CN111088172A - 一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法 - Google Patents

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Abstract

一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法，属于微生物技术领域。该稗草平脐蠕胞菌孢子是经过循环接种稗草种子8‑12次驯化培养得到。本发明方法提高了稗草平脐蠕胞菌孢子对多种稗草的致病性，尤其是对长芒稗、紫穗稗和湖南稗子的致病性增加明显。在驯化过程中没有显著改变孢子对主要作物的安全性，并对产孢和孢子的耐热性能和产孢特性没有显著影响。本发明产品在除草毒力上相比未经过驯化的稗草平脐蠕胞菌孢子具有更好的优势。

Description

一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法。
背景技术
水稻是重要的粮食作物，在生产过程中水稻产量和品质易受杂草的影响。目前生产上主要依赖化学除草剂防治。化学除草剂长期大量应用已造成稻田抗药性生物型杂草急剧增加，局部地区农田和水环境被污染，对环境和生态安全以及农业可持续发展构成潜在威胁。相反，微生物农药对环境友好，选择性强，可用于生产无公害食品等，是稻田化学除草的一种有效补充或替代，同时有利于保护稻区环境安全和生物多样性。
杂草病原菌是微生物除草剂主要来源之一，具有安全且不易产生抗药性等优点。迄今为止，我国尚未有商品化的微生物除草剂产品应用于稻田杂草防治。但文献报道有几种具有除草毒力的潜力菌株，包括画眉草弯孢菌(Curvulariaeragrostidis)、禾长蠕孢菌（Helminthosporiumgramineum）、新月弯孢菌(Culvularialunata) 、尖角突脐孢菌（Exserohilummonoceras）、齐整小核菌（Sclerotiumrolfsii）、和假隔链格孢菌(Nimbyaalternantherae)等。稗草平脐蠕胞菌（Bipolarisgraminus）是从自然感病的稗草植株上分离筛选到的除草毒力菌株，生产性状好、对稗草等稻田杂草具有高致病性，但田间除草毒力不能满足生产要求。本方法通过不断驯化的方法提高了稗草平脐蠕胞菌的致病性和除草毒性，以利于生产应用。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法。本发明产品增强除草毒力的稗草平脐蠕胞菌孢子经过循环接种稗草种子8-12次驯化培养得到，提高了稗草平脐蠕胞菌的致病性和除草毒力。
为了实现上述目的，采用以下技术方案：
一种增强除草毒力的稗草平脐蠕胞菌孢子，其特征在于该稗草平脐蠕胞菌孢子是经过循环接种稗草种子8-12次驯化培养得到。
所述的一种增强除草毒力的稗草平脐蠕胞菌孢子，其特征在于具体通过以下步骤得到：
（1）将稗草平脐蠕胞菌接种到PDA平板上，25℃-28℃黑暗倒置培养10-14d后，采用无菌0.05%Tween-20溶液洗脱孢子，配制成浓度1×105-5×105个/mL的孢子悬浮液，备用；
（2）将20-25g稗草种子置于三角瓶中，121℃灭菌30min，冷却后接种上一步骤得到的孢子悬浮液，进行25℃-28℃恒温黑暗培养10-12d，收集孢子悬浮液；
（3）重复步骤（2）8-12次，得到驯化后的孢子悬浮液；
（4）取步骤（3）得到的驯化后的孢子悬浮液50-100μL滴加到PDA平板上，采用接种环划线后，进行25℃-28℃恒温培养4-5d；
