CN111135251A

CN111135251A - 一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111135251A
Application number: CN202010021368.1A
Authority: CN
Inventors: 李睿; 阮文辉; 叶松华; 刘冠群; 吴哲; 冯夏珍; 张娇
Original assignee: Shanxi University of Chinese Mediciine
Current assignee: Shanxi University of Chinese Mediciine
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2040-01-09
Also published as: CN111135251B

Abstract

本发明公开了一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药及其制备方法与应用，所述的兽药包括如下质量份数的组分：黄芪100～300份，白芍100～300份，麦冬50～250份，淫羊藿50～200份，女贞子50～200份，板蓝根50～150份，黑果腺肋花楸冻干果粉30～80份。兽药的制备方法为：(1)按照质量分数称取除黑果腺肋花楸冻干果粉以外的中药，粉碎，加入酶进行酶解，得到酶解液；(2)将酶解液超声提取，固液分离，向固体中加入水，超声提取，过滤，得到滤液；将滤液趁热离心，得到上清液；(3)将上清液加热，真空浓缩后冻干，粉碎，再向其中加入黑果腺肋花楸，混匀，即得。与现有技术相比，本发明在最后添加黑果腺肋花楸能够有效提高兽药的活性。

Description

一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药及其制备方法与应用。

背景技术

市场的需求，使得畜牧业获得了快速发展。为促进动物的生长，缩短动物的生长周期，提高养殖的经济效益和生产效率，越来越多的饲料添加剂被研发出来，并且被广泛的应用到畜牧业当中。德国研究者把门冬氨酸添加到绵羊的饲料中，这是一种人工合成的非蛋白氮物质，通过检测发现绵羊血液中的氮含量显著提高。某些抗生素在动物饲料中作为添加剂使用一定程度上预防了畜禽的疾病发生，但是，长期的使用却导致严重的后果，弊端越来越明显。自从将化学合成药物、抗生素以及激素等药物作为添加剂应用到饲料中，用于促进养殖业发展以来，药物带来的副作用、环境污染和兽药残留问题越发严重，不仅损害了人们的身体健康，同时也打击了养殖业的发展。

鸡群中，免疫抑制性疾病也越来越常见，传染性法氏囊病毒(IBDV)、IBD是由病毒引起的危害幼鸡的急性、高度接触性传染病(BW,1999)。其最大的危害是破坏鸡的中枢免疫器官-法氏囊，法氏囊是禽类特有的体液免疫中枢器官，是诱导B细胞分化和成熟的场所，来自骨髓的淋巴干细胞在法氏囊内诱导分化为成熟B细胞，成熟B细胞膜上分别具有SigG、SigM、SigA，经淋巴、血液循环到达外周免疫器官组织的特定部位(即囊依赖区)，在抗原刺激下，B细胞分化为前浆细胞，进而转化为成熟浆细胞，合成和分泌相应类型的特异性抗体，参与机体的体液免疫。IBDV使携带SigM标志的B淋巴细胞变性和坏死(Hirai K,1981)，导致严重的、长期的免疫抑制，使机体对其他疫苗的免疫反应降低、对其他细菌和病毒等病原体的易感性增加(Anderson WL,1977；Rosenberger JK,1978；Wyeth PJ,1994；Sharma,2000)。其发病突然，传播迅速，通常在感染第3d开始死亡，5d～7d达到死亡高峰，以后很快停息。死亡率一般在15％～50％，超强毒感染死亡率可达70％以上(Van den Berg TP,2000)。

中药可从整体上调理机体的各种功能，中药免疫增强剂可提高机体的非特异性免疫力；且中草药资源丰富，价格低廉，长期使用对机体的毒副作用小，低残留或无残留，因此，复方中草药免疫增强剂是近年来动物用免疫增强剂和病毒抑制剂的发展趋势之一。

黄芪为豆科植物膜荚黄芪或内蒙古黄芪的根，主产甘肃、内蒙古等地。传统中医认为：黄芪是一味补气药，可“补气益元”“治一切气衰血虚之症”。现代医学则证实：黄芪可调节机体免疫功能，在临床上用于抗肿瘤、消除慢性炎症。兽医临床上用于治疗鸡IBD效果明显。由此可知，用黄芪调整机体免疫功能治疗疾病，与传统中医“扶正”治病的原则是相吻合的(余建国等,2000)。研究表明黄芪能激发机体产生大量的白细胞干扰素和吞噬细胞以及淋巴细胞，而且能强化体内的体液免疫途径，产生大量的免疫球蛋白和补体，改善微循环，对病毒产生干扰吞噬结合作用，通过多种途径杀灭细菌和病毒，并有清热解毒和调节机体代谢机能紊乱的功效，增强禽类抗病能力(金光明，2005)。

