CN111089926A - 一种在线凝胶净化测定苯并[a]芘及其代谢产物的系统和方法 - Google Patents
一种在线凝胶净化测定苯并[a]芘及其代谢产物的系统和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111089926A CN111089926A CN201911111914.4A CN201911111914A CN111089926A CN 111089926 A CN111089926 A CN 111089926A CN 201911111914 A CN201911111914 A CN 201911111914A CN 111089926 A CN111089926 A CN 111089926A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- gel purification
- column
- phase extraction
- solid phase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N30/08—Preparation using an enricher
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种在线凝胶净化测定苯并[a]芘及其代谢产物的系统和方法,该方法具体为:制备好的样品进样后通过高效凝胶柱净化,切割待测成分流出的部分馏分,切割的馏分用稀释泵稀释降低馏分的溶剂强度,通过混合器混合后再通过固相萃取柱富集。样品富集完成后,通过阀切换,用分析泵流动相从和样品富集相反的流向把富集的成分洗脱下来,并通过超高效液相色谱柱分离、荧光检测器检测测定苯并[a]芘及其代谢产物的含量。本发明方法可同时实现样品的高效净化和固相萃取富集,方法的分析灵敏度大大提高,分析样品前处理得到了很大的简化,可准确测定血液尿液样品中ng/mL数量级的苯并[a]芘及其代谢产物含量。为吸烟与健康的相关性研究提供了灵敏、准确、可靠的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定苯并[a]芘及其代谢产物的系统,具体涉及一种在线凝胶净化测定苯并[a]芘及其代谢产物的系统,还涉及测定方法。
背景技术
苯并[a]芘(B[a]P)是毒性最强的多环芳烃类化合物;肿瘤流行病学调查及动物实验研究发现B[a]P具有较强致癌性,与肿瘤的发生密切相关,尤其与人类肺癌的发生高度相关。3-羟基苯并[a]芘(3-OHB[a]P)和1-羟基苯并[a]芘(1-OHB[a]P)作为B[a]P最为常见的稳定代谢物,常用作B[a]P的接触生物标志物,用于评价B[a]P的接触水平。同时苯并[a]芘是卷烟主流烟气中的重要有害成分,在卷烟抽吸的过程中有可能会随卷烟烟气进入人体,从而对吸烟者的健康造成影响,因此准确测定吸烟者尿液中的B[a]P及代谢物3-OHB[a]P和1-OHB[a]P对于进一步深入了解吸烟与健康具有重要意义。
关于B[a]P及其代谢产物3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的测定,由于3-OHB[a]P和1-OHB[a]P沸点高,用气相色谱法分析需复杂的衍生化,操作麻烦且分析结果的重现性差。由于液相色谱对于热不稳定的大极性成分能获得好的分析结果,目前液相色谱-质谱法和液相色谱荧光检测法已广泛应用于B[a]P及其代谢产物分析。在这些方法中,液相色谱-质谱法灵敏度高,但苯并[a]芘本身不易电离,用液相色谱-质谱分析需要用特殊检测器,方法普及性差。液相色谱荧光检测法仪器普及度高,运行成本低,但由于吸烟者体内的B[a]P及其代谢产物1-OHB[a]P、3-OHB[a]P的含量非常低,样品前处理需采用萃取或固相萃取富集和分离净化,处理过程需多次的浓缩、转移,操作麻烦,可引入实验误差的因素多;而且有机溶剂消耗大,对环境污染大。因此寻找更简便、快速的B[a]P及其代谢产物1-OHB[a]P、3-OHB[a]P测定方法非常迫切。
针对上述存在的技术问题,本发明中构建了一种在线凝胶净化,高效液相色谱测定吸烟者血液和尿液中B[a]P及其代谢产物1-OHB[a]P、3-OHB[a]P的新方法。在所述方法中,吸烟者血液和尿液样品可直接进样分析,大大简化了样品前处理操作步骤,提高了分析结果的精密度;该方法还能显著减少前处理过程中有机溶剂用量,大大降低了样品前处理过程中有机溶剂向环境中的散发,从而减少了样品处理过程中的环境污染。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足,提供一种吸烟者血液和尿液中在线凝胶净化测定苯并[a]芘及其代谢产物的方法,该方法能满足吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物快速、准确测定的要求,为吸烟与健康研究及卷烟烟气安全性评价提供了科学、简便的新方法。
除非另有说明,本发明所采用的百分数均为重量百分数。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的系统,包括凝胶净化系统和液相色谱分析系统,凝胶净化系统和液相色谱分析系统通过六通阀和固相萃取柱连接;凝胶净化流出馏分稀释泵与凝胶净化系统的三通阀连接;
样品分析时,通过凝胶净化系统进样器进样,用检测器指示待测组分的流出时间,待测组分通过三通阀切割,切割的组分经混合器混合,从六通阀进入,流经固相萃取柱,让待测组分富集在固相萃取柱上,同时通过凝胶净化流出馏分稀释泵对切割的组分进行稀释,以降低流动相的洗脱强度,保证待测组分在固相萃取柱上不被洗脱而完全富集在固相萃取柱上,经固相萃取捕集后的流动相流出进入废液;在该工作状态下,液相色谱分析系统的流动相直接进入废液;
待测组分切割、富集完成后,通过阀切换,凝胶净化系统的流动相通过三通阀进入废液。同时分析系统的流动相从六通阀的另一口进入,通过固相萃取柱,从和富集相反的流向把固相萃取柱上富集的待测组分洗脱下,再流出,进入液相色谱分析系统的分析柱分离,再经检测器检测确定待测成分含量。
本发明涉及的一种在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,包括如下步骤:
步骤(1),制备好的样品通过凝胶净化系统的进样器进样,再通过高效凝胶柱分离净化除去干扰成分,切割待测成分流出的部分馏分进行固相萃取富集;
步骤(2),切割将进入固相萃取柱的馏分用稀释泵稀释,以降低馏分的溶剂强度,然后通过固相萃取柱富集待测成分;