（5）挑选步骤（4）得到的平板上的稗草平脐蠕胞菌单菌落，取其边缘带有菌丝体的菌块，转接至新鲜PDB培养基内，25℃-28℃振荡培养3-4d后将菌丝体粉碎，制成菌悬液备用；
（6）以玻化微珠为底物基质，添加稗种豆粕粉混合培养基质、Na3PO4·12H2O、MgSO4和水，搅拌均匀后于121℃灭菌30min，得到培养基，冷却后接种步骤（5）所得到的菌悬液，搅拌均匀后25℃-28℃恒温黑暗培养12-14d，收集稗草平脐蠕胞菌孢子，配制得到0.05% Tween-20孢子悬浮液。
所述的一种增强除草毒力的稗草平脐蠕胞菌孢子，其特征在于所述步骤（6）中培养基中玻化微珠、稗种豆粕粉混合培养基质、Na3PO4·12H2O4g、MgSO4和水的质量比为140:100:4:2:800，所述稗种豆粕粉混合培养基质包括稗种粉、豆粕粉和稗草茎杆粉质量比为1:1:8。
所述的一种增强除草毒力的稗草平脐蠕胞菌孢子，其特征在于所述步骤（6）中所述菌悬液接种量为150～170g/L。
一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法，其特征在于将稗草平脐蠕胞菌孢子经循环接种稗草种子进行8-12次驯化，以增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力。
所述的一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）将稗草平脐蠕胞菌接种到PDA平板上，25℃-28℃黑暗倒置培养10-14d后，采用无菌0.05%Tween-20溶液洗脱孢子，配制成浓度1×105-5×105个/mL的孢子悬浮液，备用；
（2）将20-25g稗草种子置于三角瓶中，121℃灭菌30min，冷却后接种上一步骤得到的孢子悬浮液，进行25℃-28℃恒温黑暗培养10-12d，收集孢子悬浮液；
（3）重复步骤（2）8-12次，得到驯化后的孢子悬浮液；
（4）取步骤（3）得到的驯化后的孢子悬浮液50-100μL滴加到PDA平板上，采用接种环划线后，进行25℃-28℃恒温培养4-5d；
（5）挑选步骤（4）得到的平板上的稗草平脐蠕胞菌单菌落，取其边缘带有菌丝体的菌块，转接至新鲜PDB培养基内，25℃-28℃振荡培养3-4d后将菌丝体粉碎，制成菌悬液备用；
（6）以玻化微珠为底物基质，添加稗种豆粕粉混合培养基质、Na3PO4·12H2O、MgSO4和水，搅拌均匀后于121℃灭菌30min，得到培养基，冷却后接种步骤（5）所得到的菌悬液，搅拌均匀后25℃-28℃恒温黑暗培养12-14d，收集稗草平脐蠕胞菌孢子，配制得到0.05% Tween-20孢子悬浮液。
所述的一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法，其特征在于所述步骤（6）中培养基中玻化微珠、稗种豆粕粉混合培养基质、Na3PO4·12H2O4g、MgSO4和水的质量比为140:100:4:2:800，所述稗种豆粕粉混合培养基质包括稗种粉、豆粕粉和稗草茎杆粉质量比为1:1:8。
所述的一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法，其特征在于所述步骤（6）中所述菌悬液接种量为150～170g/L。
本发明具有以下有益效果：
本发明方法提高了稗草平脐蠕胞菌孢子对多种稗草的致病性，尤其是对长芒稗、紫穗稗和湖南稗子的致病性增加明显。在驯化过程中没有显著改变孢子对主要作物的安全性，并对产孢和孢子的耐热性能和产孢特性没有显著影响。本发明产品在除草毒力上相比未经过驯化的稗草平脐蠕胞菌孢子具有更好的优势。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