板蓝根为十字花科菘蓝属植物菘蓝的干燥根，具有清热解毒、凉血消肿之功效，临床上广泛用于抗病毒、抗菌，并具有抗肿瘤，增强机体免疫力的功能(赵军,2003)。在免疫方面，板蓝根能增强网状内皮系统的免疫能力，增强细胞吞噬力(彭少平等,2005)，从而增强机体的免疫功能。

淫羊藿为小蘗科淫羊藿植物，具有“补气壮阳，祛风除湿”的传统中药，现代研究证明，淫羊藿对免疫功能具有促进作用，可增强T淋巴细胞的功能；促进B淋巴细胞的增生和转化，提高抗体生成水平；还可以通过影响巨噬细胞因子的分泌而调节免疫功能(杨朝晔，1999)。

女贞子为木犀科乔木女贞成熟干燥后的果实，果实味道甘、苦；主要药理作用是滋补肝脏和肾脏，明目，清虚热。现代药理已对其进行了研究证实，中药女贞子作为纯天然植物饲料添加剂有极广阔的应用前景与推广价值。女贞子的主要成分是齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、熊果酸及一些亚麻酸等。女贞子在畜禽类中的应用主要是提高动物本身免疫力、抗衰老、抗氧化、抗菌、抗病毒和抗炎作用、升高白细胞和抗炎抑菌、保肝护肝、强心、利尿、降血糖和抗癌等作用。清除羟自由基、超氧阴离子自由基和活性氧，提高抗氧化酶活力。从而抑制机体免疫器官退化及提高免疫功能。

白芍为毛茛科植物芍药的干燥根，作为临床常用中药，祖国医学认为其具有养血、敛阴、柔肝、止痛等作用。早在上世纪80年代，我国学者已发现白芍有效成分-白芍总苷具有促进淋巴细胞转化的作用。近年来，大量研究表明白芍总苷具有抗炎和免疫调节的作用，已广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中。

麦冬是百合科植物麦冬Ophiopogon japonicas(L.f)Ker-GawL的干燥块根，其味甘微苦，性微寒；归心、肺、胃经；具有养阴生津、润肺清心之效。目前，从麦冬中分离出的化合物主要有甾体皂苷类、高异黄酮类、多糖类及氨基酸类等，具有多种药理作用，如免疫调节、降血糖、保护心血管系统、抗炎、抗肿瘤等。研究发现，甾体皂苷类化合物作为麦冬里主要的活性部位，其不仅具有镇咳、改善肝肺病理性损伤的作用，还具有明显的抗肿瘤，抗衰老，抗心脑血管疾病，抗炎及免疫调节等多种作用。目前，针对麦冬的研究虽然很广泛，但尚缺乏对其各组分的深入研究。

生地的主要化学成分有环烯醚萜及其苷类，有机酸类、氨基酸、酚类、糖类等。传统医学认为，地黄具有滋阴补血，生津止渴的功效怛。现代药理学实验发现，生地黄提取物中的苷类、酚类、糖类几乎对人体的各个系统都有作用，主要活性成分为具有改善心血管系统功能作用的环烯醚萜苷类物质和能够调节内分泌、提高机体免疫功能及降血糖作用的生地黄多糖和生地黄寡糖，同时苯乙醇苷类成分毛蕊花糖苷具有促进骨骼细胞增殖及分化的作用，在保健食品和医药研究等方面具有广阔的开发应用价值。

赤芍为毛茛科植物赤芍或川赤芍的干燥根。苦，微寒。归肝经。有清热凉血，活血祛瘀的功效。用于热人营血，温毒发斑，吐血衄血，目赤肿痛，肝郁胁痛，经闭痛经，瘾瘕腹痛，跌扑损伤，痈肿疮疡。

丹皮为毛茛科植物牡丹干燥根皮。生用或炒用。现代研究，所含牡丹酚及其以外的糖苷类成分均有抗炎作用；牡丹皮的甲醇提取物有抑制血小板作用；牡丹酚有镇静、降温、解热、镇痛、解痉等中枢抑制作用及抗动脉粥样硬化、利尿、抗溃疡等作用。

蒲公英中含有蒲公英醇、蒲公英素、胆碱、有机酸、菊糖等多种健康营养成分。性味甘，微苦，寒。归肝、胃经。有利尿、缓泻、退黄疸、利胆等功效。治热毒、痈肿、疮疡、内痈、目赤肿痛、湿热、黄疸、小便淋沥涩痛、疔疮肿毒，乳痈，瘰疬，牙痛，目赤，咽痛，肺痈，肠痈，湿热黄疸，热淋涩痛。治急性乳腺炎，淋巴腺炎，瘰疬，疔毒疮肿，急性结膜炎，感冒发热，急性扁桃体炎，急性支气管炎，胃炎，肝炎，胆囊炎，尿路感染等。