步骤(3),样品富集完后,通过阀切换,用分析泵流动相从和样品富集相反的流向把富集的成分洗脱下来,并通过超高效液相色谱柱分离、荧光检测器检测测定苯并[a]芘及其代谢产物的含量。
进一步地,分析样品制备时,血液和尿液样品采集后,准确移取的样品,用甲醇定容,使得甲醇的比例在50%以上,高速离心一段时间;取上层清液过滤,直接供样品分析用。
进一步地,在线凝胶净化时,进样体积为0.01~5.0mL;凝胶净化柱为安捷伦GP-104PL gel 104凝胶色谱柱;色谱柱为聚苯乙烯树脂型凝胶,纯甲醇为流动相,流速为2.0 mL/min;收集时间为14-18min。
进一步地,凝胶净化流出馏分稀释泵以2.0mL/min的流速输送水,通过混合器混合后再通过固相萃取柱,把固相萃取柱的流动相降为50%的甲醇。
进一步地,色谱分析时,分析柱为安捷伦Zorbax SB-C18,3.5*50 mm,1.8 µm,超高效液相色谱柱;流动相为68%的乙腈-水。
进一步地,制备好的样品进样体积为1.0~2.0 mL,甲醇为流动相,流速2.0 mL分离,检测波长280 nm;切割凝胶净化系的时间为14-18min部分流出馏分,用稀释泵以2.0mL/min的流速输送水稀释切割馏分,通过混合器混合后再通过固相萃取柱富集;样品富集完成后,通过阀切换,用分析泵以68%的乙腈-水溶液为流动相从和样品富集相反的流向把富集的成分洗脱下来,并通过安捷伦Zorbax SB-C18,3.5*50 mm,1.8 µm,超高效液相色谱柱分离,并通过荧光检测器检测;检测波长为:0~6.5 min激发波长365 nm,发射波长450nm;6.5~12.0 min激发波长 384 nm;发射波长406 nm;色谱分析时间为12 min。
进一步地,得到线性回归方程如下:
B[a]P的回归方程为:YA =2147 XC+151.8,线性范围为 16~1200 ng/L,r=0.9996,XC单位:ng/L;
3-OHB[a]P的回归方程为:YA = 1962 XC–89.3,线性范围为 20~850 ng/L,r=0.9998;XC单位:ng/mL;
1-OHB[a]P的回归方程为:YA =1674 XC+122.8,线性范围为22 ~900 ng/L,r=0.9996;XC单位:ng/L;其中: XC为浓度,YA为峰面积。
和常规分析分析装置相比,该装置中在凝胶净化系统和液相分析系统之间增加了在线固相萃取柱和凝胶净化流出馏分稀释泵。样品分析时,通过凝胶净化系统进样器进样,用检测器指示待测组分的流出时间,待测组分通过三通阀切割,切割的组分经混合器混合,从六通阀的7口进入,流经固相萃取柱,让待测组分富集在固相萃取柱上,同时通过稀释泵(泵2)对切割的组分进行稀释,以降低流动相的洗脱强度,保证待测组分在固相萃取柱上不被洗脱而完全富集在固相萃取柱上,经固相萃取捕集后的流动相经1口和6口流出进入废液。在该工作状态下,液相色谱分析系统的流动相直接进入废液。
待测组分切割、富集完成后,通过阀切换,凝胶净化系统的流动相通过三通阀进入废液。同时分析系统的流动相从六通阀的2口进入,通过固相萃取柱,从和富集相反的流向把固相萃取柱上富集的待测组分洗脱下,再从4口和3口流出,进色谱系统2的分析柱分离,再经检测器检测确定待测成分含量。
本发明中采用凝胶净化、反相液相色谱分离测定;凝胶色谱为尺寸排斥色谱,分离机制和反相色谱完全不同,通过两种不同介质色谱的结合,实现样品的高效净化和分离测定。
针对两级色谱之间直接切割会导致色谱峰变宽的问题,在凝胶净化系统和色谱分析系统之间增加了固相萃取柱,用于排掉凝胶净化系统的流动相,避免了大体积馏分切割造成的色谱峰扩宽,大幅度的提高检测灵敏度。
对于超低含量样品,可通过经凝胶净化的待测组分在固相萃取柱上累加到足够的量(多次进样累加富集),再经分析系统洗脱、分离,以实现超高灵敏的分析。
方法中设计了稀释泵,通过稀释泵降低了凝胶净化流出馏分对固相萃取组的洗脱强度,实现待测成分在固相萃取柱上的完全的完全保留。
线凝胶净化固相萃取和色谱分析两个系统均为独立的管路,互不交叉,可实现色谱分析和固相萃取富集同时进行,有效缩短了分析时间。
采用和样品富集相反的流向洗脱,可有效缩短洗脱路径,进一步避免色谱峰扩宽;采用超高效液相色谱分析,可有效缩短样品的分析时间,提高分析灵敏度。
上述装置中,由于通过固相萃取柱排掉了凝胶净化系统的流动相,凝胶净化系统的流动相不再进入分析系统,使凝胶净化系统和色谱分析系统之间流动相的兼容性大大提高。采用固相萃取柱富集,反方向洗脱的方式,和直接切割相比,即使大体积馏分切割进入二级色谱也不会造成色谱峰扩宽,可通过增加样品进样量大幅度的提高灵敏度。对于超低含量样品,还可通过经凝胶净化的待测组分在固相萃取柱上累加到足够的量(多次进样累加富集),再经分析系统洗脱、分离,实现超高灵敏的分析。
本发明的分析过程具体如下:
A、标准工作液的配制
本发明中的B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P标准样品购于(Aldrich, USA),纯度>98%。
先把标准品用甲醇配成三种成分浓度均分别为1.0 µg/mL的混合标准储备液;再用60%的甲醇配制成浓度分别为(10 ng/L、40 ng/L、80.0 ng/L、160.0 ng/L、320.0 ng/L、480.0 ng/L、800.0 ng/L、1200 ng/L)的系列标准溶液,供制作工作曲线用。
B、分析样品制备
由于苯并[a]芘及其代谢产物极性小,而血液和尿液样品均为水性,待测成分易在保存样品的容器壁上吸附;而且样品中存在大量活性酶,待测成分在酶的作用下会继续转化或分解,待测成分在样品中稳定性差。本发明中发现血液和尿液样品中加入甲醇同样具有很好的样品稳定效果,可有效避免待测成分在容器壁上的吸附和活性酶作用下继续转化和分解。试验了样品介质中不同比例的甲醇对样品稳定性的影响,实验结果表明:当样品介质中甲醇的比例在50%以上时,样品中的苯并[a]芘及其代谢产物即可保持稳定,在1周内变化率不超过5%。因此,本实验中选择样品取样后立即调节为60%的甲醇介质稳定样品。
具体操作为:血液和尿液样品采集后,准确移取4.0 mL的样品,用甲醇定容到10mL (控制样品介质的甲醇浓度为60%),20000 r/min高速离心10min;取上层清液过滤,直接供样品分析用。
C、在线凝胶净化
由于血液和尿液样品背景非常复杂,干扰物质非常多,不但含有蛋白质、酶、多肽等大分子成分,还含有大量尿酸、肌酐等小分子化合物。考虑到苯并[a]芘及其代谢产物与干扰成分分子量差别比较大;凝胶色谱为尺寸排斥色谱,不同组分可按分子量顺序得到分离,凝胶净化血液和尿液样品效果优于传统的柱层析和固相萃取净化,因此本发明中采用凝胶净化样品。