（1）将稗草平脐蠕胞菌接种在PDA平板上，28℃黑暗倒置培养14d后，用无菌0.05%Tween-20溶液洗下孢子，配成浓度为1×105个/mL孢子悬浮液。
（2）将25g无芒稗种子置于250mL三角瓶内，121℃灭菌30min，冷却后接种步骤（1）得到的孢子悬浮液，每瓶10mL，接种3瓶。
（3）将三角瓶置于培养箱内，28℃恒温黑暗培养10d后，收集孢子循环接种无芒稗种子10次进行驯化。
（4）取驯化10次后的孢子悬浮液50μL滴于PDA平板上，用接种环划线后，28℃恒温培养5d。
（5）挑选培养皿上划线培养出的稗草平脐蠕胞菌单菌落，取其边缘带有菌丝体的菌块，转接至新鲜PDB培养基内，28℃振荡培养3d后，将菌丝体粉碎制成菌悬液，转接至新鲜PDB培养基内，28℃振荡培养3d后，将菌丝体粉碎制成菌悬液备用。
（6）以140g玻化微珠为底物基质，添加100g稗种豆粕粉混合培养基质（稗种粉：豆粕粉：稗草茎杆粉质量比为1:1:8），4g Na3PO4·12H2O和2g MgSO4，800g水，搅拌均匀后于121℃灭菌30min，冷却后接种160g上述配制好的菌悬液至培养基内，搅拌均匀后，28℃恒温黑暗培养12d，收集驯化10次后的稗草平脐蠕胞菌孢子，配制成0.05%Tween-20孢子悬浮液。
（7）将驯化前的孢子接种在PDA培养基上，28℃恒温黑暗培养12-14d，收集稗草平脐蠕胞菌孢子，配制成未驯化0.05%Tween-20孢子悬浮液。
实施例2：驯化后的0.05%Tween-20孢子悬浮液对主要作物的安全性评价。
将水稻（秀水134、中早39、浙优18）、小麦、玉米、高粱、大豆、蚕豆、棉花和油菜分别在盆钵中育苗。在禾本科植物2叶1心和双子叶植物2片真叶时分别喷施驯化后和驯化前孢子悬浮液，每平方米接种孢子数为4×107。接种后置于培养箱内，28±0.5℃黑暗保湿(RH95%)培养24h，然后移入28±2℃的温室，前2d喷雾保湿。接种7d后调查发病情况。以未添加孢子的0.05%Tween-20溶液为负对照（作物不感病），以无芒稗为正对照（稗草感病），每个处理重复3次，实验结果如表1所示。
表1稗草平脐蠕孢菌经驯化后对主要作物安全性评价
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：NS表示不感病；LS表示轻度感病；HS表示高度感病。
由表1可见，相对驯化前菌株，稗草平脐蠕胞菌驯化10次的孢子悬浮液喷施叶片7d后，对无芒稗高度感病，对粳稻（秀水134）、籼稻（中早39）和杂交稻（浙优18）均安全，除了对高粱中度感病外，其它作物均不感病，表明驯化过程没有显著改变孢子对主要作物的安全性。
实施例3：驯化后的0.05%Tween-20孢子悬浮液对不同种类稗草致病性评价。
将无芒稗、孔雀稗、长芒稗、硬稃稗、水田稗、湖南稗子和紫穗稗种子催芽后分别种在盆钵中，2-3叶期时分别喷雾接种驯化10次后和驯化前的孢子悬浮液，每平方米接种孢子数为4×107。接种后置于培养箱内，28±0.5℃黑暗保湿(RH95%)培养24h，然后移入28±2℃的温室，前2d喷雾保湿。接种7d后调查发病情况。以未添加孢子的0.05%Tween-20溶液为对照，每个处理重复3次，结果如下表2所示。
表2稗草平脐蠕孢菌驯化后对不同稗草种类的致病性
Figure 310436DEST_PATH_IMAGE002
注：0-3表示病级，0=无病斑，1=不扩展小型病斑，2=轻到中等扩展病斑，3=大型病斑。
由表2可见，与驯化前菌株相比，稗草平脐蠕胞菌驯化10次的孢子悬浮液喷施7d后，对长芒稗、紫穗稗和湖南稗子的致病性均有所增加，驯化前分别为1-2级，驯化后对所有稗草均高度致病。表明驯化过程提高了孢子对这3种稗草的致病性。