地丁其有效成分为生物碱，有体外抗菌作用，对甲型链球菌、肺炎球菌、卡他球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有抑制(试管法)；对葡萄球菌(金黄色和白色)、八叠球菌也有作用(琼脂平板打洞法)。亦用人胚肾原代单层上皮细胞组织培养，1：10苦地丁注射液对脊髓灰质炎(疫苗株)爱柯18、柯萨奇B1、腺病毒Ⅲ型均未见抑制；对4个凝血单位的流感亚甲京科68-1株(1：160)无抑制，而对副流感仙台株有抑制。

黑果腺肋花楸系蔷薇科腺肋花楸属的一个种，落叶灌木，浆果。黑果腺肋花楸果实富含黄酮、花青素和多酚等物质，其花青素含量达到了3000mg/100g，其抗氧化自由基的能力达到蓝莓、蔓越莓和越橘的4～7倍，其提取物在抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖等方面具有良好的生物活性，对心脏病、高血压等心血管疾病具有特殊的疗效。

然而，传统中兽药普通粉在禽病防治中常采用常规方式粉碎(低速粉碎)给药，由于鸡的肠道较短，药物在消化道的通过时间与家畜相比非常短，对纤维素的消化能力低，消化液中的消化酶在药物细胞壁的影响下，只能将药物中的很少一部分有效成分浸出，药物的吸收利用率低，单位体重用量大，见效慢，造成很大浪费。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，其对免疫抑制性因素提供毒副作用小，不易产生耐药性的增强免疫功能的兽药，而且安全、高效、质量可控。

本发明还要解决的技术问题是提供上述兽药的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述兽药的应用。

发明思路：黄芪100～300份，白芍100～300份，麦冬50～250份，淫羊藿50～200份，女贞子50～200份，板蓝根50～150份，主要起的作用是增加鸡的免疫力，提升鸡抵抗法氏囊没病毒的能力，降低其得法氏囊病的可能性，生地20～80份，赤芍20～80份，丹皮20～80份，蒲公英20～80份，地丁20～80份。主要作用是抑制和杀灭法氏囊病毒，黑果腺肋花楸冻干果粉30～80份主要作用是增效免疫效果，并降低鸡法氏囊疾病引起的萎靡不振，肌肉出血，法氏囊出血，冻样病变症状。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，其包括如下质量份数的组分：黄芪100～300份，白芍100～300份，麦冬50～250份，淫羊藿50～200份，女贞子50～200份，板蓝根50～150份，黑果腺肋花楸冻干果粉30～80份。

其中，黑果腺肋花楸冻干果粉的制备方法为采集黑果腺肋花楸成熟鲜果，挑拣，清洗，晾干，直接冻干得到黑果腺肋花楸冻干果，-20℃低温粉碎得到黑果腺肋花楸冻干果粉。

优选地，所述的兽药还包括如下质量分数的组分：生地20～80份，赤芍20～80份，丹皮20～80份，蒲公英20～80份，地丁20～80份。

更优选地，所述的兽药由以下重量份数的组分组成：黄芪200份，白芍200份，麦冬150份，淫羊藿100份，女贞子100份，板蓝根80份，黑果腺肋花楸冻干果粉60份。

更优选地，所述的兽药由以下重量份数的组分组成：黄芪200份，白芍200份，麦冬150份，淫羊藿100份，女贞子100份，板蓝根80份，黑果腺肋花楸冻干果粉60份，生地50份，赤芍40份，丹皮30份，蒲公英30份，地丁30份。

上述述兽药的剂型为颗粒、口服液、注射液、片剂和散剂中的任意一种。

上述兽药的制备方法包括如下步骤：

(1)按照质量分数称取除黑果腺肋花楸冻干果粉以外的中药，超微粉碎，加入酶进行酶解，得到酶解液；

(2)将步骤(1)得到的酶解液灭酶后超声提取，固液分离，向固体中加入水，超声提取，重复2～3次，过滤，得到滤液；将滤液趁热离心，得到上清液；

(3)将步骤(2)得到的上清液加热，真空浓缩后冻干，粉碎，再向其中加入黑果腺肋花楸冻干果粉，混匀，即得。

步骤(1)中，所述的中药需40℃条件下，低温烘干至水分9.5％以下；超微粉碎15min后，经显微镜镜检确认细胞破碎率99％以上。

步骤(1)中，所述的酶为纤维素酶与果胶酶的组合酶；纤维素酶与果胶酶的质量份数比为2:1；纤维素酶的酶活为10万U/g，果胶酶的酶活为3万U/g；控制酶的添加量，使酶与中药的质量比为0.5％～2％；纤维素酶活的定义为在37℃，pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所学要的酶量为一个酶活单位U；果胶酶酶活定义为在45℃，pH值为5的条件下，1分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量为一个酶活单位U。

