配体功能萃取材料能实现对目标物的高效识别。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料，其是将交联剂，高亲水有机聚合单体，二元致孔剂，核酸适配体，引发剂均匀混合制备成预聚液，然后通过一步热聚合法制备得到。

进一步地，上述的高亲水有机聚合单体为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述二元致孔剂为N ,N-二甲基甲酰胺和PEG 10000；所述的核酸适配体为PAEs核酸适配体5^，-SH-C6-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3^，。

进一步地，所述高亲水有机聚合单体的质量占整个预聚合溶液总质量的2.5%-2.9%。

进一步地，所述交联剂的质量占整个预聚合溶液总质量的10%-25%。

进一步地，所述二元致孔剂中N ,N-二甲基甲酰胺和PEG 10000的质量比为3:97-6:94。

进一步地，所述引发剂的质量占整个预聚合溶液总质量的0.22%。

进一步地，所述PAEs核酸适配体的浓度为20 μmol/L-80 μmol/L。

上述用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料的制备方法，包括以下步骤：首先将5’-SH修饰的核酸适配体使用前在8000 rmp的转速下离心10 min后，轻轻打开，用移液器移取一定体积的20 mmol/L配制好的BB缓冲液（pH 7.90）溶解混匀后，置于90 ℃恒温水浴锅中加热3 min 退火处理，然后在室温中自然冷却约30 min备用。然后准确称取一定量的交联剂EDMA、功能单体AMPS、致孔剂DMF和PEG-10000、核酸适配体溶液、引发剂AIBN于2 mL的离心管中，涡旋振荡至完全溶解，得到均一的预聚合溶液，低温超声脱气20min（≤20 ℃）。然后置于55 ℃水浴锅中反应12 h，聚合成功后使用甲醇和水冲洗聚合物，再用缓冲盐溶液清洗聚合物两遍，得到适配体聚合物。将得到的适配体聚合物置于烘箱中干燥，然后研磨成粉末。称取一定质量的上述研磨成粉末的适配体聚合物，用筛板固定，加入到购买的3 mL固相萃取小柱中。最后加入2 mL的BB缓冲溶液，密封好上下两个端口，储存在4 ℃以便后续实验使用。

上述步骤中的BB缓冲液组成为：10 mmol/L Tris-HCl，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl和20 mmol/L CaCl₂，pH为7.90。

本发明的用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料可以分离和富集饮用水中PAEs成分。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明将核酸适配体与固相萃取技术相结合制备了用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料；

（2）本发明制备的核酸适配体功能萃取材料可以实现对邻苯二甲酸酯类物质的特异性分离；

（3）本发明制备的核酸适配体功能萃取材料对PAEs的最大富集倍数是90；

（4）本发明制备的核酸适配体功能萃取材料能够被用于饮用水中邻苯二甲酸酯类物质的高效富集与分离，其检测回收率最高可达108.90%。

附图说明

图1为不含核酸适配体的萃取材料（A）的示意图（A：100000倍）和核酸适配体功能萃取材料（B-E）的示意图（B：20 μmol/L APT，100000倍；C：40 μmol/L APT，100000倍；D：60μmol/L APT，100000倍；E：80 μmol/L APT，100000倍；）；

