CN111077198B - 基于sda的电化学发光适配体传感器及其三价砷离子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种三价砷离子的基于SDA的电化学发光适配体传感器,及利用该传感器进行三价砷离子检测的检测方法,所述传感器包括发夹DNA、负载发夹DNA的聚多巴胺纳米球、识别三价砷离子的适配体以及与适配体杂交的cDNA;所述发夹DNA的序列为:5'‑GCTGTAATACCAGCTTATTCAA CCTCAGCTTCGATATTTGTTATCGAAGC‑3';cDNA的序列为5'‑TTGAATAAGCTGGTATTACAGC‑3';本发明传感器中的发夹DNA可以省去引物‑模板比例的调节,确保有效的DNA扩增,另外,在ECL检测时可以避免电极的处理和探针的固定。
Description
技术领域
本发明涉及一种三价砷离子的基于SDA的电化学发光适配体传感器,及利用该传感器进行三价砷离子检测的检测方法。
背景技术
高灵敏度分析方法的开发在食品安全,临床诊断,环境分析和国土安全等许多领域都具有重要意义。为了达到这个目的,信号放大过程是关键的组成部分。聚合酶链反应(PCR)是一种经典的DNA扩增技术,已获得最广泛的应用。然而,PCR需要复杂的设备过程和复杂的热循环步骤,从而限制了其在资源有限的环境和现场分析中的应用。与复杂的PCR热循环不同,已经出现了几种可以在恒定温度下进行的等温扩增技术,作为信号扩增的有希望的替代方法,包括链置换扩增(SDA),解旋酶依赖性扩增(HDA)以及滚环放大扩增技术(RCA)。SDA于1992年提出并得到了改进,它依靠置换链的聚合酶和Nicking核酸内切酶的结合来产生单链DNA(ssDNA)的指数积累。由于其高效,适应性强,操作简单等特点,SDA结合了电化学分析,比色分析,荧光分析和化学发光分析等多种生物传感器的构建方法。电化学发光(ECL)是一种化学发光过程,由ECL活性物质在电极上的电化学反应触发。作为一种功能强大的分析工具,ECL由于其卓越的优势(包括高灵敏度,操作简单和可控制的发光)而被用于开发基于ECL SDA的传感器。但是,在这些ECL传感器中,标记的引物或报告DNA是必需的,这可能会增加传感器的成本。另外,一些复杂的操作是必不可少的,例如电极的处理和探针在电极上的固定。这些过程不仅费时,而且可能导致重现性差。因此,期望开发基于SDA的无固定化和无标记的ECL传感器。
砷是一种剧毒元素,广泛存在于环境中。由于其对细胞抗氧化机制的负面影响,砷会引起一系列健康问题,例如皮肤损伤,心脏病和癌症。在各种有机和无机砷化合物中,砷有四个氧化态,包括-3、0,+3和+5。其中,砷(As(III)为H3AsO3)被认为是该元素的最具毒性的形式,其毒性比砷(As(V))高约60倍。世界卫生组织已将饮用水中砷的最大污染物含量定为10ppb。鉴于其高毒性,已经为检测As(III)付出了巨大的努力。传统的砷分析方法包括原子荧光光谱法、原子吸收光谱法和电感耦合等离子体质谱法。尽管这些方法用于监测砷离子具有良好的灵敏度和准确性,但它们也面临一些缺点,例如笨重的设备,复杂的预处理过程以及高度专业的人员。作为替代识别元件,最近十年来,适体已引起更多关注。与抗体相比,适配体具有独特的优势,包括低成本,易于合成,保存和对常规技术的修饰,甚至适配体还可以识别多种金属离子。由于As(III)-适配体是体外选择的,因此开发了多种灵巧的检测策略来检测As(III),包括电化学、比色、荧光和表面增强拉曼散射。然而,据我们所知,尚无As(III)的基于ECL适配子的传感器的报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种三价砷离子的基于SDA的电化学发光适配体传感器,该传感器无固定化且无标记。
本发明的目的之二在于提供利用所述的电化学发光适配体传感器进行三价砷离子检测的检测方法。
本发明的目的之三在于提供一种三价砷离子的电化学发光检测试剂盒。
本发明的目的通过如下技术方案实现:
一种三价砷离子的基于SDA的电化学发光适配体传感器,它包括发夹DNA、负载发夹DNA的聚多巴胺纳米球(PDANS)、识别三价砷离子的适配体以及与适配体杂交的cDNA;
