CN111065417A - 免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

用于预防和/或治疗院内感染的技术。

Description

免疫原性组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月23日提交的美国临时申请号62/524,315，和2018 年2月22日提交的美国临时申请号62/633,807的优先权和权益，其全部内容通过引用纳入本文。
现有技术
院内感染(也称为医院内获得性感染)是今日病人面临的主要问题。在美国183家医院进行的调查(Magill等，2014)中显示，在11，282 位患者中有452位患有一或多种医疗护理相关的感染(4.0％；置信区间为95％，3.7至4.4)。在504种这类的感染中，最常见的类型是肺炎(21.8％)、手术部位感染(21.8％)和胃肠感染(17.1％)。艰难梭菌 (Clostridiumdifficile)是最常被报告出来的病原体(引起12.1％的医疗护理相关感染)。在这类感染中占25.6％的装置相关感染(即中心静脉导管相关的血流感染、导管相关泌尿道感染和呼吸器相关肺炎)在传统上一直是预防医疗护理相关感染的项目重点。作者估计，在2011年在美国急症护理医院中共有648,000位患者，其中有721,800 例医疗护理相关感染(HAI)。
随着多重耐药性(MDR)细菌的剧增，已变得难以治疗院内感染。临床医师不得不求助于毒性更强而效果较差的抗生素。尽管如此，疾病控制与预防中心(CDC)估计每年因MDR细菌引起的感染导致约 23,000人死亡。
因此，仍然有对预防和/或治疗这类感染的有效技术的需求。
发明内容
本发明解决了缺乏用于预防和/或治疗院内感染的合适技术问题。此外，本发明解决了提供具有足够免疫原性的疫苗的攻击以实现免疫性和预防定殖。
此外，本发明提供了用于在有需要的患者群体中预防和/或治疗院内感染的组合物和方法。
此外，本发明提供了免疫原性组合物，其包括(例如)(i)主链聚合物，其包括聚合物和与该聚合物偶联的一或多种抗原性多糖；以及(ii)与该聚合物或抗原性多糖非共价复合的一或多种多肽抗原。
在一些实施方式中，免疫原性组合物可包括一或多种通过接头与聚合物偶联的抗原性多糖。在一些实施方式中，免疫原性组合物可包括一或多种在没有接头的情况下与聚合物偶联的抗原性多糖。在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖衍生自革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌。在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖衍生自克雷伯氏菌(Klebsiella)、假单胞菌(Pseudomonas)和/或大肠杆菌抗原性多糖。
在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖的免疫原性或调理作用潜能中的一或多种在用ELISA和/或用抗体功能测定法测量时相对于预定水平增加。在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖的免疫原性或调理作用潜能中的一或多种在用ELISA和/或用抗体功能测定法测量时相对于对照组合物增加。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该免疫原性组合物中的抗原性多糖且不包括存在于该免疫原性组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该免疫原性组合物中的抗原性多肽且不包括存在于该免疫原性组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该免疫原性组合物中的抗原性多肽和/或存在于该免疫原性组合物中的抗原性多糖，且不包括存在于该免疫原性组合物中的聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该疫苗组合物中的抗原性多糖且不包括存在于该疫苗组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该疫苗组合物中的抗原性多肽且不包括存在于该疫苗组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该疫苗组合物中的抗原性多肽和/或存在于该疫苗组合物中的抗原性多糖，且不包括存在于该疫苗组合物中的聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该医药组合物中的抗原性多糖且不包括存在于该医药组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该医药组合物中的抗原性多肽且不包括存在于该医药组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该医药组合物中的抗原性多肽和/或存在于该医药组合物中的抗原性多糖，且不包括存在于该医药组合物中的聚合物。
在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖的免疫原性或调理作用潜能中的一或多种在用ELISA和/或用抗体功能测定法测量时相对于预定水平增加至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。在一些实施方式中，该预定水平是免疫前水平。在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖的表位配价高于天然多糖至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
在一些实施方式中，该一或多种多肽抗原可以是用于一或多种抗原性多糖的载体蛋白。在一些实施方式中，当给予对象时，免疫原性组合物用ELISA测量以大于包括抗原性多糖而不包括该主链聚合物的组合物的水平，诱导该对象中的抗一或多种病原体的抗体产生。在一些实施方式中，当给予对象时，免疫原性组合物用ELISA 测量以大于包括多肽抗原而不包括该主链聚合物的组合物的水平，诱导该对象中的抗一或多种病原体的抗体产生。在一些实施方式中，该一或多种病原体选自克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌。在一些实施方式中，当给予对象时，免疫原性组合物引发对抗克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种的免疫反应。
在一些实施方式中，多肽抗原是或包括细菌多肽、真菌多肽、和/或病毒多肽、或其组合。在一些实施方式中，多肽抗原是或包括来自克雷伯氏菌、假单胞菌和/或大肠杆菌的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，多肽抗原是或包括衍生自克雷伯氏菌、假单胞菌和/或大肠杆菌多肽的多肽。
在一些实施方式中，聚合物是或包括多糖、多肽或合成树状聚合物。在一些实施方式中，聚合物大小是约50kDa至约2000kDa。在一些实施方式中，聚合物是或包括衍生自革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌的荚膜多糖。在一些实施方式中，荚膜多糖是或包括克雷伯氏菌荚膜多糖、假单胞菌胞外泌多糖和/或大肠杆菌荚膜多糖。在一些实施方式中，聚合物是或包括克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，聚合物是或包括线性聚L-赖氨酸，或L-赖氨酸的树状聚合物。在一些实施方式中，聚合物是或包括合成单糖或寡糖的树状聚合物。
在一些实施方式中，一或多种多肽抗原通过形成至少一互补亲和分子对而与聚合物和/或一或多种抗原性多糖非共价复合，所述互补亲和分子对包括：(i)第一亲和分子，其与该聚合物或该一或多种抗原性多糖结合；和(ii)互补亲和分子，其与一或多种多肽抗原结合。在一些实施方式中，该互补亲和分子对选自由以下组成的组：生物素/生物素结合蛋白、抗体/抗原、酶/底物、受体/配体、金属/金属结合蛋白、碳水化合物/碳水化合物结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、和 His标签/His标签结合分子。在一些实施方式中，该第一亲和分子是生物素或其衍生物。在一些实施方式中，该互补亲和分子是生物素结合蛋白或其生物素结合结构域。在一些实施方式中，该生物素结合蛋白是利查维啶(rhizavidin)、亲和素(avidin)、链霉亲和素 (streptavidin)、巴达维啶(bradavidin)、塔马维啶(tamavidin)、伦蒂维啶(lentiavidin)、西勃维啶(zebavidin)、中性亲和素(NeutrAvidin)、生物素连接蛋白(CaptAvidinTM)、或其组合。
在一些实施方式中，第一亲和分子交联或共价键合至该聚合物或该一或多种抗原性多糖上。在一些实施方式中，该第一亲和分子交联或共价键合至该主链聚合物的聚合物上。在一些实施方式中，该第一亲和分子交联或共价键合至该一或多种抗原性多糖上。在一些实施方式中，该第一亲和分子交联或共价键合至该主链聚合物的聚合物上和该一或多种抗原性多糖上。在一些实施方式中，该聚合物是或包括聚L-赖氨酸。在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖是或包括克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种的多糖。
在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖是或包括O1、O2、 O3、O5型或其组合的肺炎克雷伯氏菌OPS。在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖是或包括O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、 O11、O12型或其组合的铜绿假单胞菌OPS。在一些实施方式中，该抗原性多糖中的至少一种是或包括铜绿假单胞菌外泌多糖PsL。在一些实施方式中，该PsL是或包括至少一表位与单克隆抗体结合，该单克隆抗体包括与SEQ ID NO：4序列有至少80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO：5序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，至少一多肽抗原是或包括与SEQ ID NO：1序列(肺炎克雷伯氏菌第I型菌毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其免疫原性片段。在一些实施方式中，至少一多肽抗原是或包括与SEQ IDNO：2 序列(肺炎克雷伯氏菌保守III型菌毛蛋白MrkA)有至少80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列和/ 或与SEQ ID NO：3序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段。在一些实施方式中，至少一多肽抗原是或包括铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型A、铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B、或其免疫原性片段。在一些实施方式中，至少一多肽抗原是或包括与SEQ ID NO：6序列(铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型A1)有至少80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO：9 序列(铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型A2)有至少80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：7序列(铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B)有至少80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段。在一些实施方式中，至少一多肽抗原是或包括与 SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其免疫原性片段。
在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物是或包括：(a)主链聚合物，包括：(i)聚合物，其包括克雷伯氏菌种K19荚膜多糖；和 (ii)一或多种抗原性多糖，其包括与克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的克雷伯氏菌或假单胞菌的多糖；以及(b)一或多种多肽抗原，其通过形成至少一互补亲和分子对而与该聚合物非共价复合，所述互补亲和分子对包括：(i)第一亲和分子，其与该聚合物结合；和(ii)互补亲和分子，其与该一或多种多肽抗原结合。在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖是或包括O1、O2、O3、O5型或其组合的肺炎克雷伯氏菌OPS。在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖是或包括 O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型或其组合的铜绿假单胞菌 OPS。在一些实施方式中，该第一亲和分子是生物素或其衍生物且该互补亲和分子是或包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域。在一些实施方式中，该生物素结合蛋白是或包括利查维啶(rhizavidin) 或其生物素结合结构域。在一些实施方式中，该一或多种多肽抗原是或包括铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B的缺少TLR5结合基序的 D2结构域、铜绿假单胞菌PcrV、肺炎克雷伯氏菌MrkA、其抗原性片段、或其组合。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，该融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的FlaB鞭毛蛋白D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段；和(iii)包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列(肺炎克雷伯氏菌MrkA)有至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，该融合蛋白是或包括包括与SEQ ID NO：24序列(Rhavi-FlaB-结构域2-MrkA-His) 有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，该融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段；和(iii)包括与SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，融合蛋白是或包括包括与SEQ ID NO：26序列(Rhavi-FlaB-结构域2-PcrV-His)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
此外，本发明提供了疫苗组合物。在一些实施方式中，疫苗组合物可包括一或多种免疫原性组合物。在一些实施方式中，疫苗组合物可包括药学上可接受的运载体。
在一些实施方式中，疫苗组合物可包括以下的一或多种：(a)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种 K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(b)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(c)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(d)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，疫苗组合物可包括以下的一或多种：(a)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种 K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(b)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(c)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(d)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，疫苗组合物可包括以下的一或多种：(a)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种 K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(b)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(c)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(d)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(e)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(f)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(g)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(h)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，疫苗组合物可包括以下的一或多种：(a)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种 K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(b)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(c)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(d)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(e)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(f)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(g)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(h)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA 融合蛋白。
在一些实施方式中，疫苗组合物可包括以下的一或多种：(a)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种 K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(b)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(c)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(d)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(e)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(f)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(g)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(h)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(i)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(j)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(k)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(1)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA 融合蛋白。
在一些实施方式中，疫苗组合物可包括以下的一或多种：(a)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种 K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(b)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(c)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(d)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(e)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(f)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(g)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(h)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(i)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(j)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(k)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的 Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(1)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11 OPS、和与该生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA 融合蛋白。在一些实施方式中，该Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白是或包括包括与SEQID NO：24序列(Rhavi-FlaB-结构域2-MrkA-His)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，该Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白是或包括包括与SEQ ID NO：26序列(Rhavi-FlaB-结构域 2-PcrV-His)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，各免疫原性组合物的OPS以约1∶1的w/w比例存在。在一些实施方式中，各免疫原性组合物的主链聚合物以约1∶1 的w/w比例存在。在一些实施方式中，各免疫原性组合物的合并的 OPS与CPS以约1∶1的w/w比例存在。在一些实施方式中，各免疫原性组合物的OPS以约1μg存在。在一些实施方式中，各免疫原性组合物的主链聚合物以约1μg存在。在一些实施方式中，各免疫原性组合物的合并的OPS与CPS以约1μg存在。在一些实施方式中，各免疫原性组合物的OPS以约5μg存在。在一些实施方式中，各免疫原性组合物的主链聚合物以约5μg存在。在一些实施方式中，各免疫原性组合物的合并的OPS与CPS以约5μg存在。在一些实施方式中，该主链聚合物是或包括BP-1主链。在一些实施方式中，该主链聚合物是或包括BP-1.2主链。在一些实施方式中，该主链聚合物是或包括BP-2a 主链。在一些实施方式中，该主链聚合物是或包括BP-2b主链。该主链聚合物是或包括BP-3主链。
在一些实施方式中，一或多种多肽抗原是或包括一或多种铜绿假单胞菌蛋白或变体，且其中该互补亲和分子是或包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域。在一些实施方式中，所述多肽抗原中的至少一种是或包括与SEQ ID NO：7序列(铜绿假单胞菌FlaB鞭毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段。在一些实施方式中，所述多肽抗原中的至少一种是或包括与SEQ ID NO：6序列(铜绿假单胞菌 FlaA1鞭毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对是或包括融合蛋白，该融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与 SEQ ID NO：9序列(FlaA2鞭毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对是或包括融合蛋白，该融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与 SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的FlaB鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽、或包括与SEQ ID NO：11序列(缺少TLR5结合基序的FlaA1鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽、或包括与SEQ ID NO：12序列 (缺少TLR5结合基序的FlaA2鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对是或包括融合蛋白，该融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与 SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的FlaB鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对是或包括融合蛋白，该融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与 SEQ ID NO：11序列(缺少TLR5结合基序的FlaA1鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对是或包括融合蛋白，该融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与 SEQ ID NO：12序列(缺少TLR5结合基序的FlaA2鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对是或包括融合蛋白，该融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与 SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌第III型分泌系统(TTSS)PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对是或包括融合蛋白，该融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：7序列(铜绿假单胞菌F1iC鞭毛蛋白亚型B)有至少 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：8序列 (铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对是或包括融合蛋白，该融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对是或包括融合蛋白，该融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：7序列(铜绿假单胞菌FliC亚型B鞭毛蛋白)有至少 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：2或 SEQ ID NO：3序列(肺炎克雷伯氏菌MrkA)有至少80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对是或包括融合蛋白，该融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的铜绿假单胞菌FliC亚型B鞭毛蛋白D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列(肺炎克雷伯氏菌 MrkA)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
在一些实施方式中，至少一互补亲和分子对是或包括融合蛋白，该融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列(肺炎克雷伯氏菌MrkA)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
在一些实施方式中，当给予对象时，免疫原性组合物引发会识别表达MrkA的肺炎克雷伯氏菌上的天然MrkA的抗体。在一些实施方式中，当给予对象时，疫苗组合物是引发会识别表达MrkA的肺炎克雷伯氏菌上的天然MrkA的抗体。
在一些实施方式中，医药组合物包括一或多种本文中所述的免疫原性组合物或疫苗组合物。在一些实施方式中，医药组合物包括医药学上可接受的运载体。在一些实施方式中，医药组合物包括一或多种佐剂。在一些实施方式中，所述佐剂选自由以下组成的组：磷酸铝、氢氧化铝、磷酸化氢氧化铝、诸如TLR2皂素(QS21)或孔蛋白的TLR激动剂和诸如(例如)单磷酰脂A(MPL)的TLR4激动剂和诸如鞭毛蛋白的TLR5等。
在一些实施方式中，医药组合物经配制用于肌肉内、腹膜内、皮内和/或皮下给药。在一些实施方式中，医药组合物经配制用于注射。在一些实施方式中，当给予对象时，医药组合物引发Th1反应和 /或Th17细胞反应。在一些实施方式中，当给予对象时，医药组合物引发对抗克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种的调理反应/杀菌反应。在一些实施方式中，其中当给予对象时，医药组合物降低克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种在黏膜表面的穿透率和/或定殖率。在一些实施方式中，当给予对象时，医药组合物降低克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种在GI道的穿透率和/或定殖率。
一些实施方式提供对对象进行免疫接种以抗克雷伯氏菌感染的方法，其包括将有效量的本发明免疫原性组合物给予该对象。一些实施方式提供对对象进行免疫接种以抗克雷伯氏菌感染的方法，其包括将有效量的本发明疫苗组合物给予该对象。一些实施方式提供对对象进行免疫接种以抗克雷伯氏菌感染的方法，其包括将有效量的本发明医药组合物给予该对象。
一些实施方式提供对对象进行免疫接种以抗铜绿假单胞菌感染的方法，其包括将有效量的本发明免疫原性组合物给予该对象。一些实施方式提供对对象进行免疫接种以抗铜绿假单胞菌感染的方法，其包括将有效量的本发明疫苗组合物给予该对象。一些实施方式提供对对象进行免疫接种以抗铜绿假单胞菌感染的方法，其包括将有效量的本发明医药组合物给予该对象。
一些实施方式提供对对象进行免疫接种以抗大肠杆菌感染的方法，其包括将有效量的本发明免疫原性组合物给予该对象。一些实施方式提供对对象进行免疫接种以抗大肠杆菌感染的方法，其包括将有效量的本发明疫苗组合物给予该对象。一些实施方式提供对对象进行免疫接种以抗大肠杆菌感染的方法，其包括将有效量的本发明医药组合物给予该对象。
在一些实施方式中，当给予对象时，免疫原性组合物引发对抗革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌的免疫反应。在一些实施方式中，当给予对象时，疫苗组合物引发对抗革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌的免疫反应。在一些实施方式中，当给予对象时，医药组合物引发对抗革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌的免疫反应。在一些实施方式中，革兰氏阴性细菌选自克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌及其组合。在一些实施方式中，该免疫反应是抗体或B细胞反应。在一些实施方式中，该免疫反应是CD4+T细胞反应，包含Th1、Th2或Th17 反应，或CD8+T细胞反应，或CD4+/CD8+T细胞反应。在一些实施方式中，该免疫反应是抗体或B细胞反应；以及T细胞反应。
一些实施方式提供包括用本发明的免疫原性组合物进行免疫接种的哺乳动物中所产生的抗体的抗体组合物。一些实施方式提供包括用本发明的疫苗组合物进行免疫接种的哺乳动物中所产生的抗体的抗体组合物。一些实施方式提供包括用本发明的医药组合物进行免疫接种的哺乳动物中所产生的抗体的抗体组合物。在一些实施方式中，该抗体组合物包括至少一选自由单克隆抗体和抗个体遗传型抗体组成的组的抗体。在一些实施方式中，该抗体组合物包括分离的γ球蛋白部分。
在一些实施方式中，本发明提供从克雷伯氏菌的一或多种细胞组分纯化O-抗原多糖的方法，其中所述细胞组分包含蛋白质和/或核酸，该方法包括以下步骤：使一或多种细胞组分与氧化剂接触以得到混合物，其中该混合物的pH是约3和5之间；从所述细胞组分中分离出O-抗原多糖；以及提取OPS，其中该OPS基本上不含有其他细胞组分且在其还原末端含有游离醛。在一些实施方式中，所述氧化剂是亚硝酸钠，所述酸是乙酸，且其中所述OPS的还原末端是含有游离醛的2，5-脱水甘露糖残基。
在一些实施方式中，本发明提供从革兰氏阴性细菌的一或多种细胞组分纯化O-抗原多糖的方法，其中所述细胞组分包含蛋白质和/ 或核酸，该方法包括：使一或多种细胞组分与酸性试剂接触以得到混合物，其中该混合物的pH是约3和5之间；将该混合物加热至约80℃至约100℃之间；从所述细胞组分中分离出O-抗原多糖；以及提取 OPS，其中该OPS基本上不含有其他细胞组分且在其还原末端含有酮。
在一些实施方式中，本发明提供制备包括至少一非生物素化O- 抗原多糖的主链聚合物的方法，其中该O-抗原多糖包括伯氨基，和至少一生物素化多糖，该方法包括：通过将O-抗原多糖与含有醛基的部分氧化的多糖以及含有伯胺的生物素混合而使该O-抗原多糖伯氨基化学连接以得到混合物；且用还原剂还原胺化该混合物而产生 BP-1聚合物主链，其中该多糖是经生物素化的，而所述化学连接的 O-抗原多糖是非经生物素化的。一些实施方式提供由本文所公开方法制备的BP-1聚合物主链。