步骤(1)中，酶解的条件为在pH为4.5～6，温度为45～60℃下酶解40～60min，优选pH为5.0，50℃下酶解50min。

步骤(2)中，所述的灭酶为90℃下灭活15min。

步骤(2)中，所述的超声提取为50～70℃(优选60℃)下，20～60KHz超声30～50min(优选40KHz超声40min)；所述的向固体中加入水，超声提取为向固体中再加10倍重量份数的水，重复超声提取2次。

步骤(2)中，所述的过滤为保温趁热经100～300目的滤纸或滤布减压过滤或加压过滤；所述加压为5～40MPa。

步骤(2)中，所述的趁热离心为在3000～6000rpm的转速下离心10～15min，优选4000rpm下离心15min。

步骤(3)中，加热的温度为70～90℃，加热的时间为20～40min；所述的浓缩为减压浓缩。

步骤(3)中，黑果腺肋花楸中富含花青素，黄酮，微量元素，维生素等，本项目中添加的为黑果腺肋花楸鲜果采摘后的冻干果，从采摘结束到冻干预冻的时间在8小时以内。最大限度的保证了其中活性成分，冻干结束后真空避光包装，使用前对冻干果进行粉碎和配药。黑果腺肋花楸冻干果粉中的活性成分与中药中的多糖结合提升免疫效果，与中药中的生物碱结合可以降低组方中的生物碱对肌体的损伤，在杀灭病毒的同时保护免疫器官，增加畜禽采食量。

之所以最后干粉配药是为了防止黑果腺肋花楸中的花青素、原花青素、黄酮类、氨基酸及维生素类活性物质在药材水溶中一起熬煮会产生明显的活性损失。黑果腺肋花楸冻干果粉中的活性成分与中药中的多糖结合提升免疫效果，与中药中的生物碱结合可以降低组方中的生物碱对肌体的损伤，在杀灭病毒的同时保护免疫器官，增加畜禽采食量。

本发明采用中兽药超微粉碎破壁后，酶法辅助超声提取得到中药活性成分提取液，摒弃传统中药提取中的水提醇沉的方法，把中药中的水溶性糖类、多糖类，鞣质，氨基酸、蛋白质、生物碱类。醇溶性萜类、生物碱类等药材中的有效成分能够充分释放出来，表面积增大，有效成分在胃肠道的溶解度增加，药物用量少、见效快、疗程短。

上述兽药在制备治疗鸡法氏囊病药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的治疗为预防和治疗。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、安全本发明选用黄芪、淫羊藿、女贞子、板蓝根、白芍、麦冬、生地，赤芍份，丹皮，蒲公英，地丁，黑果腺肋花楸为原料，这些原料为天然中药，具有很长的临床应用你是，毒副作用小，无残留，而且这些天然中药原料及其产物均可在自然环境中降解，不致造成环境污染。

2、高效本发明根据中医基础理论，结合畜禽免疫抑制性因素的研究，进行中医辨证论治组方，复合中医学特征，产品经试验，效果显著。

3、质量可控本发明产品制定产品质量标准，以黄芪甲苷、淫羊藿苷、白芍苷、齐墩果酸、R,S-告依春(齐墩果酸是女贞子的标志物，R,S-告依春是板蓝根的标志物)、作薄层色谱，以白芍苷计，测成品多糖含量，质量稳定、可控。

4、本发明中兽药的制备方法为其他药物熬煮后再加入黑果腺肋花楸冻干果粉，能够有效降低药物中白芍苷和多糖在空气中和高温条件下的降解，增药效，且延长保质期，同时可以降低鸡得法氏囊疾病的风险，减轻得法氏囊疾病的症状，与本发明中药组方的协同作用可以缩短鸡痊愈的时间。

附图说明

图1为单味药材和复方药材的对比图，其中，S1：黄芪、淫羊藿、板蓝根混合物(扶正解毒散)液相色谱图；S2：本组方液相色谱图；S3：黄芪；S4：白芍；S5：淫羊藿；S6：板蓝根；S7：女贞子；S8：麦冬。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，按下述配比称取原料：黄芪200份，白芍200份，麦冬150份，淫羊藿100份，女贞子100份，板蓝根80份，生地50份，赤芍40份，丹皮30份，蒲公英30份，地丁30份，合药酶解，得提取液，冷冻干燥后加入黑果腺肋花楸冻干果粉60份，制备成合药。