其中,所述发夹DNA的序列为:
5'-GCTGTAATACCAGCTTATTCAACCTCAGCTTCGATATTTGTTATCGAAGC-3';其3'端的TTCGATATTTGTTATCGAAGC为引发聚合反应的引物链区域,将折叠成发夹结构;其中间区域序列CCTCAGC包含Nicking核酸内切酶的识别位点;其5'端的序列GCTGTAATACCAGCTTATTCAA为单链结构域,是后续链置换过程的模板;
所述cDNA的序列为5'-TTGAATAAGCTGGTATTACAGC-3';cDNA与发夹DNA的单链结构域可杂交形成双链发夹结构;
所述适配体的序列为:
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3'。
一种利用所述的电化学发光适配体传感器进行三价砷离子检测的检测方法,它包括以下步骤:
1)配制溶液:利用二次蒸馏水分别溶解发夹DNA、cDNA、适配体、聚多巴胺纳米球、DNA聚合酶、Nicking核酸内切酶、dNTPs混合物以及Ru(phen)3 2+得到对应物质的水溶液;
2)制备反应液:
a.将等浓度的cDNA水溶液与适配体水溶液分别在95℃下保持5min,然后以0.1℃/s的速率退火至25℃,之后将退火后的cDNA水溶液与退火后的适配体水溶液等体积混合后,加入Tris-醋酸缓冲液;之后加入待测液,并在37℃下孵育30min;
b.将发夹DNA水溶液在95℃下保持5min,然后以0.1℃/s的速率退火至25℃,之后,加入PDANS水溶液,并在37℃下孵育30min;
c.将步骤b反应所得的溶液加入步骤a的溶液体系中,继续孵育30min;随后加入DNA聚合酶水溶液、Nicking核酸内切酶水溶液、dNTPs水溶液,再在37℃下再孵育1.5h;之后,将反应后所得的混合液进行4000rpm离心,再在搅拌下将Ru(phen)3 2+水溶液加入上清液中,得反应液;
3)ECL检测:将步骤2)所得的反应液倒入含有TPA的Tris-醋酸缓冲液中,得测试溶液,将ECL检测时所用的三电极系统浸入测试溶液中进行ECL检测,根据ECL检测时的ECL强度,实现对三价砷离子的定性定量检测;
其中,所述发夹DNA的序列为:
5'-GCTGTAATACCAGCTTATTCAACCTCAGCTTCGATATTTGTTATCGAAGC-3';
所述cDNA的序列为5'-TTGAATAAGCTGGTATTACAGC-3';
所述适配体的序列为:
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3';
所述Nicking核酸内切酶为Nb.BbvCI。
一种三价砷离子的电化学发光检测试剂盒,它包括发夹DNA、cDNA、适配体、聚多巴胺纳米球、DNA聚合酶、Nicking核酸内切酶、dNTPs混合物、Ru(phen)3 2+、二次蒸馏水、Tris-醋酸缓冲液以及三丙胺;
其中,所述发夹DNA的序列为:
5'-GCTGTAATACCAGCTTATTCAACCTCAGCTTCGATATTTGTTATCGAAGC-3';
所述cDNA的序列为5'-TTGAATAAGCTGGTATTACAGC-3';
所述适配体的序列为:
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3';
所述Nicking核酸内切酶为Nb.BbvCI;
所述Tris-醋酸缓冲液为0.1M pH7.4的缓冲液,且它包括0.1M Tris、0.08M醋酸、10mM NaCl以及0.1mM MgCl2。
较之现有技术而言,本发明的优点在于:
1.本发明的电化学发光适配体传感器具有以下几个优点:1)发夹DNA可以省去引物-模板比例的调节,确保有效的DNA扩增。2)在ECL检测时可以避免电极的处理和探针的固定。3)这种无固定化和无标记的电化学发光适配体传感器显示出较低的检测限(检出限可以达到1.2×10-3ppb),并可用于槐花水提物中或其他待测样品中As(III)的检测。4)该电化学发光适配体传感器还具有特异性好的优点,该传感器表现出对As(III)的高选择性。