在一些实施方式中，本发明提供制备包括至少一非生物素化O- 抗原多糖的主链聚合物的方法，其中该O-抗原多糖包括伯氨基，和至少生物素化多糖，该方法包括：由将O-抗原多糖与经生物素化和氧化的多糖混合而使该O-抗原多糖伯氨基化学连接，所述经生物素化和氧化的多糖是先用1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳二亚胺(EDC)和 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和生物素酰肼处理多糖的羧酸盐基团，并接着用氧化剂处理多糖而获得；且用还原剂还原胺化该混合物而产生 BP-1.2聚合物主链，其中该多糖是经生物素化的，而所述化学连接的O-抗原多糖是非经生物素化的。在一些实施方式中，该O-抗原多糖上的伯氨基是铜绿假单胞菌OPS外核的L-丙氨酸α-氨基，或是通过用还原剂还原胺化使得在每个末端含有伯氨基的短间隔分子化学连接而已引入到O-抗原多糖的还原端的氨基。在一些实施方式中，用于氧化多糖的氧化剂是过碘酸钠，含有二胺的短间隔物是己二酸二酰肼，而还原胺化的还原剂是氰基硼氢化钠。一些实施方式提供由本文所公开方法制备的BP-1.2聚合物主链。
在一些实施方式中，本发明提供制备包括至少一非生物素化O- 抗原多糖的主链聚合物的方法，其中该O-抗原多糖包括伯氨基，和至少一生物素化多糖，该方法包括：由将O-抗原多糖与经生物素化和CDAP活化的多糖混合而使该O-抗原多糖伯氨基化学连接，所述经生物素化和CDAP活化的多糖是先用1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和生物素酰肼处理多糖的羧酸盐基团，并接着用CDAP活化该生物素化的多糖而获得，由此产生 BP-1.3聚合物主链，其中该多糖是经生物素化的，而所述化学连接的O-抗原多糖是非经生物素化的。在一些实施方式中，该O-抗原多糖上的伯氨基是铜绿假单胞菌OPS外核的L-丙氨酸α-氨基，或是通过用还原剂还原胺化使得在每个末端含有伯氨基的短间隔分子化学连接而已引入到O-抗原多糖的还原端的氨基。在一些实施方式中，含有二胺的短间隔物是己二酸二酰肼，而还原胺化的还原剂是氰基硼氢化钠。一些实施方式提供由本文所公开方法制备的BP-1.3聚合物主链。
在一些实施方式中，本发明提供制备包括至少一生物素化O-抗原多糖和至少一生物素化多糖的主链聚合物的方法，该方法包括：使在核部含有伯胺的O-抗原多糖化学连接，其是通过还原胺化作用将在各末端含有伯胺的短间隔物与O-抗原多糖连接以得到O-抗原多糖-间隔分子，或使用含有L-丙氨酸α-氨基的未衍生化的OPS；将含有伯胺的O-抗原多糖与部分氧化的多糖混合以得到混合物；还原胺化该混合物以形成OPS主链；以及用CDAP和含有伯胺的生物素将该混合物衍生化；由此形成主链聚合物，其中该多糖和化学连接的O- 抗原多糖经生物素化。一些实施方式提供由本文所公开方法制备的主链聚合物。
在一些实施方式中，本发明提供制备包括至少一生物素化O-抗原多糖和至少一非生物素化多糖的主链聚合物的方法，该方法包括：用CDAP和含有伯胺的生物素将包括一或多个核心KDO和/或庚糖部分的O-抗原多糖生物素化，以得到经生物素化的OPS混合物；用过碘酸钠将经生物素化的OPS混合物部分氧化，以将醛引入到所述核心 KDO和/或庚糖部分；用己二酸二酰肼将该生物素化混合物还原胺化；将经生物素化和胺化的OPS与部分氧化的多糖混合，以形成混合物；以及还原胺化该混合物；由此形成主链聚合物，其中该多糖未经生物素化而该化学连接的O-抗原多糖经生物素化。一些实施方式提供由本文所公开方法制备的主链聚合物。
在一些实施方式中，本发明提供制备包括至少一生物素化O-抗原多糖和PLL聚合物的主链聚合物的方法，该方法包括：用PLL聚合物的ε-NH2基团将含有末端醛或α KDO的O-抗原多糖还原胺化，以产生OPS PLL聚合物；用CDAP将OPS衍生化，以形成衍生混合物；使该衍生混合物与含有伯胺的生物素反应；以及用酰化剂处理或不处理该混合物，以加帽PLL聚合物的未反应的ε-NH2基团；由此制备主链聚合物，其中经加帽的N-酰化PLL主链或未经加帽的PLL未经生物素化，而该化学连接的O-抗原多糖经生物素化。在一些实施方式中，该酰化剂是醋酸酐或乙酰氯。在一些实施方式中，该还原剂是氰基硼氢化钠。一些实施方式提供由本文所公开方法制备的主链聚合物。
在一些实施方式中，本发明提供制备包括至少一非生物素化O- 抗原多糖的主链聚合物的方法，其中该O-抗原多糖在其还原末端包括叠氮基团，以及至少一含有炔基团的生物素化多糖，该方法包括：在催化剂的存在下使在还原端含有叠氮基团的O-抗原多糖与含有炔的生物素化多糖化学点击连接；由此形成OPS主链聚合物，其中该多糖经生物素化，但化学点击连接的O-抗原多糖未经生物素化。一些实施方式提供由本文所公开方法制备的主链聚合物。
在一些实施方式中，本发明提供制备包括至少一非生物素化O- 抗原多糖的主链聚合物的方法，其中该O-抗原多糖在其还原末端包括醛或酮基团，以及在催化剂的存在下使含有炔基团的生物素化多糖与小分子量化合物点击连接而得到的至少一含有伯氨基的生物素化多糖，所述小分子量化合物在一端含有叠氮且在另一端含有游离氨基，该方法包括：通过将O-抗原多糖与含有伯氨基的生物素化多糖混合并用还原剂还原胺化该混合物而化学连接所述含有醛或酮基团的O-抗原多糖；由此形成主链聚合物，其中该多糖经生物素化，但化学连接的O-抗原多糖未经生物素化。一些实施方式提供由本文所公开方法制备的主链聚合物。
在一些实施方式中，本发明提供制备包括至少一生物素化O-抗原多糖的主链聚合物的方法，其中该生物素化O-抗原多糖在其还原末端包括叠氮基团，以及至少一含有炔的非生物素化多糖，该方法包括：在催化剂的存在下使在还原端含有叠氮基团的生物素化O-抗原多糖与含有炔的非生物素化多糖化学点击连接；由此形成主链聚合物，其中该多糖非经生物素化，但化学点击连接的O-抗原多糖经生物素化。在一些实施方式中，用于经由炔-叠氮化物环加成使该O- 抗原多糖与该多糖点击连接的催化剂是硫酸铜。在一些实施方式中，使该多糖衍生化的炔基团选自由以下组成的组：1-氨基-3-丁炔、1- 氨基-4-戊炔、DBCO-胺和炔-PEG4-胺。在一些实施方式中，使多糖衍生化的叠氮基团选自由以下组成的组：叠氮基-PEG3-胺、叠氮基- 丙胺和叠氮基-丁胺。一些实施方式提供由本文所公开方法制备的主链聚合物。
在一些实施方式中，融合蛋白是或包括生物素结合结构域和多肽，该多肽是或包括与SEQ ID NO：16至26中的任一种序列有至少 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白是或包括生物素结合结构域和多肽，该多肽是或包括与SEQ ID NO：1至3或6至26中的任一种序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种制备变体MAPS的方法包括将本文中所描述的至少一主链聚合物与本文中所描述的融合蛋白中的至少一种复合。在一些实施方式中，该变体MAPS是BP-1MAPS、BP-1.2 MAPS、BP-1.3MAPS、BP-2a MAPS、BP-2b MAPS或BP-3MAPS。
在一些实施方式中，一种评估本文中所描述的免疫原性组合物的免疫原性的方法，包括使用包含B细胞和T细胞反应的一或多种体外生物测定法来评估、测量、和/或比较免疫反应，诸如通过ELISA 的抗体水平、通过FC的功能性抗体水平、OPK和其他功能性测试如凝集作用、移动性、细胞毒性、Th1/Th17细胞和细胞因子水平、和院内疾病(肺炎、败血症、烧烫伤、GI和手术部位感染)的体内测定法，诸如对于所述免疫原性组合物的靶标院内病原体的攻击后的细菌清除、被动和主动保护。在一些实施方式中，该免疫反应与对照组合物比较。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该免疫原性组合物中的抗原性多糖且不包括存在于该免疫原性组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该免疫原性组合物中的抗原性多肽且不包括存在于该免疫原性组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该免疫原性组合物中的抗原性多肽其/或存在于该免疫原性组合物中的抗原性多糖，且不包括存在于该免疫原性组合物中的聚合物。
在一些实施方式中，一种评估本文中所描述的免疫原性组合物的效价的方法，包括使用包含B细胞和T细胞反应的一或多种体外生物测定法来评估、测量、和/或比较免疫反应，诸如通过ELISA的抗体水平、通过FC的功能性抗体水平、OPK和其他功能性测试如凝集作用、移动性、细胞毒性、Th1/Th17细胞和细胞因子水平、和院内疾病(肺炎、败血症、烧烫伤、GI和手术部位感染)的体内测定法，诸如对于所述免疫原性组合物的靶标院内病原体的攻击后的细菌清除、被动和主动保护。在一些实施方式中，该免疫反应与对照组合物比较。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该免疫原性组合物中的抗原性多糖且不包括存在于该免疫原性组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该免疫原性组合物中的抗原性多肽且不包括存在于该免疫原性组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该免疫原性组合物中的抗原性多肽其/或存在于该免疫原性组合物中的抗原性多糖，且不包括存在于该免疫原性组合物中的聚合物。
在一些实施方式中，一种评估本文中所描述的疫苗组合物的免疫原性的方法，包括使用包含B细胞和T细胞反应的一或多种体外生物测定法来评估、测量、和/或比较免疫反应，诸如通过ELISA的抗体水平、通过FC的功能性抗体水平、OPK和其他功能性测试如凝集作用、移动性、细胞毒性、Th1/Th17细胞和细胞因子水平、和院内疾病(肺炎、败血症、烧烫伤、GI和手术部位感染)的体内测定法，诸如对于所述疫苗组合物的靶标院内病原体的攻击后的细菌清除、被动和主动保护。在一些实施方式中，该免疫反应与对照组合物比较。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该疫苗组合物中的抗原性多糖且不包括存在于该疫苗组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该疫苗组合物中的抗原性多肽且不包括存在于该疫苗组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该疫苗组合物中的抗原性多肽其/或存在于该疫苗组合物中的抗原性多糖，且不包括存在于该疫苗组合物中的聚合物。
在一些实施方式中，一种评估本文中所描述的疫苗组合物的效价的方法，包括使用包含B细胞和T细胞反应的一或多种体外生物测定法来评估、测量、和/或比较免疫反应，诸如通过ELISA的抗体水平、通过FC的功能性抗体水平、OPK和其他功能性测试如凝集作用、移动性、细胞毒性、Th1/Th17细胞和细胞因子水平、和院内疾病(肺炎、败血症、烧烫伤、GI和手术部位感染)的体内测定法，诸如对于所述疫苗组合物的靶标院内病原体的攻击后的细菌清除、被动和主动保护。在一些实施方式中，该免疫反应与对照组合物比较。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该疫苗组合物中的抗原性多糖且不包括存在于该疫苗组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该疫苗组合物中的抗原性多肽且不包括存在于该疫苗组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该疫苗组合物中的抗原性多肽其/或存在于该疫苗组合物中的抗原性多糖，且不包括存在于该疫苗组合物中的聚合物。
在一些实施方式中，一种评估本文中所描述的医药组合物的免疫原性的方法，包括使用包含B细胞和T细胞反应的一或多种体外生物测定法来评估、测量、和/或比较免疫反应，诸如通过ELISA的抗体水平、通过FC的功能性抗体水平、OPK和其他功能性测试如凝集作用、移动性、细胞毒性、Th1/Th17细胞和细胞因子水平、和院内疾病(肺炎、败血症、烧烫伤、GI和手术部位感染)的体内测定法，诸如对于所述医药组合物的靶标院内病原体的攻击后的细菌清除、被动和主动保护。在一些实施方式中，该免疫反应与对照组合物比较。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该医药组合物中的抗原性多糖且不包括存在于该医药组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该医药组合物中的抗原性多肽且不包括存在于该医药组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该医药组合物中的抗原性多肽其/或存在于该医药组合物中的抗原性多糖，且不包括存在于该医药组合物中的聚合物。
在一些实施方式中，一种评估本文中所描述的医药组合物的效价的方法，包括使用包含B细胞和T细胞反应的一或多种体外生物测定法来评估、测量、和/或比较免疫反应，诸如通过ELISA的抗体水平、通过FC的功能性抗体水平、OPK和其他功能性测试如凝集作用、移动性、细胞毒性、Th1/Th17细胞和细胞因子水平、和院内疾病(肺炎、败血症、烧烫伤、GI和手术部位感染)的体内测定法，诸如对于所述医药组合物的靶标院内病原体的攻击后的细菌清除、被动和主动保护。在一些实施方式中，该免疫反应与对照组合物比较。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该医药组合物中的抗原性多糖且不包括存在于该医药组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该医药组合物中的抗原性多肽且不包括存在于该医药组合物中的主链聚合物。在一些实施方式中，对照组合物可包括存在于该医药组合物中的抗原性多肽其/或存在于该医药组合物中的抗原性多糖，且不包括存在于该医药组合物中的聚合物。
常用缩写清单
ADH：己二酸二酰肼；AMR：抗微生物剂耐药性；AU：任意单位；BB：主链；BP：主链聚合物；CDAP：1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐；CDC：疾病控制与预防中心；CDM：化学成分确定培养基；CF：囊性纤维化；CP：共享部分；CPS：荚膜多糖；CFU：菌落形成单位；COPS：O多糖核心；CT：霍乱毒素；DNA：脱氧核糖核酸；DTT：二硫苏糖醇；EC：大肠杆菌；EDC：1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺；ELISA：酶联免疫吸附分析法；ELISpot：酶联免疫斑点分析法；ETEC：肠毒性大肠杆菌；FC：流式细胞仪分析法；FT；流出物；GI：肠胃；GNB：革兰氏阴性细菌；GNR：革兰氏阴性杆菌；H-NMR：质子核磁共振仪；HA：血球凝集反应； HK：热灭菌；HL-60细胞：人类早幼骨髓性白血病细胞；HPLC：高效能液相层析法；IATS：国际抗原分型计划；ICU：重症加护病房； IEC：离子交换色层分析法；IFN：干扰素；IL：白介素；IM：肌内； IN：鼻内；IP：腹膜内；IV：静脉内；IVIG：静脉注射免疫球蛋白； Ig：免疫球蛋白；KDO：酮酸基团；KP：肺炎克雷伯氏菌；KO：产酸克雷伯氏菌；LAL：鲎变形细胞裂解物：LPS：脂多糖；mAb：单克隆抗体；MALLS：多角度激光光散射；MAPS：多重抗原呈递系统；MDR：多重耐药性；MHC：主要组织相容性复合物；MW：分子量；NAPLL：N-乙酰基聚-L-赖氨酸；NaBH3CN：氰基硼氢化钠； NaIO4：偏过碘酸钠；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；NHS：正常人类血清；NMR：核磁共振；OD：光密度；OMP：外膜蛋白；OPA：调理吞噬测定法；OPK：调理吞噬灭杀；OPS：O多糖；PA：铜绿假单胞菌；PCR：聚合酶链反应；PBS：磷酸盐缓冲溶液；PEG：聚乙二醇； PMN：多形核白细胞；PLL：聚-L-赖氨酸；PO：经口；PPG：聚丙二醇；PRO-CN：载体蛋白对照组；PT：百日咳毒素；RCB：研究细胞库；RI：折射率；RIA：放射免疫测定法；RNA：核糖核酸；RPM：每分钟转速；SBA：血清杀菌测定法；SC：皮下；SDS：十二烷基硫酸钠；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺胶电泳；SEC：尺寸排阻层析术；TFF：切向流过滤；TLR：Toll样受体；TNF：肿瘤坏死因子；TTSS：第III型分泌系统；UF：超滤；US：美国；WFI：注射用水。
【附图简单说明】
与附图一起阅读时，本文中所述的发明提示将可通过以下各种说明性实施例的描述而更充分了解。应了解以下所述的附图仅用于说明目的，而非意欲以任何方式限制本发明的提示。
图1A显示来自铜绿假单胞菌(PA)的脂多糖的内核(顶部)和外核(底部)的化学结构，标记为“裂解”的箭头指向由乙酸介导的介于“酮酸基团”(KDO)与脂质A分子之间的裂解位点。图1B 显示含有几种国际公认的分型标准(IATS)类型的不同PA核部的重复O多糖(OPS)单元的化学结构。图1C显示当用亚硝酸钠和乙酸(亚硝酸)处理LPS时，肺炎克雷伯氏菌脂多糖(LPS)的核心多糖的部分结构，其中在核部的葡萄糖胺与半乳糖醛酸残基之间具有脱氨基裂解位点，其导致在OPS的共同部分(CP)的还原端在C-1位置形成具有醛基的2，5-脱水甘露糖。图1D显示几种肺炎克雷伯氏菌(KP) OPS的重复单元化学结构，在OPS的CP的还原端具有2，5-脱水甘露糖。图1E显示产酸克雷伯氏菌(KO)荚膜多糖(CPS)K19的重复单元化学结构，其与肺炎克雷伯氏菌K19 CPS相同(Brisse等，2013)，因此这两种在本文中可互换地指KP K19 CPS。图1F是纯化的KP K19 CPS在950MHz的H-核磁共振(H-NMR)光谱。
图2A是用己二酸二肼(ADH)标记并通过还原胺化与在CPS (BP-1)上选择性地生物素化的氧化CPS连接的KP/PA OPS的生产示例性化学程序示意图。图2B显示用于产生KP/PACPS/OPS BP-1.2的示例性化学程序示意图，其中生物素残基经由1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺(EDC-NHS)反应而连接在主链聚合物的CPS的羧酸基团上，经ADH标记的OPS通过用高碘酸盐氧化的和生物素化的CPS进行还原胺化而与经生物素化的CPS主链聚合物连接。图2C显示用于产生KP/PA CPS/OPS BP-1.3的示例性化学程序示意图，其中生物素残基经由1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺 N-羟基琥珀酰亚胺(EDC-NHS)反应而连接在主链聚合物的CPS的羧酸基团上，且随后经ADH标记的OPS与经生物素化和CDAP活化的CPS主链聚合物连接。
图3显示用于产生与氧化的CPS连接且接着在CPS和OPS(BP-2a) 上添加生物素残基的ADH标记的OPS的示例性化学程序示意图。
图4显示用于产生与氧化的CPS连接的OPS的化学程序示例性示意图，其中生物素残基选择性地与OPS(BP-2b)连接。
图5A显示用聚-L-赖氨酸(PLL)聚合物产生OPS主链聚合物的化学程序示例性示意图，其中生物素残基选择性地引入OPS且PLL的未反应的ε-游离氨基经加帽以产生生物素化的OPS N-乙酰基化PLL (NAPLL)主链聚合物(BP-3)。图5B是描绘用于制备示例性主链聚合物的三种流程图。流程图1和流程图2是显示两种使用点击化学产生CPS/OPS主链1(BP-1)的方式的化学程序示意图；流程图3是显示使用点击化学法产生CPS/OPS主链-2b(BP-2b)的化学程序示意图。
图6A描绘KP K19氧化的CPS、OPS-ADH衍生化的KPO1(记录曲线1)、KPO5(记录曲线5)、PAO6(记录曲线6)、PAO10(记录曲线10)的示例性尺寸排阻层析术(SEC)高效能液相层析法(HPLC) (Waters BioAlliance系统和Phenomenex BioSep SEC-4000管柱在含有叠氮化钠(0.02％)的pH 7.4的PBS中进行，流速为1mL/min)洗脱曲线。图6B描绘SEC HPLC(WatersBioAlliance系统和Phenomenex BioSep SEC-4000管柱在含有叠氮化钠(0.02％)的pH 7.4的PBS中进行，流速为1mL/min)洗脱曲线(左图)：OPSADH；氧化的KP K19 CPSox (在图中以K19Ox表示)和K19 CPSOx：OPSADH主链聚合物；洗脱曲线 (右图)：K19 CPSox：OPSADH在使用SEC或使用100kDa标称分子量截留(NMWCO)膜的超滤(UF)进行分子分粒之后的主链聚合物。图6C 描绘通过酶联免疫吸附分析法(ELISA)对PA COPS或PA COPS：K19 BP-1构建体的免疫原性分析，其使用来自于热灭杀(HK)的铜绿假单胞菌的免疫接种的兔高度免疫血清(第四次免疫接种后)。肠毒性大肠杆菌(ETEC)COPS作为ELISA中的阴性对照组使用。PA COPS K19BP-1与铜绿假单胞菌特异性OPS抗血清的强烈反应性表明主链聚合物中的OPS表位被保留。
图7A是描绘具有利查维啶融合蛋白和OPS BP-1或BP-1.2的BP-1 MAPS复合物的示例性示意图；图7B是描绘具有利查维啶融合蛋白和 OPS BP-2a的BP-2a MAPS复合物的示例性示意图；图7C是描绘具有利查维啶融合蛋白和OPS BP-2b的BP-2b MAPS复合物的示例性示意图；图7D是描绘具有利查维啶融合蛋白和OPS BP-3的BP-3MAPS复合物的示意图；图7E是描绘具有利查维啶融合蛋白和天然OPS的 MAPS复合物的示意图。
图8A是描绘来自KP的OPS和来自PA的OPS的下游纯化程序的示例性流程图。图8B是描绘示例性SEC-HPLC(Waters BioAlliance系统和Phenomenex BioSep SEC-4000管柱在含有叠氮化钠(0.02％)的 pH 7.4的PBS中进行，流速为1mL/min)曲线，从左到右的纯化KPOPS 和K19 CPS重叠的折射指数(RI)记录曲线为K19 CPS、O1、O3、O2 和O5。图8C描绘示例性SEC-HPLC(Waters BioAlliance系统和 Phenomenex BioSep SEC-4000管柱在含有叠氮化钠(0.02％)的pH7.4 的PBS中进行，流速为1mL/min)曲线，从左到右的纯化PA OPS重叠的RI记录曲线为：O2、O6、O3、O4、O5、O1、O10和O11。
图9A是描绘KO CPS K19的下游纯化程序的示例性流程图。图9B 是描绘过量产生外泌多糖PsL的假单胞菌试剂菌株的基因构建图。图 9C是描绘PA外泌多糖PsL的下游纯化程序的流程图。
图10的上面图块显示含有Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白与K19： KPO2-ADH BP-2a的BP-2a MAPS复合物在Superdex-200管柱上的示例性SEC洗脱曲线。图10的下面图块显示通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和SEC管柱洗脱出的分馏物的总蛋白质染色的筛选结果，样品在SDS-PAGE之前在具有10mM二硫苏糖醇 (DTT)的十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液中不加热处理以使得 MAPS复合物保持完整。
图11A-11C描绘使用不同融合蛋白制备的示例性BP-1变体MAPS 复合物的SDS-PAGE分析和总蛋白染色的实施例。图11A描绘分别与PA O10 OPS BP-1(泳道4和5)、PA O1OPS BP-1(泳道6和7)和PA O2 OPS BP-1(泳道8和9)形成的利查维啶融合蛋白(PRO-CN)之间的变体BP-1MAPS复合物的示例性SDS-PAGE。图11B描绘分别与PA O10 OPS BP-1(泳道4和5)、PA O1 OPS BP-1(泳道6和7)和PA O2 OPS BP-1(泳道8和9)形成的利查维啶-FlaB-PcrV蛋白 (Rhavi-FlaB-PcrV)之间的BP-1变体MAPS复合物的示例性 SDS-PAGE。图11C描绘含有PA O10 OPS BP-1(泳道4和5)、PA O1 OPS(泳道6和7)和PA O2 OPS BP-1(泳道8和9)的利查维啶 -FlaB-D2-MrkA蛋白(Rhavi-FlaBD2-MrkA)之间的BP-1变体MAPS 复合物的示例性SDSPAGE。在图11A-11C中，用单独利查维啶融合蛋白跑胶以作为对照组(泳道1和2)。每个样品经加热处理(通过沸腾)(泳道1、4、6和8)和不加热处理(泳道2、5、7和9)。BP-1 变体MAPS复合物在没有加热的情况下没有被破坏，且BP-1变体 MAPS复合物中的蛋白质保留在凝胶的最顶端。在沸腾处理下，BP-1 变体MAPS复合物被破坏，蛋白质被释放且蛋白质二聚体也被解离。蛋白质分子量标记物(泳道3)也包含在内，标准物的分子量以kDa 表示在凝胶的左侧。
图12A是显示衍生自假单胞菌(PcrV；FlaB；FlaA2；FlaA1； FlaB-PcrV；FlaB-D2；FlaA2-D2)或克雷伯氏菌(MrkA)所产生的利查维啶-抗原融合蛋白、或衍生自克雷伯氏菌和假单胞菌 (FlaB-D2-MrkA；PcrV-MrkA)的杂合蛋白的示意图。图12B显示天然假单胞菌鞭毛蛋白和Rhavi融合蛋白的Toll样受体(TLR)5生物活性，其是单独的或作为具有肺炎球菌多糖(PnPS)6B的变体MAPS复合物，在此测定中HEK293-NFkB：Luc细胞对鞭毛蛋白有反应但对单独培养基则无。这些结果表明单独利查维啶鞭毛蛋白构建体(FlaB， FlaA1，FlaA2)或其与PnPS 6B的MAPS复合物会促进TLR5活性，因此是正确折叠的。
图13A-13B比较用各种利查维啶-抗原融合蛋白和肺炎球菌荚膜多糖(PnCPS)产生的MAPS复合物通过ELISA测量在兔中引发抗CPS 19A抗体(图13A)反应或抗CPS-6B抗体(图13B)反应的能力。在免疫接种(P0)之前、第一次免疫接种(P1)后两周和第二次免疫接种(P2)后两周评估血清样品。测得的IgG反应从一个12,500AU/ml 的标准曲线来指定任意单位(AU)。几何平均值以水平黑线表示，误差棒为95％置信区间。图13A的上面图块：对于具有以下各种的 PnCPS 19A的免疫球蛋白(IgG)反应：PRO-CN；单独利查维啶 (Rhavi)；利查维啶-FlaB-D2(FlaBD2)；利查维啶-FlaA2-D2 (FlaA2D2)；利查维啶-FlaB-PcrV(FlaB-PcrV)；利查维啶 -FlaB-D2-MrkA(FlaBD2-MrkA)；利查维啶-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA)。图13A的下面图块：PRO-CN；利查维啶-PcrV(PcrV)；利查维啶-FlaB(FlaB)；利查维啶-FlaA1(FlaA1)；利查维啶-FlaA2 (FlaA2)；利查维啶-MrkA(MrkA)。图13B上面图块：对于具有以下各种的PnCPS 6B的IgG反应：单独利查维啶(Rhavi)；利查维啶 -FlaB-D2(FlaBD2)；利查维啶-FlaA2-D2(FlaA2D2)；利查维啶 -FlaB-PcrV(FlaB-PcrV)；利查维啶-FlaB-D2-MrkA(FlaBD2-MrkA)；利查维啶-PcrV-MrkA(PcrV-MrkA)。图13B下面图块：PRO-CN；利查维啶-PcrV(PcrV)；利查维啶-FlaB(FlaB)；利查维啶-FlaA1 (FlaA1)；利查维啶-FlaA2(FlaA2)；利查维啶-MrkA(MrkA)。
图14显示用利查维啶-抗原融合蛋白(在弗氏佐剂中的100μg蛋白质)进行免疫接种的兔的免疫反应。在免疫接种(P0)之前和第二次免疫接种(P2)后两周，用血清样品通过ELISA测量兔对于免疫抗原的IgG。测得的IgG反应从一个12,500AU/ml的标准曲线来指定AU。几何平均值以水平黑线来表示。以下蛋白质的效价以AU显示： Rhavi-FlaB-D2(FlaB-D2)；Rhavi-FlaA2-D2(FlaA2-D2)； Rhavi-FlaB-PcrV(FlaB-PcrV)；Rhavi-FlaB-D2-MrkA(FlaB-D2-MrkA)；和Rhavi-PcrV-MrkA(PcrV-MrkA)。
图15比较在具有利查维啶融合蛋白PRO-CN或利查维啶(Rhz)的 MAPS复合物中的PA O6和O10天然OPS二价制剂在兔中的免疫原性。抗O6或O10 OPS IgG效价以注射前(P0)、注射一次后(P1)或注射两次后(P2)的ELISA单位显示。
图16比较以下各制剂在兔中的免疫原性：2价KP O1和KP O5 OPS BP-1制剂；单价KP O1 BP-2a制剂；和KP O1 BP-2b制剂，所述制剂均在具有利查维啶融合蛋白PRO-CN和磷酸铝的变体MAPS复合物中。抗KP O1或KP O5 OPS IgG效价以注射前(P0)、注射一次后(P1)或注射两次后(P2)的ELISA单位显示。
图17比较以下各制剂在兔中的免疫原性：与PRO-CN复合的2价 PA O6，O10 OPSBP-1；与PRO-CN复合的PA O6，O10 OPS BP-1(不含明矾)；PA O6，O10-BP-1(不含蛋白质，例如不含PRO-CN)；PA O6， O10 OPS BP-1(不含MAPS；例如无生物素化但含有主链聚合物组分和PRO-CN)；和单价PA-O6 OPS BP-1，除非另有说明，所述制剂均在具有利查维啶融合蛋白PRO-CN和磷酸铝的BP-1MAPS复合物中。抗PA O6和抗PA O10 OPS IgG效价以注射前(P0)、注射一次后(P1)或注射两次后(P2)的ELISA单位显示。
图18A用人类早幼骨髓性白细胞(HL-60)比较了兔抗血清(来自于兔AFV651和AFV667)对于以下各种的克雷伯氏菌菌株12-0581 (O1：K62)的调理吞噬灭杀(OPK)作用：免疫接种之前与第二次免疫接种之后的KP O1 OPS BP-1PRO-CN MAPS(左图)；免疫接种之前与第二次免疫接种之后的KP O1 OPS BP-2a/利查维啶PRO-CN MAPS(右图)。当与相同兔中的免疫前血清相比时，对于BP-2a免疫血清观察到灭杀作用增加。图18B用铜绿假单胞菌PAIATSO6的 HL-60细胞比较了兔抗血清对于二价PA O6，O10-OPS BP-1PRO-CN MAPS和单价PAIATSO6-OPS BP-1 PRO-CN MAPS的OPK作用。经测试的个别兔血清对产生了PA IATSO6作用，兔血清AFV643产生了暗示强OPS抗体效价之前带效应。图18C显示用2价PA-O6，-O10 OPSBP-1-PRO-CN-MAPS疫苗产生的四个兔对象免疫血清(P2)在HL-60 细胞中诱导对PA O10细菌的强健OPK作用。
图19A比较对于完整克雷伯氏菌菌株B5055(O1：K2)用个别兔抗血清对MAPS KPO1，O5 OPS BP-1(左图)和KPO1 OPS BP-2a(右图) 的PRO-CN变体的FC结合结果。这些含有完整细菌的FC结合结果与对于纯化的KP O1 OPS的ELISA效价有类似的趋势，即低效价和低FC结合性。少数双阳性事件表明在克雷伯氏菌菌株B5055表面上的抗体结合力薄弱或OPS抗体的暴露度受限。图19B(上面图块)是显示单个兔血清(AFV667)对具有KPO1 OPS BP-2a的PRO-CN BP-2a MAPS 复合物的FC散布图，其中是比较出对于B5055以及(肺炎克雷伯氏菌，产酸克雷伯氏菌，O1：K2)的结合力弱，而对于未囊封的克雷伯氏菌 (CVD 3001)O1菌株的结合力强。图19B(下面图块)显示对同样三种克雷伯氏菌O1菌株的用2价KP O1，O5 OPS BP-1PRO-CN MAPS 免疫接种的兔血清的FC全部结合事件。这些结合数据暗示了CPS数量会影响OPS的裸露，这可能受到生长条件的影响。
图20比较FC对于完整假单胞菌菌株PAK(O6：FlaA1)的结合力结果，包含(左图)含2价PAO6-PAO10天然OPS-PRO-CN的兔血清(3 只兔的汇集血清，第二次免疫接种之后)；(中图)2价PAO6-PAO10 OPS BP-1-PRO-CN MAPS的兔血清(3只兔的汇集血清，第二次免疫接种之后)；(右图)单价PAO6-IATSO6-OPS BP-1-PRO-CN MAPS 的兔血清(3只兔的汇集血清，第二次免疫接种之后)；当与天然形式的OPS MAPS相比时，观察到PAO6 OPS BP-1 MAPS有更强的FC 结合。
图21A描绘与表达FlaB的PAO1菌株O5结合的兔抗FlaB的FC结合数据：右边图块显示当与放血前(P0)血清(左图)相比时，用利查维啶FlaB-D2(缺少TLR5结合区域)进行免疫接种的兔在第三次放血(P3放血；10的兔的汇集血清)中后有高比例的已标记的PAO1族群的散布图。图21B上面图块显示兔对象P3放血血清对于利查维啶 FlaB-D2的FC结果；中间图块显示兔对象P3放血血清对于利查维啶 FlaB-PcrV的结果；下面图块显示兔对象P3放血血清对于利查维啶 FlaB-D2-MrkA的结果。
图22描绘当与针对PAO1 FlaB产生的阳性对照组抗PA-FlaB、多克隆人类静脉注射免疫球蛋白(IVIG)抗体以及阴性对照组(不含抗体)相比时，用汇集的兔抗Rhavi-FlaB-His抗血清对于含有标靶菌株假单胞菌菌株PAO1(O5：表达有FlaB)的HL-60细胞的OPK结果。
图23显示通过不同稀释度的抗-FlaBD2-MrkA兔血清来阻断KP O5 6997(源自于南非)对A549(肺癌)细胞的黏附的结果。 FlaBD2-MrkA(第三次免疫接种之后，P3)血清抑制克雷伯氏菌菌株6997与A549细胞的结合，而免疫前血清则不然。这表明 FlaBD2-MrkA FP的MrkA蛋白组分是正确折叠的并引发功能性抗体。
图24A显示抗PcrV抗体保护A549细胞不受假单胞菌菌株PAK (O6：FlaA1)中毒。在用Rhavi-FlaB-PcrV融合蛋白免疫接种的兔10％血清(3只的汇集血清)的存在下，用单胞菌菌株PAK(O6：FlaA1)感染 A549单层4小时。与免疫前血清相比，抗Rhavi-FlaB-PcrV血清(P3，第3次免疫接种之后)保护细胞免于假单胞菌菌株PAK中毒，如同在较少的圆形分离细胞中所观察到。图24B显示A549单层细胞在各种稀释度的NCB006 Rhavi-FlaB-PcrV血清(汇集3只)的存在下用假单胞菌菌株PAK感染4小时。细胞用PBS洗涤并与中性红一起培养1小时。将细胞裂解并记录每个孔中的染剂吸光度。与免疫前血清相比，抗Rhavi-FlaB-PcrV(P3)血清在稀释度1至40可保护细胞免于假单胞菌菌株PAK细胞毒性中毒。
图25描绘用若干假单胞菌菌株使用A549细胞和抗FlaB-PcrV兔血清(第3次免疫接种之后，P3)的细胞毒性测定：高毒性PA IATS O1 (闭合菱形)，未受到血清的细胞毒性保护；具细胞毒性的PA M-2 O5 (闭合圆形)，没有血清保护作用；具细胞毒性的PA 17002(O10) (闭合矩形)，有明显的血清保护作用；非细胞毒性PA IATS O6(闭合三角形)，未检测到毒性。
图26是描绘小鼠的Kaplan-Meier存活图，所述小鼠经烧伤并接着将28个菌落形成单位(CFU)的表达FlaB的假单胞菌菌株M-2(O5) 给药于烧伤伤口进行感染。在此模型中，CD-1小鼠被动转移了免疫前兔血清或抗FlaB兔血清中，并用磷酸盐缓冲溶液(PBS)或用在PBS 中的假单胞菌菌株M-2模拟感染。经给予抗FlaB抗血清的小鼠在用假单胞菌菌株M-2伤口攻击后受到保护(5/5或100％存活)10天或更久，而来自其他群组的所有小鼠均死于伤口攻击，除了模拟感染的小鼠以外。
图27显示KP感染的小鼠模型中的清除率和器官负荷。小鼠 (CD1；3组)被动地经腹膜内(IP)给予抗KPO1 BP-2a OPS-PRO-CN MAPS的兔血清，并接着用克雷伯氏菌菌株KPB5055 O1：K2(9x104 CFU)经静脉注射攻击(IV)。在攻击14小时之后测量脾脏KP活菌计数。与接受免疫前血清(P0)的小鼠脾脏相比，观察到接受免疫血清(P2) 的小鼠脾脏中的KP活菌计数明显降低。这些数据表明通过该变体 MAPS疫苗中的主链聚合物所生成的OPS O1抗体能够从小鼠组织清除生物体，因此具有体内保护活性的功能。
图28绘示小鼠被动保护的Kaplan-Meier存活结果，其在用生长在水杨酸盐中的克雷伯氏菌菌株B5055(O1：K2)感染之前，针对KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS给予兔血清以降低荚膜的表达。CD1小鼠 (每组5只)在用2x 104CFU克雷伯氏菌菌株B5055(O1：K2)IP细菌攻击之前，IP给予0.1mL的兔免疫(P2)或免疫前(P0)汇集血清。其显示了接受P0或P2 KPO1BP-1OPS-PRO-CN MAPS血清的小鼠的 Kaplan-Meier存活图。对于已接受KPO 1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS抗血清存活的且相对于给予P0血清的小鼠延长一段时间的小鼠，P2血清在该模型中保护了较高比例的小鼠。