制备方法：分别进行超微粉碎，加入中药质量的1.5％的组合酶，其中纤维素酶：果胶酶的质量比为2:1，在pH5.0，50℃下酶解50min，加热90℃，15min灭酶，然后于60℃，40KHz条件下超声提取40min，固液分离取上清液，再向固体别加入10倍重量份数的水进行超声提取，重复两次，每次40min，过滤，滤液合并；后趁热在4000rpm的条件下离心15min，取上清液，将上清液混合后在80℃条件下加热30min，充分混匀，真空浓缩后冻干，粉碎，加入黑果腺肋花楸果冻干粉60份，合药200份，加入辅料β-环糊精100份、蔗糖粉30份制备成颗粒。

每1g药物含有R,S-告依春8.84μg，白芍苷871.77μg，淫羊藿苷33.46μg，花青素1.82mg，多糖53.64mg。

实施例2：一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，按下述配比称取原料：黄芪150份，白芍150份，麦冬100份，淫羊藿80份，女贞子100份，板蓝根75份，黑果腺肋花楸冻干果粉50份，经提取制成口服液。

制备方法：将以上十一味中药分别进行超微粉碎，加入原料质量2.0％的组合酶，其中纤维素酶：果胶酶的质量比为2:1，在pH 5.0，50℃下酶解50min，加热90℃，15min灭酶，然后于60℃，40KHz超声提取40min，固液分离取上清液，再向固体中加入10倍质量份数的水超声提取，再重复两次，每次30min，过滤，滤液合并；后趁热在3500rpm的条件下离心15min，取上清液，将上清液混合后在80℃条件下加热30min，充分混匀，真空浓缩后冻干，粉碎，加入60份黑果腺肋花楸果冻干粉，加入纯水，灌装，灭菌。

每1mL药物含有R,S-告依春4.86μg，白芍苷479.47μg，淫羊藿苷18.40μg，花青素0.98mg，多糖29.50mg。

实施例3：一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，按下述配比称取原料：黄芪100份，白芍100份，麦冬75份，淫羊藿100份，女贞子150份，板蓝根150份，生地40份，赤芍40份，丹皮30份，蒲公英30份，地丁20份，黑果腺肋花楸冻干果粉80份，经提取制备成散剂。

制备方法：将以上十一味中药分别进行超微粉碎，加入中药质量的1.0％的组合酶，其中纤维素酶：果胶酶的质量比为2:1，在pH 5.0，50℃下酶解50min，加热90℃，15min灭酶，然后于60℃，40KHz条件下超声提取40min，固液分离取上清液，再向固体中加入10倍重量份数的水超声提取，再重复两次，每次30min，过滤，滤液合并；后趁热在4000rpm条件下离心15min，取上清液，将滤液混合后在85℃条件下加热30min，充分混匀，真空浓缩后冻干，粉碎，加入60份黑果腺肋花楸冻干果粉，过40目筛，制备成散剂，真空包装。

每1g药物含有R,S-告依春14.58μg，白芍苷1438.42μg，淫羊藿苷55.21μg，花青素2.76mg，多糖88.50mg。

对比例1：

一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，按下述配比称取原料：黄芪200份，白芍200份，麦冬150份，淫羊藿100份，女贞子100份，板蓝根80份，生地50份，赤芍40份，丹皮30份，蒲公英30份，地丁30份，黑果腺肋花楸冻干果粉60份，制备成合药。

制备方法：分别进行超微粉碎，按上述配方对药材进行称量组合，加入纤维素酶：果胶酶＝2:1的组合酶，组合酶与的中药质量比为1.5％，在pH5.0，50℃下酶解50min，加热90℃，15min灭酶，然后于60℃，40KHz条件下超声提取40min，固液分离取上清液，再向固体中加入10倍重量份数的水超声提取，再重复两次，每次40min，过滤，滤液合并；后趁热在4000rpm的条件下离心15min，取上清液，将60份黑果腺肋花楸超微粉(采集黑果腺肋花楸成熟鲜果，挑拣，清洗，晾干，直接冻干得到黑果腺肋花楸冻干果，-20℃低温粉碎得到黑果腺肋花楸冻干果粉)按照固液比1:10加入水，在50℃条件下超声提取40min，固液分离取上清液，后固体分别加入10倍水两次进行超声提取，每次40min，过滤，滤液合并；将中药上清混合液与黑果腺肋花楸上清液充分混匀，真空浓缩后冻干，粉碎，合药200份，加入辅料β-环糊精100份、蔗糖粉30份制备成颗粒。

每1g药物含有R,S-告依春6.93μg，白芍苷713.35μg，淫羊藿苷26.36μg，花青素0.072mg，多糖35.21mg。

对比例2：

一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，按下述配比称取原料：黄芪100份，白芍100份，麦冬75份，淫羊藿100份，女贞子150份，板蓝根150份，黑果腺肋花楸冻干果粉80份，经提取制备成散剂。