2.本发明的检测方法,操作简单,避免了引物模板比的调整,提高了扩增效率,还减少了电极的处理和电极上探针的固定。该方法有望应用于食品污染、环境污染的检测。
附图说明
图1是本发明聚多巴胺纳米球(PDANS)的表征图。其中,图1中A为PDANS的SEM图像,B为PDANS的傅里叶变换红外光谱图。
图2是本发明电化学发光适配体传感器的砷(III)感测原理图。
图3是本发明电化学发光适配体传感器的可行性分析图。图3中A为具有与不具有靶标As(III)情况下,传感器的ECL信号图,且图A的曲线a为不存在As(III)时,传感器的ECL信号曲线,曲线b为存在As(III)时,传感器的ECL信号曲线。图3中B为不同酶对传感器ECL信号的影响图,且图B的曲线a为不存在As(III)的情况下,传感器的ECL信号曲线,曲线b为没有任何酶且As(III)存在下,传感器的ECL信号曲线,曲线c为具有DNA聚合酶且As(III)存在下,传感器的ECL信号曲线,曲线d为具有DNA聚合酶和Nb.BbvCI内切酶且As(III)存在下,传感器的ECL信号曲线。图3中C为SDA过程的PAGE结果,图C中泳带0:DNA标记物;泳带1:含有20ppb As(III);泳带2:2ppb As(III);泳带3:0.2ppb As(III);泳带4:0ppb As(III)。
图4是本发明检测方法的条件优化图。其中,图4的A为发夹DNA的剂量对荧光信号的影响曲线,B为不同浓度的DNA聚合酶和Nicking核酸内切酶作用下的ECL信号图,C为不同SDA反应时间的ECL信号图,D为不同Ru(phen)3 2+浓度的ECL信号图。
图5为不同浓度的As(III)的ECL谱图。图5中,曲线a到h As(III)的浓度分别为0ppb、0.002ppb、0.02ppb、0.2ppb、2ppb、20ppb、200ppb。
图6为ECL强度与As(III)浓度的对数之间的线性曲线。
图7为检测不同金属离子时传感器的ECL信号图。As(III)的浓度为2ppb(15nM),其他金属离子的浓度为200nM。直方图a到g分别代表As(III)、Ag+、Cd2+、Cu2+、Hg2+、Mn2+、Pb2+。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明:
一种三价砷离子的基于SDA的电化学发光适配体传感器,它包括发夹DNA、负载发夹DNA的聚多巴胺纳米球、识别三价砷离子的适配体以及与适配体杂交的cDNA;
其中,所述发夹DNA的序列为:
5'-GCTGTAATACCAGCTTATTCAACCTCAGCTTCGATATTTGTTATCGAAGC-3';其3'端的TTCGATATTTGTTATCGAAGC为引发聚合反应的引物链区域,将折叠成发夹结构;其中间区域序列CCTCAGC包含Nicking核酸内切酶的识别位点;其5'端的序列GCTGTAATACCAGCTTATTCAA为单链结构域,是后续链置换过程的模板;
所述cDNA的序列为5'-TTGAATAAGCTGGTATTACAGC-3';cDNA与发夹DNA的单链结构域可杂交形成双链发夹结构;
所述适配体的序列为:
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3'。
为了开发用于As(III)的无固定化和无标签的基于SDA的ECL传感器,本发明设计了精细的发夹DNA,将引物和模板整合在一起。该发夹DNA被限制在载体聚多巴胺纳米球(PDANS)上,目标As(III)的存在可以释放发夹DNA,并借助聚合酶和Nicking核酸内切酶诱导SDA过程。许多SDA产物与Ru(phen)3 2+相互作用,并且远离ITO电极表面,从而降低了ECL信号。该传感器的原理大致为:
无As(III)时,cDNA仅与适配体杂交,同时发夹DNA会受到聚多巴胺纳米球的约束,SDA过程受到抑制,作为ECL探针的游离状态下的Ru(phen)3 2+,因本身带正电,可以通过静电力结合的作用迅速扩散到带负电荷的ITO电极表面,产生强的ECL信号;