本发明中所述凝胶净化系统为安捷伦1260型高效液相色谱,配半制备型双环自动进样器(进样体积 0.01~5.0 mL)和二极管阵列检测器;凝胶净化柱为安捷伦GP-104 PLgel 104 (7.5*300 mm, 10 µm) 凝胶色谱柱。
本发明中采用安捷伦GP-104 PL gel 104 (7.5* 300 mm, 10 µm)高效凝胶柱作为净化柱,该色谱柱为聚苯乙烯树脂型凝胶,推荐采用纯甲醇作为流动相,流速为2.0 mL/min。凝胶净化系统的进样体积影响分析灵敏度和样品净化效果,增大进样体积有利于提高分析灵敏度,但需收集的馏分过宽,会导致切割引入的杂质增加,样品净化效果变差。综合样品净化效果和实际样品检测需到达的灵敏度考虑,本实验中选择凝胶净化系统的进样体积为1.0~2.0 mL。采用B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P混合标准品进行色谱分析标记适合的切割时间段。结果表明,在进样体积为2.0 mL时,苯并[a]芘及其代谢产物出峰时间为14.2~17.8 min之间(图-2),考虑到保留时间会有一定漂移,为保证待测组分能完全切割收集,因此本实验中适当扩宽可切割时间,选择收集时间为14.0 ~18 min。进一步采用实际样品(加入已知量的混合标样)进行了凝胶柱净化,结果表明该条件下实际样品具有很好的净化效果,而且待测组分能完全切割,加入的标准品回收率均在97%以上。
D、在线固相萃取富集
经过凝胶净化后的样品馏分,需通过在线固相萃取富集,把待测组分富集在固相萃取柱上,通过固相萃取柱排掉了凝胶净化系统的流动相,才能进入分析色谱分析。考虑到为了增加凝胶净化系统和分析色谱系统的互补性,本发明中分析色谱系统采用反相色谱,并选择安捷伦C18预柱 (3.5 *10 mm, 5 µm)为在线固相萃取柱。由于凝胶净化后流出的切割馏分为纯甲醇溶剂,对C18柱的洗脱强度很强,该条件下待测组分不能在固相萃取柱上保留,需用水稀释降低溶剂的洗脱强度才能让待测组分在固相萃取柱上完全保留。在本实验中,选择用稀释泵以2.0 mL/min的流速输送水,通过混合器混合后再通过固相萃取柱,把固相萃取柱的流动相降为50%的甲醇,这样B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P均能很好的保留在固相萃取柱上。采用B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P混合标准品进行了固相萃取回收率实验。结果表明:三种待测成分的固相萃取回收率在95.4~102.7%之间,具有很高的固相萃取回收率。
E、色谱分析
对于B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的色谱分离,本实验中选择安捷伦Zorbax SB-C18(3.5 * 50 mm, 1.8 µm)超高效液相色谱柱作为分析柱。在选定色谱柱的情况下,我们对流动相进行了优化。由于本方法采用荧光检测器检测,用甲醇作为流动相背景值高,因此采用乙腈-水作为流动相。试验了不同比例的乙腈和水作为流动相(包括梯度),结果表明:用梯度洗脱基线不平,会向上漂移;用等度洗脱基线相对平稳,用68%的乙腈-水溶液为流动相待测成分能达到基线分离且时间短,因此本实验选用68%的乙腈-水做为流动相。通过荧光检测器扫描可得苯并[α]芘的激发光谱和发射光谱图,B[a]P最大激发波长为384 nm,最大发射波长为406 nm,3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的最大激发波长均为365 nm,最大发射波长为450nm,因此本实验中选择荧光检测器采用程序波长检测,0 ~ 6.5 min激发波长 365 nm,发射波长450 nm;6.5 ~ 12.0 min激发波长 384 nm;发射波长406 nm;波长变化时色谱图基线会有跳跃,但不影响B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的积分。
在选定色谱条件下,标样和实际样品的色谱图见图-3。从图-3可看出,B[a]P、3-OHB[a]P、1-OHB[a]P能得到很好的分离。由于通过在线固相萃取柱排掉了一级色谱的流动相,即使在一级色谱大体积进样(进样体积达2.0 mL)的情况下,二级色谱中色谱峰也没有显著变宽,能保持很好的峰型。
F、样品分析流程的确定
在上述条件优化的基础上,确定了样品的分析流程。制备好的样品进样1.0~2.0 mL,以安捷伦GP-104 PL gel 104 (7.5 * 300 mm, 10 µm)高效凝胶柱作为净化柱,甲醇为流动相,流速2.0 mL分离,检测波长280 nm。切割凝胶净化系的时间为14.0 ~18 min部分流出馏分,选择用稀释泵以2.0 mL/min的流速输送水稀释切割馏分,通过混合器混合后再通过固相萃取柱富集。样品富集完成后,通过阀切换,用分析泵以68%的乙腈-水溶液为流动相从和样品富集相反的流向把富集的成分洗脱下来,并通过安捷伦Zorbax SB-C18 (3.5*50 mm,1.8 µm)超高效液相色谱柱分离,并通过荧光检测器检测。检测波长为:0~6.5 min激发波长365 nm,发射波长450 nm;6.5~12.0 min激发波长 384 nm;发射波长406 nm。色谱分析时间为12 min。
本发明中在线凝胶净化和样品分析均为独立的管路系统,互不交叉,可凝胶净化固相萃取富集和色谱分析同时进行。即在样品色谱分析的过程中,可进行下一个样品的凝胶净化和固相萃取富集,色谱分析完成并平衡色谱柱后,下一个样品的固相萃取富集也同时完成,立即可进行色谱分析,有效缩短了分析时间。
G、工作曲线、检测限和定量限
配制一系列标准溶液(10 ng/L、40 ng/L、80.0 ng/L、160.0 ng/L、320.0 ng/L、480.0ng/L、800.0 ng/L、1200 ng/L),进行HPLC分析,以标样峰面积(YA)和浓度(XC)进行线性回归,得到线性回归方程;B[a]P的回归方程为:YA =2147 XC (ng/L)+151.8,线性范围为16 ~1200 ng/L,r=0.9996;3-OHB[a]P的回归方程为:YA = 1962 XC (ng/mL) – 89.3,线性范围为 20 ~ 850 ng/L,r=0.9998。1-OHB[a]P的回归方程为:YA =1674 XC (ng/L)+122.8,线性范围为22 ~900 ng/L,r=0.9996。根据信噪比(S/N = 3)和(S/N = 10)分别得:B[a]P的检出限为 4.6 ng/L、定量限为16 ng/L,3-OH[a]P的检出限为 6.0 ng/L、定量限为20 ng/L,1-OH[a]P的检出限为 6.0 ng/L、定量限为22 ng/L。从上述结果可看出,方法灵敏度高,线性范围宽,不同浓度的各待测组分线性关系良好。