图2为不含核酸适配体的萃取材料（a）、40 μmol/L核酸适配体功能萃取材料（b）对PAEs的特异性识别；

图3为不同交联剂对核酸适配体功能萃取材料的影响；

图4为不同洗脱液类型对核酸适配体功能萃取材料的影响。

具体实施方式

为进一步公开而不是限制本发明，以下结合具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

一种用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料的制备方法，具体步骤为：首先将5’-SH修饰的核酸适配体使用前在8000 rmp的转速下离心10 min后，轻轻打开，用移液器移取至20 mmol/L配制好的BB缓冲液（pH 7.90）中溶解混匀，置于90 ℃恒温水浴锅中加热3 min 退火处理，然后在室温中自然冷却约30 min备用，不使用时将核酸适配体溶液储存于-20 ℃冰箱保存。然后准确称取质量占整个预聚合溶液质量15%的交联剂EDMA、质量占整个预聚合溶液质量2.7%的有机聚合功能单体AMPS、质量占整个预聚合溶液质量81.74%的二元致孔剂DMF和PEG-10000（二元致孔剂DMF的质量与PEG-10000的质量比为4.5:95.5）、质量占整个预聚合溶液质量0.22%的引发剂AIBN以及浓度为40 μmol/L的核酸适配体溶液于2mL的离心管中，涡旋振荡至完全溶解，得到均一的预聚合溶液，低温超声脱气20 min（≤20℃）。然后置于55 ℃水浴锅中反应12 h，聚合成功后使用甲醇和水冲洗聚合物，再用缓冲盐溶液清洗聚合物两遍，得到适配体聚合物。将得到的适配体聚合物置于烘箱中干燥，然后研磨成粉末。称取15 mg的上述研磨成粉末的适配体聚合物，用筛板固定，加入到购买的3 mL固相萃取小柱中。最后加入2 mL的BB缓冲溶液，密封好上下两个端口，储存在4 ℃以便后续实验使用，可得材料C₂。

缓冲液组成为：10 mmol/L Tris-HCl，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl₂，pH为7.90。

实施例2

准确称取质量占整个预聚合溶液质量10%的交联剂EDMA，其他步骤如实施例1，可得材料C₁。

实施例3

准确称取质量占整个预聚合溶液质量20%的交联剂EDMA，其他步骤如实施例1，可得材料C₃。

实施例4

准确称取质量占整个预聚合溶液质量25%的交联剂EDMA，其他步骤如实施例1，可得材料C₄。

实施例5

准确称取质量占整个预聚合溶液质量2.5%的有机聚合功能单体AMPS，其他步骤如实施例1，可得材料C₅。

实施例6

准确称取质量占整个预聚合溶液质量2.9%的有机聚合功能单体AMPS，其他步骤如实施例1，可得材料C₆。

实施例7

准确称取质量占整个预聚合溶液质量81.74%的二元致孔剂DMF和PEG-10000（二元致孔剂DMF的质量与PEG-10000的质量比为3:97），其他步骤如实施例1，可得材料C₇。

实施例8

准确称取质量占整个预聚合溶液质量81.74%的二元致孔剂DMF和PEG-10000（二元致孔剂DMF的质量与PEG-10000的质量比为6:94），其他步骤如实施例1，可得材料C₈。

实施例9

准确称取浓度为20 μmol/L的核酸适配体溶液于2 mL的离心管中，其他步骤如实施例1，可得材料C₉。

实施例10

准确称取浓度为60 μmol/L的核酸适配体溶液于2 mL的离心管中，其他步骤如实施例1，可得材料C₁₀。

实施例11

准确称取浓度为80 μmol/L的核酸适配体溶液于2 mL的离心管中，其他步骤如实施例1，可得材料C₁₁。

实施例12 一种用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料的特异性测试

应用不含核酸适配体的萃取材料作为对照组和实施例1所得材料C₂检测对4种邻苯二甲酸酯类物质的特异性识别。分别按以下步骤实施：（1）平衡：先用2 mL结合缓冲液平衡，所述的结合缓冲液为10 mmol/L Tris-HCl，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl和20 mmol/LCaCl₂，pH 7.90；（2）富集：将2 mL浓度为1000 ng/mL的邻苯二甲酸酯混合溶液（DMP、DEP、BBP、DBP）分别注入两种萃取材料中，通过重力作用流过萃取材料，用4 mL洗净的离心管收集富集尾液；（3）清洗：用结合缓冲液对对照组和核酸适配体功能萃取材料分别清洗；清洗液通过重力作用流过萃取材料，用4 mL洗净的离心管收集清洗尾液；（4）洗脱：用2 mL甲醇作为洗脱液将邻苯二甲酸酯类物质从萃取材料中洗脱下来，洗脱液通过重力作用流过萃取材料，用4 mL洗净的离心管收集洗脱尾液。采用HPLC-紫外检测器上检测收集液，对照组对邻苯二甲酸酯类物质的特异性识别较差（图2a），而邻苯二甲酸酯类物质可以被核酸适配体功能萃取材料有效识别富集和洗脱下来，且特异性高（图2b）。