图29绘示与4价KP疫苗(疫苗中各类BP献出5μg的PS，治疗组4) 相比下的对于用12价KP/PA疫苗1(疫苗中各类BP献出5μg的PS，治疗组5)免疫接种的兔汇集血清的KP OPS IgG终点ELISA效价的结果。
图30绘示与8价PA疫苗(疫苗中各类BP献出5μg的PS，治疗组4) 相比下的对于用12价KP/PA疫苗1(疫苗中各类BP献出5μg的PS，治疗组5)免疫接种的兔汇集血清的PA OPS IgG终点ELISA效价的结果。
图31绘示在与疫苗中有1μg的各类BP所献出的PS的12价KP/PA 疫苗1(治疗组6)相比的下，用12价KP/PA疫苗1(例如，疫苗中的全部PS为60μg；疫苗中各类BP献出5μg的PS)进行免疫接种的兔汇集血清的PA OPS IgG终点ELISA效价的结果。
图32描绘针对5μg剂量的12价KP/PA疫苗1(例如，疫苗中的全部PS为60μg；疫苗中各类BP献出5μg的PS)的个别IgG效价。
图33描绘针对1μg剂量的12价KP/PA疫苗1(例如，疫苗中的全部PS为12μg；疫苗中各类BP献出1μg的PS)的个别IgG效价。
图34描绘5μg剂量的12价KP/PA疫苗1在诱导个别抗OPS IgG方面有所增加。
图35描绘5μg PS/BP剂量和1μg PS/BP剂量的12价KP/PA疫苗1 在诱导个别抗OPSIgG方面的增加比较。
图36描绘在与用12μg剂量的12价KP/PA疫苗2(该疫苗剂量中各类BP献出1μg的PS；治疗组2)相比下，用60μg剂量的12价KP/PA 疫苗2(该疫苗剂量中各类BP献出5μg的PS；治疗组1)进行免疫接种的兔汇集血清的PA和KP OPS IgG终点ELISA效价的结果。
图37描绘针对5μg剂量的12价KP/PA疫苗2中的各PS的个别IgG 效价。
图38描绘5μg剂量的12价KP/PA疫苗2在诱导个别抗OPS IgG方面有所增加。
图39描绘通过给予12价KP/PA疫苗1、12价KP/PA疫苗2、8价PA 疫苗和4价KP疫苗所诱导的抗FlaBD2的兔IgG的ELISA分析。
图40描绘通过给予12价KP/PA疫苗1、12价KP/PA疫苗2、8价PA 疫苗和4价KP疫苗所诱导的抗MrkA的兔IgG的ELISA分析。
图41描绘通过给予12价KP/PA疫苗1所诱导的抗PcrV的兔IgG的 ELISA分析。
图42描绘通过给予12价KP/PA疫苗1、12价KP/PA疫苗2、8价PA 疫苗和4价KP疫苗所诱导的个别抗载体蛋白IgG在诱导方面有所增加。
图43描绘在三项兔的免疫原性研究NCB007、NCB008和NCB012中，通过给予不同疫苗制剂所诱导的FlaB反应在诱导方面有所增加。
图44描绘在三项兔的免疫原性研究NCB007、NCB008和 NCB012中，通过给予不同疫苗制剂所诱导的MrkA反应在诱导方面有所增加。
图45描绘在三项兔的免疫原性研究NCB007、NCB008和 NCB012中，通过给予不同疫苗制剂所诱导的PcrV反应在诱导方面有所增加。
图46描绘由仅含有FlaB结构域2的载体蛋白展现缺乏TLR5激动剂生物活性。
图47描绘使用KP O2 K-菌株7380进行人类嗜中性粒细胞OPK测定的结果。
图48A描绘在庆大霉素存在下用J774巨噬细胞株进行OPK摄取测定的结果。图48B描绘在庆大霉素不存在下用J774巨噬细胞株进行 OPK摄取测定的结果。
图49描绘用12价疫苗-1进行免疫接种的兔汇集血清进行调理调节的PA和KP的庆大霉素保护测定试验的结果。免疫血清(P2)介导了巨噬细胞样J774细胞对细菌的摄取，而免疫前血清(P0)则没有。
图50描绘使用GFP标记的PA对巨噬细胞样J774细胞摄取细菌的显微镜分析。PA在暴露于免疫血清后被强烈吸收。
图51显示来自接受5μg剂量的12价KP/PA疫苗1(共有60μg PS) 的汇集血清促进了巨噬细胞的细菌摄取。
图52描绘使用KP O2菌株7380的HL60 OPK测定中的存活细胞百分比。
图53描绘显现PcrV抗体保护细胞免受细胞毒性的测定结果。与来自相同兔的免疫前血清相比，与12价免疫血清(汇集10只，疫苗 -1高剂量)混合的PA菌株(不含FlaB)显示出细胞毒性降低。
图54显现用5μg剂量(例如，疫苗中的全部PS为60μg；疫苗中各类BP献出5μg的PS)的12价KP/PA疫苗-1进行免疫接种的兔汇集血清处理的细胞显示，当与使用免疫前血清的处理相比，PA O5 FlaB 菌株通过抗FlaB的抗体可降低移动性。
图55显示来自用4价KP疫苗(5μg剂量，治疗组4)进行免疫接种的兔的不含PA OPS的汇集血清可增加表达FlaB的PA聚集，显现出针对含有FlaB的载体蛋白所产生的抗体具有功能性。
图56显示用12价KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔汇集血清、用8 价PA疫苗进行免疫接种的兔汇集血清(MrkA为该8价PA疫苗中的唯一KP抗原)、用4价KP疫苗进行免疫接种的兔汇集血清可阻断KP O5 菌株6997黏附至AS49细胞。数据暗示了由载体蛋白FlaBD2-MrkA诱导的MrkA抗体负责。
图57描绘在3只用KP O1菌株B5055攻击的小鼠在攻击后1小时和 4小时的血液清除测定结果。
图58描绘用KP O1菌株B5055攻击后的小鼠肝脏和脾脏中的器官负荷。
图59描绘在3只用KP O5菌株6997攻击的小鼠在攻击后1小时和4 小时的血液清除测定结果。
图60描绘用KP O5(菌株6997)攻击后的小鼠脾脏中的器官负荷。
图61描绘小鼠脾脏中的器官负荷被动保护分析，其显现出在用经用12价KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔血清处理后可从血液循环中清除KP O2(菌株KPN-12)。
图62描绘使用抗克雷伯氏菌O2 K2的NCB012免疫前血清和免疫血清的CD-1小鼠被动保护实验的各种示例性优化实验方案与结果。
图63描绘在来自于用KP O1 MAPS疫苗进行免疫接种并且接着用KP O1：K2菌株B5055进行细菌攻击的小鼠的经刺激脾细胞中诱导出了IL-17a。
图64描绘在用两剂量的PA O6 MAPS疫苗进行免疫接种并且接着用细菌攻击的大鼠中，使用PA O6进行胃肠道定殖研究的治疗实验方案与结果。
图65是描绘KP OPS Gal-I、Gal-II和Gal-III表位的结构示意图。
图66描绘通过流式细胞仪分析来自于用4价KP PRO-CN MAPS 疫苗进行免疫接种的动物的抗血清与表达KP D-Gal-III与KP D-Gal-I 的表位的结合结果。
图67描绘流式细胞仪分析的结果，其显现出在用12价KP/PA疫苗 1进行免疫接种的兔汇集血清中的抗体与来自菌血症分离株的3株 ST258菌株中的2株结合，并且还与4种不在该疫苗中且带有MrkA的突变型等位基因的血清型中的3种结合。
图68描绘用BP-1(第1组)和BP-1.2(第2组)KP/PA 4价MAPS 疫苗进行免疫接种后的个别抗OPS IgG效价。
图69描绘从BP-1MAPS(第1组)与BP-1.2MAPS(第2组)的汇集血清比较中所观察到的载体蛋白IgG反应。
图70描绘BP-1和BP-1.2(KP/PA 4价)在个别血清中分别对载体蛋白FlaBD2的抗体反应。
图71描绘BP-1和BP-1.2(KP/PA 4价)在个别血清中分别对载体蛋白MrkA的抗体反应。
定义
本申请中，除非上下文另有明确指示，否则(i)术语“一个”可以被理解为指“至少一个”；(ii)术语“或”可被理解为指“和/或”；(iii)术语“包含”和“包括”可以被理解为包括所列出的逐项成分或步骤，无论其独自存在还是与一种或多种附加成分或步骤一起存在；和(iv) 术语“约”和“大约”可以被理解为本领域技术人员允许的标准偏差；和(v)当提供的是范围时，包括该范围的端点。
约：在本文中参考数值而使用术语“约”时，其指一个在所述参考值的上下文中的类似的数值。一般而言，熟悉上下文的本领域技术人员将了解“约”在上下文中所涵盖的相关差异度。例如，在一些实施方式中，术语“约”可涵盖在所述数值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、 7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的数值范围。
给予；如本文所用术语”给予”通常指向对象或系统给予组合物以实现试剂的递送，该试剂是或包含于该组合物。本领域技术人员将意识到在适当情况中可用于给予对象(例如人类)的各种途径。举例而言，在一些实施方式中，给予可以是经眼、经口、非经肠、经局部等。在一些特定实施例中，给予可以是经支气管(例如，通过支气管滴注)、经颊、经真皮(其可以是或包含(例如)局部给予至真皮、真皮内(intradermal)、真皮内(interdermal)、经皮等中的一或多种)、经肠、动脉内、真皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、室内、在特定器官内(例如肝内)、经黏膜、经鼻、经口、直肠、皮下、舌下、局部、经气管(例如，通过气管内滴注)、经阴道、经玻璃体等。在一些实施方式中，给予可涉及单一剂量。在一些实施方式中，给予可涉及给药固定数目的剂量。在一些实施方式中，给予可涉及间歇性(例如，适时隔开的多个剂量)和/或周期性(例如，间隔相同时间段的个别剂量)投药的投药。在一些实施方式中，给予可涉及连续投药(例如，灌注)达至少所选时间段。
试剂：一般而言，如本文所使用，术语“试剂”可指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖、脂质、小分子、金属或其组合或复合物。在适当情况下，本领域技术人员将从上下文可知，该术语可用以指一个是或包括细胞或生物体、或其部分、提取物或组分的实体。替代性地或另外地，可由上下文明确了解到，该术语可用以指一个在自然中发现和/或从自然中获得的天然产物。在一些实施方式中，也可由上下文明确了解到，该术语可用以指通过人工所设计、工程化和/或产生，且/或并非在自然中发现的一或多种人造实体。在一些实施方式中，可以分离或纯形式使用试剂；在一些实施方式中，可以粗产物形式使用试剂。在一些实施方式中，提供潜在试剂作为集合或文库，例如可对其进行筛选以识别或定性其中的活性剂。在一些情况中，该术语可用以指一个可以是或包括一聚合物的化合物或实体；在一些情况中，术语“试剂”可用以指一个是或包括一聚合部分的化合物或实体。在一些实施方式中，术语”试剂”可指一个不是聚合物和/或基本上不含任何聚合物和/或不含一或多个特定聚合部分的化合物或实体。在一些实施方式中，该术语可指一个缺少或基本上不含任何聚合部分的化合物或实体。
氨基酸：本文使用的术语”氨基酸”在广义上指，例如，可通过形成一个或多个肽键而纳入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方式中，氨基酸具有H2N-C(H)(R)-COOH的一般结构。在一些实施方式中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸是非天然氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的20种标准L-氨基酸中的任何一种。“非标准氨基酸”指除标准氨基酸外的任何氨基酸，不管它是合成制备的，还是从天然来源获得的。在一些实施方式中，氨基酸，包括多肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，与上面提到的一般结构相比可以含有结构修饰。例如，在一些实施方式中，与一般结构相比，氨基酸可以发生甲基化、酰胺化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化和/或取代修饰(例如，氨基、羧酸基团、一或多个质子、和/或羟基团的修饰)。在一些实施方式中，与含有其它相同未修饰的氨基酸相比，这样的修饰可以，例如，改变含有修饰氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方式中，与含有其它相同未修饰的氨基酸相比，这样的修饰并不显著改变包含修饰氨基酸的多肽的相关活性。从上下文中清楚可见，在一些实施方式中，术语“氨基酸”可指游离氨基酸；在一些实施方式中，可指多肽的氨基酸残基。
抗体：如本文中所使用，术语“抗体”指一种多肽，其包括足以提供与具体目标抗原的特异性结合的标准免疫球蛋白序列组件。如所属领域中已知，如在自然界中产生的完整抗体是约150kDa四聚体试剂，其包含两个一致重链多肽(每个约50kDa)和两个一致轻链多肽(每个约25kDa)，所述多肽彼此结合成通常被称为“Y形”结构的物质。每条重链包含至少四个结构域(每条长度是约110个氨基酸)- 氨基端可变(VH)域(位于Y结构的顶端)，接着是三个恒定域：CH1、CH2和羧基端CH3(位于Y的主干的基底)。短区域，称为“开关”，连接重链可变区与恒定区。“铰链”连接CH2和CH3结构域与抗体的其余部分。这一铰链区中的两个二硫键使完整抗体中的两个重链多肽彼此连接。每条轻链包含两个结构域-氨基端可变(VL)域，接着是羧基端恒定(CL)域，其彼此由另一个“开关”分离。完整抗体四聚体包含两个重链-轻链二聚体，其中重链和轻链通过单个双硫键彼此连接；另外两个二硫键使重链铰链区彼此连接，使得二聚体彼此连接并且形成四聚体。天然产生的抗体也糖基化，通常在CH2结构域上。天然抗体中的每个结构域具有由”免疫球蛋白折叠”表征的结构，所述免疫球蛋白折叠由在压缩反平行β桶中针对彼此封装的两个β片(例如3-、4-或5-多股片)形成。每个可变域含有三个称为“互补决定区”的高变环(CDR1、CDR2和CDR3)以及四个在某种水平上恒定的“构架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成β片，其提供结构域的结构构架，并且来自重链和轻链的CDR环区域在三维空间中结合在一起，使得其产生位于Y结构的顶端的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区结合于补体系统的组件，并且还结合于效应细胞上的受体，包括例如介导细胞毒性的效应细胞。如所属领域中已知，可通过糖基化或其它修饰来调节Fc区对Fc受体的亲和力和/或其它结合属性。在一些实施方式中，根据本发明产生和/或使用的抗体包括糖基化Fc结构域，包括具有这类糖基化修饰或工程改造的Fc结构域。出于本发明的目的，在一些实施方式中，任何包括足够的如在天然抗体中发现的免疫球蛋白域序列的多肽或多肽复合物可称为和/或用作“抗体”，无论这类多肽是天然产生(例如通过生物体对抗原的反应产生)，或通过重组型工程改造、化学合成或其它人工系统或方法产生。在一些实施方式中，抗体是多克隆的；在一些实施方式中，抗体是单株的。在一些实施方式中，抗体具有恒定区序列，其具有小鼠、兔、灵长类动物或人类抗体的特性。在一些实施方式中，如所属领域中已知，抗体序列组件是人类化、灵长类化、嵌合等。此外，在适合的实施例中(除非另有说明或从上下文可知)，如本文中所使用的术语“抗体”指以替代性呈现方式用于利用抗体结构和功能性特征的所属领域中已知的或研发构建体或形式中的任一种。例如，在实施例中，根据本发明而利用的抗体呈选自(但不限于)以下的形式：完整IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双重或多重特性抗体(例如，
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等)；抗体片段，诸如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段、和分离的CDR或其组合；单链Fvs；多肽-Fc融合体；单域抗体(例如，鲨鱼单域抗体，诸如IgNAR 或其片段)；骆驼抗体；隐蔽态抗体(例如
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)；小模块免疫药物(Small Modular ImmunoPharmaceuticals，“SMIPsTM”)；单链或串联双功能抗体(
Figure BDA0002388953440000443
)；VHHs；
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微型抗体；
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锚定重复序列蛋白或
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DARTs； TCR样抗体；
Figure BDA0002388953440000447
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微蛋白；
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和
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在一些实施方式中，抗体可不具有可能天然产生的共价修饰(例如聚糖的连接)。在一些实施方式中，抗体可含有共价修饰(例如聚糖、有效负载[例如可检测部分、治疗性部分、催化部分等]的连接)或其它侧基 (例如聚乙二醇等)。
抗原：本文使用的术语“抗原”指(i)引发免疫反应的物质；和/ 或(ii)与T细胞受体(例如，当由MHC分子呈递时)或抗体结合的物质。在一些实施方式中，抗原引发体液反应(例如，包括产生抗原特异性的抗体)；在一些实施方式中，引发细胞反应(例如，涉及受体特异性地与所述抗原相互作用的T细胞)。在一些实施方式中，抗原引发体液反应和细胞反应。在一些实施方式中，抗原结合至抗体且可或不会在生物体中诱导特定的生理反应。一般而言，抗原可以是任何化学实体或包括任何化学实体，例如，小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质和聚合物(在一些实施例中除了生物聚合物外(例如，除了核酸或氨基酸聚合物以外))等。在一些实施方式中，抗原是或包括多肽。在一些实施方式中，抗原是或包括多糖。本领域技术人员可以理解，在一般情况下，抗原可以以分离或纯化的形式提供，或者以粗品形式来提供(例如，在提取物中与其它物质一起提供，例如，细胞提取物或其他含抗原源的相对粗制品)。在一些实施方式中，本发明使用的抗原以粗制品形式提供。在一些实施方式中，抗原是重组抗原。
相关：如本文使用的，如果一个实体的存在、水平和/或形式与另一个实体涉及，那么就认为它们彼此”相关”。在一些实施方式中，如果两个或更多个彼此之间直接或间接地相互作用，以使它们彼此之间保持物理位置接近，则认为它们彼此之间”相关”。在一些实施方式中，以物理方式彼此相关联的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施方式中，以物理方式彼此相关联的两个或更多个实体不彼此共价连接，而是以非共价形式相关联，例如借助于亲和相互作用、氢键、范德华力相互相用、疏水性相互作用、磁性和其组合。
主链聚合物：如本文中所用，术语”主链聚合物”指与或可以与一或多种多糖(例如抗原性多糖)偶联的聚合物。在一些实施方式中，主链聚合物是聚合物和与该聚合物偶联的一或多种多糖(例如抗原性多糖)。
结合：应理解，如本文中所使用，术语“结合”通常指两个或更多个实体之间或之中的非共价缔合。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触；间接结合涉及借助于与一或多个中间实体物理接触进行的物理相互作用。两个或更多个实体之间的结合可在多种情况中的任一种中加以评估，包括其中相互作用的实体或部分在分离或更复杂系统的情况中进行研究(例如同时共价或以其它方式与运载体实体缔合和/或在生物学系统或细胞中)。
载体蛋白：如本文中所用，术语“载体蛋白”指引发或增强对于耦接或复合的半抗原的免疫反应的蛋白或多肽。在一些实施方式中，由载体蛋白所引发或增强的免疫反应是对于半抗原的反应。在一些实施方式中，对于载体蛋白本身没有显著的反应；在一些实施方式中，可检测到对于载体蛋白本身的反应。在某一实施例中，载体蛋白与一或多种其他分子复合。
点击化学：如本文中所用，术语“点击化学”指一个快速且高产率的反应，例如由K.B.Sharpless在2001年所述。在一些实施方式中，点击化学反应产生了可以在不用层析的情况下除去的副产物。在一些实施方式中，点击化学反应只产生可以在不用层析的情况下除去的副产物。在一些实施方式中，点击化学反应具有立体特异性。在一些实施方式中，点击化学反应可使用一或多种容易去除的溶剂来进行。在一些实施方式中，点击化学反应可使用一或多种良性溶剂来进行。在一些实施方式中，点击化学反应利用铜催化的叠氮化物-炔环加成反应以连接一或多个分子实体。在一些实施方式中，所述一或多个分子实体不受分子大小的限制。在一些实施方式中，点击化学反应可以是生物正交的；例如，反应物及其产物的官能团都不会与官能化的生物分子相互作用且/或在温和无毒的条件下容易进行反应，诸如在室温下且较佳地在水中。在一些实施方式中，点击化学反应可以是铜催化的Huisgen环加成反应、叠氮化物-炔[3+2] 偶极环加成反应、Staudinger接合反应、或叠氮化物-膦接合反应。在一些实施方式中，点击化学反应可用以将两个生物聚合物(例如两个核酸，或一个核酸与一个蛋白质或肽，或两个糖聚合物等)连接一起。
定殖(例如黏膜的或胃肠道的)：如本文中所用，术语“定殖”指微生物在解剖部位(例如黏膜、损伤部位、器官等)建立生态位的能力。
组合疗法：如本文中所用，术语“组合疗法”指对象同时暴露于二或多种治疗方案(例如二或多种治疗试剂)的情况。在一些实施方式中，所述二或多种治疗方案可同时给药；在一些实施方式中，这类方案可依序给药(例如，在给予第二方案的任何剂量之前给予第一方案的全部“剂量”)；在一些实施方式中，这些试剂按重叠给药方案给予。在一些实施方式中，组合疗法的“给予”涉及对接受该组合中的其它试剂或治疗方案的对象给予一或多种试剂或治疗方案。为清楚说明，组合疗法不需要个别的试剂在单一组合物中一起给药(或甚至需要在同一时间)，尽管在一些实施例中可在结合组合物中一起给药二或多种试剂或其活性部分(例如，作为单一化学复合物或共价实体的一部分)。
组合物：本领域技术人员将了解，如本文中所用的术语“组合物”可用以指包括一或多个特定成分的分散物理实体。一般而言，除非另有说明，组合物可呈任何形式-例如气体、凝胶、液体、固体等。
衍生物；如本文中所用，术语“衍生物”指参考物质的结构类似物。也即，“衍生物”是一个显示出与参考物质有显著结构相似度的物质，例如共有核心或共同结构，但也在某些个别方面不同。在一些实施方式中，衍生物是可通过化学操作由参考物质产生的物质。在一些实施方式中，衍生物是可通过进行与用于产生参考物质的过程大体上类似(例如共有多个步骤)的合成过程而产生的物质。
结构域：术语“结构域”在本文中用以指实体的区段或部分。在一些实施方式中，“结构域”与实体的特定结构和/或功能特征相关联，使得当结构域与其亲本实体的其余部分物理分离时，其基本上或完全保留特定结构和/或功能特点。替代性地或另外地，结构域可以是或包括当与该(亲本)实体分离并与不同(接受者)实体连接时基本上保留和/或赋予接受者实体一个或多个结构和/或功能特点的实体部分，所述结构和/或功能特点在亲本实体中以结构域为特征。在一些实施方式中，结构域是分子(例如，小分子、碳水化合物、脂质、核酸或多肽)的区段或部分。在一些实施方式中，结构域是多肽的区段；在一些这样的实施方式中，结构域的特征在于特定的结构组件(例如，特定的氨基酸序列或序列基序、α-螺旋特征、β-折叠特征、卷曲螺旋特征、无规卷曲特征等)，以和/或特定的功能特点(例如结合活性、酶活性、折叠活性、信号传导活性等)。
剂型或单位剂型：本领域技术人员将了解，术语“剂型”可用以指用于给予对象的活性剂(例如治疗剂或诊断剂)的物理离散单位。一般而言，每个单位含有预定量的活性剂。在一些实施方式中，这类量是适合于根据已确定在给予相关群体时与所需或有利结果相关的给药方案(即，用治疗性给药方案)投药的单位剂量的量(或其完全部分)。所属领域的技术人员将理解，给予具体对象的治疗性组合物或试剂的总量是由一或多位主治医生测定并且可涉及多种剂型的投药。
给药方案：本领域技术人员将了解，术语“给药方案”指个别地给予对象的通常由时间段间隔的一组单位剂量(通常超过一个)。在一些实施方式中，既定治疗剂具有推荐的给药方案，其可能涉及一或多个剂量。在一些实施方式中，给药方案包含多个剂量，其各自彼此在时间上有所间隔。在一些实施方式中，个别的剂量各自彼此间隔相同长度的时间段；在一些实施方式中，给药方案包含多个剂量以及间隔开个别剂量的至少两个不同时间段。在一些实施方式中，给药方案内的全部剂量具有相同单位剂量的量。在一些实施方式中，给药方案内的不同剂量具有不同量。在一些实施方式中，给药方案包含呈第一剂量的量的第一剂量，接着是呈不同于第一剂量的量的第二剂量的量的一或多种其它剂量。在一些实施方式中，给药方案包含呈第一剂量的量的第一剂量，接着是呈与第一剂量的量相同的第二剂量的量的一或多种其它剂量。在一些实施方式中，当跨越相关群体给予时，给药方案与所需或有利结果相关(即，治疗性给药方案)。
表位：如本文中所用，术语“表位”通过免疫球蛋白(例如抗体或受体)结合组分特异性地识别的任何部分。在一些实施方式中，表位包含抗原上的多个化学原子或基团。在一些实施方式中，此类化学原子或基团在抗原采取相关三维构象时经表面暴露。在一些实施方式中，此类化学原子或基团在抗原采取此类构象时在空间上彼此物理接近。在一些实施方式中，至少一些此类化学原子是在抗原采取替代构象(例如经线性化)时彼此物理分离的基团。
外泌多糖：术语“外泌多糖”在本文中用以指由糖残基组成且由微生物分泌于其环境内的高分子量天然聚合物。外泌多糖可互换地称为细胞外多糖(EPS)。EPS建立了生物膜的功能和结构完整性，且被认为是决定生物膜的生理化学特性的基本成分。EPS占生物膜总有机质的50％至90％。
片段；如本文中所述的材料或实体的“片段”具有一种结构，其包括整体的离散部分，但不具有在整体中发现的一或多个部分。在一些实施方式中，片段由这类离散部分组成。在一些实施方式中，片段包含整体的离散部分，其中离散部分共享在整体中发现的一或多个功能特征。在一些实施方式中，片段是由这类的离散部分组成。在一些实施方式中，片段由在整体中发现的特征结构组件或部分组成或包含在整体中发现的特征结构组件或部分。在一些实施方式中，聚合物片段包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、 170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、 350、375、400、425、450、475、500个或更多个如在完整聚合物中发现的单体单元(例如残基)或由其组成。在一些实施方式中，聚合物片段包含至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、25％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或更多的在完整聚合物中发现的单体单元(例如残基)或由其组成。在一些实施方式中，完整材料或实体可称为整体的“亲本”。
同源性：如本文所用，术语“同源性”指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方式中，若聚合物分子的序列至少是25％、 30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的，则认为其彼此是“同源的”。在一些实施方式中，若聚合物分子的序列至少是25％、30％、35％、40％、 45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％近似的，则认为其彼此是“同源的”。
同一性：如本文中所使用，术语“同一性”指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方式中，如果聚合分子的序列至少25％、 30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，那么认为所述聚合分子彼此“基本上相同”。两个核酸或多肽序列之间的同一性百分比的计算可例如通过出于最佳比较目的而比对两个序列来进行(例如可将间隙引入第一和第二核酸序列中的一个或两个中以便最佳比对且出于比较目的可以忽略不相同序列)。在一些实施方式中，出于比较目的所比对的序列长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。接着比较相应位置处的核苷酸。当第一序列中的一个位置由与第二序列中相应位置相同的残基(例如核苷酸或氨基酸)占据时，那么所述分子在所述位置处相同。两个序列之间的同一性百分比与所述序列共有的相同位置的数目涉及，考虑最佳比对两个序列需要引入之间隙的数目和每个间隙的长度。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法实现。举例来说，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用迈尔和米勒算法(CABIOS，1989，4：11-17)确定，其已纳入ALIGN程序(2.0版)中。在一些示例性实施例中，由ALIGN程序进行的核酸序列比较使用PAM120加权残基表、空位长度罚分是12 和空隙处罚是4。或者，可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用 NWSgapdna.CMP矩阵确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。
“改进”、“增加”、“抑制”或“降低”：如本文中所用，术语“改进”、“增加”、“抑制”或“降低”或其语法等效物，指示相对于基线测量值或其他参考测量值的值。在一些实施方式中，适合的参考测量值可以是或包括，在没有特定药剂或治疗存在(例如，在之前和/或之后)的其他可比较条件下，或在有适当的可比较参考试剂下，在特定系统中的测量值(例如，在单一对象中)。在一些实施方式中，适合的参考测量值可以是或包括，在有相关的试剂或治疗的存在下，在一个已知或预期以特定方式反应的可比较系统中的测量值。
经分离：如本文中所用，其指如下物质和/或实体：(1)已与最初产生时与其相关的至少一些组分分离(无论在自然界中和/或在实验环境中)；和/或(2)通过人力设计、产生、制备和/或制备。经分离的物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％的与其最初相关的其它组分分离。在一些实施方式中，经分离的药剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％纯。如本文中所使用，物质在其基本上不含其它组分时是“纯”的。在一些实施方式中，如所属领域的技术人员将了解，在与某些其它组分(例如一或多种载剂或赋形剂(例如缓冲剂、溶剂、水等))组合之后，物质仍可被视为“经分离”或甚至“纯”；在这类实施例中，在不包括这类载剂或赋形剂的情况下计算物质的分离或纯度百分比。仅举一个例子，在一些实施方式中，当在自然界中产生的生物聚合物如多肽或多核苷酸在以下情况下时被认为是“分离的”：a)由于其起源或获取来源与在自然界中在其天然状态下伴随它的某些或全部组分不相关联；b)它基本上不含与自然界中产生它的物种相同物种的其他多肽或核酸；c)由不属于在自然界中产生它的物种的细胞或其他表达系统表达或以其他方式与来自不属于在自然界中产生它的物种的细胞或其他表达系统的组分相关。因而，例如，在一些实施方式中，被化学合成或在与自然界中产生它的细胞系统不同的细胞系统中合成的多肽被认为是“分离的”多肽。可替代地或另外地，在一些实施方式中，已经经历一种或多种纯化技术的多肽可被认为在已经与其他组分分离的水平上是“分离的”多肽，所述其他组分a)在自然界中与多肽相关联；和/ 或b)在初始产生时与多肽相关联。
接头：如本文中所用，其用于指将不同组件相互连接的多组件试剂的部分。例如，本领域的普通技术人员认识到，其结构包括两个或更多个功能或组织结构域的多肽通常在这些结构域之间包括使其彼此连接的一段氨基酸。在一些实施方式中，包含接头组件的多肽具有通式S1-L-S2的总体结构，其中S1和S2可以相同或不同，并且代表通过接头彼此相关联的两个结构域。在一些实施方案中，多肽接头是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个氨基酸长度。在一些实施方案中，接头的特征在于其倾向于不采用刚性三维结构，而为多肽提供灵活性。当设计本领域已知的多肽(例如融合多肽)时，可以适当地使用各种不同的接头组件(Holliger 等，1993；Poljak，1994)。
医药组合物：如本文中所用，术语“医药组合物”指与一或多种医药学上可接受的运载体一起配制的活性剂组合物。在一些实施方式中，活性剂以适合于给予的单位剂量的量存在于治疗方案中，其在给予相关群体时展示出统计学上显著的实现预定治疗作用的概率。在一些实施方式中，医药组合物可专门配制用于以固体或液体形式给予，其包括适合于以下的医药组合物：口服给予，例如顿服药(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂，例如靶向颊内、舌下和全身吸收的片剂、用于向舌施加的大丸剂、散剂、颗粒、糊剂；肠胃外给予，例如作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放配制物通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射给予；局部给药，例如给药于皮肤、肺或口腔的乳膏、软膏或控制释放贴片或喷雾；经阴道内或直肠内，例如作为子宫托、乳膏或发泡体；经舌下；经眼；经皮；或经鼻、经肺和到其它黏膜表面。
医药学上可接受的：如本文中所用，应用于配制如本申请所公开的组合物的运载体、稀释剂或赋形剂的术语“医药学上可接受的”指所述运载体、稀释剂或赋形剂必须与所述组合物的其它成分兼容并对其接受者无害。
多糖：术语“多糖”在本文中用以指聚合碳水化合物分子，其由通过糖苷键结合在一起的单糖单元长链所组成，且在水解时得到所组成的单糖或寡糖。多糖的结构范围从线性的到高度分枝化的。示例包含诸如淀粉和糖原的储存性多糖、诸如纤维素和几丁质和微生物多糖的结构性多糖，以及在微生物中发现的抗原性多糖，包含 (但不限于)OPS、CPS、COPS和LPS。
预防或防止：当与疾病，病症和/或病症的发生相关地使用时，本文中所用的预防或防止指降低发展疾病、病症和/或病况的风险和 /或延迟发生疾病、病症或病况的一或多种特征或症状。当疾病、病症或病况的发作已经延迟了预定时间期间时，可认为预防是完整的。
蛋白质：如本文中所使用，术语“蛋白质”指多肽(即，通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的链带)。蛋白质可包括除氨基酸以外的部分(例如可以是糖蛋白、蛋白多糖等)和/或可以其它方式加工或修饰。所属领域的技术人员将了解，“蛋白质”可以是如由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或可以是其特征部分。所属领域的技术人员将了解，蛋白质有时可包括例如由一或多个二硫键连接或通过其它方式缔合的超过一个多肽链。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或其两种，且可含有所属领域中已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。适用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方式中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其组合。术语“肽”一般用于指长度小于约 100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施方式中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征性部分。