H、方法的回收率和精密度
为验证方法的精密度和回收率,按标准曲线浓度范围在实际血液或尿液样品中加入已知量的对照品。血液或尿液样品测定时每样准备相同样品4份,其中1份为参比,另3份分别加入已知量的标品(苯并[α]芘设10 ng/L、30 ng/L、50 ng/L三个添加量;样品按选定的样品前处理条件处理,并按选定色谱条件进样分析,通过加入标准的测出量除以标准加入量计算回收率;得B[a]P的回收率在92.2%-96.7%之间,3-OHB[a]P的回收率在93.5%-96.7%之间,1-OHB[a]P的回收率在92.8%-97.2%之间。说明方法回收率较好。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
A、本发明中采用凝胶净化、反相液相色谱分离测定吸烟者血液和尿液中的B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P。凝胶色谱为尺寸排斥色谱,分离机制和反相色谱完全不同,血液和尿液样品的净化效果优于传统的柱层析和固相萃取净化。
B、本发明针对两级色谱之间直接切割会导致色谱峰变宽的问题,在凝胶净化系统和色谱分析系统之间增加了固相萃取柱,通过固相萃取排掉了凝胶净化系统的流动相,即使凝胶净化后的大体积馏分切割进入色谱分析系统,也不会造成色谱峰扩宽,可通过增加样品进样量大幅度提高检测灵敏度。
C、对于超低含量样品,还可通过经凝胶净化的待测组分在固相萃取柱上累加到足够的量(多次进样累加富集),再经分析系统洗脱、分离,实现超高灵敏的分析。
D、为了让凝胶净化切割的馏分能更好的在固相萃取柱上保留,在本发明中还有针对性的设计了稀释泵,通过稀释泵降低了凝胶净化流出馏分对固相萃取组的洗脱强度,使待测的 B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P均能完全的保留在固相萃取柱上,有效解决了捕集凝胶净化切割出馏分中待测组分高效捕集的技术难题。
E、本发明在线凝胶净化固相萃取和色谱分析两个系统均为独立的管路,互不交叉,可色谱分析和固相萃取富集同时进行。即在样品色谱分析的过程中,可进行下一个样品的富集,色谱分析完成后,下一个样品的固相萃取富集也同时完成,立即可进行色谱分析;能有效缩短了分析时间。
F、本发明中采用从和样品富集相反的流向洗脱固相萃取柱,超高效液相色谱分析B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P。采用和样品富集相反的流向洗脱可有效缩短洗脱路径,避免色谱峰扩宽;采用超高效液相色谱分析可有效缩短样品的分析时间,提高分析灵敏度。
附图说明
图1为本发明中样品净化、富集状态下的装置的结构示意图;
图2为本发明中样品分析状态下的装置的结构示意图;
图3为凝胶净化流出组分的色谱图;
图4为实施例1的实际样品和标样的典型色谱图;其中,a、实际尿液样品;b、标样。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示,本实施例的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的系统,包括凝胶净化系统1和液相色谱分析系统5,凝胶净化系统1和液相色谱分析系统5通过六通阀2和固相萃取柱3连接;凝胶净化流出馏分稀释泵4与凝胶净化系统的三通阀1.5连接。
凝胶净化系统1包括进样器1.2,进样器1.2一端与第一泵1.1连接,另一端与净化柱1.3连接,净化柱1.3一端检测器1.4连接,检测器1.4一端与三通阀1.5一端连接,三通阀1.5的该端还与第二泵连接,第二泵为凝胶净化流出馏分稀释泵4,三通阀1.5的另外两端一端为废液出口,另一端连接混合器1.6。
六通阀2上设有七个口,分别为第一口至第七口,混合器一端与第七口连通。液相色谱分析系统5的第三泵5.3与第二口连通。第三口与液相色谱分析系统5的分析柱5.2连接,分析柱5.2与检测器5.1连接。固相萃取柱3两端与第一口和第四口连通。
如图2所示,样品分析时,通过凝胶净化系统1进样器1.2进样,用检测器1.4指示待测组分的流出时间,待测组分通过三通阀1.5切割,切割的组分经混合器混合,从六通阀2的第七口进入,通过第四口流经固相萃取柱3,让待测组分富集在固相萃取柱3上,同时通过上述稀释泵4对切割的组分进行稀释,以降低流动相的洗脱强度,保证待测组分在固相萃取柱上不被洗脱而完全富集在固相萃取柱3上,经固相萃取捕集后的流动相经第一口和第六口流出进入废液。在该工作状态下,液相色谱分析系统5的流动相直接进入废液。
待测组分切割、富集完成后,通过六通阀2切换,凝胶净化系统1的流动相通过三通阀2进入废液。同时分析系统5的流动相从六通阀的第二口进入,通过固相萃取柱3,从和富集相反的流向把固相萃取柱3上富集的待测组分洗脱下,再从第四口和第三口流出,进入液相色谱分析系统5的分析柱分离,再经检测器检测确定待测成分含量。
本实施例的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,按以下进行:
待测试样品为非吸烟者尿液样品。
制备好的样品进样1.0 mL,以安捷伦GP-104 PL gel 104 (7.5*300 mm,10 µm)高效凝胶柱作为净化柱,甲醇为流动相,流速2.0 mL进行分离;切割凝胶净化系的时间为14.0~18 min部分流出馏分,并用稀释泵以2.0 mL/min的流速输送水稀释切割的馏分,通过混合器混合后再通过固相萃取柱富集。样品富集完成后,通过阀切换,用分析泵以68%的乙腈-水溶液为流动相从和样品富集相反的流向把富集的成分洗脱下来,并通过安捷伦Zorbax SB-C18(3.5*50 mm,1.8 µm)超高效液相色谱柱分离,并通过荧光检测器检测。检测波长为:0~6.5 min激发波长365 nm,发射波长450 nm;6.5~12.0 min激发波长 384 nm;发射波长406nm。色谱分析时间为12 min。
B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的色谱峰积分后,根据峰面积从工作曲线计算含量,B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的含量分别为817.4、289.5、247.3 ng/L。
凝胶净化流出组分的色谱图如图3所示,实际样品和标样的典型色谱图如图4所示,其中,a、实际尿液样品;b、标样。
实施例2
本实施例的装置与实施例1的装置相同。