As(III)存在时,As(III)与适配体结合形成复合物并释放cDNA,释放的cDNA与发夹DNA的单链结构域杂交形成双链发夹结构,双链发夹结构从PDANS表面释放进入溶液,并在DNA聚合酶和Nicking核酸内切酶的帮助下触发SDA过程,生成大量dsDNA;Ru(phen)3 2+极易嵌入dsDNA的磷酸骨架中形成dsDNA-Ru(phen)3 2+复合物,由于dsDNA带有大量负电荷,在静电排斥作用下,该dsDNA-Ru(phen)3 2+复合物难以接近ITO电极表面,导致ECL响应低。
所述聚多巴胺纳米球可自行合成或通过商业渠道进行购买,本发明所用的聚多巴胺纳米球是本发明的发明人合成所得。
一种利用所述的电化学发光适配体传感器进行三价砷离子检测的检测方法,它包括以下步骤:
1)配制溶液:利用二次蒸馏水分别溶解发夹DNA、cDNA、适配体、聚多巴胺纳米球、DNA聚合酶、Nicking核酸内切酶、dNTPs混合物以及Ru(phen)3 2+得到对应物质的水溶液;
2)制备反应液:
a.将等浓度的cDNA水溶液与适配体水溶液分别在95℃下保持5min,然后以0.1℃/s的速率退火至25℃,之后将退火后的cDNA水溶液与退火后的适配体水溶液等体积混合后,加入Tris-醋酸缓冲液;之后加入待测液,并在37℃下孵育30min;
b.将发夹DNA水溶液在95℃下保持5min,然后以0.1℃/s的速率退火至25℃,之后,加入PDANS水溶液,并在37℃下孵育30min;
c.将步骤b反应所得的溶液加入步骤a的溶液体系中,继续孵育30min;随后加入DNA聚合酶水溶液、Nicking核酸内切酶水溶液、dNTPs水溶液,再在37℃下再孵育1.5h;之后,将反应后所得的混合液进行4000rpm离心,再在搅拌下将Ru(phen)3 2+水溶液加入上清液中静置10min,得反应液;
3)ECL检测:将步骤2)所得的反应液倒入含有TPA的Tris-醋酸缓冲液中,得测试溶液,将ECL检测时所用的三电极系统浸入测试溶液中进行ECL检测,根据ECL检测时的ECL强度,实现对三价砷离子的定性定量检测;
其中,所述发夹DNA、cDNA以及适配体的序列如上述所示;
所述Nicking核酸内切酶为Nb.BbvCI。
所述发夹DNA水溶液的浓度优选为1μM。
所述cDNA水溶液的浓度优选为5nM;所述适配体水溶液的浓度优选为5nM;所述聚多巴胺纳米球水溶液的浓度优选为90μg/mL。
所述DNA聚合酶水溶液的浓度优选为10U/μL。
所述Nicking核酸内切酶水溶液的浓度优选为7U/μL。
所述Ru(phen)3 2+水溶液的浓度优选为40μM。
所述Tris-醋酸缓冲液为0.1M pH7.4的缓冲液,且它包括0.1M Tris、0.08M醋酸(用来调pH值的)、10mM NaCl以及0.1mM MgCl2。
一种三价砷离子的电化学发光检测试剂盒,它包括发夹DNA、cDNA、适配体、聚多巴胺纳米球、DNA聚合酶、Nicking核酸内切酶、dNTPs混合物、Ru(phen)3 2+、二次蒸馏水、Tris-醋酸缓冲液以及三丙胺;
其中,所述发夹DNA、cDNA以及适配体的序列如上述所示;
所述Nicking核酸内切酶为Nb.BbvCI。
所述DNA聚合酶为exo-Klenow。
所述Tris-醋酸缓冲液为0.1M pH7.4的缓冲液,且它包括0.1M Tris、0.08M醋酸、10mM NaCl以及0.1mM MgCl2。
下面结合具体实施例对本发明作更细致的阐述:
1.1 材料和试剂:
所有合成的寡核苷酸均购自生工生物工程(上海)股份有限公司(中国上海)。
寡核苷酸的序列如下表1:
表1实验中的DNA序列
其中,发夹DNA可以组装形成茎环结构。带下划线的序列含有Nicking核酸内切酶的识别位点,带粗体的序列是随后链置换过程的模板。
DNA聚合酶、Nicking核酸内切酶(Nb.BbvCI)和dNTPs混合物(各2.5mM)购自NewEngland Biolabs(马萨诸塞州伊普斯维奇),Ru(phen)3 2+购自生工生物工程(上海)股份有限公司。所有试剂均为分析试剂级,用二次蒸馏水制备水溶液,即利用二次蒸馏水分别溶解发夹DNA、cDNA、适配体、聚多巴胺纳米球、DNA聚合酶、Nicking核酸内切酶、dNTPs混合物以及Ru(phen)3 2+得到对应物质的水溶液;所述二次蒸馏水已经用Milli-Q纯化系统纯化。
1.2 仪器和电极的预处理