实施例13 一种用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料的最大富集倍数测定

考察了在不同试样体积条件下，核酸适配体功能萃取材料对PAEs的富集性能。分别将含有10 μg PAEs的20，40，80，100，120，160，180和200 mL的样本溶液在最佳吸附和脱附条件下萃取富集，然后通过对PAEs回收率的测定来研究其最大富集倍数。（表2）结果表明，当试样体积增大至200 mL时，DMP的回收率降至46.97%，DEP的回收率降至68.45%，BBP和DBP的回收率均在80%以下。这说明核酸适配体功能萃取材料对PAEs具有良好的萃取富集能力，由于2 mL甲醇溶液就能实现定量回收PAEs，故其最大富集倍数为90。

应用实施例1

采用实施例1中的核酸适配体功能萃取材料，测试其对饮用水水中邻苯二甲酸酯类物质的富集效率。将可饮用的矿泉水直接通过HPLC，发现并不能检测出邻苯二甲酸酯类物质通过核酸适配体功能萃取材料90倍富集之后，实际矿泉水样品中的邻苯二甲酸酯类物质可以被有效识别富集并洗脱下来，PAEs在矿泉水基质中的检测含量为0.38 ng/mL-2.01 ng/mL。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料，其特征在于：所述用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料是将交联剂，高亲水有机聚合单体，二元致孔剂，核酸适配体，引发剂均匀混合制备成预聚液，然后通过一步热聚合法制备得到。

2.根据权利要求1中所述的用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料，其特征在于：所述高亲水有机聚合单体为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸；所述高亲水有机聚合单体的质量占整个预聚液总质量的2.5%-2.9%。

3.根据权利要求1中所述的用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料，其特征在于：所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述交联剂的质量占整个预聚液总质量的10%-25%。

4.根据权利要求1中所述的用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料，其特征在于：所述二元致孔剂为N ,N-二甲基甲酰胺和PEG 10000，所述N ,N-二甲基甲酰胺和PEG 10000的质量比为3:97-6:94。

5.根据权利要求1中所述的用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料，其特征在于：所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述引发剂的质量占整个预聚液总质量的0.22%。

6.根据权利要求1中所述的用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料，其特征在于：所述核酸适配体为PAEs核酸适配体5^，-SH-C6-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3^，，其浓度为20 μmol/L-80 μmol/L。

7.一种如权利要求1-6任一项所述用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料的制备方法，其特征在于：所述方法是将交联剂，高亲水有机聚合单体，二元致孔剂，核酸适配体，引发剂均匀混合制备成预聚液，然后通过一步热聚合法制备得到用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）将核酸适配体在8000 rmp的转速下离心10 min，然后加入20 mmol/L的BB缓冲液中溶解混匀后，再置于90 ℃恒温水浴锅中退火处理3 min，然后在室温中自然冷却30 min备用；

（2）称取交联剂、高亲水有机聚合单体、二元致孔剂、步骤（1）得到的核酸适配体溶液、引发剂于离心管中，涡旋振荡至完全溶解，得到均一的预聚合溶液，低温超声脱气20 min；

（3）将步骤（2）得到的预聚合溶液置于55 ℃水浴锅中反应12 h，再使用甲醇和水冲洗聚合物，再用缓冲盐溶液清洗，得到用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料。

9.一种如权利要求1中所述的用于吸附邻苯二甲酸酯的核酸适配体功能萃取材料在分离和富集饮用水中邻苯二甲酸酯类物质上的应用。