本实施例的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,按以下进行:
待测试样品为非吸烟者血液样品。
制备好的样品进样2.0 mL,以安捷伦GP-104 PL gel 104 (7.5*300 mm, 10 µm)高效凝胶柱作为净化柱,甲醇为流动相,流速2.0 mL进行分离;切割凝胶净化系的时间为14.0 ~18 min部分流出馏分,并用稀释泵以2.0 mL/min的流速输送水稀释切割的馏分,通过混合器混合后再通过固相萃取柱富集。样品富集完成后,通过阀切换,用分析泵以68%的乙腈-水溶液为流动相从和样品富集相反的流向把富集的成分洗脱下来,并通过安捷伦Zorbax SB-C18 (3.5*50 mm,1.8 µm)超高效液相色谱柱分离,并通过荧光检测器检测。检测波长为:0~6.5 min激发波长365 nm,发射波长450 nm;6.5~12.0 min激发波长 384 nm;发射波长406 nm。色谱分析时间为12 min。
B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的色谱峰积分后,根据峰面积从工作曲线计算含量,B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的含量分别为391.5、151.6、162.4 ng/L。凝胶净化流出组分的色谱图如图3所示。
实施例3
本实施例的装置与实施例1的装置相同。
本实施例的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,按以下进行:
待测试样品为轻度吸烟者尿液样品。
制备好的样品进样1.0 mL,以安捷伦GP-104 PL gel 104 (7.5*300 mm, 10 µm)高效凝胶柱作为净化柱,甲醇为流动相,流速2.0 mL进行分离;切割凝胶净化系的时间为14.0 ~18 min部分流出馏分,并用稀释泵以2.0 mL/min的流速输送水稀释切割的馏分,通过混合器混合后再通过固相萃取柱富集。样品富集完成后,通过阀切换,用分析泵以68%的乙腈-水溶液为流动相从和样品富集相反的流向把富集的成分洗脱下来,并通过安捷伦Zorbax SB-C18 (3.5*50 mm,1.8 µm)超高效液相色谱柱分离,并通过荧光检测器检测。检测波长为:0~6.5 min激发波长365 nm,发射波长450 nm;6.5~12.0 min激发波长 384 nm;发射波长406 nm。色谱分析时间为12 min。B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的色谱峰积分后,根据峰面积从工作曲线计算含量,B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的含量分别为881.8、330.5、224.2 ng/L。凝胶净化流出组分的色谱图如图3所示。
实施例4
本实施例的装置与实施例1的装置相同。
本实施例的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,按以下进行:
待测试样品为重度吸烟者血液样品。
制备好的样品进样2.0mL,以安捷伦GP-104 PL gel 104 (7.5*300 mm, 10 µm)高效凝胶柱作为净化柱,甲醇为流动相,流速2.0 mL进行分离;切割凝胶净化系的时间为14.0~18 min部分流出馏分,并用稀释泵以2.0 mL/min的流速输送水稀释切割的馏分,通过混合器混合后再通过固相萃取柱富集。样品富集完成后,通过阀切换,用分析泵以68%的乙腈-水溶液为流动相从和样品富集相反的流向把富集的成分洗脱下来,并通过安捷伦Zorbax SB-C18 (3.5*50 mm,1.8 µm)超高效液相色谱柱分离,并通过荧光检测器检测。检测波长为:0~6.5 min激发波长365 nm,发射波长450 nm;6.5~12.0 min激发波长 384 nm;发射波长406nm。色谱分析时间为12 min。
B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的色谱峰积分后,根据峰面积从工作曲线计算含量,B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的含量分别为420.8、170.2、121.9 ng/L。凝胶净化流出组分的色谱图如图3所示。
实施例5
本实施例的装置与实施例1的装置相同。
本实施例的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,按以下进行:
待测试样品为电子烟吸烟者血液样品。
制备好的样品进样2.0mL,以安捷伦GP-104 PL gel 104 (7.5*300 mm, 10 µm)高效凝胶柱作为净化柱,甲醇为流动相,流速2.0 mL进行分离;切割凝胶净化系的时间为14.0~18 min部分流出馏分,并用稀释泵以2.0 mL/min的流速输送水稀释切割的馏分,通过混合器混合后再通过固相萃取柱富集。样品富集完成后,通过阀切换,用分析泵以68%的乙腈-水溶液为流动相从和样品富集相反的流向把富集的成分洗脱下来,并通过安捷伦Zorbax SB-C18 (3.5*50 mm,1.8 µm)超高效液相色谱柱分离,并通过荧光检测器检测。检测波长为:0~6.5 min激发波长365 nm,发射波长450 nm;6.5~12.0 min激发波长 384 nm;发射波长406nm。色谱分析时间为12 min。
B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的色谱峰积分后,根据峰面积从工作曲线计算含量,B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的含量分别为411.9、210.0、147.2 ng/L。凝胶净化流出组分的色谱图如图3所示。
实际样品分析总结
采用实施例1-5的方法对吸烟者血液和尿液中的B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P进行测定,结果见表1。由表-1数据可知,不同吸烟者和对照相比血液和尿液样品中B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P含量明显差异。通过B[a]P的测定不能作为判断人体卷烟烟气暴露水平的依据。