多肽：如本文中所用的术语“多肽”通常具有其领域公认的是至少3个氨基酸的聚合物的含义。本领域的普通技术人员将了解，术语“多肽”旨在足够一般地不但涵盖具有本文叙述的完整序列的多肽，而且涵盖表示此类完整多肽的功能片段(即，保持至少一种活性的片段)的多肽。而且，本领域的普通技术人员了解，蛋白质序列通常耐受不破坏活性的某种取代。因此，在如本文中所用的涉及术语“多肽”中涵盖保持活性并且与相同类别的另一个多肽共有至少约 30-40％总体序列同一性，常常高于约50％、60％、70％或80％，并且进一步地通常在一个或多个高度保守区域内包括同一性高得多，常常高于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％的至少一个区域，通常涵盖至少3-4个且常常多达20个或更多个氨基酸的任何多肽。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者并且可含有本领域已知的各种氨基酸修饰或类似物。有用的修饰包括，例如，末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方式中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。
预防：如本文中所用的术语”预防”指延迟发作和/或降低特定疾病、病症或病况的一个或多个症状的频率和/或严重性。在一些实施方式中，预防基于群体进行评价，以致如果在对疾病、病症或病况易感的群体中在疾病、病症或病况的一个或多个症状的发生、频率和/或强度方面观察到统计学显著降低，则试剂被认为“预防”特定疾病、病症或病况。当疾病、病症或病况的发作已经延迟了预定时间期间时，可认为预防是完整的。
蛋白质：如本文中所使用，术语“蛋白质”指多肽(即，通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的链带)。蛋白质可包括除氨基酸以外的部分(例如可以是糖蛋白、蛋白多糖等)和/或可以其它方式加工或修饰。所属领域的技术人员将了解，“蛋白质”可以是如由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或可以是其特征部分。所属领域的技术人员将了解，蛋白质有时可包括例如由一或多个二硫键连接或通过其它方式缔合的超过一个多肽链。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或其两者，且可含有所属领域中已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。适用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方式中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其组合。术语“肽”一般用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施方式中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征性部分。
重组体：如本文中所用，其意指通过重组方式设计、工程改造、制备、表达、产生、制备和/或分离的多肽，诸如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽；自重组、组合人类多肽库分离的多肽；自动物(例如小鼠、兔、绵羊、鱼等)分离的多肽，所述动物转基因或以其他方式操作来表达(多个)基因、或是编码和/或直接表达多肽或其一或多个组件、部分、组件、结构域的基因组分；和/或通过涉及所选核酸序列组件相互剪接或接合的任何其他方式制备、表达、产生或分离的多肽，化学合成所选序列组件，和/或以其他方式产生编码和/或直接表达多肽或其一或多个组件、部分、组件、结构域的核酸。在一些实施方式中，在自然界中发现此类所选序列组件中的一或多种。在一些实施方式中，此类所选序列组件中的一或多种经计算器设计。在一些实施方式中，一或多个此类所选序列组件由例如来自天然或合成来源的已知序列组件的突变诱发(例如体内或体外)产生，诸如(例如)在相关源生物体(例如人类、小鼠等)的生殖系中的序列组件。
参考物：如本文所用，其描述相对于其进行比较的标准物或对照物。例如，在一些实施方式中，所感兴趣的药剂、动物、对象、群体、样品、序列或数值与参考或对照药剂、动物、对象、群体、样品、序列或数值进行比较。在一些实施方式中，参考物或对照物基本上与相关测试或测定同时测试和/或测定。在一些实施方式中，参考物或对照物是可选地在有形介质中实施的历史参考物。通常，如本领域技术人员将理解，参考物或对照物在可与评估时的条件或环境相当的条件或环境下测定或表征。本领域技术人员将理解当证明依赖于和/或与特定可能的参考物或对照物相比时存在足够的相似性。
反应：如本文中所使用，对治疗的反应可指由治疗引起或与治疗相关的对象病状中任何有利变化。这类变化可包括病状的稳定(例如预防将在不存在治疗的情况下发生的恶化)、病状的症状的改善和 /或病状的治愈前景的改良等。其可指对象反应或对肿瘤的反应。肿瘤或对象反应可根据广泛多种准则测量，包括临床准则和目标准则。用于评估反应的技术包括(但不限于)临床检验、正电子发射断层摄影法、胸腔X射线CT扫描、MRI、超音波、内窥镜检查、腹腔镜检查、从对象获得的样品中肿瘤标记物的存在或含量、细胞学和/或组织结构。许多这些技术尝试测定肿瘤的尺寸或以其他方式测定总体肿瘤负荷。用于评估对治疗的反应的方法和指南论述于Therasse等 (2000)的”评估实体肿瘤中对治疗的反应的新指南(New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors)”中，欧洲癌症研究和治疗组织(European Organization for Research and Treatment ofCancer)，美国国家癌症研究所(National Cancer Institute of the United States)，加拿大国家癌症研究所(National Cancer Institute of Canada) 中。可以任何适合的方式选择确切反应准则，限制条件是当比较肿瘤和/或患者的群组时，待比较的群组是基于用于测定反应率的相同或类似准则来评估。所属领域的技术人员将能够选择适合的准则。
风险：正如将从上下文将理解的那样，疾病、病症和/或病状的“风险”是指特定对象将发展所述疾病、病症和/或病状的可能性水平。在一些实施方案中，将风险表示为百分比。在一些实施方案中，风险是自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、 60、70、80、90高达至100％。在一些实施方案中将风险表示为相对于和一个参考样品或一组参考样品相关联的风险的风险。在一些实施方案中，一个参考样品或一组参考样品具有已知的疾病、病症、病状和/或现象风险。在一些实施方案中一个参考样品或一组参考样品来自于与特定对象可比较的对象。在一些实施方案中，相对风险是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。
血清型：如本文中所用，术语“血清型(serotype)”也称为血清变形(serovar)，是指在细菌或病毒种类或不同对象的免疫细胞中的不同变体。这些微生物、病毒或细胞根据其细胞表面抗原而分类在一起，使生物体的流行病学分类达到亚种级别。一群具有共同抗原的血清型可称为血清群(serogroup)或有时称为血清复合物 (serocomplex)。
短寡糖：出于本发明的目的，寡糖若在任何线性链尚有少于4个、或肯定少于3个残基，则通常被认为是“短的”。
对象：如本文中所用，术语“对象”是指有机体，通常是哺乳动物(例如人类，在一些实施方式中，包含胎儿期的人类形式)。在一些实施方式中，对象患有相关疾病、病症或病状。在一些实施方式中，对象易患疾病、病症或病状。在一些实施方式中，对象显示疾病、病症或病状的一或多种症状或特征。在一些实施方式中，对象不显示疾病、病症或病状的任何症状或特征。在一些实施方式中，对象是具有对疾病、病症或病状的敏感性或风险的一或多种特性特征的对象。在一些实施方式中，对象是患者。在一些实施方式中，对象是进行和/或已进行诊断和/或治疗的对象。
易患：“易患”疾病、病症或病状的对象具有发展疾病、病症或病状的风险。在一些实施方式中，易患疾病、病症或病状的对象不表现出疾病、病症或病状的任何症状。在一些实施方式中，易患疾病、病症或病状的对象还没有被诊断出患有所述疾病、病症或病状。在一些实施方式中，易患疾病、病症或病状的对象是已暴露于与所述疾病、病症或病状的发展相关的条件下的对象。在一些实施方式中，发展疾病、病症或病状的风险是基于人群的风险(例如，对象的家庭成员患有所述疾病、病症或病状)。
症状减轻：根据本发明，“症状减轻”是指特定疾病、病症或病状的一种或多种症状的严重水平(例如，强度、严重水平等)和/或频率减少。为了清楚起见，特定症状的发作延迟被认为是症状频率减少的一种形式。
治疗有效量：如本文中所用，其意指产生给予所期望的效果的量。在一些实施方式中，该术语是指当根据治疗给药方案向罹患或易患疾病、病症和/或病状的群体给予时足以治疗该疾病、病症和/ 或病状的量。在一些实施方式中，治疗有效量是降低疾病、病症和/或病状的一或多种症状的发生率和/或严重性，和/或延迟其发作的量。普通技术人员将了解术语“治疗有效量”实际上不需要在特定对象中实现成功治疗。确切而言，治疗有效量可以是当向需要此类治疗的患者给予时在显著数目的对象中提供特定所需药理学反应的该量。在一些实施方式中，提及治疗有效量可以是提及如在一或多种特定组织(例如受疾病、病症或病状影响的组织)或流体(例如血液、唾液、血清、汗液、泪液、尿液等)中测量的量。普通技术人员将了解，在一些实施方式中，治疗有效量的特定药剂或疗法可以单次剂量配制和/或给予。在一些实施方式中，治疗有效的药剂可以多个剂量，例如作为给药方案的一部分配制和/或给予。在一些实施方式中，治疗有效量可以指合适引发免疫反应的免疫原性组合物或疫苗的数量。例如，“治疗有效量”是指无毒但足以治疗、减弱或预防任何对象的感染和/或疾病(例如，细菌感染、肺炎球菌感染等)的数量。
治疗：如本文中所用，术语“治疗(treatment/treat/treating)”是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状的一或多种症状、特征和/或病因、延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发生率的任何疗法的给予。在一些实施方式中，此类治疗可向不展示相关疾病、病症和/或病状的征兆的对象和/或仅展示疾病、病症和/ 或病状的早期征兆的对象给予。或者或另外，这类治疗可以是一个展现出相关疾病、病症和/或病状的一或多种已确立征兆的对象的治疗。在一些实施方式中，这类治疗可以是对已诊断为罹患相关疾病、病症和/或病状的对象的治疗。在一些实施方式中，治疗可以是对已知具有一或多种在统计学上与相关疾病、病症和/或病状发展风险增加相关的易感性因素的对象的治疗。
变体：如本文中所用，在例如核酸、蛋白质或小分子的分子的上下文中，术语“变体”是指显示与参考分子的显著结构同一性，但与参考分子结构上的不同的处在于与参考分子相比，例如一或多个存在或不存在的化学部分和/或该化学部分的水平的分子。在一些实施方式中，变体也在功能上与其参考分子不同。一般而言，特定分子是否恰当地视为参考分子的“变体”是基于其与参考分子的结构同一性的水平。如本领域技术人员将了解，任何生物或化学参考分子都具有某些特征结构组件。根据定义，变体是共有一或多种此类特征结构组件、但在至少一方面上与该参考分子不同的不同分子。仅给出一些实施例，多肽可具有由多个在线性或三维空间中具有相对于彼此的指定位置和/或促成特定结构基序和/或生物功能的氨基酸构成的特征序列组件；核酸可具有由多个在线性或三维空间中具有相对于彼此的指定位置的核苷酸残基构成的特征序列组件。在一些实施方式中，变体多肽或核酸可因氨基酸或核酸序列中的一或多种差异和/或共价连接于多肽或核酸组分(例如，连接于)的化学部分(例如碳水化合物、脂质、磷酸基团)中的一或多种差异而不同于参考多肽或核酸。在一些实施方式中，变体多肽或核酸显示与参考多肽或核酸至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。在一些实施方式中，变体多肽或核酸并不与参考多肽或核酸共有至少一种特征序列组件。在一些实施方式中，参考多肽或核酸具有一或多种生物活性。在一些实施方式中，变体多肽或核酸共有参考多肽或核酸的生物活性中的一或多种。在一些实施方式中，变体多肽或核酸缺乏参考多肽或核酸的生物活性中的一或多种。在一些实施方式中，变体多肽或核酸与参考多肽或核酸相比显示一或多种生物活性的水平降低。在一些实施方式中，若相关多肽或核酸的氨基酸或核酸序列与参考物的氨基酸序列相同但在特定位置有少量序列变化，则相关多肽或核酸视为该参考多肽或核酸的“变体”。通常，与参考物相比，变体中少于约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约 6％、约5％、约4％、约3％、约2％的残基经取代、插入或缺失。在一些实施方式中，与参考物相比，变体多肽或核酸包括约10、约9、约 8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1个经取代的残基。变体多肽或核酸相对于参考物通常包括极少数目(例如少于约5、约4、约3、约2或约1个)的经取代、插入或缺失的功能残基(即参与特定生物活动的残基)。在一些实施方式中，如与亲本相比，变体多肽或核酸通常包括不超过约5、约4、约3、约2或约1个添加或缺失，并且，在一些实施方式中，与该参考物相比不包括添加或缺失。在一些实施方式中，与该参考物相比，变体多肽或核酸包括少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6个添加或缺失，且通常少于约5、约4、约3或约2个添加或缺失。在一些实施方式中，参考多肽或核酸是在自然界中发现的多肽或核酸。在一些实施方式中，参考多肽或核酸是人类多肽或核酸。
接种：如本文中所用，术语“接种”是指给予一组合物而意欲产生免疫反应，例如致病试剂。为达到本发明的目的，可在暴露于该致病试剂之前、期间和/或之后给予接种，且在一些实施例中在暴露于试剂之前、期间和/或之后不久。在一些实施方式中，接种包含以适当间隔时间多次给予接种组合物。
某些实施方式的详细说明
本发明一般涉及包含复合的蛋白质与多糖(例如具有复合的蛋白质与多糖的疫苗)的组合物、系统和方法。这类复合物可用以(例如)在有院内感染风险的患者中诱导和/或增加免疫保护反应。
院内感染是在医院或其他医疗护理机构入院后至少约48小时所获得的感染。为了强调医院和非医院环境，院内感染有时被称为医疗护理相关感染(HAI或HCAI)。在一些实施方式中，院内感染可能在医院、护理的家、复健机构、门诊或其他临床环境中获得。在一些实施方式中，院内感染通过各种方式在临床环境中传播给易感染的患者。在一些实施方式中，除了受污染的设备、床单或空气中的飞沫外，医疗护理人员也会传播院内感染。在一些实施方式中，院内感染可以来自外部环境、另一个已感染的病人、可能被感染的工作人员，或在一些情况中来自于无法确定的院内感染来源。在一些情况中，造成院内感染的微生物来自于患者自身的皮肤微生物区，在手术或其他损害皮肤保护屏障的处置后而变得有机会致病。尽管患者可能已经从自身的皮肤感染了感染，但这类感染因为其在医疗护理环境中发展而仍被认为是院内的。
抗微生物剂耐药性
已越来越认识到疫苗在面临抗微生物剂耐药性(AMR)问题中的作用。疫苗可以通过降低使用抗微生物剂的需要来降低耐药性的流行，并可通过降低病例总数来降低其冲击。通过降低可能导致特定临床症状的病原体数量，疫苗可以允许使用窄谱抗生素进行经验性治疗。这些影响可以通过群体免疫来扩大，扩大对人群中未接种疫苗的人的保护。因为耐药性的选择很多是因为对正常人群的旁观者选择，所以疫苗接者可以降低耐药性压力，即使是未包含在疫苗中的病原体也是如此。一些疫苗对目标物种内的耐药性谱已有不成比例的影响，这可能是疫苗设计中更深思熟率地开发的一个效益 (Lipsitch和Siber，2016)。疫苗通过这些机制对抗AMR的效益是可通过间接保护或群体免疫而放大(Fine，1993)，导致当接种疫苗的对象本身不会被感染或定殖时，不会将病原体传播到其他对象。在这种方式下，不仅可以在接种疫苗的对象中降低感染、耐药性感染和抗微生物剂的使用，且可降低对它们的接触。最后，对于无症状地定殖到鼻咽、皮肤、肠道或其他部位的生物体的疫苗，理论上有可能通过接种降低微生物族群的密度而降低耐药性组件的遗传交换机会 (Levin等，1979；Levin和Cornejo，2009)。
特别感兴趣的疫苗是靶向HAI的经常对多种抗生素具有耐药性的最重要成因的疫苗(CDC，2013；Chang等，2015)。HAI的最一般成因包含多重耐药性的革兰氏阴性细菌；最近的公开报导了来自全球的分离株已经对最终的试剂多黏菌素B和柯利霉素有耐药性(Du等，2015：Liu等，2016)。对第一线和第二线试剂的耐药性在革兰氏阳性细菌中也是个问题。念珠菌属是免疫功能降低的患者黏膜和播散性感染的重要成因且是抗微生物剂治疗的结果(CDC，2013)。革兰氏阴性细菌大肠杆菌、假单胞菌、克雷伯氏菌和不动杆菌属也越来越对多种抗生素具有耐药性(McGann等，2016；Collignon，2009； Agodi等，2011，WHO报告，2014)。为解决这知识落差，CDC在2009 年开始了一个三阶段的工作，对HAI和抗微生物试剂的使用研制和进行数个州的流行率调查。流行率调查结果已使用在其它国家以描述这类感染问题的范畴与规模。CDC的工作在2011年的一项大型调查中告终，其估计了急症护理医院中的HAI流行率，根据如表1中所见感染部位和病原体而确定这些感染的分布情况，并产生这些感染对国家负担的最新预估值(Magill等，2014)。
调查在美国183家医院进行(Magill等，2014)。在11，282位患者中有452位患有一或多种HAI(4.0％；置信区间为95％，3.7至4.4)。在 504种这类的感染中，最常见的类型为肺炎(21.8％)、手术部位感染 (21.8％)和胃肠(GI)感染(17.1％)。艰难梭菌是最常被报告出来的病原体(引起12.1％的医疗护理相关感染)。在这类感染中占25.6％的装置相关感染(即中心静脉导管相关的血流感染、导管相关泌尿道感染和呼吸器相关肺炎)在传统上一直是预防HAI的计划重点。作者估计，在2011年在美国急症护理医院中共有648,000位患者，其中有721,800 例HAI。通过在医院环境中接种靶向定肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌或其组合的疫苗会显著影响最常见的HAI感染(诸如肺炎、手术部位和尿道感染)的发病率，并且降低表1中所示抗生素耐药性的流行率。
表1：HAI的多州点流行率调查：根据感染类型(Magill等，2014)
Figure BDA0002388953440000621
Figure BDA0002388953440000631
免疫原性复合物
本发明涵盖包含有主链聚合物、多糖和多肽的免疫原性复合物。
在一些实施方式中，免疫原性复合物是多重抗原呈递系统 (MAPS)。某些MAPS系统先前已描述于WO 2012/155007案中。一般而言，本文中所述的免疫原性复合物是呈现出新的变体MAPS类型复合物，其包含(i)包括聚合物和与该聚合物偶联的一或多种多糖(例如抗原性多糖)的主链聚合物；和(ii)与该聚合物和/或抗原性多糖非共价复合的一或多种多肽(例如抗原性多肽和/或载体肽)。一些示例性主链聚合物绘示于表7A-7D中所示免疫原性复合物之中。在一些实施方式中，所述变体MAPS复合物是BP-1MAPS。在一些实施方式中，所述变体MAPS复合物是BP-1.2MAPS。在一些实施方式中，所述变体MAPS复合物是BP-2a MAPS。在一些实施方式中，所述变体 MAPS复合物是BP-2b MAPS。在一些实施方式中，所述变体MAPS复合物是BP-3MAPS。
在一些实施方式中，通过形成至少一亲和分子/互补亲和分子对，一或多种多肽抗原是与主链聚合物非共价复合，和/或与该聚合物偶联的抗原性多糖，所述亲和分子/互补亲和分子对包括：(i)与该聚合物和/或抗原性多糖结合的第一亲和分子；和(ii)与一或多个多肽抗原结合的互补亲和分子。在一些实施方式中，所述一或多种多糖与该聚合物化学连接。在一些实施方式中，所述一或多种抗原性多糖衍生自革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌。在一些实施方式中，一或多种微生物抗原性多糖衍生自肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌抗原性多糖。
在一些实施方式中，一或多种多肽与本文中所述的互补亲和分子共价连接(例如，融合)。
在一些实施方式中，一或多种抗原性多糖与主链聚合物偶联。在一些实施方式中，一或多种抗原性多糖以约0.01至约10w/w比例与该主链聚合物偶联。在一些实施方式中，一或多种抗原性多糖以约 0.01至约0.1w/w比例与该主链聚合物偶联。在一些实施方式中，一或多种抗原性多糖以约0.01至约1w/w比例与该主链聚合物偶联。在一些实施方式中，一或多种抗原性多糖以约0.1至约1w/w比例与该主链聚合物偶联。在一些实施方式中，一或多种抗原性多糖以约0.1至约10w/w比例与该主链聚合物偶联。在一些实施方式中，一或多种抗原性多糖以约1至约10w/w比例与该主链聚合物偶联。
在一些实施方式中，一或多种抗原性多糖衍生自一或多种病原体。在一些实施方式中，一或多种抗原性多糖衍生自病原体的1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24或25种血清型或菌株。
在一些实施方式中，主链聚合物包括一或多种与该主链聚合物偶联的亲和分子。在一些实施方式中，所述抗原性多糖包括一或多种与该抗原性多糖偶联的亲和分子。在一些实施方式中，所述主链聚合物和抗原性多糖与一或多种亲和分子偶联。在一些实施方式中，所述主链聚合物与一或多种亲和分子偶联，而所述抗原性多糖未与亲和分子偶联。在一些实施方式中，所述主链聚合物未与亲和分子偶联，而所述抗原性多糖与一或多种亲和分子偶联。在一些实施方式中，所述亲和分子包括生物素或生物素衍生物。
在一些实施方式中，主链聚合物包括与多个该主链聚合物偶联的亲和分子。在一些实施方式中，所述抗原性多糖包括多个与该抗原性多糖偶联的亲和分子。在一些实施方式中，所述主链聚合物和抗原性多糖与多个亲和分子偶联。在一些实施方式中，所述主链聚合物与多个亲和分子偶联，而所述抗原性多糖未与亲和分子偶联。在一些实施方式中，所述主链聚合物未与亲和分子偶联，而所述抗原性多糖与多个亲和分子偶联。在一些实施方式中，所述亲和分子包括生物素或生物素衍生物。
在一些实施方式中，可包含在免疫原性复合物中的多糖和/或多肽以重组方式或合成方式产生。在一些实施方式中，可包含在免疫原性复合物中的多糖和/或多肽从天然来源分离出和/或衍生出。示例性多糖和/或多肽如下所述。
克雷伯氏菌
绝大多数的克雷伯氏菌感染与住院相关。机会致病的病原体克雷伯氏菌属主要攻击免疫功能降低的住院且患有严重潜在疾病(诸如糖尿病或慢性肺阻塞)的对象。院内的克雷伯氏菌感染主要由肺炎克雷伯氏菌造成，其是该属在医学上最重要的物种。据估计，克雷伯氏菌属造成美国与欧洲全部院内细菌感染的8％(Podschun and Ullmann，1998)。除了主要在亚洲发现而在欧洲和西半球并不常见的高毒性K1荚膜菌株以外，在发生频率上未注意到有很大的地理差异。在美国，克雷伯氏菌占全部院内细菌感染的3％至7％，使其列为八种医院中最重要的感染性病原体之一(Horan等，1988；Schaberg 等，1991)，从英国收集的数据(Bergogne-Berezin，1995)和从德国收集的数据(Ullmann，1986)与CDC报导的非常相似。因此，在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含了一或多种克雷伯氏菌多糖和/或多肽。
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含一或多种克雷伯氏菌LPS衍生的多糖和/或CPS多糖。在一些实施方式中， LPS衍生的多糖是OPS。在一些实施方式中，LPS衍生的多糖是COPS。在一些实施方式中，荚膜几乎由全部克雷伯氏菌菌株产生；其呈现出表面结构中与宿主环境接触的最外层，且其已被证实有高度免疫原性且无毒性(Cryz等，1985)。肺炎克雷伯氏菌(KP)CPS疫苗的不利条件是数量众多的荚膜(K)抗原(超过80种不同的抗原)。然而，在对菌血症的克雷伯氏菌分离株中的荚膜类型发生率的研究中，观察到只有25种血清型占全部菌血症菌株的70％(Cryz等，1986a)。根据其血清流行病学发现，配制了24价KP CPS疫苗，随后被证明是安全且具免疫原性(Edelman等，1994)。然而，普通的多糖本身不具有足够的免疫原性来展开和维持长期有效的记忆反应，且必须经常与蛋白质偶联才有效。开发24价KP多糖偶联物疫苗是复杂且具攻击性的，因为将24种糖偶联物组合成一种疫苗可能需要平衡由每种组分引发的免疫原性。
由于其内毒素特性，LPS被认为在败血症的病理学中是重要的。直到最近，克雷伯氏菌LPS O抗原一般被认为被CPS掩蔽且因而未暴露在细菌表面上。然而有若干研究展现出，在表达特定荚膜血清型的菌株中，O抗原的表面暴露和抗体可及性(Tomas等，1988)。与K抗原相反，仅知道有8种O型，O1是临床分离株中最常发现到的O型。四种KP分离物(O1，O2，O3，O5)占了大多数的临床分离株(Hansen 等，1999)。已有报告指出，在致死性内毒素血症的小鼠模型中给予针对克雷伯氏菌O1抗原的单克隆抗体(mAb)具有保护性(Mandine等，1990)。
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含克雷伯氏菌第3型线毛蛋白或多肽。与其它菌毛不同，第3型线毛会凝集已用丹宁处理过的红血球。虽然其名称“具甘露糖抗性的克雷伯氏菌样的血球凝集素(MR/K-HA)”暗指这种菌毛类型仅由克雷伯氏菌合成，后来的研究展现了第3型线毛会在许多肠道属中出现(Clegg和 Gerlach，1987)。此外，第3型线毛在全部肠内细菌属中明显不一致，因为血清学研究显示出相当的抗原多样性(Old和Adegbola，1985)。最初被描述为栖息在植物根部的克雷伯氏菌的黏附胞器，后来发现这些线毛能够结合各种人类细胞。表达第3型线毛的肺炎克雷伯氏菌菌株黏附于内皮细胞、呼吸道上皮细胞和尿道上皮细胞(Hornick等， 1992；Tarkkanen等，1997；Würker等，1990)。在肾脏中，这些线毛介导细菌黏附于管状基底膜、鲍氏囊(Bowman’s capsule)和肾血管上 (Tarkkanen等，1990)。MrkA是第III型线毛复合物的主要蛋白质，且与宿主细胞附着和生物膜形成涉及(Murphy和Clegg，2012)，此为细菌病原体用于建立感染的策略(Burmolle等，2008)。先前显示出是 MrkA促进生物膜的形成而不是黏附素(MrkD)(Langstraat等，2001)。 MrkA抗原在不同的KP分离株之中展现出高度的序列保守性，且通常可作为细胞外的标靶而可接近(Wang等，2016)。来自于两个最主要的致病性分离株肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌的MrkA展现出 95％的同源性。另外，在肠内杆菌科家族的代表性成员中的MrkA同源性＞90％，因此这些序列数据暗示了研发基于MrkA的抗肺炎克雷伯氏菌和泛革兰氏阴性细菌策略的潜在机会。
肺炎克雷伯氏菌多糖
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含一或多种肺炎克雷伯氏菌多糖。除CPS(例如，K抗原)以外，OPS是另一个重要的肺炎克雷伯氏菌毒力因子。至少存在有9种肺炎克雷伯氏菌 OPS亚型，其每一种有不同的多糖化学结构。在一些实施方式中， OPS多糖包含在本文所述免疫复合物之中。本文中所使用的每一个血清型名称根据世界卫生组织(WHO)的大肠杆菌与克雷伯氏菌参考与研究合作中心所指定。
在一些实施方式中，免疫原性复合物包含一或多种克雷伯氏菌多糖，所述多糖可以是或衍生自一或多种选自以下的肺炎克雷伯氏菌血清型：O1(和d-Gal-III变体)、O2(和d-Gal-III变体)、O2ac、O3、 O4、O5、O7、O8和O12。在一些实施方式中，免疫复合物包含来自或衍生自一或多种血清型O1、O2、O3和O5或其组合的克雷伯氏菌多糖。在一些实施方式中，免疫复合物包含来自或衍生自血清型O1、 O2、O3和O5中的每一种的克雷伯氏菌多糖。
在一些实施方式中，免疫原性复合物包含一或多种克雷伯氏菌多糖，所述多糖可以是或衍生自OPS。在一些实施方式中，OPS是或衍生自克雷伯氏菌血清型O1、O2、O3、O5以及其变体或组合。在一些实施方式中，免疫复合物包含选自或衍生自一或多种血清型O1、 O2、O3和O5或其组合的克雷伯氏菌OPS。在一些实施方式中，免疫复合物包含来自或衍生自血清型O1、O2、O3和O5中的每一种的克雷伯氏菌OPS。
在一些实施方式中，免疫原性复合物包含一或多种克雷伯氏菌多糖，所述多糖可以是或衍生自CPS。在一些实施方式中，CPS是或衍生自克雷伯氏菌K1、K2、K10、K16和K19。在一些实施方式中，CPS是或衍生自克雷伯氏菌K19。
肺炎克雷伯氏菌多肽
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含一或多种肺炎克雷伯氏菌多肽。在一些实施方式中，肺炎克雷伯氏菌多肽是或衍生自肺炎克雷伯氏菌第I型菌毛蛋白或其免疫原性片段。在一些实施方式中，肺炎克雷伯氏菌多肽是或包括公开于Gerlach等，2012，J Bacteriology的SEQ ID NO：1多肽。在一些实施方式中，肺炎克雷伯氏菌多肽是或包括与SEQ ID NO：1序列有至少80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽，或其免疫原性片段。
肺炎克雷伯氏菌第I型菌毛蛋白SEQ ID NO：1
Figure BDA0002388953440000681
在一些实施方式中，肺炎克雷伯氏菌多肽是或衍生自肺炎克雷伯氏菌保守的第III型菌毛蛋白MrkA或其免疫原性片段。在一些实施方式中，肺炎克雷伯氏菌多肽是或包括SEQ ID NO：2的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，肺炎克雷伯氏菌多肽是或包括与SEQ ID NO：2序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽，或其免疫原性片段。
肺炎克雷伯氏菌保守的第III型菌毛蛋白MrkA SEQ ID NO：2
Figure BDA0002388953440000682
在一些实施方式中，肺炎克雷伯氏菌多肽是或衍生自肺炎克雷伯氏菌第III型菌毛蛋白MrkA或其免疫原性片段，例如具有重复序列以对于MrkA单体蛋白提供稳定相互作用。在一些实施方式中，肺炎克雷伯氏菌多肽是或包括SEQ ID NO：3的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，肺炎克雷伯氏菌多肽是或包括与SEQ ID NO：3序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽，或其免疫原性片段。
肺炎克雷伯氏菌稳定的第III型菌毛蛋白MrkA SEQ ID NO：3
Figure BDA0002388953440000691
假单胞菌
假单胞菌是HAI感染的主要成因，特别是在因嗜中性粒细胞缺乏症而免疫功能降低和机械通气的患者中，且其是囊性纤维化患者死亡的主要原因。假单胞菌感染也涉及烧伤、眼(例如，角膜)损伤、创伤等。因此，在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含一或多种假单胞菌多糖和/或多肽。
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含假单胞菌O抗原。WellcomeResearch提供了开发基于此抗原的疫苗的大部分早期工作，将含有20种O-抗原血清型中的16种的纯化萃取物组合到 PEV-1疫苗中。1976年至1984年之间共发表了5个1-2期临床试验的结果(Jones等，1976，1978，1979，1980；Langford和Hiller，1984)。疫苗安全性数据指出其都有良好耐受性。在正常志愿者和烧伤或囊性纤维化(CF)患者的接种组中的血清转换似乎相对一致。疫苗接种对烧伤定殖具有从很小或没有效果到有显著效果的不同效果。在一项研究中的血液培养显示，因为接种疫苗而降低了近10倍。在每一个烧伤患者的研究中，尽管铜绿假单胞菌导致的死亡人数并不总是很明显，但死亡率却下降到70％至100％不等。在CF的研究中 (Langford和Hiller，1984)，疫苗接种似乎对铜绿假单胞菌定殖没有临床益处也没有差异，且抗体ELISA效价与临床或细菌学读数之间没有相关性。瑞士血清研究院、Berna Biotech和Crucell公司开发了一种八价O-抗原-外毒素A偶联疫苗(Aerugen)，该疫苗经历了三次公开的1-2期临床试验(Schaad等，1991；Lang等，1995；Cryz等，1994)。他们的肌内(IM)给药疫苗似乎有良好的耐受性，且在所有的研究中认为其对所有血清型的血清转换都是显著的。在大部分的研究中，疫苗接种导致了定殖显著减少，且在疫苗或安慰剂组中未有PA相关死亡的报告。在Crucell公司在CF患者中对476位患者的第3期研究中，疫苗并未达到先前研究中所观察到的期望指标或重复结果。
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含假单胞菌鞭毛或其抗原性部分。早期研究的功效研究(Holder等，1982； Holder和Naglich，1986；Montie等，1987)已证实，a型或b型鞭毛可在鼠类烧伤模型中提供特定类型的免于死亡的保护，但b型鞭毛似乎更擅于如此。在临床前研究中，IMMUNO AG公司(Crowe等，1991) 使用由a0、a0a1a2、a0a2、a0a3、a0a3a4和b型鞭毛组成的个别疫苗确定b抗原似乎是更好的免疫原，在免疫功能降低的小鼠模型中提供高于a型制剂的高保护率。相同论文中的第1期研究显示出，这些免疫源均引发高效价且持久的血清抗体，如同后续的第2期研究(
Figure BDA0002388953440000701
等，1995)中的单一b型免疫原，其也显示了支气管肺泡洗液中有IgG、 IgA和sIgA血清转换。在CF患者(第3期)中给予结合型的a型(a0a1a2) +b型鞭毛疫苗会产生高效价且持久的血清IgG。然而，尽管有一些针对铜绿假单胞菌肺感染的保护功效，与该疫苗不相关的血清型的存在却使结果的阐释蒙上了阴影(
Figure BDA0002388953440000702
和Dorner，1997；
Figure BDA0002388953440000703
等， 2007)。在一篇后续的评论中，
Figure BDA0002388953440000704
和Pier(2008)暗示了二价鞭毛疫苗可能不是最好的，并且说了，在包含b型鞭毛和所有a型亚型的单一疫苗中似乎不存有数据。
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含假单胞菌鞭毛蛋白或其抗原性片段。对鞭毛亚基，鞭毛蛋白的研究没有超越研究阶段。所述研究已包含纯化的鞭毛蛋白(Campodonico等，2010；Faezi等，2013)、具有鞭毛蛋白的DNA疫苗(Saha等，2007)、以及鞭毛蛋白/聚甘露糖醛酸偶联物(Campodonico等，2011)。尽管这些均具免疫原性和保护性，其似乎未达到鞭毛制剂所实现的水平。也已用抗b型血清(Barnea等，2006)、mAb抗a型(Barnea等，2009)和抗a型血清(Faezi等，2011)来研究被动免疫接种。全部的制剂均显示在小鼠烧伤模型中的死亡减少。
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含假单胞菌PcrV(分泌第III型)或其抗原性片段。与疾病严重水平相关的关键毒力因子是铜绿假单胞菌第III型分泌系统(T3SS)，其将细菌毒素直接注入宿主细胞的细胞质内。位于T3SS注射体(injectisome)复合物末梢处的PcrV蛋白对于T3SS功能是必需的，且在靶向铜绿假单胞菌的免疫预防策略的动物模型中是一个经过充分验证的标靶。基于先前对于PcrV的基础工作，在各种动物模型中主动和被动免疫接种(Sawa 等，1999；Holder等，2001；Shime等，2001；Frank等，2002)均显示出保护性，KaloBios公司已开发了”Humaneered，具高亲和力的聚乙二醇化Fab′“(KB-001)，其在临床前(Baer等，2009)和临床试验 (Francois等，2012；Milla等，2014)中作为被动疗法进行调查研究。在小鼠和”人类改造的(humaneered)”mAbs和其Fab’片段在动物研究中证实是有效的同时，使用KB-001的临床试验则显示出在铜绿假单胞菌的定殖数量、症状或肺功能测定之间并无显著差异，并且，用于在囊性纤维化患者中治疗铜绿假单胞菌感染的新改良版本的 KB-001在第2期人类临床试验中并未达到其主要指标 (ClinTrials.gov，2014)。直到本公开内容之前，关于以PcrV蛋白抗原作为活性疫苗使用的工作做得很少。