制备方法：将以上十一味中药分别进行超微粉碎，加入原料质量1.5％的组合酶，其中纤维素酶：果胶酶的质量比2:1，在pH 5.0，50℃下酶解50min，加热90℃，15min灭酶，然后于60℃，40KHz条件下超声提取40min，固液分离取上清液，再向固体中加入10倍重量份数的水超声提取，再重复两次，每次30min，过滤，滤液合并；后趁热在4000rpm的条件下离心15min，取上清液，将60份黑果腺肋花楸超微粉按照固液比1:10加入水，在50℃条件下超声提取40min，固液分离取上清液，后固体分别加入10倍水两次进行超声提取，每次40min，过滤，滤液合并；将中药上清混合液与黑果腺肋花楸上清液充分混匀，真空浓缩后冻干，粉碎过40目筛，制备成散剂，真空包装。

每1g药物含有R,S-告依春11.44μg，白芍苷1177.02μg，淫羊藿苷43.50μg，花青素0.12mg，多糖58.10mg。

对比例3：一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，按下述配比称取原料：黄芪100份，白芍100份，麦冬75份，淫羊藿100份，女贞子150份，板蓝根150份，生地40份，赤芍40份，丹皮30份，蒲公英30份，地丁20份，经提取制备成散剂。

制备方法：将以上十一味中药分别进行超微粉碎，加入原料质量1.5％的组合酶，其中纤维素酶：果胶酶的质量比2:1，在pH 5.0，50℃下酶解50min，加热90℃，15min灭酶，然后于60℃，40KHz条件下超声提取40min，固液分离取上清液，再向固体中加入10倍重量份数的水超声提取，再重复两次，每次30min，过滤，滤液合并；后趁热在4000rpm的条件下离心15min，取上清液，滤液合并；将中药上清混合液充分混匀，真空浓缩后冻干，粉碎过40目筛，制备成散剂，真空包装。

每1g药物含有R,S-告依春12.93μg，白芍苷1043.63μg，淫羊藿苷39.76μg，花青素，0.02mg，多糖57.45mg。

实施例4：

(一)材料与方法

1 材料及来源

1.1 受试药物：

1.1.1 名称：本发明提供的增强免疫功能的兽药颗粒

1.1.2 研制单位：山西中医药大学

1.1.3 规格：1000g/包。

1.2 对照药物

1.2.1 名称：扶正解毒散

1.2.2 生产单位：太原恩禾动物药业有限公司

1.2.3 批号：190801

1.2.4 规格：1000g含1000g原药材

2 实验动物

2.1 品种：海兰鸡

2.2 来源：购自河北曹妃甸区八农场孵化场

2.3 日龄：1日龄饲养至63日龄

2.4 每组动物数：30只

2.5 饲养条件：饲养在严格消毒的养殖场实验室内，饲喂800只鸡颗粒料(广东恒兴集团浙江恒兴饲料有限公司)，应用洁净自来水。

3 试验分组及给药途径

试验分组及给药途径具体情况见表1。

表1试验分组及处理

(二)结果与讨论

2.1 单味与合药的检测方法

安捷伦1200型高效液相色谱仪，DAD检测器，自动进样器；C18色谱柱，不同流动相体系梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长230nm，乙腈-0.1％磷酸水作为流动相，梯度洗脱(见表2)。

图1为检测结果，从图1中可以看出，本专利中药组方中白芍苷的含量明显高于市售扶正解毒散中的白芍苷含量。

表2梯度洗脱程序表

2.2 提取方法的区别

表3传统合药热回流提取与本方法分药提取效果比较

从表3中，可以看出，本发明所采用的超微粉碎+酶法辅助超声的方法能够有效提高R,S-告依春、淫羊藿苷、白芍苷和多糖的的含量。

2.3 观察指标及检测结果

2.3.1 IBDV-HI抗体(法氏囊-血凝抑制试验抗体)检测

分别于免疫后7天和21天，随机挑选10羽，翅静脉采血1mL，分离血清，采用“V”微量血凝板以鸡法氏囊血凝抑制(HI)试验检测IBDV-HI抗体效价。

效价的测定方法：“V”型反应板的每一孔开始，依次作倍数稀释至最后一孔，弃除混合液50μL。每孔分别加入1:16鸡法氏囊标准抗原稀释液50μL；同时，设鸡法氏囊标准抗原、阳性血清(均购自浙江省畜禽防检站)、稀释液三个对照，于微量振荡器上摇匀，置培养箱内37℃放置30min。每孔再加入1％鸡红细胞悬液50μL，混匀，置37℃放置30名后观察。

2.3.2 免疫器官体重系数的计算

于免疫后第7天，随机挑选鸡10羽，经颈动脉放血致死后，采集脾脏、胸腺和法氏囊三种免疫器官，称取湿重，按下列公司计算免疫器官指数。

脾指数＝脾湿重(mg)/鸡活体重(g)