在ECL检测系统(MPI-E,中国西安瑞迈电子仪器有限公司)上进行ECL测量。ECL检测的三电极系统包含一个Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参考电极,一个铂丝电极作为辅助电极,以及一个ITO工作电极作为工作电极。将ITO电极切成1cm×0.6cm的大小,并依次在三种溶液(alconox溶液、丙-2-醇和超纯水)中超声处理15分钟。最后,获得带负电的ITO工作电极。
1.3 PDANS的制备
在100毫升蒸馏水和40毫升异丙醇的混合液中加入100毫克盐酸多巴胺,搅拌60小时得到了黑色悬浮液。然后,将悬浮液离心并用水洗涤数次。沉淀(PDANS)被分散在水中,用于以下实验。
PDANS的表征:
图1A展示了PDANS的SEM图像。由图可见,所制备的PDANS显示出均匀的球形,平均直径为约200nm。从傅里叶变换红外光谱(图1B)可以看出,制备的PDANS在约3400cm-1、1600cm-1和1290cm-1处有几个吸收带,分别对应于酚类O-H、N-H、芳香环和酚类C-O的伸缩振动。这一红外光谱也证实了PDANS是一种富π的聚合物。
1.4 As(III)的识别与SDA反应
a.将5nM cDNA水溶液以及5nM适配体水溶液分别在95℃下保持5min,然后以0.1℃/s的速率退火至25℃,之后将退火后的cDNA水溶液与退火后的适配体水溶液等体积混合后,加入Tris-醋酸缓冲液,使整个混合溶液的总体积达100μL;之后加入待测液,并在37℃下孵育30min;
b.将50μL 1μM发夹DNA水溶液在95℃下保持5min,然后以0.1℃/s的速率退火至25℃,之后,加入50μL的90μg/mL PDANS水溶液,并在37℃下孵育30min;
c.将步骤b反应所得的溶液加入步骤a的溶液体系中,继续孵育30min,随后加入0.5μL exo-Klenow DNA聚合酶水溶液(10U/μL)、0.5μL Nb.BbvCI Nicking核酸内切酶水溶液(7U/μL)以及2μL dNTPs(各2.5mM),再在37℃下再孵育1.5h,之后,将反应所得的混合液4000rpm离心,再在轻微搅拌下将100μL浓度为40μM的Ru(phen)3 2+水溶液引入上清液中静置10min,得反应液。最后,将所得的反应液用于以下ECL检测。所述待测液可以为不同浓度的As(III)溶液或是任何一种待检测的溶液(如槐花的水提取液)。不同浓度的As(III)溶液可利用二次蒸馏水作为溶剂进行配置。
1.5 ECL检测
将1.4所得的反应液加入2mL含有20mM TPA的0.1M pH 7.4的Tris-醋酸缓冲液中,得测试溶液。
本发明所述传感器的感应原理如下:
本发明使用SDA作为扩增过程,构建了无标记和无固定化的As(III)ECL传感器。传感过程如图2所示。
首先,本发明设计了一个由三个结构域组成的整合发夹DNA,发夹DNA的3'端21-nt(TTCGATATTTGTTATCGAAGC)作为引发聚合反应的引物链区域,将折叠成发夹结构,发夹DNA的中间区域序列CCTCAGC包含Nicking核酸内切酶的识别位点,发夹DNA 5'端的序列GCTGTAATACCAGCTTATTCAA为单链结构域是后续链置换过程的模板。另一方面,相同浓度的cDNA和As(III)适配体混合并杂交以形成双链DNA。没有靶目标As(III)时,这种精心设计的整合发夹DNA通过π–π堆叠的方式锚定在PDANS上,并与cDNA和As(III)适配体形成的双链DNA共存于溶液中。
当溶液中存在As(III)时,靶目标靶标As(III)的添加将与适配体结合形成复合物并释放cDNA,接下来,释放的cDNA将与发夹DNA的单链结构域杂交以形成双链发夹结构。由于PDANS与双链DNA之间相互作用相较于单链DNA大为减弱,可视为发夹DNA被从PDANS表面移除进入溶液。此外,借助于DNA聚合酶和Nicking核酸内切酶,溶液中的DNA序列发生了SDA过程,通过链置换产生了大量完整的dsDNA。重新释放的cDNA将继续与PDANS上的发夹DNA杂交,以引发更多的SDA反应。结果,通过循环SDA过程,产生了许多dsDNA。实验引入ECL探针Ru(phen)3 2+,因Ru(phen)3 2+容易嵌入dsDNA凹槽,故而形成表面带大量负电荷磷酸骨架的dsDNA-Ru(phen)3 2+复合物。由于复合物和带负电荷的ITO电极之间存在静电排斥,使得复合物远离ITO电极表面,致使Ru(phen)3 2+无法靠近电极表面,从而导致弱的ECL信号。
但是,在不存在As(III)的情况下,cDNA仅与适配体杂交,而PDANS阻止了发夹DNA的酶消解。因此,生成的dsDNA很少,此时大多数游离的Ru(phen)3 2+将通过静电相互作用自由扩散到ITO电极的表面,从而产生强的ECL信号。
1.6 传感器的可行性
首先,本发明研究了该策略的可行性。图3A显示了具有和不具有靶标As(III)的传感器的ECL信号。在不存在As(III)的情况下,观察到明显的ECL信号(曲线a)。该现象归因于PDANS的保护,使得SDA过程受到抑制,因此游离的Ru(phen)3 2+可以自由扩散到ITO电极上。然而,溶液中添加2ppb的As(III)后,ECL响应明显降低(曲线b),这表明在SDA处理后会生成大量dsDNA,原本游离的Ru(phen)3 2+嵌入dsDNA中形成复合物,并且由于带负电的磷酸骨架产生的静电排斥作用而使得该复合物无法接近ITO电极,最终导致ECL信号的降低。
接下来研究了酶的扩增作用(图3B)。在没有DNA聚合酶和Nicking核酸内切酶的情况下,与空白(曲线a)相比,含有2ppb As(III)的溶液的ECL强度有所下降(曲线b),表明无酶的扩增作用时一个靶分子仅释放了一个适配体,此时溶液中生成的dsDNA较少。而当DNA聚合酶引入检测体系时,ECL信号明显下降(曲线c),表明该条件下溶液中产生了更多的dsDNA。一旦两种酶都存在,ECL信号就进一步衰减(曲线d),表明此时的溶液中产生了大量的dsDNA。此外,根据PAGE凝胶电泳的实验结果(图3C),在SDA处理后,在泳道中可以观察到清晰的具有完整dsDNA大小的DNA条带,并且随着As(III)浓度的增加,DNA条带的强度逐渐增加。(对应As(III)浓度:泳带1含有20ppb As(III),泳带2含有2ppb As(III),泳带3含有0.2ppb As(III))。而在对照泳道(4区)中观察不到明显的DNA条带。这些结果表明,这种无标记和无固定的SDA扩增策略可用于检测As(III)。
1.7 最佳条件的确定
为了获得可靠和准确的分析结果,我们进一步优化了相关实验条件。首先考察了发夹DNA在PDANS上的用量(如图4A所示)。将50μL不同浓度的FAM-发夹DNA添加到50μL的90μg/mL PDANS中。考虑到PDANS的猝灭作用,荧光信号在低浓度的FAM-发夹DNA处猝灭。一旦FAM-发夹DNA浓度超过1μM,就可以监测荧光信号,表明发夹DNA在PDANS上已饱和。因此,将1μM发夹DNA用于以下实验。
我们研究了酶浓度和SDA时间的作用。将DNA聚合酶和Nicking核酸内切酶的浓度设置为相等。图4B显示了在不同浓度的DNA聚合酶和Nicking核酸内切酶作用下的ECL信号。随着酶浓度的增加,ECL强度降低。一旦DNA聚合酶(曲线a)和Nicking核酸内切酶(曲线b)的浓度分别超过10U/μL和7U/μL,ECL强度就不再下降。因此,将10U/μLDNA聚合酶和7U/μLNicking核酸内切酶用于以下实验。接下来,研究SDA时间(图4C)。当反应时间从0增加到90分钟时,ECL强度降低。90分钟后,ECL强度趋于平稳值。因此,反应时间设定为90分钟。
我们还研究了Ru(phen)3 2+的浓度。如图4D所示,随着Ru(phen)3 2+浓度的增加,ECL强度逐渐增强。当浓度超过40μM时,ECL强度达到平稳状态,表明Ru(phen)3 2+的浓度达到饱和。因此,选择40μM的Ru(phen)3 2+。
1.8 对不同浓度的As(III)的检测
基于上述最佳条件,监测了不同浓度的As(III)。
配制As3+标准溶液,浓度分别为0ppb、0.002ppb、0.02ppb、0.2ppb、2ppb、20ppb以及200ppb。不同浓度的As3+标准溶液分别利用1.4、1.5所述的检测方法,进行检测。图5显示了不同浓度的As(III)时的ECL谱图。可以看出,随着As(III)浓度的增加,ECL信号逐渐降低。此外,注意到ECL信号与As(III)的浓度成正比,范围为(图6所示),线性方程为:
y=6456.90-1524.75x,R2=0.9920
其中y和x分别代表ECL强度和As(III)浓度的对数。根据3SD/斜率(SD代表空白样品的标准偏差7倍),As(III)的检出限为1.2×10-3ppb(约9.2pM),优于传统的检测方法。
1.9 特异性实验:
为了验证传感器的特异性,选择了各种金属离子作为干扰物,例如Ag+,Cd2+,Cu2+,Hg2+,Mn2+和Pb2+,这些离子的浓度均为200nM,而As(III)的浓度为2ppb(15nM),将含有这些离子的溶液分别利用1.4、1.5所述的方法检测。检测结果示于图7。如图7,所示在不存在As(III)的情况下,几乎没有观察到ECL的变化,但是在As(III)的存在下,ECL明显下降。这些结果表明该传感器表现出对As(III)的高选择性,这归因于适配体的高结合能力。
1.10 槐花中的分析方法(III)
槐花是中药,是槐花的干燥花蕾。槐花具有潜在的生物活性,包括抗癌,心血管保护,抗过敏和抗氧化作用。本发明将这种电化学传感器用于检测槐花中的As(III)的浓度。
将2g槐花与20mL H2O混合,回流20分钟。过滤后,用0.1M pH7.4的Tris-醋酸缓冲液将1mL的提取液稀释至1000mL,得稀释后的槐花萃取液。
取若干份稀释后的槐花萃取液,在所取的槐花萃取液中加入已知量的As(III),之后分别利用1.4、1.5所示方法进行进行检测,测试所得的ECL强度,分别代入1.8所得的线性方程中,计算出各溶液中As(III)的浓度,将计算出的As(III)的浓度与萃取液中实际加入的As(III)量,进行对比,得检测结果,检测结果显示在表2中,回收率在97%至113%之间。
从表2显示的结果可知,当向稀释后的槐花萃取液中加入1ppb的As(III)后,利用本发明的检测方法,检测得到的As(III)的浓度为0.97ppb,回收率为97%,同理,其他被测溶液的检测结果如表2所示。
表2槐花提取物中As(III)的含量测定
2.结论
本发明设计了一个精致的发夹DNA,其中包含SDA过程的引物和模板。使用这种特定的发夹DNA触发SDA过程,构建了具有高灵敏度和良好选择性的As(III)的无固定化和无标记的ECL传感器。该ECL传感器简化了SDA工艺的设计以及复杂的固定和修饰步骤,可用于通过更换不同的适体来测定食品污染物,环境污染物的方法。
序列表
<110> 福建中医药大学
<120> 基于SDA的电化学发光适配体传感器及其三价砷离子的检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gctgtaatac cagcttattc aacctcagct tcgatatttg ttatcgaagc 50
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ttgaataagc tggtattaca gc 22
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttttacagaa caaccaacgt 60
cgctccgggt acttcttcat cgagatagta agtgcaatct 100
Claims (10)
1.一种三价砷离子的基于SDA的电化学发光适配体传感器,其特征在于:它包括发夹DNA、负载发夹DNA的聚多巴胺纳米球、识别三价砷离子的适配体、与适配体杂交的cDNA、DNA聚合酶、Nicking核酸内切酶、dNTPs混合物以及Ru(phen)3 2+;发夹DNA被限制在载体聚多巴胺纳米球上,三价砷离子的存在释放发夹DNA,并借助DNA聚合酶和Nicking核酸内切酶诱导SDA过程, SDA产物与Ru(phen)3 2+相互作用,并且远离ITO电极表面,从而降低了ECL信号,实现三价砷离子的检测;
其中,所述发夹DNA的序列为:
5'-GCTGTAATACCAGCTTATTCAACCTCAGC TTCGATATTTGTTATCGAAGC-3';其3'端的TTCGATATTTGTTATCGAAGC为引发聚合反应的引物链区域,将折叠成发夹结构;其中间区域序列CCTCAGC包含Nicking核酸内切酶的识别位点;其5'端的序列GCTGTAATACCAGCTTATTCAA为单链结构域,是后续链置换过程的模板;
所述cDNA 的序列为5'-TTGAATAAGCTGGTATTACAGC-3'; cDNA与发夹DNA的单链结构域可杂交形成双链发夹结构;
所述适配体的序列为:
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3'。
2.一种利用权利要求1所述的电化学发光适配体传感器进行三价砷离子检测的检测方法,其特征在于:它包括以下步骤:
1)配制溶液:利用二次蒸馏水分别溶解发夹DNA、cDNA、适配体、聚多巴胺纳米球、DNA聚合酶、Nicking核酸内切酶、dNTPs混合物以及Ru(phen)3 2+得到对应物质的水溶液;
2)制备反应液:
a.将等浓度的cDNA水溶液与适配体水溶液分别在95°C下保持5min,然后以0.1°C /s的速率退火至25℃,之后将退火后的cDNA水溶液与退火后的适配体水溶液等体积混合后,加入Tris-醋酸缓冲液;之后加入待测液,并在37℃下孵育30min;
b.将发夹DNA水溶液在95°C下保持5min,然后以0.1°C /s的速率退火至25℃,之后,加入聚多巴胺纳米球水溶液,并在37℃下孵育30min;
c.将步骤b反应所得的溶液加入步骤a的溶液体系中,继续孵育30min;随后加入DNA聚合酶水溶液、Nicking核酸内切酶水溶液、dNTPs水溶液,再在37°C下再孵育1.5 h;之后,将反应后所得的混合液进行4000 rpm离心,再在搅拌下将Ru(phen)3 2+水溶液加入上清液中,得反应液;
3)ECL检测:将步骤2)所得的反应液倒入含有TPA的Tris-醋酸缓冲液中,得测试溶液,将ECL检测时所用的三电极系统浸入测试溶液中进行ECL检测,根据ECL检测时的ECL强度,实现对三价砷离子的定性定量检测;
其中,所述发夹DNA 、cDNA以及适配体如权利要求1所述;
所述Nicking核酸内切酶为Nb.BbvCI。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:所述发夹DNA水溶液的浓度为1μM。
4.根据权利要求2所述的检测的方法,其特征在于:所述cDNA 水溶液的浓度为5nM ;所述适配体水溶液的浓度为5nM;所述聚多巴胺纳米球水溶液的浓度为90μg/ mL。
5.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:所述DNA聚合酶水溶液的浓度为10 U/μL。
6.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:所述Nicking核酸内切酶水溶液的浓度为7 U /μL。
7.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:所述Ru(phen)3 2+水溶液的浓度为40μM。
8.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:步骤3)中进行ECL检测时,ECL分析仪的光电倍增管(PMT)在800V电压下运行;将三电极系统浸入测试溶液中,并通过扫描将电势范围设置为0〜1.4 V 、速率为100 mV / s。
9.一种三价砷离子的电化学发光检测试剂盒,其特征在于:它包括发夹DNA、cDNA、适配体、聚多巴胺纳米球、DNA聚合酶、Nicking核酸内切酶、dNTPs混合物、Ru(phen)3 2+、二次蒸馏水、Tris-醋酸缓冲液以及三丙胺;
其中,所述发夹DNA 、cDNA以及适配体如权利要求1所述;
所述Nicking核酸内切酶为Nb.BbvCI。
10.根据权利要求9所述的三价砷离子的电化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述DNA聚合酶为exo-Klenow。
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