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含假单胞菌外泌多糖。在一些实施方式中，本文中所述的免疫复合物包含假单胞菌PsL。此外泌多糖对于铜绿假单胞菌附接至哺乳动物细胞，以及对于由非黏液样与黏液样铜绿假单胞菌分离株所产生的生物膜的形成和维持生物膜是重要的。PsL多糖的功能是将生物膜细胞维持在一起，因此在黏附上PsL扮演了重要的角色(Ma等，2006)。功能性的筛选显示出针对PsL表位的mAb在OPK和细胞黏附测试中会展现出极佳的活性，并在多个动物模型中会赋予显著的保护性。
多糖PsL是一种抗体可接近的非血清型相关性表面结构特征，且其在非黏液样与黏液样临床分离株中普遍存在(DiGiandomenico等， 2012)。在动物中，PsL抗体在效应细胞的存在下介导OPK，并抑制铜绿假单胞菌结合到上皮细胞。PsL推定的特异性mAb Cam-003以剂量相关性方式在小鼠的器官中被动进行保护和降低细菌承载量 (DiGiandomenico等，2012)。Cam-003在小鼠肺炎模型中对于多种铜绿假单胞菌血清型也具有保护性。类似的结果可在划伤的角膜或烧伤的小鼠模型中获得，在这两个例子，Cam-003都能有效减少感染。MEDI 3902是一种靶向非血清型相关性TTSS毒力因子PcrV与持久性因子PsL外泌多糖的双特异性抗体(DiGiandomenico等，2014)。将 MEDI 3902用于预防由假单胞菌引起的肺炎(呼吸器相关肺炎)的第1 期安全试验是已经完成(https：//clinicaltrials.gov/NCT02255760)。直到本公开内容之前，关于以PsL外泌多糖抗原作为活性疫苗使用的工作做得很少。
铜绿假单胞菌多糖
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含一或多种铜绿假单胞菌多糖。由IATS方法已知大约有20种的O-抗原血清型。该分子的O-抗原多糖对于疫苗的开发提供了无毒性的潜在目标。在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含一或多种假单胞菌OPS、LPS和/或外泌多糖。在一些实施方式中，LPS衍生的多糖是OPS。在一些实施方式中，LPS衍生的多糖是COPS。
在一些实施方式中，免疫原性复合物包含一或多种假单胞菌多糖，所述多糖是或衍生自一或多种选自O1、O2、O3、O4、O5、O6、 O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、 O19和O20的铜绿假单胞菌血清型(IATS)。在一些实施方式中，免疫原性复合物包含一或多种假单胞菌多糖，所述多糖是或衍生自一或多种选自O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10和O11或其组合的铜绿假单胞菌血清型。在一些实施方式中，免疫原性复合物包含复数假单胞菌多糖，所述多糖是或衍生自选自O1、O2、O3、O4、O5、O6、 O10和O11铜绿假单胞菌血清型中的每一种。
在一些实施方式中，免疫原性复合物包含一或多种假单胞菌多糖，所述多糖是或衍生自OPS。在一些实施方式中，所述OPS是或衍生自O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、 O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19和O20型或其组合的假单胞菌。在一些实施方式中，所述OPS是或衍生自O1、O2、O3、O4、O5、 O6、O10或O11型或其组合的假单胞菌。在一些实施方式中，所述OPS 是或衍生自O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10或O11型假单胞菌中的每一种。
在一些实施方式中，免疫原性复合物包含一或多种假单胞菌多糖，所述多糖是或衍生自荚膜或荚膜样细胞外泌多糖。在一些实施方式中，该荚膜或荚膜样多糖是或衍生自假单胞菌海藻酸盐、Psl或 Pel。
在一些实施方式中，免疫原性复合物包含一或多种假单胞菌多糖，所述多糖是或衍生自外泌多糖。在一些实施方式中，该外泌多糖是或衍生自PsL。在一些实施方式中，该PsL包括至少一表位与单克隆抗体结合，该单克隆抗体包括SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5。在一些实施方式中，结合PsL的至少一表位的单克隆抗体是或包括与 SEQ ID NO：4序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽，或其PsL结合片段。在一些实施方式中，结合 PsL的至少一表位的单克隆抗体是或包括与SEQ ID NO：5序列有至少 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽，或其PsL结合片段。在一些实施方式中，结合PsL的至少一表位的单克隆抗体是或包括与SEQ ID NO：4序列有至少80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的多肽或其PsL结合片段，以及与SEQ ID NO：5序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽或其PsL结合片段。
PsL中结合Cam-003mAb的序列SEQ ID NO：4
Figure BDA0002388953440000741
PsL中结合Cam-003mAb的序列SEQ ID NO：5
Figure BDA0002388953440000742
铜绿假单胞菌多肽
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含一或多种铜绿假单胞菌多肽。在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或衍生自铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型A1或其免疫原性片段。在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或包括SEQ ID NO：6的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或包括与 SEQ ID NO：6序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽或其免疫原性片段。
铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型A1SEQ ID NO：6
Figure BDA0002388953440000743
在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或衍生自铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B或其免疫原性片段。在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或包括SEQ ID NO：7的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或包括与SEQ ID NO：7序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽或其免疫原性片段。
铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B SEQ ID NO：7
Figure BDA0002388953440000751
在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或衍生自铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B的缺少TLR5结合基序的D2结构域或其免疫原性片段。在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或包括SEQ ID NO：10的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或包括与SEQ ID NO：10序列有至少80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的多肽或其免疫原性片段。
铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B的缺少TLR5结合基序的鞭毛蛋白D2结构域SEQID NO：10
Figure BDA0002388953440000752
在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或衍生自铜绿假单胞菌第III型分泌系统(TTSS)毒力因子PcrV或其免疫原性片段。在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或包括SEQ ID NO：8的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，铜绿假单胞菌多肽是或包括与SEQ ID NO：8序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽或其免疫原性片段。
铜绿假单胞菌第III型分泌系统(TTSS)毒力因子PcrV SEQ ID NO：8
Figure BDA0002388953440000761
大肠杆菌
即使采用最佳的抗微生物剂治疗和支持性护理，与大肠杆菌败血症相关的死亡率为20％-40％(Grandsen等，1990；Kreger等，1980； Rayner and Willcox，1988；Bryan等，1983；Cross等，1983)。明显需要有新的预防和治疗方法，包含用这些和其他革兰氏阴性细菌的抗体进行辅助治疗。尽管O-抗原特异性抗体可针对同源细菌菌株感染进行保护，鉴于革兰氏阴性细菌的血清型多样性，研究人员认为用这类抗体的免疫治疗的价值有限(Baumgartner，1990)。然而，与肠外侵入性大肠杆菌感染相关的细菌血清型的流行病学调查显示，数量有限的O血清群占了菌血症病例的近60％(Grandsen等，1990； Cross等，1984；McCabe等，1978)。因此，仍需要有效的技术来预防和/或治疗这类感染。
纯化多糖的方法
在一些实施方式中，本公开提供从一或多种细菌的细胞组分纯化本文所述的一或多种多糖的方法。在一些实施方式中，所述方法涉及从一或多种细菌的细胞组分纯化O-抗原多糖。在一些实施方式中，所述方法涉及从一或多种细菌的细胞组分纯化CPS。
在一些实施方式中，该细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施例中是肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌。
在一些实施方式中，该细胞组分包含蛋白质。在一些实施方式中，该细胞组分包含核酸。在一些实施方式中，该细胞组分包含脂质。在一些实施方式中，该细胞组分包含多糖。在一些实施方式中，该细胞组分包含部分的裂解物。
在一些实施方式中，从细菌的一或多个细胞组分纯化多糖的方法包括使细胞组分与氧化剂和酸接触以得到混合物。在一些实施方式中，该氧化剂包括亚硝酸纳。在一些实施方式中，该酸是乙酸。在一些实施方式中，该混合物的pH介于约3和约5之间。在一些实施方式中，该方法包括从该混合物中的一或多个细胞组分中分离出O- 抗原多糖。在一些实施方式中，分离的OPS在其还原末端含有游离醛。在一些实施方式中，分离的OPS含有在其还原末端含有含游离醛的 2，5-脱水甘露糖残基。在一些实施方式中，该方法包括回收OPS，其中经回收的OPS基本上不含有一或多种其他细胞组分。在一些实施方式中，经回收的OPS在其还原末端含有游离醛。在一些实施方式中，经回收的OPS在其还原末端含有含游离醛的2，5-脱水甘露糖残基。
在一些实施方式中，从革兰氏阴性细菌的一或多个细胞组分纯化多糖的方法包括使细胞组分与酸性试剂接触以得到混合物。在一些实施方式中，该混合物的pH介于约3和约5之间。在一些实施方式中，该方法包括将该混合物加热至约80℃至约135℃之间。在一些实施方式中，该方法包括从该混合物中的一或多种细胞组分中分离出核部和O-抗原多糖(COPS)。在一些实施方式中，经分离的COPS在其还原末端含有KDO。在一些实施方式中，经分离的COPS在其还原末端含有酮于KDO内。在一些实施方式中，该方法包括回收COPS，其中经回收的COPS基本上不含有一或多种其他细胞组分。在一些实施方式中，经回收的COPS在其还原末端含有酮。
亲和分子对
如本文中所述，在一些实施方式中，本公开的免疫复合物包含与一或多种聚合物和/或一或多种抗原性多糖非共价复合的一或多种多肽。在一些实施方式中，一或多种多肽经由与一或多种聚合物和/或一或多种抗原性多糖的亲和相互作用而进行复合。在一些实施方式中，本公开的免疫复合物包含使用一或多种亲和分子/互补亲和分子对，而与一或多种聚合物和/或一或多种抗原性多糖非共价复合的一或多种多肽。在一些实施方式中，免疫复合物包含(i)本文中所述的第一亲和分子，其与一或多种聚合物偶联和/或与一或多种抗原性多糖偶联；以及(ii)融合蛋白，其是或包括本文中所述的互补亲和分子和多肽。当该第一亲和分子与该互补亲和分子结合时，所述一或多种多肽与所述一或多种聚合物和/或一或多种抗原性多糖非共价复合。
在一些实施方式中，该亲和分子/互补亲和分子对选自生物素/ 生物素结合蛋白、抗体/抗原、酶/底物、受体/配体、金属/金属结合蛋白、碳水化合物/碳水化合物结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、和 His标签/His标签结合分子中的一或多种。
在一些实施方式中，该第一亲和分子是生物素(或其衍生物或片段)，且该互补亲和分子是生物素结合蛋白或其生物素结合结构域。在一些实施方式中，该生物素结合蛋白是利查维啶(rhizavidin)、亲和素(avidin)、链霉亲和素(streptavidin)、巴达维啶(bradavidin)、塔马维啶(tamavidin)、伦蒂维啶(lentiavidin)、西勃维啶(zebavidin)、中性亲和素(NeutrAvidin)、生物素连接蛋白(CaptAvidinTM)、或其生物素结合片段、或其组合。在一些实施方式中，该生物素结合片段是利查维啶或其生物素结合片段。在一些实施方式中，生物素结合蛋白包括SEQ ID NO：13的多肽或其生物素结合片段。在一些实施方式中，生物素结合蛋白包括SEQ ID NO：14的多肽或其生物素结合片段。
融合蛋白
在一些实施方式中，本文中所述的免疫复合物包含是或包括本文中所述的互补亲和分子的融合蛋白，以及本文中所述的一或多种多肽。在一些实施方式中，这类融合蛋白具有运载体和/或抗原性特性。在一些实施方式中，融合蛋白是或包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域，以及多肽。
在一些实施方式中，该生物素结合蛋白包括SEQ ID NO：13的多肽或其生物素结合片段。在一些实施方式中，该多肽是或包括与SEQ ID NO：13序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽或其生物素结合片段。在一些实施方式中，该生物素结合蛋白包括SEQ ID NO：14的多肽或其生物素结合片段。在一些实施方式中，该多肽是或包括与SEQ ID NO：14序列有至少80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽或其生物素结合片段。
在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子 (例如本文中所述的生物素结合蛋白)和一或多种衍生自肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种的多肽。
在一些实施方式中，融合蛋白包括一或多种接头和/或组氨酸标签。在一些实施方式中，接头包括包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列 (GGGGSSS)的多肽。在一些实施方式中，接头包括与SEQ ID NO：15 序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子 (例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ ID NO：7序列 (铜绿假单胞菌FlaB鞭毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子 (例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ ID NO：6序列 (铜绿假单胞菌FlaA1鞭毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子 (例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ ID NO：9序列 (铜绿假单胞菌FlaA2鞭毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。
在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子 (例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ ID NO：10序列(铜绿假单胞菌FlaB鞭毛蛋白的缺少TLR5结合基序的D2结构域) 有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子(例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ ID NO：11序列(铜绿假单胞菌FlaA1鞭毛蛋白的缺少TLR5结合基序的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子(例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ ID NO：12序列(铜绿假单胞菌FlaA2鞭毛蛋白的缺少TLR5结合基序的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子(例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌第III型分泌系统(TTSS)PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。
在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子 (例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ ID NO：7序列 (铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B)有至少80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段以及包括与SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，融合蛋白包括包括与SEQ ID NO：23序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子(例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ IDNO：10序列(铜绿假单胞菌 FliC鞭毛蛋白亚型B的缺少TLR5结合基序的D2结构域)有至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段以及包括与SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，融合蛋白包括包括与SEQ ID NO：26序列有至少80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子 (例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ ID NO：7序列 (铜绿假单胞菌FliC亚型B鞭毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段以及包括与SEQ ID NO：2序列(肺炎克雷伯氏菌的保守型 MrkA)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。
在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子 (例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ ID NO：10序列(铜绿假单胞菌FliC亚型B鞭毛蛋白的缺少TLR5结合基序的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段以及包括与SEQ ID NO：3序列(肺炎克雷伯氏菌的稳定型MrkA)有至少80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，融合蛋白包括SEQ ID NO：24的多肽。
在一些实施方式中，融合蛋白包括本文中所述的互补亲和分子 (例如本文中所述的生物素结合蛋白)以及包括与SEQ ID NO：8序列 (铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段以及包括与SEQ ID NO：3序列(肺炎克雷伯氏菌的稳定型MrkA)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。
主链聚合物
如本文中所述，在一些实施方式中，本公开的免疫复合物包含主链聚合物，该主链聚合物包括与一或多种抗原性多糖偶联的聚合物。在一些实施方式中，该聚合物是或包括多糖、多肽或合成树状聚合物。在一些实施方式中，该聚合物是或包括聚L-赖氨酸(PLL)。在一些实施方式中，该聚合物是或包括线性PLL，或L-赖氨酸树状聚合物。在一些实施方式中，该聚合物衍生自革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌的CPS。在一些实施方式中，该CPS是肺炎克雷伯氏菌CPS、铜绿假单胞菌外泌多糖和/或大肠杆菌CPS。在一些实施方式中，该聚合物是KP K19 CPS。在一些实施方式中，该聚合物是合成单糖或寡糖的树状聚合物。在一些实施方式中，该聚合物的大小是约50KDa 至约2000KDa。在一些实施方式中，该聚合物具有抗原性特性。在一些实施方式中，该聚合物不具有抗原性。在一些实施方式中，该聚合物是或包括一或多种抗原性多糖。在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖可以是肺炎克雷伯氏菌OPS、铜绿假单胞菌OPS或其组合。
主链聚合物1(BP-1)
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含主链聚合物，该主链聚合物包括与一或多种抗原性多糖偶联的聚合物。在一些实施方式中，主链聚合物包含与该聚合物偶联(例如交联或共价键合)的本文中所述的第一亲和分子(例如生物素)。在一些实施方式中，该聚合物是多糖。在一些实施方式中，该抗原性多糖是 O-抗原多糖、核部-O-抗原、或核部多糖。在一些实施方式中，该主链聚合物包含至少一生物素化的聚合物(例如多糖)以及至少一非生物素化的抗原性多糖(例如至少一O-抗原多糖)。
在一些实施方式中，包含有至少一生物素化的聚合物(例如生物素化的多糖)和至少一非生物素化的O-抗原多糖的主链聚合物的产生是通过将含有伯氨基(天然的或具有接头)的非生物素化的O- 抗原多糖与含有醛基的部分氧化的多糖以及与含有伯胺的生物素结合得到混合物；并且用还原剂还原胺化该混合物以将该O-抗原多糖 (即抗原性多糖)与该多糖(即聚合物)化学连接，由以形成包含有与非生物素化的抗原性多糖(即非生物素化的O-抗原多糖)化学连接的生物素化多糖的主链聚合物。
在一些实施方式中，该O-抗原多糖是通过间隔物而与一部分氧化的聚合物(例如多糖)化学键合。在一些实施方式中，该间隔物是短间隔物。在一些实施方式中，该短间隔物在间隔物的每一末端含有伯胺。在一些实施方式中，该间隔物可以是己二酸二酰肼。在一些实施方式中，该聚合物(例如多糖)经生物素化，而所化学连接的O-抗原多糖非经生物素化。
在一些实施方式中，O-抗原多糖包括伯氨基。在一些实施方式中，该伯氨基是铜绿假单胞菌外核O-多糖的L-丙氨酸α-氨基，或是通过用还原剂进行还原胺化以与在各末端含有伯氨基之间隔物分子化学键合而已引入到该O-抗原多糖的还原端内的氨基。在一些实施方式中，包括伯氨基的O-抗原多糖的化学键合是通过将包括伯氨基的O-抗原多糖与含有醛基的部分氧化的聚合物(例如多糖)以及与含有伯胺的生物素混合得到混合物；并且用还原剂还原胺化该混合物以形成主链聚合物，其中该聚合物(例如多糖)经生物素化，而所化学连接的O-抗原多糖非经生物素化。
在一些实施方式中，该聚合物(例如多糖)用氧化剂进行部分氧化。在一些实施方式中，该氧化剂包括过碘酸钠。在一些实施方式中，该还原剂包括氰基硼氢化钠或硼氢化钠。
主链聚合物1.2(BP-1.2)
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含主链聚合物，该主链聚合物包括与一或多种抗原性多糖偶联的聚合物。在一些实施方式中，主链聚合物包含与该聚合物偶联(例如交联或共价键合)的本文中所述的第一亲和分子(例如生物素)。在一些实施方式中，该聚合物是多糖。在一些实施方式中，该抗原性多糖是 O-抗原多糖、核部-O-抗原、或核部多糖。在一些实施方式中，该主链聚合物包含至少一生物素化的聚合物(例如多糖)以及至少一非生物素化的抗原性多糖(例如至少一O-抗原多糖)。
在一些实施方式中，包含有至少一生物素化的聚合物(例如生物素化的多糖)和至少一非生物素化的O-抗原多糖的主链聚合物的产生是通过将含有伯氨基(天然的或具有接头)的非生物素化的O- 抗原多糖与含有一或多种醛基的部分氧化的多糖结合，和通过与碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一起反应和使用该多糖的糖醛酸残基的羧酸盐而使一或多个生物素残基被引入正交位置，并且用还原剂还原胺化该混合物以将该O-抗原多糖(即抗原性多糖) 与该多糖(即聚合物)化学连接，由此形成包含与非生物素化的抗原性多糖(即非生物素化的O-抗原多糖)化学键合的生物素化多糖的主链聚合物。在一些实施方式中，该O-抗原多糖是通过间隔物而与一部分氧化的聚合物(例如多糖)化学键合。在一些实施方式中，该间隔物是短间隔物。在一些实施方式中，该短间隔物在间隔物的每一末端含有伯胺。在一些实施方式中，该间隔物可以是己二酸二酰肼。在一些实施方式中，该聚合物(例如多糖)经生物素化，而所化学键合的O-抗原多糖非经生物素化。
在一些实施方式中，O-抗原多糖包括伯氨基。在一些实施方式中，该伯氨基是铜绿假单胞菌外核O-多糖的L-丙氨酸α-氨基，或是通过用还原剂进行还原胺化以与在各末端含有伯氨基的间隔物分子化学连接而已引入到该O-抗原多糖的还原端内的氨基。在一些实施方式中，包括伯氨基的O-抗原多糖的化学连接是通过将包括伯氨基的O-抗原多糖与含有醛基的部分氧化的聚合物(例如多糖)以及与含有伯胺的生物素混合得到混合物；并且用还原剂还原胺化该混合物以形成主链聚合物，其中该聚合物(例如多糖)经生物素化，而所化学连接的O-抗原多糖非经生物素化。
在一些实施方式中，该聚合物(例如多糖)用氧化剂进行部分氧化。在一些实施方式中，该氧化剂包括过碘酸钠。在一些实施方式中，该还原剂包括氰基硼氢化钠或硼氢化钠。
在一些实施方式中，包括醛或酮的OPS通过用氰基硼氢化钠 (NaBH3CN)还原胺化，使用在各末端含有伯胺的短间隔物(例如己二酸二酰肼ADH)在其还原末端进行胺化，以产生酰肼衍生的OPS。在一些实施方式中，通过使该多糖的糖醛酸残基的羧酸盐与碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和含有伯胺的生物素衍生物(诸如(例如)胺-PEG3-生物素)一起反应，KP19 CPS主链经生物素化且有一或多个生物素残基被引入于正交位置。在一些实施方式中，经生物素化的KP 19 CPS聚合物接着用过碘酸盐部分氧化以生成一或多种醛基，与酰肼衍生的OPS混合，且该混合物用诸如氰基硼氢化钠 (NaBH3CN)的还原剂进行还原胺化，以形成在聚合物主链的糖醛残基上包括一或多个生物素部分而在O-抗原多糖上没有生物素的主链聚合物BP-1.2。
主链聚合物1.3(BP-1.3)
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含主链聚合物，该主链聚合物包括与一或多种抗原性多糖偶联的聚合物。在一些实施方式中，主链聚合物包含与该聚合物偶联(例如交联或共价键合)的本文中所述的第一亲和分子(例如生物素)。在一些实施方式中，该聚合物是多糖。在一些实施方式中，该抗原性多糖是 O-抗原多糖、核部-O-抗原、或核部多糖。在一些实施方式中，该主链聚合物包含至少一生物素化的聚合物(例如多糖)以及至少一非生物素化的抗原性多糖(例如至少一O-抗原多糖)。
在一些实施方式中，包含有至少一生物素化的聚合物(例如生物素化的多糖)和至少一非生物素化的O-抗原多糖的主链聚合物的产生是通过将含有伯氨基(天然的或具有一接头)的非生物素化的 O-抗原多糖与CDAP-活化的多糖结合，和通过与碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一起反应和使用该多糖的糖醛酸残基的羧酸盐而使一或多个生物素残基被引入正交位置，由此形成包含有与非生物素化的抗原性多糖(即非生物素化的O-抗原多糖)化学连接的生物素化多糖的主链聚合物。在一些实施方式中，该O-抗原多糖是通过间隔物而与CDAP-活化的聚合物(例如多糖)化学连接。在一些实施方式中，该间隔物是短间隔物。在一些实施方式中，该短间隔物在间隔物的每一末端含有伯胺。在一些实施方式中，该间隔物可以是己二酸二酰肼。在一些实施方式中，该聚合物(例如多糖) 经生物素化，而所化学连接的O-抗原多糖非经生物素化。
在一些实施方式中，包括醛或酮的OPS是通过用氰基硼氢化钠 (NaBH3CN)还原胺化，使用在各末端含有伯胺的短间隔物(例如己二酸二酰肼ADH)在其还原末端进行胺化，以产生酰肼衍生的OPS。在一些实施方式中，通过使该多糖的糖醛酸残基的羧酸盐与碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和含有伯胺的生物素衍生物(诸如(例如)胺-PEG3-生物素)一起反应，KP19 CPS主链经生物素化且有一或多个生物素残基被引入于正交位置。在一些实施方式中，经生物素化的KP 19 CPS聚合物接着用CDAP活化，与酰肼衍生的OPS 混合，以形成在聚合物主链的糖醛残基上包括一或多个生物素部分而在O-抗原多糖上没有生物素的主链聚合物BP-1.3。
主链聚合物2a(BP-2a)
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含主链聚合物，该主链聚合物包括与一或多种抗原性多糖偶联的聚合物。在一些实施方式中，主链聚合物包含与该聚合物偶联(例如交联或共价键合)的本文中所述的第一亲和分子(例如生物素)，且包含与一或多种抗原性多糖偶联(例如交联或共价键合)的本文中所述的第一亲和分子(例如生物素)。在一些实施方式中，该聚合物是多糖。在一些实施方式中，该抗原性多糖是O-抗原多糖。在一些实施方式中，该主链聚合物包含至少一生物素化的聚合物(例如多糖) 以及至少一生物素化的O-抗原多糖。
在一些实施方式中，包含有至少一生物素化的聚合物(例如生物素化的多糖)和至少一生物素化的O-抗原多糖的主链聚合物的产生是通过将含有伯氨基(天然的或具有接头)的O-抗原多糖与含有醛基的部分氧化的聚合物结合以得到混合物；并且用还原剂还原胺化该混合物以将该O-抗原多糖与该聚合物(例如多糖)化学连接，由此形成包含有O-抗原多糖和聚合物(例如多糖)的主链聚合物；并用CDAP或另一氰基化试剂(例如CNBr)和含有伯胺的生物素来衍生化该主链聚合物，由此形成包含有经生物素化聚合物与经生物素化O-抗原和聚合物多糖化学键合的主链聚合物(例如经生物素化的多糖)。
在一些实施方式中，该O-抗原多糖通过间隔物与一部分氧化的多糖主链化学键合。在一些实施方式中，该间隔物是短间隔物。在一些实施方式中，该短间隔物在间隔物的每一末端含有伯胺。在一些实施方式中，该间隔物可以是己二酸二酰肼。
在一些实施方式中，O-抗原多糖包括伯氨基。在一些实施方式中，该伯氨基是铜绿假单胞菌外核O-抗原多糖的L-丙氨酸α-氨基，或是通过用还原剂进行还原胺化以与在各末端含有伯氨基的短间隔物分子化学键合而已引入到该O-抗原多糖的还原端内的氨基。
在一些实施方式中，该聚合物(例如多糖)用氧化剂进行部分氧化。在一些实施方式中，该氧化剂包括过碘酸钠。在一些实施方式中，该还原剂包括氰基硼氢化钠或硼氢化钠。
主链聚合物2b(BP-2b)
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含主链聚合物，该主链聚合物包括与一或多种抗原性多糖偶联的聚合物。在一些实施方式中，主链聚合物包含与该抗原性多糖偶联(例如交联或共价键合)的本文中所述的第一亲和分子(例如生物素)。在一些实施方式中，该聚合物是多糖。在一些实施方式中，该抗原性多糖是O-抗原多糖。在一些实施方式中，该主链聚合物包含至少一非生物素化的聚合物(例如多糖)以及至少一生物素化的O-抗原多糖。
在一些实施方式中，包含有至少一非生物素化的聚合物(例如非生物素化的多糖)和至少一生物素化的O-抗原多糖的主链聚合物的产生是通过用CDAP和含有伯胺的生物素将包括该O多糖重复和一或多种核部α KDO和/或庚糖部分的O-抗原多糖生物素化，以得到经生物素化的O-抗原多糖混合物；用过碘酸钠部分氧化该经生物素化的OPS混合物以将醛引入核部KDO和/或庚糖部分和/或OPS残基内；用己二酸二酰肼将该生物素化多糖还原胺化；将经生物素化的和胺化的OPS与一部分氧化的聚合物(例如多糖)混合以形成混合物；并还原胺化该混合物；由此形成含有非生物素化的聚合物(例如多糖) 和生物素化且化学连接的O-抗原多糖的主链聚合物。
在一些实施方式中，该O-抗原多糖用氧化剂进行部分氧化。在一些实施方式中，该氧化剂包括过碘酸钠。在一些实施方式中，该还原剂包括氰基硼氢化钠或硼氢化钠。
主链聚合物3(BP-3)
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包含主链聚合物，该主链聚合物包括与一或多种抗原性多糖偶联的聚合物。在一些实施方式中，主链聚合物包含与该抗原性多糖偶联(例如交联或共价键合)的本文中所述的第一亲和分子(例如生物素)。在一些实施方式中，该聚合物是聚-L-赖氨酸(PLL)聚合物。在一些实施方式中，该抗原性多糖是O-抗原多糖。在一些实施方式中，该主链聚合物包含至少一经生物素化的O-抗原多糖以及PLL聚合物。
在一些实施方式中，包含有至少一非生物素化的聚合物(例如非生物素化的PLL聚合物)和至少一生物素化的O-抗原多糖的主链聚合物的产生是通过用PLL聚合物的ε-NH2基团胺化含有醛末端或 KDO的O-抗原多糖以产生OPS PLL聚合物；用酰化剂处理或不处理该混合物，以加帽PLL聚合物的未反应的ε-NH2基团；用CDAP将该 OPS衍生化以形成衍生混合物；且将该衍生混合物与含有伯胺的生物素混合；由此制备主链聚合物，其中经加帽的N-酰化PLL聚合物或未经加帽的PLL未经生物素化，而该化学连接的O-抗原多糖经生物素化。
在一些实施方式中，该酰化剂是醋酸酐或乙酰氯。
在一些实施方式中，“点击化学”将在其羧酸盐基团上配备有炔官能团或氧化的多糖醛的聚合物(例如多糖)连接到在其末端用叠氮基团衍生的O-抗原多糖。这两个多糖的点击连接以在水介质中的催化剂进行。O-抗原多糖与该多糖的点击连接可以用与OPS连接的叠氮基团和与该多糖连接的炔基反向使用，反之亦然。生物素化可以使用此化学选择性在多糖上产生主链聚合物-1或在O-抗原多糖上产生主链聚合物-2b。