表1 吸烟者尿液中B[a]P、3-OHB[a]P和1-OHB[a]P的测定结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的系统,其特征在于:包括凝胶净化系统和液相色谱分析系统,凝胶净化系统和液相色谱分析系统通过六通阀和固相萃取柱连接;凝胶净化流出馏分稀释泵与凝胶净化系统的三通阀连接;
样品分析时,通过凝胶净化系统进样器进样,用检测器指示待测组分的流出时间,待测组分通过三通阀切割,切割的组分经混合器混合,从六通阀进入,流经固相萃取柱,让待测组分富集在固相萃取柱上,同时通过凝胶净化流出馏分稀释泵对切割的组分进行稀释,以降低流动相的洗脱强度,保证待测组分在固相萃取柱上不被洗脱而完全富集在固相萃取柱上,经固相萃取捕集后的流动相流出进入废液;在该工作状态下,液相色谱分析系统的流动相直接进入废液;
待测组分切割、富集完成后,通过阀切换,凝胶净化系统的流动相通过三通阀进入废液。同时分析系统的流动相从六通阀的另一口进入,通过固相萃取柱,从和富集相反的流向把固相萃取柱上富集的待测组分洗脱下,再流出,进入液相色谱分析系统的分析柱分离,再经检测器检测确定待测成分含量。
2.一种在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,其特征在于:包括如下步骤:
步骤(1),制备好的样品通过凝胶净化系统的进样器进样,再通过高效凝胶柱分离净化除去干扰成分,切割待测成分流出的部分馏分进行固相萃取富集;
步骤(2),切割将进入固相萃取柱的馏分用稀释泵稀释,以降低馏分的溶剂强度,然后通过固相萃取柱富集待测成分;
步骤(3),样品富集完后,通过阀切换,用分析泵流动相从和样品富集相反的流向把富集的成分洗脱下来,并通过超高效液相色谱柱分离、荧光检测器检测测定苯并[a]芘及其代谢产物的含量。
3.根据权利要求2所述的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,其特征在于:分析样品制备时,血液和尿液样品采集后,准确移取的样品,用甲醇定容,使得甲醇的比例在50%以上,高速离心一段时间;取上层清液过滤,直接供样品分析用。
4.根据权利要求2所述的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,其特征在于:在线凝胶净化时,进样体积为0.01~5.0mL;凝胶净化柱为安捷伦GP-104 PL gel 104凝胶色谱柱;色谱柱为聚苯乙烯树脂型凝胶,纯甲醇为流动相,流速为2.0 mL/min;收集时间为14-18min。
5.根据权利要求2所述的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,其特征在于:凝胶净化流出馏分稀释泵以2.0mL/min的流速输送水,通过混合器混合后再通过固相萃取柱,把固相萃取柱的流动相降为50%的甲醇。
6.根据权利要求2所述的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,其特征在于:色谱分析时,分析柱为安捷伦Zorbax SB-C18,3.5×50 mm,1.8 µm,超高效液相色谱柱;流动相为68%的乙腈-水。
7.根据权利要求2所述的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,其特征在于:制备好的样品进样体积为1.0~2.0 mL,甲醇为流动相,流速2.0mL分离,检测波长280 nm;切割凝胶净化系的时间为14-18min部分流出馏分,用稀释泵以2.0 mL/min的流速输送水稀释切割馏分,通过混合器混合后再通过固相萃取柱富集;样品富集完成后,通过阀切换,用分析泵以68%的乙腈-水溶液为流动相从和样品富集相反的流向把富集的成分洗脱下来,并通过安捷伦Zorbax SB-C18,3.5×50 mm,1.8 µm,超高效液相色谱柱分离,并通过荧光检测器检测;检测波长为:0~6.5 min激发波长365 nm,发射波长450 nm;6.5~12.0 min激发波长 384 nm;发射波长406 nm;色谱分析时间为12 min。
8.根据权利要求2所述的在线凝胶净化测定吸烟者血液和尿液中苯并[a]芘及其代谢产物的方法,其特征在于:得到线性回归方程如下:
B[a]P的回归方程为:YA =2147 XC+151.8,线性范围为 16~1200 ng/L,r=0.9996,XC单位:ng/L;
3-OHB[a]P的回归方程为:YA = 1962 XC–89.3,线性范围为 20~850 ng/L,r=0.9998;XC单位:ng/mL;
1-OHB[a]P的回归方程为:YA =1674 XC+122.8,线性范围为22 ~900 ng/L,r=0.9996;XC单位:ng/L;其中: XC为浓度,YA为峰面积。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911111914.4A CN111089926B (zh) | 2019-11-14 | 2019-11-14 | 一种在线凝胶净化测定苯并[a]芘及其代谢产物的系统和方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911111914.4A CN111089926B (zh) | 2019-11-14 | 2019-11-14 | 一种在线凝胶净化测定苯并[a]芘及其代谢产物的系统和方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111089926A true CN111089926A (zh) | 2020-05-01 |
CN111089926B CN111089926B (zh) | 2022-12-06 |
Family
ID=70393223
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911111914.4A Active CN111089926B (zh) | 2019-11-14 | 2019-11-14 | 一种在线凝胶净化测定苯并[a]芘及其代谢产物的系统和方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111089926B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112083094A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-12-15 | 安徽国科检测科技有限公司 | 一种基于多次进样进行色谱柱上富集的分析方法 |