法氏囊指数＝法氏囊湿重(mg)/鸡活体重(g)

胸腺指数＝胸腺湿重(mg)/鸡活体重(g)

2.3.3 数据统计与疗效评价

运用t检验标间各处理组与空白对照组，受试药物试验组与空白对照组，以及受试药物不同剂量组间的差异显著性。

2.3.3.1 鸡血浆免疫指标的影响结果见表4。

表4对蛋鸡血浆免疫指标的影响

注：同行相比，不标字母或小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)。

从表4中的数据分析可知：由表可以看出，本专利中药配方能够极显著增加血清中IgM、IL-2和TNF-α的含量(P<0.01)，添加本专利配方试验组的血浆IgM含量显著高于对照组；本项目试验组Ⅱ的血浆IL-2含量显著高于对照组；添加本项目试验组Ⅱ中的血浆TNF-α的含量显著高于对照组，添加试验组Ⅱ的鸡血液IgA和IgG也明显高于对照和试验组Ⅰ(P<0.05)。

2.3.3.2 对鸡法氏囊HI抗体效价的影响

各试验组鸡血清中ND-HI抗体效价测定结果见表5。

表5中药复方对鸡血液IBDV-HI抗体的影响(nlog2)

注：同列相比，不标字母或小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)。

结果表明：由表5结果可以看出，试验组II对雏鸡法氏囊病毒抗体水平均有明显的提高作用，从21日龄开始抗体水平与对照组比较差异显著(P<0.05)。42日龄时抗体水平达最高8.8log2，比对照组高出4.1个滴度。此后随日龄的增加抗体水平程下降趋势，但试验组II抗体水平仍维持在8log2以上至63日龄，与对照组比较差异显著(P<0.05)。

2.3.3.3 对免疫器官指数的影响

各试验组鸡免疫器官指数测定结果见表6～8。

表6不同中药复方对鸡脾指数的影响

注：同行相比，不标字母或小写字母有相同表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)。

表7不同中药复方对鸡法氏囊指数的影响

表8不同中药复方对鸡胸腺指数的影响

表6～8中体现了，不同中药组方对雏鸡的脾脏、法氏囊等免疫器官均指数产生了明显的变化，表6结果显示：脾指数空白对照组无明显变化，和实验Ⅱ组的脾指数明显高于试验Ⅰ组和空白组，28天时，脾指数与空白组合试验Ⅰ相比产生显著变化。表7结果显示：法氏囊指数明显高于空白组和实验Ⅰ组，在第14天开始就产生显著变化。表8结果显示：胸腺指数变化明显，试验Ⅱ组与空白组和实验Ⅰ组相比产生显著变化。

2.3.3.4 试验组和对照组对法氏囊病毒攻毒的发病率、死亡率及保护率

从表9中可以看出，本发明所制备的兽药，即实验组Ⅱ对IBDV攻毒有着较强的抵制和治愈力，其对雏鸡法氏囊病毒攻毒保护率高达93.33％。

从表10中可以看出，本发明添加了黑果腺肋花楸冻干果粉能有效促进愈合，降低给药痊愈天数。

表9预防试验发病率、死亡率及保护率(％)

注：同列相比，不标“*”和“**”表示差异不显著(P>0.05)，标“*”表示差异显著(P<0.05)，标“**”表示差异极显著。

表10治疗效果评价(％)

2.4、不良反应及对症处理

本过程中未发现不良反应。

(三)结论

3.1 一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药复方的分析

本研究是在对常用中草药有效成分定性定量分析的基础上，筛选了含有激活免疫系统、活化免疫细胞的多糖、皂甙、黄酮等有效成分的淫羊藿、党参、黄芪、黑果腺肋花楸等11味中草药和1味食品原料，依据现代中兽医医药理论，科学配伍，研究不同配方、不同剂量的复方中草药免疫增强剂对鸡的法氏囊病毒抗体水平、免疫器官质量及免疫器官指数影响。与实施例2相比，实施例1和实施例3中加入了生地50份，赤芍40份，丹皮30份，蒲公英30份，地丁30份，其所得药物中白芍苷与多糖的含量有所提高，由此可见，生地，赤芍，丹皮，蒲公英和地丁在提高白芍苷和多糖的含量保证雏鸡免疫力的同时，增加了抑制和杀灭法氏囊病毒的活性成分，进一步提高该兽药的药效。

3.2中药复方制备方法的影响

与传统的一锅熬煮的方法不一样，本发明先将除黑果腺肋花楸冻干果粉以外的中药粉碎、酶解，提取中药组分，最后再加入除黑果腺肋花楸冻干果粉。

(1)从实施例1～3与对比例1～2可以看出，采用分开添加的方法，白芍苷和多糖的含量能够提高达1438.42μg/g和88.5mg/g。

(2)从表3中，可以看出，与传统的合药热回流提取相比，本方法分药提取效果大大提高。

3.3 中药复方对正常雏鸡脾指数、法氏囊指数和胸腺指数的影响

从实验结果看本项目预防和治疗鸡法氏囊病复方对鸡的法氏囊病毒抗体水平、脾指数、法氏囊指数和胸腺指数有显著影响。从抗体水平上可以看出，试验组Ⅱ中的效果最为显著。

动物免疫器官指数的增加是由其自身细胞生长发育和分裂增殖所致，指数增加表明机体的免疫机能提高。本试验表明，21、35日龄时脾指数、法氏囊指数与对照组比较差异显著，而随着日龄的增加，各剂量组雏鸡免疫器官重量以及体重均比对照组增加明显，但各组在28、63日龄时免疫器官指数相比却没有明显差异。究其原因一方面这可能是由于中药复方对免疫器官发挥药效的阶段主要在21、35日龄这一时段，另一方面可能是随着时间的延长，药效在体内的全面发挥作用，而复方的主要作用位点在于促进机体产生特异性抗体、激发了机体的体液免疫反应，从而出现了28日龄以后同期各组免疫器官指数与对照组相比差异不明显(P>0.05)，而抗体水平却明显高于对照组的结果(P<0.05)。

本试验发现试验组Ⅱ对正常雏鸡的脾指数有一定的提高作用。其中对正常雏鸡的脾指数、法氏囊指数和胸腺指数都有一定的提高，且免疫效果理想。

3.4 法氏囊病毒攻毒发病率、死亡率和保护率

法氏囊病毒攻毒后，各组大部分鸡开始出现不同程度的临床症状：精神沉郁，羽毛松乱逆立，食欲下降，饮水减少，排黄白色稀便等。感染对照组鸡首先出现死亡，各组死亡时间大约出现在攻毒后3d～5d，到第7d停止死亡。其中保护率最高的是试验Ⅱ组，其次是试验Ⅰ组，各组均与感染对照组极显著(P<0.01)差异(见表9)。试验Ⅱ组与空白对照组的差异最为显著，也明显高于试验Ⅰ组。

本发明提供了一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.一种预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，其特征在于，其包括如下质量份数的组分：黄芪100～300份，白芍100～300份，麦冬50～250份，淫羊藿50～200份，女贞子50～200份，板蓝根50～150份，黑果腺肋花楸冻干果粉30～80份。

2.根据权利要求1所述的预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，其特征在于，所述的兽药还包括如下质量分数的组分：生地20～80份，赤芍20～80份，丹皮20～80份，蒲公英20～80份，地丁20～80份。

3.根据权利要求1所述的预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，其特征在于，所述的兽药由以下重量份数的组分组成：黄芪200份，白芍200份，麦冬150份，淫羊藿100份，女贞子100份，板蓝根80份，黑果腺肋花楸冻干果粉60份。

4.根据权利要求2所述的预防和治疗鸡法氏囊病的兽药，其特征在于，所述的兽药由以下重量份数的组分组成：黄芪200份，白芍200份，麦冬150份，淫羊藿100份，女贞子100份，板蓝根80份，黑果腺肋花楸冻干果粉60份，生地50份，赤芍40份，丹皮30份，蒲公英30份，地丁30份。

5.权利要求1～4中任意一项所述兽药，其特征在于，兽药的剂型为颗粒、口服液、注射液、片剂和散剂中的任意一种。

6.权利要求1～4中任意一项所述兽药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)按照质量分数称取除黑果腺肋花楸冻干果粉以外的中药，粉碎，加入酶进行酶解，得到酶解液；

(2)将步骤(1)得到的酶解液超声提取，固液分离，向固体中加入水，超声提取，过滤，得到滤液；将滤液趁热离心，得到上清液；

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的酶为纤维素酶与果胶酶的组合酶；纤维素酶与果胶酶的质量份数比为2:1；纤维素酶的酶活为10万U/g，果胶酶的酶活为3万U/g；控制酶的添加量，使酶与中药的质量比为0.5％～2％；酶解的条件为在pH为4.5～6，温度为45～60℃下酶解40～60min。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的超声提取为50～70℃下，20～60KHz超声30～50min；所述的向固体中加入水，超声提取为向固体中再加10倍重量份数的水，重复超声提取2次；所述的趁热过滤为在3000～6000rpm的转速下离心10～15min。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，加热的温度为70～90℃，加热的时间为20～40min。

10.权利要求1～4中任意一项所述兽药在制备治疗鸡法氏囊病药物中的应用。