在一些实施方式中，用于炔-叠氮化物环加成反应的催化剂是硫酸铜。在一些实施方式中，将该多糖衍生化的炔基团选自由以下组成的组：1-氨基-3-丁炔、1-氨基-4-戊炔、DBCO-胺和炔-PEG4-胺。
在一些实施方式中，将该O-抗原多糖在其还原末端衍生化的叠氮化物基团选自由以下组成的组：氨基-PEG-叠氮基、叠氮基-PEG3- 胺、叠氮基-丙胺和叠氮基-丁胺。
免疫原性复合物的用途
在一些实施方式中，本文中所述的包含有一或多种免疫原性多糖的免疫原性复合物的特征在于，一或多种抗原性多糖的免疫原性或调理作用潜能中的一或多种在用ELISA和/或用功能性抗体测定法测量时相对于预定水平增加。在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖的免疫原性或调理作用潜能中的一或多种在用ELISA和/或用功能性抗体测定法测量时相对于预定水平增加至少1倍、2倍、3倍、 4倍或5倍。在一些实施方式中，该预定水平是免疫前水平。在一些实施方式中，该一或多种抗原性多糖的表位配价高于天然多糖至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。在一些实施方式中，一或多种多肽抗原是用于一或多种抗原性多糖的载体蛋白。
在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物用ELISA测量以大于仅包括抗原性多糖而不包括该主链聚合物的组合物的水平，诱导该对象中的抗一或多种病原体的抗体产生。在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物用ELISA测量以大于包括该主链聚合物而非单仅有抗原性多糖的组合物的水平，诱导该对象中的抗一或多种病原体的抗体产生。
在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物以大于仅包括抗原性多糖而不包括该主链聚合物的组合物的水平，诱导该对象中的抗一或多种病原体的免疫反应。在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物以大于包括该主链聚合物而非单仅有抗原性多糖的组合物的水平，诱导该对象中的抗一或多种病原体的免疫反应。在一些实施方式中，该免疫反应是抗体或B细胞反应。在一些实施方式中，该免疫反应是CD4+T细胞反应，包含Th1、Th2或Th17反应，或是CD8+T细胞反应，或是 CD4+/CD8+T细胞反应。在一些实施方式中，该免疫反应是抗体或B 细胞反应以及T细胞反应。
在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物用ELISA测量以大于仅包括多肽抗原而不包括该主链聚合物的组合物的水平，诱导该对象中的抗一或多种病原体的抗体产生。在一些实施方式中，该一或多种病原体选自克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌。在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物引发对抗克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种的免疫反应。
在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物引发对抗革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌的免疫反应。在一些实施方式中，该革兰氏阴性细菌选自克雷伯氏菌、假单胞菌、大肠杆菌、及其组合。在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物引发会识别表达MrkA的肺炎克雷伯氏菌上的天然MrkA的抗体。
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物包括一或多种多肽抗原。在一些实施方式中，该一或多种多肽抗原是细菌多肽、真菌多肽、和/或病毒多肽。在一些实施方式中，该一或多种多肽抗原是衍生自克雷伯氏菌、假单胞菌和/或大肠杆菌多肽的多肽。
在一些实施方式中，所述抗原性多糖中的至少一种是铜绿假单胞菌外泌多糖PsL。在一些实施方式中，PsL包括至少一表位与单克隆抗体结合，该单克隆抗体包括与SEQ IDNO：4序列有至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列和/或与SEQ ID NO：5序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的序列(Cam-003)。在一些实施方式中，至少一多肽抗原包括与SEQ ID NO：1序列(肺炎克雷伯氏菌第I型菌毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，至少一多肽抗原包括与 SEQ ID NO：2序列(肺炎克雷伯氏菌保守III型菌毛蛋白MrkA)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或与单体稳定型MrkA SEQ ID NO：3序列有至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段。在一些实施方式中，至少一多肽抗原是铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型A、铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B、或其免疫原性片段。在一些实施方式中，至少一多肽抗原包括与SEQ ID NO：6序列(亚型A1)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO：9序列(亚型 A2)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其免疫原性片段。
免疫原性复合物的制备
本公开包含用于制备本文中所述的免疫原性复合物的方法。在一些实施方式中，制备免疫原性复合物的方法包括将至少一生物素化的主链聚合物与至少一生物素结合融合蛋白复合。在一些实施方式中，该融合蛋白包括与SEQ ID NO：16至26中的任一种有至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
疾病、病症和病况
在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物(例如包括本文中所述的免疫原性复合物的组合物)用ELISA 测量以大于包括抗原性多糖而不包括该主链聚合物的组合物的水平，诱导该对象中的抗一或多种病原体的抗体产生。在一些实施方式中，所述一或多种病原体选自克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌。
在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物(例如包括本文中所述的免疫原性复合物的组合物)引发该对象中的抗一或多种病原体的免疫反应。在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物以大于包括抗原性多糖而不包括该主链聚合物的组合物的水平，引发该对象中的抗一或多种病原体的免疫反应。在一些实施方式中，所述一或多种病原体选自克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌。
在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物(例如包括本文中所述的免疫原性复合物的组合物)用以治疗或预防感染。在一些实施方式中，所述感染是烧烫伤感染、GI感染、手术部位感染、尿道感染、角膜感染、皮肤和/或软组织感染、糖尿病伤口感染、装置相关感染(例如导管、外科植入物、假体)。在一些实施方式中，当给予对象时，本文中所述的免疫原性复合物用以治疗或预防肺炎、败血症和/或定殖。
免疫原性组合物与制剂
本说明书也提供了包含有一或多种本文中所述的免疫原性复合物的组合物。例如，免疫原性复合物(例如)疫苗组合物可包含一或多种本文中所述的免疫原性复合物。在一些实施方式中，这类组合物可包含多种本文中所述的免疫原性复合物的一种类型。另外地或替代性地，这类组程物可包含多种本文中所述的免疫原性复合物的超过一种的类型。在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物配制成医药组合物。在一些实施方式中，医药组合物可以是疫苗。在一些实施方式中，医药组合物包括医药学上可接受的运载体。
在一些实施方式中，疫苗组合物是多重效价或多价疫苗。在一些实施方式中，疫苗组合物的配价是指该疫苗组合物中存在的免疫原性复合物类型数量。本文中所述的疫苗的配价并不局限于所述医药组合物、免疫原性复合物或疫苗中的全部抗原，也不局限于给予所述医药组合物、免疫原性复合物或疫苗组合物所可能诱导免疫保护反应的病原体菌株数量。在一非限制性的实施例中，12价的疫苗组合物可包括超过12种抗原性组合物(例如，肽和/或多糖组合物)，且可针对超过12种病原体或致病菌株诱导免疫保护反应。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括1至50种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物包括1至25种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物包括1至15种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物包括1至10种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物包括1至5种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗是多重效价疫苗。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物包括1种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物包括2种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物包括4种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物包括6种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物包括8种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物包括10种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物包括12种类型的免疫原性复合物。在一些实施方式中，疫苗组合物在数量上包括二或更多种类型的免疫原性复合物，使得在来自于各个免疫原性组合物的疫苗组合物中的OPS重量有所不同，例如以非约1∶1的w/w比例存在。在一些实施方式中，疫苗组合物在数量上包括二或更多种类型的免疫原性复合物，使得在来自于各个免疫原性组合物的疫苗组合物中的OPS重量大约相同，例如以约1∶1的w/w比例存在。在一些实施方式中，在来自于各个免疫原性组合物的疫苗中的OPS重量约为1μg。在一些实施方式中，在来自于各个免疫原性组合物的疫苗中的OPS重量约为2μg。在一些实施方式中，在来自于各个免疫原性组合物的疫苗中的OPS重量约为3μg。在一些实施方式中，在来自于各个免疫原性组合物的疫苗中的OPS重量约为4μg。在一些实施方式中，在来自于各个免疫原性组合物的疫苗中的OPS重量约为5μg。
在一些实施方式中，疫苗组合物在数量上包括二或更多种类型的免疫原性复合物，使得在来自于各个免疫原性组合物的疫苗组合物中的OPS与CPS的总重量有所不同，例如以非约1∶1的w/w比例存在。在一些实施方式中，疫苗组合物在数量上包括二或更多种类型的免疫原性复合物，使得在来自于各个免疫原性组合物的疫苗组合物中的OPS与CPS的总重量有所不同，例如以非约1∶1的w/w比例存在。在一些实施方式中，疫苗组合物在数量上包括二或更多种类型的免疫原性复合物，使得在来自于各个免疫原性组合物的疫苗组合物中的OPS与CPS的总重量大约相同，例如以约1∶1的w/w比例存在。在一些实施方式中，在来自于各个免疫原性组合物的疫苗中的OPS 与CPS的总重量约为1μg。在一些实施方式中，在来自于各个免疫原性组合物的疫苗中的OPS与CPS的总重量约为2μg。在一些实施方式中，在来自于各个免疫原性组合物的疫苗中的OPS重量约为3μg。在一些实施方式中，在来自于各个免疫原性组合物的疫苗中的OPS与 CPS的总重量约为4μg。在一些实施方式中，在来自于各个免疫原性组合物的疫苗中的OPS与CPS的总重量约为5μg。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括二或更多种类型的选自以下的免疫原性组合物：
(a)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(b)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(b’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(c)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(d)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(d’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(e)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(e’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(f)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(f’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(g)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(g’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PAO3OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(h)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(h’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(i)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(j)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(k)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(1)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括二或更多种类型的选自以下的免疫原性组合物：
(a)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(a’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O1OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(b)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(b’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(c)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(c’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(d)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(d’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(e)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(e’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(f)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(f’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(g)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(g’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(h)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(h’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(i)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(i’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(j)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(i’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(k)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(k’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(1)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(1’)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(b)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(c)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(d)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(e)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(f)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(g)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(h)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(i)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(i)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(k)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(1)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(b)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(c)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(d)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(e)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(f)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(g)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(h)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(i)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(j)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(k)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(1)包括主链聚合物的免疫原性组合物，该主链聚合物包括聚合物，该聚合物包括生物素化的克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与该克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11OPS、和与该经生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括二或更多种类型的选自以下的免疫原性组合物：
(a)包括KP O1 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；
(a’)包括KP O1 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物；
(b)包括KP O2 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；
(b’)包括KP O2 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物；
(c)包括KP O3 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；
(c’)包括KP O3 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物；
(d)包括KP O5 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；
(d’)包括KP O5 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物；
(e)包括PA O1 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；
(e’)包括PA O1 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物；
(f)包括PA O2 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；
(f’)包括PA O2 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物；
(g)包括PA O3 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；
(g’)包括PA O3 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物；
(h)包括PA O4 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；
(h’)包括PA O4 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物；
(i)包括PA O5 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；
(i’)包括PA O5 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物；
(j)包括PA O6 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；
(j’)包括PA O6 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物；
(k)包括PA O10 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；
(k’)包括PA O10 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物；
(1)包括PA O11 OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物；以及
(1’)包括PA O11 OPS和FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物。
在一些实施方式中，一或多种类型的免疫原性组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该 FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括选自以下的免疫原性组合物：
(a)包括O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS和FlaBD2-MrkA 融合蛋白的组合的免疫原性组合物；以及
(b)包括O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS和FlaBD2-MrkA融合蛋白的组合的免疫原性组合物。
在一些实施方式中，一或多种类型的免疫原性组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，肺炎克雷伯氏菌OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该 FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)免疫原性组合物，包括：
(i)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS及其任意组合；和
(ii)FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及/或
(b)免疫原性组合物，其包括：
(i)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS及其任意组合；和
(ii)FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，一或多种类型的免疫原性组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括选自以下的免疫原性组合物：
(a)包括O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS、FlaBD2-PcrV 融合蛋白和FlaBD2-MrkA融合蛋白的组合的免疫原性组合物；以及
(b)包括O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS、FlaBD2-PcrV融合蛋白和FlaBD2-MrkA融合蛋白的组合的免疫原性组合物。
在一些实施方式中，该疫苗进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该聚合物偶联。在一些实施方式中，该聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS；以及
(b)一或多种多肽，其包括与SEQ ID NO：1-3、6-12、或16-26 中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，该一或多种OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种多肽与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该一或多种多肽与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS；以及
(b)一或多种多肽，其包括与SEQ ID NO：1-3、6-12、或16-26 中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种多肽与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中， OPS和该一或多种多肽与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS；
(b)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS；以及
(c)一或多种多肽，其包括与SEQ ID NO：1-3、6-12、或16-26 中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种多肽与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中， OPS和该一或多种多肽与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS；以及
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS；以及
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS；
(b)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS；以及
(c)FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS；以及
(b)FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS；以及
(b)FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS；
(b)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS；
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS、该FlaBD2-MrkA融合蛋白和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS；以及
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS、该FlaBD2-MrkA融合蛋白和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS；
(b)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS；和
(c)FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(d)FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，该疫苗组合物进一步包括一或多种聚合物。在一些实施方式中，OPS与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS、该FlaBD2-MrkA融合蛋白和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种聚合物偶联；以及
(b)一或多种多肽，其包括与SEQ ID NO：1-3、6-12、或16-26 中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该一或多种多肽与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该一或多种多肽与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS，其中该铜绿假单胞菌OPS与一或多种聚合物偶联；以及
(b)一或多种多肽，其包括与SEQ ID NO：1-3、6-12、或16-26 中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该一或多种多肽与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该一或多种多肽与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种第一聚合物偶联；
(b)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS，其中该铜绿假单胞菌OPS与一或多种第二聚合物偶联；以及
(c)一或多种多肽，其包括与SEQ ID NO：1-3、6-12、或16-26 中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该一或多种多肽与该一或多种第一聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种多肽与该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种多肽与该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物是相同的。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物是不同的。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物包括一来自第一病原体的荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种第二聚合物包括一来自第二病原体的荚膜多糖。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是不同的细菌。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是相同血清型的相同细菌。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是不同血清型的相同细菌。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物包括PLL。在一些实施方式中，该一或多种第二聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种聚合物偶联；以及
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS，其中该铜绿假单胞菌OPS与一或多种聚合物偶联；以及
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种聚合物偶联；
(b)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS，其中该铜绿假单胞菌OPS与一或多种第二聚合物偶联；以及
(c)FlaBD2-MrkA融合蛋白。