CN114509515A (zh) * | 2022-01-18 | 2022-05-17 | 常州大学 | 一种受污染水体中痕量亚硝胺类消毒副产物的检测方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011129827A1 (en) * | 2009-04-10 | 2011-10-20 | Waters Technologies Corporation | Apparatus and method for coupled lc-nmr analysis |
CN103063791A (zh) * | 2012-12-06 | 2013-04-24 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种同时测定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法 |
CN104977380A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-10-14 | 中国环境科学研究院 | 胎儿宫内多种污染物暴露水平的分析检测方法 |
CN109781876A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-05-21 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测吸烟者尿液中苯并[a]芘的方法 |
-
2019
- 2019-11-14 CN CN201911111914.4A patent/CN111089926B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011129827A1 (en) * | 2009-04-10 | 2011-10-20 | Waters Technologies Corporation | Apparatus and method for coupled lc-nmr analysis |
CN103063791A (zh) * | 2012-12-06 | 2013-04-24 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种同时测定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法 |
CN104977380A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-10-14 | 中国环境科学研究院 | 胎儿宫内多种污染物暴露水平的分析检测方法 |
CN109781876A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-05-21 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测吸烟者尿液中苯并[a]芘的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
FISCHER E 等: "Sensitive and selective determination of metabolically formed trans-dihydrodiols and phenols of benzo [a] pyrene in water and urine samples by HPLC with amperometric detection", 《FRESENIUS JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY》, vol. 360, 31 December 1998 (1998-12-31), pages 95 - 99 * |
司晓喜 等: "在线凝胶渗透色谱-固相萃取-气相色谱/质谱法测定吸烟者尿液中的苯并[a]芘", 《中国烟草学会2016年度优秀论文汇编——烟草工业主题》, 31 December 2016 (2016-12-31), pages 170 - 177 * |
孔维松 等: "新型前处理技术结合超高效液相色谱法测定吸烟者尿液中的苯并[a]芘及3-羟基苯并[a]芘的含量", 《理化检验(化学分册)》, vol. 54, no. 06, 31 December 2018 (2018-12-31), pages 621 - 626 * |
陈静 等: "全自动在线固相萃取-二维高效液相色谱与质谱联用测定辣椒油中苏丹红", 《分析化学》, 30 September 2013 (2013-09-30), pages 1418 - 1422 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112083094A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-12-15 | 安徽国科检测科技有限公司 | 一种基于多次进样进行色谱柱上富集的分析方法 |
CN114509515A (zh) * | 2022-01-18 | 2022-05-17 | 常州大学 | 一种受污染水体中痕量亚硝胺类消毒副产物的检测方法 |
CN114509515B (zh) * | 2022-01-18 | 2024-04-30 | 常州大学 | 一种受污染水体中痕量亚硝胺类消毒副产物的检测方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111089926B (zh) | 2022-12-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gündel et al. | High-performance liquid chromatographic method with fluorescence detection for the determination of 3-hydroxybenzo [a] pyrene and 3-hydroxybenz [a] anthracene in the urine of polycyclic aromatic hydrocarbon-exposed workers | |
Jen et al. | Simultaneous determination of uric acid and creatinine in urine by an eco-friendly solvent-free high performance liquid chromatographic method | |