实施例4：驯化后的0.05%Tween-20孢子悬浮液对无芒稗除草毒力评价。
将无芒稗种子催芽后播种于盆钵中，2-3叶期时分别对叶面喷施驯化后和驯化前的孢子悬浮液，每平方米分别接种孢子数为4×107、8×106、8×105。接种后置于培养箱内，28±0.5℃黑暗保湿(RH95%)培养24h，然后移入28±2℃的温室，前2d喷雾保湿。以未添加孢子的0.05%Tween-20溶液为对照，每个处理重复3次。7d后调查稗草感病情况，17d后调查稗草株高、干重，按下式计算稗草株高抑制率和干重抑制率。所有数据经DPS软件进行统计分析，实验结果如下表3所示。
株高（干重）抑制率（%）＝（对照调查值－处理调查值）/对照调查值×100%
表3稗草平脐蠕孢菌驯化后不同孢子剂量下杀草毒力
Figure DEST_PATH_IMAGE003
由表3可见，与驯化前菌株比，稗草平脐蠕胞菌驯化10次后，不同剂量孢子悬浮液喷施2-3叶期无芒稗，处理7d后稗草感病指数显著高于驯化前菌株，且喷施高剂量孢子悬浮液对无芒稗的株高、干重抑制率和死亡率显著高于低剂量孢子悬浮液处理。表明驯化过程提高了孢子对无芒稗的除草毒力。
实施例5：产孢特性
分别将驯化8次、10次和12次后的孢子制成0.05%Tween-20孢子悬浮液，各取100μL接种于PDA平板上，用玻璃涂棒涂布均匀，28℃恒温黑暗倒置培养14d。用直径7mm打孔器取6个菌块，置于100mL0.05%（W/V）Tween-20溶液中，分散均匀后在血球计数板下测定孢子浓度，计算产孢量（孢子个数/cm2），以驯化前菌株的孢子悬浮液作为对照，每个处理重复3次。所有数据经DPS软件进行统计分析，结果如下表4所示。
表4驯化对稗草平脐蠕孢菌孢子产量和孢子耐热性能的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE004
注：5%水平上，相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。
由表4可见，与驯化前菌株比，稗草平脐蠕胞菌驯化8次、10次和12次后在PDA平板上培养，孢子产量均无显著差异，表明驯化过程对菌株产孢特性没有显著影响。
实施例6：耐热特性
取驯化8次、10次和12次后的孢子悬浮液，50℃下放置24h后，各取100μL接种于PDA平板上，用玻璃涂棒涂布均匀，28℃恒温培养12h后，显微镜下镜检200个孢子，记数其中萌发的孢子数量，计算萌发率。以驯化前菌株孢子悬浮液为对照，每个处理重复3次。所有数据经DPS软件进行统计分析，实验结果如上表4所示。由表4可知，与驯化前菌株比，稗草平脐蠕胞菌驯化8次、10次和12次后在PDA平板上培养，受热处理后孢子萌发率均无显著差异，表明驯化过程对孢子耐热性能没有显著影响。
若实施例1中稗草平脐蠕胞菌孢子经过循环接种其他稗草种类的种子，经过驯化培养得到的孢子悬浮液，依然可以得到实施例2-6所得到的结论。

Claims (8)

1.一种增强除草毒力的稗草平脐蠕胞菌孢子，其特征在于该稗草平脐蠕胞菌孢子是经过循环接种稗草种子8-12次驯化培养得到。
2.如权利要求1所述的一种增强除草毒力的稗草平脐蠕胞菌孢子，其特征在于具体通过以下步骤得到：
（1）将稗草平脐蠕胞菌接种到PDA平板上，25℃-28℃黑暗倒置培养10-14d后，采用无菌0.05%Tween-20溶液洗脱孢子，配制成浓度1×105-5×105个/mL的孢子悬浮液，备用；
（2）将20-25g稗草种子置于三角瓶中，121℃灭菌30min，冷却后接种上一步骤得到的孢子悬浮液，进行25℃-28℃恒温黑暗培养10-12d，收集孢子悬浮液；