在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第一聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物是相同的。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物是不同的。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物包括一来自第一病原体的荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种第二聚合物包括一来自第二病原体的荚膜多糖。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是不同的细菌。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是相同血清型的相同细菌。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是不同血清型的相同细菌。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物包括PLL。在一些实施方式中，该一或多种第二聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS，其中该铜绿假单胞菌OPS与一或多种聚合物偶联；以及
(b)FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种第一聚合物偶联；
(b)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS，其中该铜绿假单胞菌OPS与一或多种第二聚合物偶联；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第一聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物是相同的。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物是不同的。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物包括一来自第一病原体的荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种第二聚合物包括一来自第二病原体的荚膜多糖。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是不同的细菌。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是相同血清型的相同细菌。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是不同血清型的相同细菌。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物包括PLL。在一些实施方式中，该一或多种第二聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种聚合物偶联；
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该 FlaBD2-MrkA融合蛋白和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS、该FlaBD2-MrkA融合蛋白和该 FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS，其中该铜绿假单胞菌OPS与一或多种聚合物偶联；
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该 FlaBD2-MrkA融合蛋白和该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，OPS、该FlaBD2-MrkA融合蛋白和该 FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种第一聚合物偶联；
(b)一或多种O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS，其中该铜绿假单胞菌OPS与一或多种第二聚合物偶联；和
(c)FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(d)FlaBD2-PcrV融合蛋白。
在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物是相同的。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物是不同的。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物包括一来自第一病原体的荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种第二聚合物包括一来自第二病原体的荚膜多糖。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是不同的细菌。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是相同血清型的相同细菌。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是不同血清型的相同细菌。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物包括PLL。在一些实施方式中，该一或多种第二聚合物包括PLL。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第一聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第一聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第一聚合物偶联，而该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第一聚合物偶联，而该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA 融合蛋白与该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物偶联。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括二或更多种类型的选自以下的免疫原性组合物：
(a)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的KP O1 OPS的免疫原性组合物；
(a’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的KP O1 OPS的免疫原性组合物；
(b)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的KP O2 OPS的免疫原性组合物；
(b’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的KP O2 OPS的免疫原性组合物；
(c)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的KP O3 OPS的免疫原性组合物；
(c’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的KP O3 OPS的免疫原性组合物；
(d)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的KP O5 OPS的免疫原性组合物；
(d’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的KP O5 OPS的免疫原性组合物；
(e)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的PA O1 OPS的免疫原性组合物；
(e’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的PA O1 OPS的免疫原性组合物；
(f)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的PA O2 OPS的免疫原性组合物；
(f’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的PA O2 OPS的免疫原性组合物；
(g)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的PA O3 OPS的免疫原性组合物；
(g’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的PA O3 OPS的免疫原性组合物；
(h)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的PA O4 OPS的免疫原性组合物；
(h’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的PA O4 OPS的免疫原性组合物；
(i)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的PA O5 OPS的免疫原性组合物；
(i’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的PA O5 OPS的免疫原性组合物；
(j)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的PA O6 OPS的免疫原性组合物；
(j’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的PA O6 OPS的免疫原性组合物；
(k)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的PA O10 OPS的免疫原性组合物；
(k’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的PA O10 OPS的免疫原性组合物；
(1)包括与FlaBD2-MrkA融合蛋白共价连接的PA O11 OPS的免疫原性组合物；以及
(1’)包括与FlaBD2-PcrV融合蛋白共价连接的PA O11 OPS的免疫原性组合物。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括二或更多种类型的选自以下的免疫原性组合物：
(a)包括聚合物、KP O1 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或KP O1 OPS共价连接；
(a’)包括聚合物、KP O1 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或KP O1 OPS共价连接；
(b)包括聚合物、KP O2 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或KP O2 OPS共价连接；
(b’)包括聚合物、KP O2 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或KP O2 OPS共价连接；
(c)包括聚合物、KP O3 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或KP O3 OPS共价连接；
(c’)包括聚合物、KP O3 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或KP O3 OPS共价连接；
(d)包括聚合物、KP O5 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或KP O5 OPS共价连接；
(d’)包括聚合物、KP O5 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或KP O5 OPS共价连接；
(e)包括聚合物、PA O1 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O1 OPS共价连接；
(e’)包括聚合物、PA O1 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O1 OPS共价连接；
(f)包括聚合物、PA O2 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O2 OPS共价连接；
(f’)包括聚合物、PA O2 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O2 OPS共价连接；
(g)包括聚合物、PA O3 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O3 OPS共价连接；
(g’)包括聚合物、PA O3 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O3 OPS共价连接；
(h)包括聚合物、PA O4 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O4 OPS共价连接；
(h’)包括聚合物、PA O4 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O4 OPS共价连接；
(i)包括聚合物、PA O5 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O5 OPS共价连接；
(i’)包括聚合物、PA O5 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O5 OPS共价连接；
(i)包括聚合物、PA O6 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O6 OPS共价连接；
(j’)包括聚合物、PA O6 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O6 OPS共价连接；
(k)包括聚合物、PA O10 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O10 OPS共价连接；
(k’)包括聚合物、PA O10 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O10 OPS共价连接；
(l)包括聚合物、PA O11 OPS、与FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O11 OPS共价连接；以及
(1’)包括聚合物、PA O11 OPS、与FlaBD2-PcrV融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或PA O11 OPS共价连接。
在一些实施方式中，至少一聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括选自以下的免疫原性组合物：
(a)包括聚合物，O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS的组合，和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接；以及
(b)包括聚合物，O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS的组合，和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该融合蛋白与该聚合物和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，至少一聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括选自以下的免疫原性组合物：
(a)包括一或多种第一聚合物，O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS的组合，FlaBD2-PcrV融合蛋白，和FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第一聚合物的至少一部分和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接，且其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第一聚合物的至少一部分和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接；以及
(b)包括一或多种第二聚合物，O1、O2、O3、O4、O5、O6、 O10、O11型铜绿假单胞菌OPS的组合，FlaBD2-PcrV融合蛋白，和 FlaBD2-MrkA融合蛋白的免疫原性组合物，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第二聚合物的至少一部分和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接，且其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第二聚合物的至少一部分和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第一聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第一聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第一聚合物偶联，且该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第一聚合物偶联，且该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物偶联。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物是相同的。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物和该一或多种第二聚合物是不同的。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物包括来自第一病原体的荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种第二聚合物包括来自第二病原体的荚膜多糖。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是不同的细菌。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是相同血清型的相同细菌。在一些实施方式中，该第一病原体和该第二病原体是不同血清型的相同细菌。在一些实施方式中，该一或多种第一聚合物包括PLL。在一些实施方式中，该一或多种第二聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种；以及
(c)包括与SEQ ID NO：1-3、6-12或16至26中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中该多肽与该一或多种聚合物和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种；以及
(c)包括与SEQ ID NO：1-3、6-12或16至26中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中该多肽与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种；
(c)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种；以及
(d)包括与SEQ ID NO：1-3、6-12或16至26中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中该多肽与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种；以及
(c)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种；以及
(c)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种；
(c)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种；以及
(d)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种；
(c)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种；以及
(d)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种；
(c)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接；以及
(d)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种；以及
(c)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接；以及
(d)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种；
(c)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种；以及
(d)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接；以及
(e)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种聚合物共价连接；以及
(b)包括与SEQ ID NO：1-3、6-12或16至26中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中该多肽与该聚合物的至少一部份和/ 或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种，其中该铜绿假单胞菌OPS与该一或多种聚合物共价连接；以及
(b)包括与SEQ ID NO：1-3、6-12或16至26中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中该多肽与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种聚合物共价连接；
(b)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种，其中该铜绿假单胞菌OPS与该一或多种聚合物共价连接；以及
(c)包括与SEQ ID NO：1-3、6-12或16至26中的一或多种的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中该多肽与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种聚合物共价连接；以及
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种，其中该铜绿假单胞菌OPS与该一或多种聚合物共价连接；以及
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种聚合物共价连接；
(b)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种，其中该铜绿假单胞菌OPS与该一或多种聚合物共价连接；以及
(c)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)一或多种聚合物；
(b)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种，其中该铜绿假单胞菌OPS与该一或多种聚合物共价连接；以及
(b)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种聚合物共价连接；
(b)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种，其中该铜绿假单胞菌OPS与该一或多种聚合物共价连接；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种聚合物共价连接；
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种，其中该铜绿假单胞菌OPS与该一或多种聚合物共价连接；
(b)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接；以及
(c)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS中的一或多种，其中该肺炎克雷伯氏菌OPS与一或多种聚合物共价连接；
(b)O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS 中的一或多种，其中该铜绿假单胞菌OPS与该一或多种聚合物共价连接；
(c)FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中该FlaBD2-MrkA融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接；以及
(d)FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中该FlaBD2-PcrV融合蛋白与该一或多种聚合物的至少一部份和/或所述OPS类型中的至少一种共价连接。
在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
在一些实施方式中，疫苗组合物包括：
(a)包括聚合物、与该聚合物偶联的KP O1 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-MrkA融合蛋白的第一免疫原性组合物；
(b)包括聚合物、与该聚合物偶联的KP O2 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-PcrV融合蛋白的第二免疫原性组合物；
(c)包括聚合物、与该聚合物偶联的KP O3 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-MrkA融合蛋白的第三免疫原性组合物；
(d)包括聚合物、与该聚合物偶联的KP O5 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-PcrV融合蛋白的第四免疫原性组合物；
(e)包括聚合物、与该聚合物偶联的PA O1 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-PcrV融合蛋白的第五免疫原性组合物；
(f)包括聚合物、与该聚合物偶联的PA O2 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-PcrV融合蛋白的第六免疫原性组合物；
(g)包括聚合物、与该聚合物偶联的PA O3 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-PcrV融合蛋白的第七免疫原性组合物；
(h)包括聚合物、与该聚合物偶联的PA O4 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-PcrV融合蛋白的第八免疫原性组合物；
(i)包括聚合物、与该聚合物偶联的PA O5 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-MrkA融合蛋白的第九免疫原性组合物；
(j)包括聚合物、与该聚合物偶联的PA O6 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-MrkA融合蛋白的第十免疫原性组合物；
(k)包括聚合物、与该聚合物偶联的PA O10 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-MrkA融合蛋白的第十一免疫原性组合物；以及
(1)包括聚合物、与该聚合物偶联的PA O11 OPS、和与该聚合物共价连接的FlaBD2-MrkA融合蛋白的第十二免疫原性组合物。
在一些实施方式中，所述聚合物中的至少一种包括荚膜多糖。在一些实施方式中，该荚膜多糖是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。在一些实施方式中，该一或多种聚合物包括PLL。
通过涉及在对象中合适的免疫反应观察的标准研究可确定特定疫苗的最佳组分含量。在初次接种疫苗后，对象可以适当时间间隔接受一次或数次加强免疫接种。
本文中所述的免疫原性复合物，和/或其制剂，可配制成单位剂型以易于给药并使剂量一致。任何特定患者或生物体的特定治疗有效剂量水平可取决于多种因素，包含感染风险的严重水平或水平；所用特定疫苗或疫苗组合物的活性；所用特定疫苗或疫苗组合物的其他特性；年龄、体重、总体健康状况、对象性别、对象的饮食、对象的药物动力学状况、给药时间(例如，关于对象的其他活动，诸如进食、睡眠、接受包含其他疫苗剂量的其他药物等)、给予途径、所用特定疫苗或疫苗组合物的排泄率；与所用疫苗组合物组合或同时使用的疫苗；以及医学领域中众所周知的类似因素。
可以根据已知技术将根据本发明使用的免疫原性复合物配制成组合物(例如，药物组合物)。疫苗的制备大致上描述于Vaccine Design(Powell和Newman，1995)之中。例如，免疫原性量的疫苗产物可与一或多种有机或无机、液体或固体的医药学上合适运载体材料一起配制。肺炎球菌多糖与偶联疫苗的制备描述于(例如)2006年3 月31日提交的美国专利发明第11/395,593号之中，其内容以引用方式纳入本文中。
一般而言，医药学上可接受的运载体包含溶剂、分散介质等，其与药物给药相容。例如，可当成医药学上可接受的运载体的材料包含(但不限于)诸如乳糖、葡萄糖、右旋糖和蔗糖；诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉的淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；诸如可可脂和栓剂蜡的赋形剂；诸如花生油、棉籽油、红花子油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油的油类；诸如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇的多元醇；诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯的酯类；琼脂；诸如氢氧化镁的缓冲剂；海藻酸；无热原水；等渗透压盐水；林格氏液；乙醇、磷酸盐缓冲液、以及诸如月桂酸硫酸钠和硬脂酸镁的其他无毒兼容的润滑剂，以及防腐剂和根据调制者判断也可存在于该组合物中的抗氧化剂(Martin，1975)。
疫苗可通过任何可用的方法将本文中所公开的一或多种免疫原性复合物与运载体和/或其他可选择的成分组合配制，包含(例如)常用的混合、制粒、溶解、冻干或类似过程。
可以将用于所提供方法中的疫苗组合物冻干直至其即将使用时，此时其以稀释剂临场重建。在一些实施方式中，疫苗成分或组合物在一或多种其他组分(例如佐剂)的存在下冻干，并用盐水溶液临场重建。替代性地，可以单独冻干和/或储存个别的组分或一组组分(例如在疫苗接种试剂盒中)，将组分重建并在使用前混合或分别给予对象。
冻干可以产生更稳定的组合物(例如通过预防或降低多糖抗原的分解)。疫苗或疫苗组分的冻干法在本领域中是众所周知的。通常，液体疫苗或疫苗组分通常在抗结块剂(诸如(例如)，诸如蔗糖或乳糖的糖类)的存在下冷冻干燥。在一些实施方式中，抗结块剂例如以10-200mg/ml的初始浓度存在。冻干通常出现在一系列的步骤中，例如在-69℃下开始一个循环，在3小时内逐渐调整到-24℃，接着保持此温度18小时，接着在1小时内逐渐调整到-16℃，接着维持此温度6小时，接着在3小时内逐渐调整到+34℃，最后保持此温度超过9小时。
根据本发明使用的疫苗或疫苗组分可纳入脂质体、脂质卷、诸如聚丙交酯、聚乙交酯和聚丙交酯-共-乙交酯的可生物降解的聚合物、或免疫刺激复合物(ISCOMS)中。
在某些情况下，可能期望能延长疫苗的效果或根据本发明使用，例如通过减缓一或多种疫苗组分的吸收。这样的延迟吸收可通过(例如)使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。产物的吸收速率接着取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于大小和形式。替代性地或另外地，延迟吸收可通过将一或多种疫苗组分溶解于或悬浮于油性运载体中来实现。也可利用可注射的贮存形式来延迟吸收。这类贮存形式可通过形成具有一或多种疫苗组分的微胶囊底物的可生物降解聚合物网络来制备。取决于聚合物与疫苗组分的比例，以及所用的特定聚合物的性质，而可控制释放速率。
可根据本发明而利用的可生物降解聚合物示例包含(例如)聚(原酸酯)和聚(酸酐)。一特定的示例性聚合物是聚丙交酯和聚乙交酯。
可注射的贮存型制剂也可通过将产物包埋在与身体组织兼容的脂质体或微乳液中来制备。
聚合物递送系统也可用于非贮存型制剂，包含(例如)口服制剂。例如，可生物降解的、生物兼容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸等可用于口服制剂中。多糖抗原或偶联物可与这类聚合物一起配制，以(例如)制备颗粒、微粒、挤出物、固体分散剂、混入物或其他组合，以便于制备有用的制剂(例如口服)。
根据本发明使用的疫苗包含免疫原性组合物，且可额外包含一或多种另外的活性剂(即，发挥生物效应的试剂-非惰性成分)。应理解，这类额外的试剂可与一或多种其他疫苗组分一起配制，或可在给药时或接近给药时保持分离和组合。在一些实施方式中，这类额外的组分可在适当的一段时间内与一些或所有其他疫苗组分分开给药，以达到相关效果。
例如，在疫苗的制备中常见包含有一或多种佐剂。佐剂通常是增强对于抗原的免疫反应的试剂。在一些实施方式中，其利用了会增强Th1型免疫反应的佐剂。
在一些实施方式中，其利用了会增强Th17型免疫反应的佐剂。
佐剂
在一些实施方式中，本文中所述的免疫原性复合物与佐剂组合配制和/或给药。在一些实施方式中，佐剂选自由以下组成的组：氢氧化铝、磷酸氢铝、磷酸铝、TLR激动剂、TLR2激动剂(例如，皂苷(例如，QS21等)、孔蛋白等)、TLR3激动剂(例如，dsRNA、 polyI：polyC、poly-ICLC、
Figure BDA0002388953440001381
等)、TLR4激动剂(例如，单磷酰脂A(MPL A))、TLR5激动剂(例如，鞭毛蛋白)；TLR 7、8或9 激动剂(例如，CpG-寡核苷酸等)。
在一些实施方式中，适合根据本发明使用的佐剂包含(但不限于)：
(1)铝盐(矾)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；
(2)水包油型乳化制剂(含有或不含有其他特异性免疫刺激剂，诸如胞壁肽(如下文定义的)或细菌细胞壁组分)，诸如(例如)，
