CN111134056B - 一种海水青鳉受精卵孵化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种海水青鳉受精卵孵化方法，属于水产养殖领域，本发明方法通过将受精卵在不同盐度梯度的海水中进行孵化，孵化的理化条件为温度26‑28℃，湿度40‑60％，光强80‑125μmol·m‑2·s‑1，光暗比为14：10；本发明方法能够获得清洁度高的受精卵，便于胚胎学实验观察和显微注射等实验操作，本发明方法受精卵的孵化率可高达94.7％。且孵化得到的海水青鳉仔鱼经过后续长期观察，能够正常发育、成长、繁殖，未发现有异常现象存在。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类繁育领域，具体涉及海洋模式生物海水青鳉的受精卵高效孵化方法。
背景技术
海水青鳉(Oryzias melastigma)隶属于脊索动物门、辐鳍鱼纲、颚针鱼目、怪颌鳉科、青鳉属。其个体较小，成体体长仅为28±2mm，易于实验室内人工培养。繁殖周期短，3月龄即可达到性成熟。受精卵直径约为0.9±0.05mm，整体呈现透明色，便于观察。由于具有以上众多生物学优势，海水青鳉已被推荐为一种理想的海洋模式鱼种，广泛用于生物发育学、生态毒理学和分子生物学研究。
海水青鳉产卵类型属于典型的黏着沉性卵，与经济鱼种大泷六线鱼、鲆鲽类、鲱鱼、颌针鱼等相似。其孵化温度要求较高，需在26-28℃之间，孵化周期也较长，通常为12-14天。如此高温条件下，受精卵所在水体往往会滋生藻类，例如小球藻、硅藻等微藻。到孵化后期，大量藻类会附着在受精卵表面，导致受精卵整体发黑，仔稚鱼的破壳孵化进程受阻，同时也会影响胚胎观察等实验的正常开展。孵化过程中常常观察到海水青鳉胚胎可以正常发育至后期，但由于壳上附着物过厚，导致仔稚鱼仅仅尾部钻出，头部卡在壳内，最终缺氧死亡。
目前，关于海水青鳉受精卵孵化的专利主要有两个，即“一种青鳉鱼高效繁殖及孵化方法(公告号：105900879A)”和“一种循环水挂网片孵化海水青鳉受精卵的方法(公告号：106172131A)”。前者通过设计了一款孵化箱，设置了1个控制仓和4个幼鱼仓，通过将鱼卵在不同鱼仓中培育，最终获取仔稚鱼。后者则通过将受精卵挂至网片上，然后放入循环水系统进行孵化。这两种孵化方法可以有效节水并获得仔稚鱼，但无论哪种方法都不可避免受精卵在孵化后期发黑、加厚、死亡。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供了一种海水青鳉受精卵孵化方法，本发明方法简单、高效，并能保持其较高的洁净度，便于胚胎学实验观察和显微注射等实验操作。
本发明所采用的技术解决方案如下：
一种海水青鳉受精卵孵化方法，所述方法具体如下：
(1)受精卵孵化的理化条件
温度26-28℃，湿度40-60％，光强80-125μmol·m-2·s-1，光暗比为14：10；
(2)盐度梯度稀释受精卵孵化过程
挑选正常受精的受精卵，将受精卵移至孵化容器中，用新鲜海水冲洗以去除受精卵上吸附的杂质，用盐度30±1‰的海水进行孵化，孵化密度在1-3egg/mL；
海水孵化24h后，将受精卵移至另一容器中继续孵化，孵化海水盐度调至20±1‰；
再次孵化24h后，将受精卵移至另一容器中进一步孵化，孵化海水盐度降为10±1‰；
孵化24h后，将受精卵移至另一容器静止孵化，此时的孵化水体为淡水，盐度为1‰；
在淡水中孵化至10-11天，观察到胚体在受精卵内有明显的翻转现象时，将受精卵快速移回至盐度10±1‰的海水中孵化，孵化4h后移至盐度20±1‰的海水中孵化，孵化4h后再次移至盐度30±1‰的海水中孵化，直至仔鱼破膜而出。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明方法能够获得清洁度高的受精卵，便于胚胎学实验观察和显微注射等实验操作，本发明方法受精卵的孵化率可高达94.7％。且孵化得到的海水青鳉仔鱼经过后续长期观察，能够正常发育、成长、繁殖，未发现有异常现象存在。
附图说明
图1是通过实施例1得到的清洁度高的海水青鳉受精卵观察图。
图2是普通海水孵化大量微藻黏附的海水青鳉受精卵观察图。
图3是普通海水孵化卵壳增厚变黑的海水青鳉受精卵观察图。
图4是通过实施例1得到的海水青鳉仔鱼观察图。
图5是普通海水孵化卵壳增厚，海水青鳉仔鱼缺氧死亡观察图。
具体实施方式
下面通过实施例结合实验图对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