Blanco et al. | Field sampling, preconcentration and determination of mercury species in river waters | |
Balinova | Solid-phase extraction followed by high-performance liquid chromatographic analysis for monitoring herbicides in drinking water | |
Liu et al. | Automated on-line liquid chromatography–photodiode array–mass spectrometry method with dilution line for the determination of bisphenol A and 4-octylphenol in serum | |
Cairns et al. | Speciation analysis of mercury in seawater from the lagoon of Venice by on-line pre-concentration HPLC–ICP-MS | |
CN105510483B (zh) | 一种全自动在线检测血清中全氟及多氟化合物的系统 | |
CN104330512B (zh) | 基于在线SPE的快速测定尿液中轭合态β-受体激动剂的方法 | |
CN103278589B (zh) | 一种挥发、半挥发性成分的检测方法及其装置 | |
Kataoka et al. | Determination of the oxidative stress biomarker urinary 8-hydroxy-2⿲-deoxyguanosine by automated on-line in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography tandem mass spectrometry | |
CN111089926B (zh) | 一种在线凝胶净化测定苯并[a]芘及其代谢产物的系统和方法 | |
CN110824077B (zh) | 一种基于固相萃取的液相-液相二维色谱测定nnk及其代谢物的系统和方法 | |
Swart et al. | Column switching in capillary liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the quantitation of pg/ml concentrations of the free basic drug tolterodine and its active 5-hydroxymethyl metabolite in microliter volumes of plasma | |
Takezawa et al. | Automatic semi-microcolumn liquid chromatographic determination of catecholamines in rat plasma utilizing peroxyoxalate chemiluminescence reaction | |
Pyrzynska et al. | On-line sorption-based systems for determination of cadmium with atomic spectrometry detectors | |
Bian et al. | Progress in the pretreatment and analysis of N-nitrosamines: an update since 2010 | |
Prados et al. | A fully automated HPLC method for the determination of catecholamines in biological samples utilizing ethylenediamine condensation and peroxyoxalate chemiluminescence detection | |
Zhang et al. | Evaluation of the oxidative deoxyribonucleic acid damage biomarker 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine in the urine of leukemic children by micellar electrokinetic capillary chromatography | |
KR101321034B1 (ko) | 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법 | |
Huclová et al. | Sequential injection extraction based on restricted access material for determination of furosemide in serum | |
Kelly et al. | Liquid-chromatographic measurement of nitrazepam in plasma. | |
KR101028042B1 (ko) | 생체 뇨 시료 내 휘발성 유기 화합물(voc) 대사체 분석 방법 | |
Rasmussen et al. | Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic determination of flumequine and oxolinic acid in salmon plasma | |
CN113155991A (zh) | 一种全自动在线萃取超高效液相色谱串联质谱联用快速测定水中磺胺类抗生素的方法 | |
Reh | Determination of digoxin in serum by on-line immunoadsorptive clean-up high-performance liquid chromatographic separation and fluorescence-reaction detection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |