CN111072683A - 香豆素类二聚体化合物、药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药物化学领域，具体提供了一种香豆素类二聚体化合物、药物组合物及其制备方法和用途，所述香豆素类二聚体化合物具有式I所示的结构，

本发明所提供的香豆素类二聚体化合物，能够显著改善Aβ_1‑42诱导的老年性痴呆模型的神经细胞损伤，而且能够提高神经营养因子表达，具有抗炎、抗氧化的作用，可用于血管性痴呆、血管性认知障碍、老年痴呆症(又称为阿尔茨海默症)、胆碱能神经退行病变、学习记忆能力减退等神经系统退行性疾病的预防和治疗。

Description

香豆素类二聚体化合物、药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及天然药物化学领域，具体涉及一种香豆素类二聚体化合物、药物组合物及其制备方法和用途。

背景技术

阿尔茨海默病(AD，老年痴呆症)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，是一种发病进程缓慢、随着时间不断恶化的持续性神经功能障碍，占痴呆症中60％-70％的成因，现在已成为21世纪人类健康最大的威胁之一。AD早期临床表现为难以记住最近发生的事情、进行性记忆力损伤、认知功能障碍、行为或性格的改变、日常生活障碍、轻微行为能力受损(Mild Behavioral Impairment,MBI)、对平日最喜欢的做的事情失去兴趣、对周围人或事物冷感、焦虑、无法控制冲动、多侵略性、对食物失去兴趣、事事疑心，经常突然性动怒爆粗话。随着全球经济和社会的不断发展，人们的物质生活有了很大的改善，近年来，人口老龄化进程加快，AD的患病率急剧上升。最新统计表明，全世界年龄超过60岁的人数约有4000万患有AD，另外每年有770万新增病例，因此AD已经成为全球一个重要的公共健康问题。但AD的病因至今仍然不明确。病理主要表现为细胞外的淀粉样斑块积聚(Amyloidβ，Aβ)、细胞内神经纤维缠结形成。目前为学术界较为公认的AD发病机制的假说主要是Aβ斑块级联假说。Aβ的毒性作用一直被认为是AD发病的主要病因之一。目前，临床上没有有效的治疗药物。多项针对Aβ途径的三期临床试验均宣告失败。因此寻找有效的防治AD的药物十分迫切。

三叉苦是芸香科(Rutaceae)吴茱萸属(Evodia)植物，主要分布于我国南部诸省及东南亚地区，是岭南常用中草药。《中药大辞典》记载其味苦，性寒，有清热解毒、祛风除湿的功效，主治咽喉肿痛、疟疾、黄疸型肝炎、风湿骨痛、湿疹、皮炎和疮疡等，也是广东地区凉茶的重要组分之一。并已经在三九胃泰、三九感冒灵、消结安胶囊等30多种成方制剂中得到广泛应用。

目前，三叉苦化学成分的研究报道较多，主要包括色稀、生物碱、黄酮等。在前人的研究基础之上，我们对三叉苦根部进行了抗老年痴呆活性先导化合物的研究，发现了一种具有显著活性的香豆素类二聚体化合物。

发明内容

因此，本发明的其中一个目的在于提供一种香豆素类二聚体化合物或其药学可接受的盐或溶剂合物，所述香豆素类二聚体化合物具有式I所示的结构，

本发明的另一个目的在于提供所述的香豆素类二聚体化合物或其药学可接受的盐或溶剂合物的制备方法，包括如下步骤：

1)取三叉苦，用有机溶剂经一次或多次提取，得到有机溶剂提取物；

2)将有机溶剂提取物用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收乙酸乙酯提取物；

3)将乙酸乙酯提取物经硅胶色谱柱分离，以环己烷/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，得到粗组分，再将所得粗组分经两次反向ODS柱层析、一次Sephadex LH-20柱层析，得到含香豆素类二聚体化合物的柱层析组分；

4)将含香豆素类二聚体化合物的柱层析组分用HPLC分离精制，制得式(I)所述的化合物；

进一步地，所述制备方法，还满足如下的(1)-(8)项中的至少一项；

(1)步骤1)中，所述有机溶剂选自正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、50％-95％的甲醇水溶液、乙醇、50-95％的乙醇水溶液中的至少一种；

(2)步骤1)中，所述提取为回流提取或者超声提取，优选回流提取，回流提物一次的时间为1-3h，次数为2-5次；

(3)步骤1)中，加入8-12倍三叉苦体积的有机溶剂；

(4)步骤1)中，所述有机溶剂提取物优选为将提取干燥后得到的浸膏；

(5)步骤3)中，两次反向ODS柱层析分离过程中，第一次反向ODS柱层析采用体积比为1：4→0：1的甲醇和水进行梯度洗脱；第二次反向ODS柱层析采用体积比为2：3→0：1的甲醇和水进行梯度洗脱；

(6)步骤3)中，硅胶色谱柱分离过程中，采用体积比为100：1→0：1的环己烷和乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱；

(7)步骤3)中，Sephadex LH-20柱层析分离过程中，采用甲醇或乙醇为洗脱剂进行洗脱；

(8)步骤4)中，HPLC分离精制过程中，采用体积百分数为50-75％的乙腈或者甲醇水溶液为流动相。

本发明还提供了一种提取物，包括所述的香豆素类二聚体化合物或其药学可接受的盐或溶剂合物。

本发明还提供了所述的提取物的制备方法，包括如下步骤：

1)取三叉苦，用有机溶剂经一次或多次提取，得到有机溶剂提取物；

2)将有机溶剂提取物用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收乙酸乙酯提取物，减压浓缩，即得。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含式(I)所示的香豆素类二聚体化合物或其药学可接受的盐或溶剂合物或者所述的提取物，以及任选的药学可接受的载体。

进一步地，以药物组合物的总质量计，所述香豆素类二聚体化合物的含量百分数为10wt％～50wt％。

进一步地，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、丸剂、注射剂、缓释制剂或者微粒给药系统。

所述的香豆素类二聚体化合物，所述的提取物或者所述的药物组合物在制备用于预防或治疗神经退行性疾病中的用途。

进一步地，所述神经退行性疾病是血管性痴呆、血管性认知障碍、老年痴呆、记忆力减退、脑组织退行性病变症候群或胆碱能神经退行性病变。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明所提供的香豆素类二聚体化合物，能够显著改善Aβ_1-42诱导的老年性痴呆模型的神经细胞损伤，而且能够提高神经营养因子表达，具有抗炎、抗氧化的作用，可用于血管性痴呆、血管性认知障碍、老年痴呆症(又称为阿尔茨海默症)、胆碱能神经退行病变、学习记忆能力减退等神经系统退行性疾病的预防和治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实验例1中细胞活力测试的结果示意图；

图2-3是本发明实验例1中神经营养因子测试的结果示意图，其中图2是BDNF mRNA水平结果示意图，图3是NGF mRNA水平结果示意图；

图4-8是本发明实验例1中氧化应激测试的结果示意图，其中图4是ROS水平结果示意图，图5是MDA水平结果示意图，图6是SOD活性结果示意图，图7是GSH-Px活性结果示意图，图8是CAT活性结果示意图；

图9-10是本发明实验例1中神经炎症测试的结果示意图，其中图9是IL-1β水平结果示意图，图10是IL-6水平结果示意图；

图11是本发明实施例1中式I化合物的高分辨质谱(HR-ESI-MS)图谱；

图12是本发明实施例1中式I化合物的¹H-NMR图谱(400MHz)；

图13是本发明实施例1中式I化合物的¹³C-NMR图谱(100MHz)；

图14是本发明实施例1中式I化合物的二维相核磁共振(COSY NMR)图谱；

图15是本发明实施例1中式I化合物的异核单量子相干核磁共振(HSQC NMR)图谱；

图16是本发明实施例1中式I化合物的¹H的异核多碳相关谱核磁共振(HMBC NMR)图谱；

图17是本发明实施例1中式I化合物的旋转坐标系NOE(ROESY NMR)图谱；

图18是本发明实施例1中式I化合物的气相ECD检测图谱。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。下述实验用三叉苦[Evodia lepta(Spreng.)Merr.]根采自广东省茂名市。

实验例1式1化合物

一、实验目的

采用造模剂Aβ_1-42(-淀粉样多肽(1-42))诱导的HT22细胞模型，研究式I所示的化合物的神经保护作用，以及氧化应激和炎症的影响，考察本发明式I所示的化合物的抗老年痴呆作用。

二、实验方法

1.实验材料

被测样品溶液的配制：采用下述实施例1分离精制的纯品式1化合物，精密称取适量式1化合物溶解于DMSO中，配制得30mM的母液，然后分别用DMEM培养液稀释成式1化合物的浓度分别为0.1μM、1μM、10μM、100μM的一系列待测样品溶液，供测试活性。

2.细胞系及细胞的传代培养

小鼠海马神经元HT22细胞购自ATCC细胞库。细胞的复苏：从液氮中取出冻存管，立即放入37℃水浴锅中迅速摇动至冻存液完全溶解，在5min内完成复温；在超净台中移入离心管，加入5mlDMEM培养液，混匀；400g，离心5min，弃上清；再在细胞沉淀中加入新的DMEM完全培养液，轻轻混匀，移入培养瓶内加足量DMEM培养液，放置37℃，5％的CO₂的培养箱中培养。

细胞的传代：用含10％灭活FBS的DMEM培养液在环境为37℃，含5％的CO₂细胞培养箱中培养HT22细胞，得到对数期HT22细胞。

3.活力测试方法

采用MTT方法测定细胞活力，将上述对数期的HT22细胞重悬后以5×10³个/孔接种于96孔板中培养24h，每孔200μL，分为样品组、空白对照组和模型组，其中，样品组每孔分别加入各组待测样品溶液20μL，空白对照组则每孔加入DMSO各20μL，继续37℃培养24h，样品组和模型组每孔均加入10μM的β-淀粉样多肽(1-42)，在37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱中继续培养24h。

然后将各个样品组、空白对照组和模型组的每孔均加入MTT14μL，再孵育3h，然后除去培养液，每孔加150μLDMSO在振荡器上振荡10min，使结晶物充分溶解。在振荡器上振荡混匀让还原产物充分溶解。选择570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(A值)，实验中各个浓度的样品组、空白对照组、模型组分别设六个平行孔，取A值平均值，按公式计算细胞活力，细胞活力比＝样品组A值或者模型组A值/空白对照组A值，每次实验重复三次。

4.qPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System，实时荧光定量核酸扩增检测系统)：按照上述步骤1制备式1化合物的浓度为10μM的待测样品溶液，按照步骤2和3的方法处理HT22细胞，并收集空白对照组、模型组和样品组细胞(10μM的待测样品溶液处理)在上述步骤(3)中加入MTT之前的细胞，使用RNeasy和SuperScript III ReverseTranscriptase试剂盒，提取细胞中的总RNA，并采用下述引物组利用实时荧光定量核酸扩增检测系统将RNA逆转录为cDNA，分别测定空白对照组、模型组和样品组细胞中β神经生长因子(Nerve growth factor beta，NGFβ)和脑源性神经营养因子(Brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)的含量。

引物序列如下：

β神经生长因子(Nerve growth factor beta，NGFβ)：

上游引物：5-′CAAGGACGCAGCTTTCTATACTG-3′：

下游引物：5′-CTTCAGGGACAGAGTCTCCTTCT-3′；

脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)：

上游引物：5′-TACTTCGGTTGCATGAAGGCG-3′；

下游引物：5′-GTCAGACCTCTCGAACCTGCC-3′；

β-肌动蛋白(β-actin)：

上游引物：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；

下游引物：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。

5.氧化应激测定：(1)活性氧(ROS)的含量测试：按照上述步骤1制备式1化合物的浓度为10μM的待测样品溶液，按照步骤2和3的方法处理HT22细胞，并收集空白对照组、模型组和样品组细胞(10μM的待测样品溶液处理)在上述步骤(3)中加入MTT之前的细胞，离心，使用DCFH-DA荧光探针方法(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分别测定空白对照组、模型组和样品组细胞中ROS的水平。(2)丙二醛(MDA)的含量测试：按照上述步骤1制备式1化合物的浓度为10μM的待测样品溶液，按照步骤2和3的方法处理HT22细胞，并收集空白对照组、模型组和样品组细胞(10μM的待测样品溶液处理)在上述步骤(3)中加入MTT之前的细胞，使用MDA试剂盒(南京建成)方法分别测定空白对照组、模型组和样品组细胞中MDA的水平。(3)超氧化物歧化酶(SOD)活性测试、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测试和过氧化氢酶(CAT)活性测试：按照上述步骤1制备式1化合物的浓度为10μM的待测样品溶液，按照步骤2和3的方法处理HT22细胞，并收集空白对照组、模型组和样品组细胞(10μM的待测样品溶液处理)在上述步骤(3)中加入MTT之前的细胞，分别使用SOD、GSH-Px、CAT酶活性试剂盒(南京建成)方法测定空白对照组、模型组和样品组细胞中SOD、GSH-Px、CAT的水平。

6.白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的测定：按照上述步骤1制备式1化合物的浓度为10μM的待测样品溶液，按照步骤2和3的方法处理HT22细胞，并收集空白对照组、模型组和样品组细胞(10μM的待测样品溶液处理)在上述步骤(3)中加入MTT之前的细胞，采用ELASA测定法，分别使用IL-1β、IL-6的ELISA试剂盒(Thermo Fisher Scientific)方法分别测定空白对照组、模型组和样品组细胞中IL-1β、IL-6含量。

7.统计分析：上述检测结果分别以空白样品组的含量为标准，各组测定结果分别除以空白样品组的测定结果，用X±SEM表示，待测样品组、模型组和空白对照组数据进行统计数据学分析，结果见图1-10所示，其中，与空白对照组相比有差异的上标*(p<0.05)，与空白对照组相比有显著性差异的上标**(p<0.01)，与模型组相比有差异的上标是#(p<0.05)，与模型组相比有显著性差异的上标是##(p<0.01)。

三、实验结果

1.细胞活力测试结果

结果见图1所示，式I所示的化合物的EC50浓度为37.7μM，相比于模型组，含有10μM、100μM的式I所示的化合物的样品组细胞活力明显提升，说明该化合物能够保护Aβ_1-42诱导的细胞损伤，且具有浓度依赖性，表明该化合物可能具有保护AD的作用。

2.神经营养因子测试结果

结果见图2-3所示，相比于模型组，含有式I所示的化合物的样品组的BDNF和NGFmRNA表达水平明显升高，表明该化合物能够明显提高Aβ_1-42诱导的BDNF和NGF mRNA表达水平，表明该化合物具有提高BDNF和NGF水平的作用。

3.氧化应激测试结果

结果见图4-8所示，相比于模型组，含有式I所示的化合物的样品组的ROS和MDA水平明显下降，抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT活性明显提升，表明该化合物能够明显缓解Aβ_1-42诱导的ROS和MDA水平的升高，同时能够提升Aβ_1-42诱导的抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT活性的下降，表明该化合物具有提高抗氧化能力的作用。

4.神经炎症测试结果

结果见图9-10所示，相比于模型组，含有式I所示的化合物的样品组的IL-1β和IL-6水平明显下降，表明该化合物能够缓解Aβ_1-42诱导的IL-1β和IL-6水平的升高。表明该化合物具有抗炎的作用。

综上所述，本发明所提供的式I所示的化合物对于Aβ_1-42诱导的老年性痴呆模型的神经细胞具有保护用，能够提高神经营养因子表达，而且具有抗炎、抗氧化的作用。

实施例1式I化合物或包含它的提取物的制备

(1)取三叉苦根，加入三叉苦根重量的12倍的体积比为70％的乙醇水溶液回流提取一次，热回流时间2h，收集乙醇提取液；残留的药渣加入三叉苦根重量的10倍的体积比为70％的乙醇水溶液回流提取一次，热回流时间2h，收集乙醇提取液；残留的药渣加入三叉苦根重量的8倍的体积比为70％的乙醇水溶液回流提取一次，热回流时间2h，收集乙醇提取液；合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得乙醇浸膏3kg。

(2)将乙醇浸膏3kg用适量蒸馏水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收乙酸乙酯萃取物(即本发明的提取物)。

(3)将乙酸乙酯萃取物上硅胶色谱柱分离，依次以环己烷/乙酸乙酯的体积比为100：1、5：1和0：1三个梯度进行洗脱，每500ml接受一个流份，共接收7个流份，分别记为Fr-1到Fr-7；

取Fr-5(为环己烷/乙酸乙酯的体积比为0：1的流份)进行第一次反向ODS柱层析分离，依次以甲醇/水＝1：4、1：2、1：1、0：1四个梯度进行洗脱，每500ml接受一个流份，共接收8个流份，分别记为Fr-5-1到Fr-5-8；

取Fr-5-4(为甲醇/水的体积比为1：1的流份)进行第二次反向ODS柱层析分离，依次以甲醇/水＝0：1、1：1、2：1三个梯度进行洗脱，每500ml接受一个流份，共接收6个流份，分别记为Fr-5-4-1到Fr-5-4-6；

取流份Fr-5-4-4(为甲醇/水的体积比为2：1的流份)经过一次Sephadex LH-20柱层析分离，以甲醇为洗脱剂洗脱，每500ml接受一个流份，共接收5个流份，分别记为Fr-5-4-4-1到Fr-5-4-4-5。

(4)取Fr-5-4-4-3用HPLC分离精制，采用体积份数为60％的乙腈水溶液为流动相，流速为7.0ml/min，检测波长为210nm、制得式(I)所述的化合物57mg。

实施例2式I化合物的表征

紫外光谱(UV)显示在297nm和326nm处有强吸收，说明该化合物为香豆素类化合物。高分辨质谱给出分子式C₂₈H₂₆O₇，[M+Na]⁺:497.1566(calcd 497.1576)，见图11。

化合物(I)在¹H-NMR谱(见图12)低场区显示一对香豆素骨架上的特征氢信号[δ_H6.20(1H,d,J＝9.4Hz,H-3),7.83(1H,d,J＝9.4Hz,H-4)]，以及一组ABX系统的氢信号[δ_H7.54(1H,d,J＝8.6Hz,H-5),7.09(1H,dd,J＝8.6,2.3Hz,H-6),7.32(1H,d,J＝2.3Hz,H-8)]，以及一对相互耦合的连氧质子信号[δ_H 6.24(1H,d,J＝2.3Hz,H-9),4.69(1H,d,J＝2.9Hz,H-10)]。同时，在¹³C-NMR谱中共显示28个碳信号，分别归属于两个香豆素单元，见表1。

化合物(I)在¹H-¹H COSY谱中(见图13)，可以观察到三组质子偶合系统，分别为：H₂-9 H-10，H-3H-4，H-9H-10。在HMBC谱中，显示δ_H 7.63(1H,s,H-4)与δ_C 140.1(C-9)相关，δ_H 3.20(2H,d,J＝7.4Hz,H₂-9)与δ_C 136.2(C-11)相关，δ_H 5.32(1H,m,H-10)与δ_C 17.9(C-12),25.9(C-13)相关。结合¹H-¹H COSY谱和HMBC谱的以上相关信号，将以上片段连接，说明结构中存在一个异戊烯基的片段，并且连接在香豆素母核的C-4位上。同时，在HMBC谱中还可以观察到δ_H 4.69(1H,d,J＝2.9Hz,H-10)与δ_C 26.7(C-12),24.6(C-13),125.5(C-6),165.8(C-7)相关，δ_H6.24(1H,d,J＝2.9Hz,H-9)与δ_C 71.8(C-11)相关，从而确定了另一个香豆素单元。此外，通过HMBC谱中的δ_H 6.24(1H,d,J＝2.9Hz,H-9)与δ_C160.8(C-7)的相关信号可以确定两个香豆素单元的连接方式，即C-7与C-9通过一个氧醚键连接，见图14-17。最后我们通过比较该化合物的计算ECD谱与实侧ECD谱确定了它的绝对构型，即9R,10R，命名为(-)-dievodialetin B，见图18。

表1化合物Ⅰ的¹H NMR和¹³C NMR数据(CD₃OD,J＝Hz)

制剂实验例1(注射剂的制备)

取采用上述实施例1得到的式I所示的化合物1000mg，加1000ml的注射用水，用碳酸钠调pH值至7，搅拌使溶解，除菌滤过，灌封，经100℃15分钟流通蒸汽灭菌，制成每支含式I化合物2mg/2ml的注射液供注射使用。

制剂实验例2(胶囊剂的制备)

按上述配方的重量称量实施例1得到的式I所示的化合物、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、十二烷基硫酸钠混合，采用辊压法进行干法制粒，再与硬脂酸镁混匀，填充入3#空心胶囊，制成规格为含式I化合物100mg/粒的胶囊剂供口服使用。

制剂实验例3(片剂)

按上述配方的重量称量实施例1得到的式I所示的化合物、淀粉、交联PVP、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁混合，加入适量5％PVP-乙醇溶液((乙醇与水的体积百分数为75：25))，制软材，以18目筛制粒，60℃干燥后1h，20目整粒后加入适量滑石粉，混匀，压片，制成规格为含式I化合物100mg/片的片剂供口服使用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种香豆素类二聚体化合物或其药学可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，所述香豆素类二聚体化合物具有式I所示的结构，

2.权利要求1所述的香豆素类二聚体化合物或其药学可接受的盐或溶剂合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取三叉苦，用有机溶剂经一次或多次提取，得到有机溶剂提取物；

2)将有机溶剂提取物用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收乙酸乙酯提取物；

3)将乙酸乙酯提取物经硅胶色谱柱分离，以环己烷/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，得到粗组分，再将所得粗组分经两次反向ODS柱层析、一次Sephadex LH-20柱层析，得到含香豆素类二聚体化合物的柱层析组分；

4)将含香豆素类二聚体化合物的柱层析组分用HPLC分离精制，制得式(I)所述的化合物；

3.根据权利要求2所述的香豆素类二聚体化合物或其药学可接受的盐或溶剂合物的制备方法，其特征在于，还满足如下的(1)-(8)项中的至少一项；

(1)步骤1)中，所述有机溶剂选自正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、50％-95％的甲醇水溶液、乙醇、50-95％的乙醇水溶液中的至少一种；

(2)步骤1)中，所述提取为回流提取或者超声提取，优选回流提取，回流提物一次的时间为1-3h，次数为2-5次；

(3)步骤1)中，加入8-12倍三叉苦体积的有机溶剂；

(4)步骤1)中，所述有机溶剂提取物优选为提取干燥后得到的浸膏；

(5)步骤3)中，两次反向ODS柱层析分离过程中，第一次反向ODS柱层析采用体积比为1：4→0：1的甲醇和水进行梯度洗脱；第二次反向ODS柱层析采用体积比为2：3→0：1的甲醇和水进行梯度洗脱；

(6)步骤3)中，硅胶色谱柱分离过程中，采用体积比为100：1→0：1的环己烷和乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱；

(7)步骤3)中，Sephadex LH-20柱层析分离过程中，采用甲醇或乙醇为洗脱剂进行洗脱；

(8)步骤4)中，HPLC分离精制过程中，采用体积百分数为50-75％的乙腈或者甲醇水溶液为流动相。

4.一种提取物，其特征在于，包括权利要求1所述的香豆素类二聚体化合物或其药学可接受的盐或溶剂合物。

5.权利要求4所述的提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取三叉苦，用有机溶剂经一次或多次提取，得到有机溶剂提取物；

2)将有机溶剂提取物用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收乙酸乙酯提取物，减压浓缩，即得。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的香豆素类二聚体化合物或其药学可接受的盐或溶剂合物或者权利要求4所述的提取物，以及任选的药学可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，以药物组合物的总质量计，所述香豆素类二聚体化合物的含量百分数为10wt％～50wt％。

8.根据权利要求6或7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、丸剂、注射剂、缓释制剂或者微粒给药系统。

9.权利要求1所述的香豆素类二聚体化合物，权利要求4所述的提取物或者权利要求6-8中任一所述的药物组合物在制备用于预防或治疗神经退行性疾病中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病为血管性痴呆、血管性认知障碍、老年痴呆、记忆力减退、脑组织退行性病变症候群或胆碱能神经退行性病变。

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