（3）重复步骤（2）8-12次，得到驯化后的孢子悬浮液；
（4）取步骤（3）得到的驯化后的孢子悬浮液50-100μL滴加到PDA平板上，采用接种环划线后，进行25℃-28℃恒温培养4-5d；
（5）挑选步骤（4）得到的平板上的稗草平脐蠕胞菌单菌落，取其边缘带有菌丝体的菌块，转接至新鲜PDB培养基内，25℃-28℃振荡培养3-4d后将菌丝体粉碎，制成菌悬液备用；
（6）以玻化微珠为底物基质，添加稗种豆粕粉混合培养基质、Na3PO4·12H2O、MgSO4和水，搅拌均匀后于121℃灭菌30min，得到培养基，冷却后接种步骤（5）所得到的菌悬液，搅拌均匀后25℃-28℃恒温黑暗培养12-14d，收集稗草平脐蠕胞菌孢子，配制得到0.05% Tween-20孢子悬浮液。
3.如权利要求2所述的一种增强除草毒力的稗草平脐蠕胞菌孢子，其特征在于所述步骤（6）中培养基中玻化微珠、稗种豆粕粉混合培养基质、Na3PO4·12H2O4g、MgSO4和水的质量比为140:100:4:2:800，所述稗种豆粕粉混合培养基质包括稗种粉、豆粕粉和稗草茎杆粉质量比为1:1:8。
4.如权利要求2所述的一种增强除草毒力的稗草平脐蠕胞菌孢子，其特征在于所述步骤（6）中所述菌悬液接种量为150-170g/L。
5.一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法，其特征在于将稗草平脐蠕胞菌孢子经循环接种稗草种子进行8-12次驯化，以增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力。
6.如权利要求5所述的一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）将稗草平脐蠕胞菌接种到PDA平板上，25℃-28℃黑暗倒置培养10-14d后，采用无菌0.05%Tween-20溶液洗脱孢子，配制成浓度1×105-5×105个/mL的孢子悬浮液，备用；
（2）将20-25g稗草种子置于三角瓶中，121℃灭菌30min，冷却后接种上一步骤得到的孢子悬浮液，进行25℃-28℃恒温黑暗培养10-12d，收集孢子悬浮液；
（3）重复步骤（2）8-12次，得到驯化后的孢子悬浮液；
（4）取步骤（3）得到的驯化后的孢子悬浮液50-100μL滴加到PDA平板上，采用接种环划线后，进行25℃-28℃恒温培养4-5d；
（5）挑选步骤（4）得到的平板上的稗草平脐蠕胞菌单菌落，取其边缘带有菌丝体的菌块，转接至新鲜PDB培养基内，25℃-28℃振荡培养3-4d后将菌丝体粉碎，制成菌悬液备用；
（6）以玻化微珠为底物基质，添加稗种豆粕粉混合培养基质、Na3PO4·12H2O、MgSO4和水，搅拌均匀后于121℃灭菌30min，得到培养基，冷却后接种步骤（5）所得到的菌悬液，搅拌均匀后25℃-28℃恒温黑暗培养12-14d，收集稗草平脐蠕胞菌孢子，配制得到0.05% Tween-20孢子悬浮液。
7.如权利要求5所述的一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法，其特征在于所述步骤（6）中培养基中玻化微珠、稗种豆粕粉混合培养基质、Na3PO4·12H2O4g、MgSO4和水的质量比为140:100:4:2:800，所述稗种豆粕粉混合培养基质包括稗种粉、豆粕粉和稗草茎杆粉质量比为1:1:8。
8.如权利要求5所述的一种增强稗草平脐蠕胞菌孢子除草毒力的方法，其特征在于所述步骤（6）中所述菌悬液接种量为150-170g/L。
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