一种高效海水青鳉(Oryzias melastigma)受精卵孵化方法，其特征在于：
所述孵化方法的理化条件如下：
实验海水取自野外无污染海水，使用前需经沉淀砂滤，脱脂棉过滤，盐度为30±1‰；孵化温度在26-28℃；空气湿度约为40-60％；孵化光强需偏大，80-125μmol·m-2·s-1更有利于受精卵的孵化；光照周期为14：10，早6点至晚8点为照明期。
所述盐度梯度稀释的受精卵孵化过程如下：
步骤一，将带卵的亲鱼放置铺有脱脂棉的培养皿中，用塑料吸管小心吸取受精卵，移至解剖镜下观察。将正常受精的受精卵挑选出来，移至500mL的1号烧杯中。再次使用吸管，吸取新鲜海水将受精卵冲洗1-2次，去除卵表面黏附的粪便、残饵等杂质。加入盐度30±1‰的海水进行孵化，海水需要经过脱脂棉过滤。孵化密度控制在1-3egg/mL较适宜，此孵化过程为24h；
步骤二，在水体盐度为30±1‰的1号烧杯中孵化24h后，用吸管将受精卵转移至2号烧杯中继续孵化，2号烧杯中盛有提前将盐度稀释至20±1‰的海水，稀释海水所用的淡水，需提前放置26-28℃的恒温室内预热方可使用；
步骤三，再次孵化24h后，将受精卵转移至3号烧杯中进一步驯化孵化，3号烧杯中盛有提前将自然海水盐度降至10±1‰的海水；
步骤四，在3号烧杯中孵化24h后，将受精卵移至4号烧杯中静止孵化，此时孵化水体为淡水，盐度约为1‰；
步骤五，在4号烧杯的淡水中孵化至11天(约265h，图1)，观察到胚体在卵内有明显的翻转现象时，尾部抖动频繁，将受精卵快速移回至3号烧杯(水体盐度为10±1‰)，4h后移至2号烧杯(水体盐度为20±1‰)，4h后再次移至1号烧杯(水体盐度为30±1‰)，直至仔鱼破膜而出(图4)。
通过本实施例，在实验所用受精卵全部正常受精的基础上，孵化率可高达94.7％。且孵化得到的海水青鳉仔鱼经过后续长期观察，能够正常发育、成长、繁殖，未发现有异常现象存在。
实施例2
纯海水孵化海水青鳉受精卵为对照组，孵化的理化条件与实施例1完全相同，孵化全程使用脱脂棉过滤的自然海水，盐度为30±1‰。在孵化后期存在大量受精卵被微藻黏附的现象(图2)，受精卵的卵壳增厚变黑，表面丝状物会黏附水体中的残饵、粪便等颗粒物(图3)，导致某些仔鱼在破膜而出时，仅尾部抖动钻出，头部卡在膜内，最终缺氧死亡(图5)。纯海水对照组的孵化率仅为67％左右，显著低于实施例1。与此同时，相对于实施例1的仔鱼几乎同步破壳孵化而言，纯海水对照组的受精卵孵化周期较长，胚胎发育延缓，仔鱼破壳而出所需时长明显延长，且不同步。
Claims (1)
1.一种海水青鳉受精卵孵化方法，其特征在于所述方法具体如下：
(1)受精卵孵化的理化条件
温度26-28℃，湿度40-60％，光强80-125μmol·m-2·s-1，光暗比为14：10；
(2)盐度梯度稀释受精卵孵化过程
挑选正常受精的受精卵，将受精卵移至孵化容器中，用新鲜海水冲洗以去除受精卵上吸附的杂质，用盐度30±1‰的海水进行孵化，孵化密度在1-3egg/mL；
海水孵化24h后，将受精卵移至另一容器中继续孵化，孵化海水盐度调至20±1‰；
再次孵化24h后，将受精卵移至另一容器中进一步孵化，孵化海水盐度降为10±1‰；
孵化24h后，将受精卵移至另一容器静止孵化，此时的孵化水体为淡水，盐度为1‰；
在淡水中孵化至10-11天，观察到胚体在受精卵内有明显的翻转现象时，将受精卵快速移回至盐度10±1‰的海水中孵化，孵化4h后移至盐度20±1‰的海水中孵化，孵化4h后再次移至盐度30±1‰的海水中孵化，直至仔鱼破膜而出。
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Effective date of registration: 20220317 Address after: No.7 Youyun Road, Laoshan District, Qingdao City, Shandong Province 266104 Patentee after: Shandong Academy of Marine Sciences (Qingdao National Marine Science Research Center) Address before: No.7 Youyun Road, Laoshan District, Qingdao City, Shandong Province 266104 Patentee before: Shandong Academy of Marine Sciences |