(a)MF59(PCT公开第WO 90/14837号)，其含有利用微流化仪 (诸如型号110Y的微流化仪(Microfluidics公司，Newton，MA))配制在亚微米颗粒中的5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85(可选择地含有不同量的MTP-PE(参见下文，尽管不是必需的))，
(b)SAF，其含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121、和thr-MDP(见下文)，其被微流化在亚微米颗粒乳剂内或被涡旋以生成更大粒度的乳剂，和
(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Corixa公司，Hamilton，MT)，其含有 2％角鲨烯、0.2％吐温80、和一或多种细菌细胞壁组分，所述细胞壁组分来自由美国专利号4,912,094描述的3-O-脱酰基单磷酰脂质A (MPLTM)(Corixa公司)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS) 组成的群组，较佳为MPL+CWS(DetoxTM)；
(3)皂素佐剂，诸如Quil A或STIMULONTM QS-21(Antigenics公司，Framingham，MA)(美国专利号5,057,540)可以利用或者从其产生的颗粒诸如ISCOM(免疫刺激复合物)；
(4)细菌脂多糖、合成的脂质A类似物诸如胺烷基葡萄糖胺磷酸化合物(AGP)、或其衍生物或类似物，其可以从Corixa公司购买到，且在美国专利号6,113,918中描述过；一种这样的AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也称为529(以前称为RC529)，其被配制为水性形式或配制为稳定的乳剂，合成的多核苷酸诸如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号 6,207,646)；TLR3激动剂(合成的dsRNA，聚I：聚C(polyI：polyC)，
Figure BDA0002388953440001391
可获自InvivoGen公司)；
(5)细胞因子，诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干扰素(例如γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、共刺激分子B7-1和B7-2等；
(6)细菌ADP-核糖基化毒素的去毒突变体，诸如野生型或突变形式的霍乱毒素(CT)，例如，按照公开的国际专利申请号WO 00/18434(也参见WO 02/098368和WO 02/098369)，其中氨基酸位置 29的谷氨酸被另一氨基酸取代，较佳地被组氨酸取代；百日咳毒素 (PT)；或大肠杆菌热不稳定毒素(LT)(特别是LT-K63、LT-R72)、以及名为LT(R192G/L211A)的新颖LT突变体，或dmLT可引发对于疫苗抗原的Th17反应(Andreasen，2009；Norton，2011；Norton，2012； Leach，2012；Toprani，2017)、CT-S109、PT-K9/G129(参见例如WO 93/13302和WO 92/19265)；以及
(7)作为免疫刺激剂以增强组合物功效的其他物质，例如δ菊粉
Figure BDA0002388953440001392
MatrixM。
胞壁肽包含(但不限于)N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏胺酰基-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。
根据本发明使用的疫苗可包含其它抗微生物剂治疗，或可同时与其给药。例如，这类疫苗可包含一或多种杀死或延缓病原体生长的试剂或与其一起给药。这类试剂包含(例如)青霉素、万古霉素、红霉素、亚兹索霉素以及克拉霉素、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢曲松 (ceftriaxone)、左氧氟沙星、加替沙星。
替代性地或另外地，根据本发明使用的疫苗可包含一或多种其它疫苗或治疗，或可与其一起给药。例如，可包含一或多种非肺炎球菌抗原于其内或与所述疫苗一起给药。
给药
在一些实施方式中，将免疫原性复合物给予有疾病风险的对象，例如住院患者。应理解，可以认为对象可处于发展疾病的风险下而没有被诊断出患有任何疾病症状。例如，若已知对象已经或将会暴露于感染风险相对较高的情况下，该对象将被认为有发展该疾病的风险(例如，住院患者、长期住在护理机构的年长对象等)。
可利用任何有效的给药途径，例如口服、经鼻、肠内、肠胃外、肌内或静脉内、皮下、皮内、直肠、阴道、局部、眼、肺、或由接触给药。在一些实施方式中，可以注射疫苗组合物(例如，经由肌内、腹膜内、皮内和/或皮下途径)；或经由黏膜递送(例如，递送至口道/消化道、呼吸道和/或泌尿生殖道)。在某些情况下鼻内给予疫苗可特别有用，例如用于治疗肺炎或中耳炎(因为可以更有效预防鼻咽携带的肺炎球菌，从而在其早期阶段使感染减弱)。在本发明的一些实施例中，可能期望通过不同途径给予不同剂量的疫苗；在一些实施方式中，可能期望经由不同途径给予一种剂量的不同组分。
在本发明的一些实施方式中，药物组合物(例如疫苗)皮内给药。皮内注射的常用技术”芒图氏程序(mantoux procedure)”包括以下步骤：清洁皮肤，且然后将一只手伸展开，且在小号注射针(规格 26至31)的斜面朝上的情况下，以10°至15°之间的角度将针插入。在针的斜面插入时，使针的针筒降低并在提供轻微压力的同时进一步推进，以将针在皮肤下抬高。然后极缓慢地注射液体，由此在皮肤表面上形成小泡或隆起，随后缓慢抽出针。
特定设计用来将液体药剂给予皮肤中或穿过皮肤的装置已有描述，例如描述于WO99/34850和EP 1092444的装置，以及例如描述于 WO 01/13977、美国专利号5,480,381、美国专利号5,599,302、美国专利号5,334,144、美国专利号5,993,412、美国专利号5,649,912、美国专利号5,569,189、美国专利号5,704,911、美国专利号5,383,851、美国专利号5,893,397、美国专利号5,466,220、美国专利号5,339,163、美国专利号5,312,335、美国专利号5,503,627、美国专利号5,064,413、美国专利号5,520,639、美国专利号4,596,556、美国专利号4,790,824、美国专利号4,941,880、美国专利号4,940,460、WO 97/37705和WO 97/13537的喷射注射装置。经真皮内给予疫苗制剂的其他方法可包含常用注射器和针或经设计用于固体疫苗的弹道式递送装置(WO 99/27961)、或经皮贴片(WO 97/48440、WO 98/28037)或涂抹于皮肤表面(经皮或经表皮递送，WO 98/20734、WO 98/28037)。
如上所述，医药组合物(例如疫苗)可以单剂量或多剂量给予。应理解，给予是单一“剂量”的给予，只要所有相关组分在一段时间内给予对象；不必每种成分均存在于单一组合物中。例如，在小于24小时的时间内给予两种不同的免疫原性组合物被认为是单一剂量。仅举一个例子，具有不同抗原性组分的免疫原性组合物可在分开的组合物中给予，但是作为单一剂量的一部分。如上所述，这类分离的组合物可经由不同途径或经由相同途径给药。替代性地或另外地，在疫苗包括免疫原性组合物和额外类型的活性试剂的组合的实施例中，免疫原性组合物可经由一种途径给药，而第二种活性试剂则可经由相同途径或经由不同途径给药。
医药组合物(例如疫苗)以达到期望结果所需的量和时间给药。在本发明的一些实施方式中，疫苗组合物包括治疗有效量的至少免疫原性组合物。达到治疗有效量所需的确切数量可有所变化，这取决于该免疫原性组合物和对象之间的不同，取决于对象的种族、年龄和一般状况，取决于疾病的阶段、特定的医药混合物、及其给药模式等。
各医药组合物(例如疫苗)剂量中的多糖抗原或偶联物的量经选定以使疫苗在如本文中所述给药时，在没有明显不利的副作用的情况下诱导适当的免疫保护反应。如本文中所用的“免疫保护性”或“保护性免疫”反应是足以保护免疫接种对象不受到疫苗所针对的特定病原体或多个病原体(例如肺炎克雷伯氏菌感染)的生产性感染的免疫反应。这类量可取决于使用哪种或哪些特定的免疫原性组合物以及其如何呈现而变化。
在一些实施方式中，包括本文中所公开的免疫原性复合物的医药组合物在给予对象时引发Th1和/或Th17细胞反应。在一些实施方式中，包括本文中所公开的免疫原性复合物的医药组合物在给予对象时针对肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种引发调理反应/杀菌反应。在一些实施方式中，包括本文中所公开的免疫原性复合物的医药组合物在给予对象时降低肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种于黏膜表面的穿透率和/或定殖率。
在一些实施方式中，包括本文中所公开的免疫原性复合物的医药组合物在穿透时降低肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种在GI道的穿透率和/或定殖率。
一些实施方式提供一种对对象进行免疫接种以抗肺炎克雷伯氏菌感染的方法，包括将有效量的如本文中所述的免疫原性组合物给予该对象。一些实施方式提供一种对对象进行免疫接种以抗肺炎克雷伯氏菌感染的方法，包括将有效量的如本文中所述的医药组合物给予该对象。
一些实施方式提供一种对对象进行免疫接种以抗铜绿假单胞菌感染的方法，包括将有效量的如本文中所述的免疫原性组合物给予该对象。一些实施方式提供一种对对象进行免疫接种以抗铜绿假单胞菌感染的方法，包括将有效量的医药组合物给予该对象。
一些实施方式提供一种对对象进行免疫接种以抗大肠杆菌感染的方法，包括将有效量的如本文中所述的免疫原性组合物给予该对象。一些实施方式提供一种对对象进行免疫接种以抗大肠杆菌感染的方法，包括将有效量的医药组合物给予该对象。
给予
根据本公开内容，医药组合物(例如，疫苗)的给予可涉及仅单一剂量的递送，或替代性地可涉及在初始剂量的适当间隔后有一或多个额外的免疫接种剂量。免疫接种时程是在一或多个特定年龄的对象中，通过一或多种特定的给药途径，给予一或多种特定剂量的一或多特定肺炎球菌疫苗的规划。
本公开内容提供涉及向幼年对象给予至少一剂疫苗的免疫接种方法。在一些实施方式中，幼年对象为18岁或更年轻。在一些实施方式中，幼年对象先前已接受一或多剂偶联的肺炎球菌多糖疫苗；在其他实施例中，幼年对象对肺炎球菌疫苗是未经验过的。在一些实施方式中，幼年对象先前已被克雷伯氏菌、假单胞菌和/或大肠杆菌感染或暴露于其感染下。
本公开内容提供涉及向成年对象给予至少一剂疫苗的免疫接种方法。在一些实施方式中，成年对象大于约50岁。在一些实施方式中，成年对象大于约65岁。在一些实施方式中，成年对象先前已接受一或多剂偶联的肺炎球菌多糖疫苗；在其他实施例中，成年对象对肺炎球菌疫苗是未经验过的。在一些实施方式中，成年对象先前已被克雷伯氏菌、假单胞菌和/或大肠杆菌感染或暴露于其感染下。
本公开内容的免疫接种时程是供以在对象中引发或诱导免疫反应(例如，免疫保护性反应)，其足以降低选自由以下组成的至少一种度量：在对象族群中和/或对象次族群中的至少一感染、疾病或病症的发病率、流行率、频率和/或严重性，和/或该感染、疾病或病症的至少一替代指标。增补的免疫接种时程是相对于其补充的标准时程有这种效果的时程。补充时程是可要求额外给药和/或超免疫原性剂量的在标准时程中所设立的本文中所公开的免疫原性组合物，或要求给药不是标准方案的一部分的疫苗。本发明的完整免疫接种时程可包括标准时程和增补时程。示例性样品疫苗接种时程是供用于说明的目的。评估本文中所讨论的免疫原性反应的方法详细说明使得技术人员可开发该样品免疫接种时程的变化而无需过多的实验。
在本公开内容的一实施例中，肺炎球菌疫苗的第一次给药通常发生在对象超过约50岁、超过约55岁、超过约60岁、超过约65岁、或超过约70岁时。
在本公开内容的一些实施方式中，其使用单次疫苗给药。本发明的目的可以用单次给药来提供，特别是当一或多种所利用的疫苗多糖和/或偶联物或其组合有强度的时候，且在这种情况下单剂量计划即足以诱导持续的免疫保护反应。
在一些实施方式中，期望能给予二或更多剂量的疫苗以有更大的免疫保护性功效和涵盖范围。因此，在一些实施方式中，多个剂量是至少两次、至少三次或更多次剂量。未设定有最大的剂量数量，然而为了达到期望的效果，临床实践上最好不要以超过必要的频率进行免疫接种。
在不受理论束缚下，根据本公开内容给药的第一剂疫苗可以被认为是“主要”剂量。在一些实施方式中，有一个以上的剂量被包含在免疫接种时程之中。在这样的方案下，后续剂量可被认为是“加强”剂量。
可以将主要剂量给予未经验过的对象(先前从未接受过多糖疫苗的对象)。在一些实施方式中，在给予根据本发明的初始疫苗剂量之前，可以将主要剂量给予之前已接受过多糖疫苗至少五年或更多年的对象。在其他实施例中，在给予根据本发明的主要疫苗之前，可以将主要剂量给予至少二十年或更多年之前已接受过偶联物疫苗的对象。
当免疫接种时程要求二或更多个分离的剂量，考虑到所述剂量之间的间隔。两个连续剂量之间的间隔在整个免疫接种时程中可相同，或因对象年龄改变。在本发明的免疫接种时程中，一旦已给予第一个疫苗剂量，在给予随后的剂量之前会有第一间隔。第一间隔一般至少为约2周、1个月、6周、2个月、3个月、6个月、9个月、12 个月或更久。当给予超过一个随后的剂量，可在这类随后的剂量之间设置第二(或更高)间隔。在一些实施方式中，随后的剂量之间的全部间隔为相同长度；在其他实施例中，所述第二间隔的长度可改变。在一些实施方式中，随后的剂量之间的间隔可以是至少约12个月、至少约15个月、至少约18个月、至少约21个月或至少约2年。在一些实施方式中，所述剂量之间的间隔可高达3年、高达约4年或高达约5 年或10年或更久。在一些实施方式中，随后的剂量之间的间隔可因对象年龄而减少。
本领域技术人员应理解，第一次给药的时间、最短间隔、最大间隔和总给药次数(绝对值，或在规定的时间内)的各种情况会有多种可能的组合和子组合，且虽然未在此明确列举，所有这些组合和子组合应被认为落入发明人的考虑范围内。
确定免疫原性反应的测定法
在一些实施方式中，评估免疫原性复合物(和/或包括免疫原性复合物的组合物)的免疫原性和/或效价的方法包括评定对于该免疫原性组合物的免疫反应。在一些实施方式中，所述评定通过执行一系列体外测定法中的一或多种而完成。在一些实施方式中，所评定的免疫反应是B细胞或T细胞反应。
在一些实施方式中，体外测定法选自以下的一或多种：ELISA、流式细胞仪分析、Th1/Th17细胞反应、由OPK所测得的细胞因子水平测量和功能性抗体水平、血清杀菌试验(SBA)、凝集性、移动性、细胞毒性、黏着性、凝集性。
在一些实施方式中，评定通过执行一系列体内测定法中的一或多种而完成。在一些实施方式中，体内测定法利用院内疾病的动物模型。在一些实施方式中，该动物模型是肺炎、败血症、烧伤、GI 感染或手术部位感染中的一或多种的模型。在一些实施方式中，体内测定法测量在一或多种目标病原体攻击后以被动保护的细菌清除、定殖或死亡中的一或多种，或是在一或多种目标病原体攻击后以主动保护的细菌清除、定殖或死亡中的一或多种。在一些实施方式中，该目标病原体是院内病原体。
一般而言，可能期望评估两种之间的体液反应、细胞反应和/或相互作用。在评估体液反应的情况下，可确定针对特定病原体血清型的抗体效价和/或类型(例如，总IgG、IgG1、IgG2、IgM、IgA等)，例如在给药疫苗初始剂量或疫苗加强剂量之前和/或之后(和/或与没有抗原性刺激时的抗体浓度相比)。可通过监测对载体蛋白的反应 (诸如延迟型高敏性反应等)来评估细胞反应。也可通过评定外周血单核细胞(PBMC)对于用感兴趣的抗原刺激的反应来直接测量细胞反应。前体和记忆B细胞群可在针对特定病原体CPS和/或OPS的酶联免疫斑点分析法(ELISpot)来评估。
可采用多种测定法中的任何一种来检测对象血清中抗体的水平和/或活性。合适测定法包含(例如)配体结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIAs)、ELISA和多重测定法(Luminex，Bioplex)；功能测定法，诸如调理吞噬测定法(OPA)；以及体内保护测定法(幼年大鼠保护和成年小鼠肺和啮齿动物GI定殖与死亡模型)。
RIA方法通过将血清与悬浮液中的放射性标记的类型特异性多糖一起培养而检测类型特异性抗体(例如，Schiffiman等，1980)。抗原-抗体复合物接着用硫酸铵沉淀，并测定有放射性标记的片状沉淀物的每分钟计数(cpm)。
在ELISA检测方法中，来自经免疫接种的对象血清的血清型特异性抗体通过与已吸附至固体支持物的血清型特异性多糖一起培养来定量(例如，Koskela和Leinonen(1981)；Kojima等，1990；Concepcion 和Frasch，2001)。结合的抗体使用与酶偶联的二级检测抗体来检测。 ELISA也允许通过使用同型-特异性或子型-特异性二级抗体对免疫反应进行同型分类和亚类化(即，IgM对IgG或IgG1对IgG2)，且可适以评定血清型特异性抗体的结合性(Anttila等，1998； Romero-Steiner等，2005)。多重测定法(例如，Luminex，Bieplex)使得能够同时检测针对多种血清型的抗体。血清型特异性CPS和/或 OPS与光谱上不同的微球体偶联，而其与稀释的血清混合一起培养。结合的抗体以与藻红素偶联的二级抗体检测，并在专门的流式细胞仪中定量，该流式细胞仪使用激光来识别珠粒类型(血清型)且使用第二种激光来定量已结合的二级抗体(Pickering等，2002；Lal等，2005)。
OPA是评估血清中的功能性抗体的方法，其仅定量可以对细菌有调理作用的抗体，导致细菌的摄入和致死。标准的测定法利用人类吞噬效应细胞、补体来源、细菌和稀释的血清。测定读数是血清终点效价，与仅用补体和人类细胞培养的细菌相比，其致死率≥50％(Romero-Steiner等，1997)。此致死的OPA也可通过利用载体不同抗生素抗性标记的目标病原菌菌株进行多重化(Kim等，2003)。1∶8或更高的终点效价被认为是这些致死型OPA的阳性结果。另一类型的多重调理测定法是非致死测定法，其中在稀释血清和补体来源的存在下，通过吞噬效应细胞摄取荧光染色的囊封病原体或与来自目标病原体的抗原性CPS和/或OPS偶联的荧光微球体而通过FC进行评估 (Martinez等，1999)。血清抗体加上补体的调理活性也可通过测量人类吞噬效应细胞对摄入的病原体的氧化反应来评估(Munro等，1985； Ojo-Amaize等，1995)。
某些体内模型系统可用于评定由本发明的疫苗所引发的血清抗体所提供的保护作用。在这类被动保护系统中，用病原体和稀释的血清攻击小鼠或大鼠，并确定针对菌血症、器官或组织定殖、或死亡提供保护的血清的终点效价(Stack等，1998；Saeland等，2000)。
抗体组合物
一些实施方式提供了一种抗体组合物，其包括用本发明的免疫原性复合物免疫接种的哺乳动物中产生的抗体。在一些实施方式中，抗体包括至少一选自由mAb和抗对象遗传型抗体组成的组的抗体。在一些实施方式中，抗体组合物包括经分离的γ球蛋白部分。
试剂盒
本公开内容也提供用于产生如本文中所公开的免疫原性复合物的试剂盒，其可用于研究者用其偏好的抗原定制免疫原性复合物，例如用于研究目的以评估抗原或抗原组合对免疫反应的影响。这类试剂盒可容易由可获得的材料与试剂来制备。例如，这类试剂盒可包括任一或多个以下材料：包括与多个第一亲和分子交联的主链聚合物的容器；以及包括与该第一亲和分子结合的互补亲和分子的容器，其中该互补亲和分子与抗原结合。
在另一实施方式中，该试剂盒可包括包括聚合物(例如多糖) 的容器、包括多个第一亲和分子的容器、以及包括用于将所述第一亲和分子与该主链聚合物交联的交联剂的容器。
在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括用以将该互补亲和分子连接至抗原的手段，该手段可通过交联剂或通过一些中介融合蛋白。在一些实施方式中，该试剂盒可包括至少一可添加至该聚合物的共同刺激因子。在一些实施方式中，该试剂盒包括交联剂，例如(但不限于)CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐)、EDC(1-乙基 -3-[3-二甲胺丙基]碳二亚胺盐酸盐)、氰基硼氢化钠、溴化氰、碳酸氢铵/碘乙酸，用于将该辅助因子与聚合物连接。
取决于试剂盒的预期用途、特定的目标抗原和用户的需求，可以制备多种试剂盒和组分以用于本文所述的方法中。
范例
以下实施例为了可以更全面地理解本文中所述的发明而提出。代表性的实施例含有信息、范例和指导，其可适用于实践本发明的各种实施例及其等效物。应理解，这些实施例仅用于说明目的，且不应被解释为以任何方式限制本发明。
实施例1：细菌菌株
试剂菌株系于无动物产物的培养基上传代三次以除去任何可能的动物产物污染物。在传代之前、传代期间和传代之后比较菌株的特性。对于假单胞菌：革兰氏染色、菌落形态、API、氧化酶试验 MacConkey琼脂上的生长、IATS血清型分型、生长动力学。对于克雷伯氏菌：革兰氏染色、菌落形态、API、通过聚合酶链反应(PCR) 的分子血清型分型、通过PCR和定序确认突变(必要时)、K分型(通过PCR)、生长动力学。
表2：使用在本研究中的克雷伯氏菌菌株和试剂菌株
Figure BDA0002388953440001481
Figure BDA0002388953440001491
使用λ Red重组法来删除guaBA和wzabc基因。简言之，guaBA和 wzabc基因的DNA上游和下游融合至一个卡那霉素抗性盒，且线性 DNA转移至也含有可表达λ重组酶基因的辅助质粒的肺炎克雷伯氏菌菌株内。在诱导时，这些基因促进同源重组而使得guaBA和wzabc基因能够被卡那霉素抗性盒取代。卡那霉素抗性盒随后使用可促进与该盒侧接的FRT位置之间的重组的内翻转酶来去除。已确认突变体是对卡那霉素敏感的且已通过对缺失的测序和PCR确认该缺失。
表3：在本研究中使用的铜绿假单胞菌(PA)菌株
试剂 菌株 最终试剂菌株
O1 IATS-O1 野生型
O2 IATS-O2 野生型
O3 IATS-O3 野生型
O4 IATS-O4 野生型
O5 IATS-O5 野生型
O6 IATS-O6 野生型
O10 IATS-O10 野生型
O11 IATS-O11 野生型
过度产生外泌多糖PsL的PA菌株的建立
使用来自于Genscript公司(Piscataway，NJ)的1886bp的合成DNA 来重新构建铜绿假单胞菌PsL-诱导型菌株PAO1 Δpsl/pBAD-psl的示例性基因方法显示于图9B中。
araC-pBAD启动子通过同源重组而插入铜绿假单胞菌PAO1 pslA 基因的上游。基本上，pslA的DNA上游扩增自铜绿假单胞菌PAO1且在上游融合有庆大霉素抗性盒。由含有araC-pBAD启动子和pslA基因的合成DNA所组成的构建体融合至庆大霉素抗性盒的下游。此整个构建体插入pEX100T克雷伯氏菌突变诱发质粒。突变诱发如先前所述(Schweizer等，1992)来执行。庆大霉素抗性基因随后被去除，并通过PCR和测序确认araC-pBAD启动子的插入。
实施例2：O-多糖抗原和K-多糖抗原的产生
克雷伯氏菌种和铜绿假单胞菌菌株的生长
全部的试剂克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌菌株在无动物产物的培养基上传代三次以除去任何可能的动物产物污染物。研究细胞库 (RCB)生长在摇动烧瓶的Hy-Soy培养液中并转移到无菌等分的小瓶中的最终浓度为15％的甘油内。细菌生长在8L BioFlo 415发酵槽中的化学成分确定的培养液(CDM)内，该培养液含有磷酸二氢钾、磷酸铵、柠檬酸单水合物、硫酸镁(MgSO4)、聚丙二醇(PPG)(消泡剂)、作为碳源的3％甘油、微量维生素和元素，并根据需求选择氨基酸。溶解氧保持在30％，喷流模式设为最小搅拌速率为200RPM，并用氢氧化铵将pH校正至7。在发酵期间，于需要时以分批模式补充含有50％甘油、MgSO4、微量维生素和微量维生素和元素的培养液。使细菌生长12-18小时至静止期，此时点收获培养物以得到多糖。
KP O-多糖和PA核部-O-多糖的纯化
KP和PA OPS的下游纯化过程的流程图显示于图8A中。简言之，在发酵结束时，对于铜绿假单胞菌细胞培养液将整个发酵培养液用 1％乙酸在100℃下处理4小时，对于克雷伯氏菌细胞培养液将整个发酵培养液用亚硝酸钠于乙酸中在4℃下处理12小时。在通过离心和深层过滤(0.45μm)澄清后，将含有经过水解和释放的OPS的澄清溶液用10kDa或30kDaNMWCO膜进行切向流过滤(TFF)UF-DF，对1M NaCl和接着对Tris缓冲液进行透析过滤。接着使渗余物通过强阴离子交换膜用Tris缓冲液进行离子交换层析(IEC)。带负电荷的PA OPS通过该膜捕获(图8A)，接着用氯化钠洗脱。中性KP和中性或弱酸性PA OPS在该IEC膜的流出物(FT)中获得。该IEC流出物或析出物接着进行硫酸铵沉淀以除去残余蛋白质。硫酸铵上清液中的KP OPS 接着进行两次连续的TFF过滤，从300kDa NMWCO膜开始，接着将 FT浓缩并用5或10kDa NMWCO膜透析过滤。后来的TFF FT渗余物中含有纯化过的KP中性OPS(图8A)。硫酸铵(NH4SO4)上清液中的纯化过的中性和酸性PA OPS用5-10kDa TFF(图8A)进行处理，且其于渗余物中回收。通过SEC-多角度激光散射法(SEC-MALLS)测得的最终OPS产物的平均MW范围是10-30kDa(视O-类型而定)，并且具有低内毒素、蛋白质和核酸内容物。
产酸克雷伯氏菌K19荚膜多糖(KP K19 CPS)的纯化
KP K19 CPS的下游纯化过程的流程图显示于图9A中。简言之，在用甲醛去活化、以及通过不连续的离心和表层过滤(0.45μm)之后，含有CPS的澄清液用30kDa NMWCO膜使用TFF进行浓缩和透析过滤。通过CTAB来沉淀30kDa渗余物。将沉淀物用氯化钙重新溶解并用20％乙醇沉淀以除去核酸和蛋白质污染物。离心之后，所采集的上清液用80％乙醇沉淀。含有沉淀物的CPS重新溶解于Tris缓冲液中并捕获于弱阴离子交换树脂上。从该树脂洗脱出的K19 CPS进一步用 0.1M NaOH的90％乙醇溶液处理(去毒)以除去任何会促成其聚集和内毒素(由鲎变形细胞裂解物(LAL)活性来测得)的残余末端脂质 (图9A)。最终的K19多糖产物在使用SEC-MALLS测量时具有220 kDa的平均分子量，并且具有低内毒素、蛋白质和核酸含量。
PA外泌多糖PsL的纯化
外PS PsL的示例性纯化过程的流程图显示于图9C中。简言之， PA细菌培养液在室温下以10,000x g离心40分钟，并使上清液过滤通过0.5-0.3um的深层过滤器。过滤过的上清液通过TFF使用100kDa MWCO PES膜和10倍透析体积的注射用水(WFI)进行透析过滤，使用 2kDa Hydrosart膜并用10-20x UF来收集并浓缩渗透物，且用10倍透析体积的pH 7.5的50mM Tris HCl和50mM NaCl进行透析过滤。经浓缩的析出物接着在GE Q-Sepharose FastFlow管柱上通过强阴离子交换树脂(IEX)层析，并再用另一管柱体积冲洗洗脱液而收集流出物。接着用WFI使用2kDa Hydrosart膜来浓缩和透析过滤该析出物，接着在室温下用80％乙醇沉淀18小时。用4000x g离心30分钟之后，将片状沉淀物溶解在WFI中，无菌过滤通过0.2μtm过滤器，并冻干。最终的经纯化多糖材料通过HPAEC/PAD(具有脉冲电化学检测的高性能阴离子交换层析法)来分析，使用Dionex ICS-4000毛细管仪和 CarboPac PA10管柱和可商业购得的单糖标准试剂对单糖组合物进行分析，用Bradford测定法分析残留蛋白，用Q-bit Life Technologies 公司的quant-IT试剂盒分析残留核酸，用LAL测定法分析内毒素，以及用蒽酮测定法分析总碳水化合物。也通过高分辨率H-NMR来分析最终的物质以确认其结构，并用SEC-HPLC推算分子量。
表征O-抗原和K-抗原的分析方法
由上述方法所得的OPS和CPS的纯度和特性如下确定。用 Bradford和/或BCA测定法确定残余蛋白浓度；使用pico green测定法或在260nm的吸光度确定核酸浓度；使用LAL测定法测量内毒素浓度；以及通过酸水解来确定多糖的糖组成，接着如上所述通过 HPAEC-PAD(Dionex)分离各个单糖。多糖的物理完整性通过高分辨率的1H-NMR用500、800或950MHz使用Bruker光谱仪来确定，记录光谱并将所得光谱与文献中公开的光谱进行比较。在纯化过程中和最终产物中的多糖特性和经纯化的天然和化学衍生的多糖上的表位完整性通过ELISA使用特异性OPS和CPS单克隆抗体以及针对热灭菌型特异性细菌所产生的多克隆兔抗血清来确认。用Hestrin比色测定法和1H-NMR来确定多糖上O-乙酰基的存在。用SEC-HPLC(图8B 和8C)和SEC-MALLS使用合适的分粒管柱来确定多糖的大小。用蒽酮测定法来确定多糖浓度。
实施例3：OPS和CPS生物素化的一般方法
使用CDAP作为活化剂对含有羟基的多糖(PS)进行生物素化。将多糖溶解于不含LPS的水(细胞培养级；HyClone)中，最终浓度为 1-5mg/mL。在时间0时，在涡动期间加入一体积的CDAP(于乙腈中新鲜配制至浓度100mg/mL)至1mg CDAP/1mg PS的最终比例。在 30秒时，加入一体积的0.2M三乙胺(TEA；Sigma-Aldrich)以将pH提升至8(对于中性PS，TEA体积等于CDAP体积；对于酸性PS，TEA 体积加倍)。在2.5分钟时，加入一体积的生物素衍生物(Pierce EZ-Link Amine-PEG3-Biotin，20mg/mL水溶液)至最终比例为1mg 生物素对1mg的PS，接着在室温下培养1-4小时。对于稀释更多倍的样品(＜1mg/mL)，使用过夜培养。加入25mM甘氨酸终止反应，并通过对PBS进行大量透析而除去过量的生物素。
对于主链聚合物BP-1.2，聚合物K19 CPS的生物素化通过用1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亚胺氢氯化物(EDC，Pierce)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来活化糖醛酸残基的羧酸盐基团而进行，以改善功效或产生建立干燥稳定的(胺反应性)中间产物。EDC将NHS与羧基偶联，形成比O-酰基异脲中间产物更加稳定的NHS酯，同时可在生理 pH下与伯胺有效偶联。生物素胺衍生物(Pierce EZ-连接胺-PEG3-生物素)接着使用于K19 CPS的NHS酯中间产物的生物素化。
总糖浓度以用于对于克雷伯氏菌OPS/CPS的葱酮测定法或用于 PA OPS之间苯二酚测定法来确定。
实施例4：重组型利查维啶和利查维啶-融合蛋白抗原的构建
衍生自肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌的利查维啶-融合蛋白表达构建体的设计和工程化
对于假单胞菌鞭毛蛋白(FliC)A(FlaA)和B(FlaB)，基于将假单胞菌FliC封装于晶体中的鞭毛纤丝的计算机模拟构建表明结构域2 (D2)会暴露于溶液中且在免疫原性上扮演重要角色(Song，2014)。另外，假单胞菌FliC经由TLR5的识别而活化了先天免疫反应，这可能导致反应原性，因此我们生成并评估了一些已去除掉TLR5结合结构域和相邻区域而仅留下结构域2的假单胞菌鞭毛蛋白。所产生的缺少 TLR5结构域的序列FlaA2-结构域2和FlaB-结构域2表达为一个单有利查维啶的融合体或具有利查维啶和克雷伯氏菌MrkA或PcrV的融合体。所生成和表达衍生自假单胞菌的利查维啶-抗原融合蛋白变体 (FlaB；FlaA1；FlaA2；PcrV；FlaB-PcrV；FlaB-D2；FlaA2-D2； FlaB-D2-PcrV)以及衍生自克雷伯氏菌与假单胞菌的杂合利查维啶融合蛋白(FlaB-D2-MrkA；PcrV-MrkA)的示意图显示于图12A中。
对于铜绿假单胞菌，由于鞭毛蛋白是鞭毛的主要组分，且已知抗鞭毛蛋白的抗体抑制了需要用来播散性感染的移动性，并在动物感染模式中已显示出具有保护性，鞭毛蛋白选来作为一个可能的载体蛋白和保护性抗原。鞭毛蛋白的血清型A2是高度保守的，但与A1 型有些微变化，与血清型B的结构域2则有显著变化。为评估这些变体的活性，血清型A1(FlaA1)、A2(FlaA2)和B(FlaB)鞭毛蛋白经克隆并表达成完整长度的蛋白质。仅来自于鞭毛蛋白A2和B的结构域2 也经克隆并表达成此结构域镶嵌已组装鞭毛的外部，且可能是中和抗体的靶标。这使得可单独评估TLR5结合结构域对适性免疫反应的贡献。所选定的序列经合成并克隆到质粒中，以在含氨基端的利查维啶融合体和用于初期亲和纯化的六个组氨酸标签的大肠杆菌中引导表达(图12A)。
对于铜绿假单胞菌，由于PcrV是编码第III型分泌设备的末梢蛋白而也选择了PcrV。已知对于作为保护性抗原的PcrV具特异性的抗体可针对侵袭性感染提供保护性。其序列是高度保守的，在18种不同的铜绿假单胞菌菌株之中，294个氨基酸只有4个位置有氨基酸的改变。该序列经合成并克隆到质粒中，以在含氨基端的利查维啶融合体和用于初期亲和纯化的六个组氨酸标签的大肠杆菌中引导表达 (图12A)。
对于肺炎克雷伯氏菌，由于MrkA编码第3型线毛的主要菌毛亚基以及菌毛的免疫显性部分而选择了MrkA。第3型菌毛需要用来介导生物膜的形成，且MrkA在生物膜的形成和黏着性中扮演了主要的角色，暗示了此抗原可在疫苗制剂中提供保护。已发现MrkA在9种不同基因型的肺炎克雷伯氏菌中是高度保守的，在180个氨基酸中只有 1个位置有氨基酸的变化。另一个基因型则提供了稍微较高的改变，在180个氨基酸中有9个位置具有氨基酸变化(表4)。对于其他第3 型线毛的菌毛亚基，一个用来在表达期间稳定单体的名为供给股互补方法的对策已被开发出来(Walczak，2014)。此对策在羧基端采用该氨基酸序列和重复，使其可回折并以β链通常由结构中的下一个亚基提供的方向来结合。我们试图将此策略延伸至肺炎克雷伯氏菌第3 型线毛亚基MrkA，通过先去除所计划的分泌信息序列以专注于我们的利查维啶融合体的细胞质表达。推定的分泌信息是制定于Chan等， 2012，Langmuir中，其基于与大肠杆菌FimA氨基酸1-24比对。我们接着将一个有六个甘氨酸的接头加到羟基酸，接着加入MrkA的N端之前20个氨基酸重复(不含该信息序列)来提供供给股互补。该序列经合成并克隆到质粒中，以在含氨基端的利查维啶融合体和用于初期亲和纯化的六个组氨酸标签来在大肠杆菌中引导表达(图12A)。
表4：肺炎克雷伯氏菌MrkA Clustal 0(1.2.1)多重序列比对
肺炎克雷伯氏菌MrkA
CLUSTAL 0(1.2.1)多重序列比对
Figure BDA0002388953440001561
对于高度保守的肺炎克雷伯氏菌MrkA蛋白，表4中的AEO27492序列 (粗体)用作来源序列以产生该合成基因。
在未纳入所预测的信息序列(氨基酸1-44)的情况下，用于这些研究中的重组型利查维啶(rRhavi)跨越由该基因体所编码的蛋白质的氨基酸45至179。为将rRhavi在大肠杆菌中的表达水平优化，编码利查维啶多肽的基因序列(45-179；SEQ ID NO：14)使用偏好大肠杆菌的表达密码子而重新设计并合成。经密码子优化的基因被克隆入 pET21b载体以引导蛋白质表达。为促使正确折叠以及利查维啶中的双硫键形成，已选择可促进细胞质中的双硫键形成的大肠杆菌菌株 T7 shuffle express(NEB)来进行表达。
为构建利查维啶-抗原融合蛋白，将一个编码了由七个氨基酸 (GGGGSSS；SEQ IDNO：15)组成的可弯曲接头区域的DNA序列直接插入该合成rRhavi基因的3′端，以提供与rRhavi分离并促进后续融合蛋白的正确折叠。编码候选抗原(全长或期望片段)的基因经合成并就在该接头区域之后插入rRhavi表达载体。为便于纯化，将一个有六个组氨酸的标签加到该构建体的末端。
引导rRhavi融合蛋白表达的含有DNA的质粒依据制备商的实验方案而转形到T7shuffle express大肠杆菌内。从单一菌落开始培养并接种于30ml的含有胺苄青霉素(Amp+)的Luria-Bertani(LB)培养基，在30℃下过夜培养。在第2天，将5ml的起始培养液接种于1升的LB 培养基/Amp+，并30℃下生长直至达到OD600约1.2至1.6。在将培养液冷却至16℃之后，加入IPTG直至最终浓度为0.1mM。经诱导的培养液在16℃下震荡培养16至20小时。细菌用5000x g离心20分钟来收集，并将沉淀物冷冻在-20℃。
示例性融合蛋白
本发明的示例性利查维啶融合蛋白陈述于下列序列表中。为方便参考，提供该融合蛋白的单字母氨基酸序列于下：
Rhavi-PcrV-His SEQ ID NO：16
Figure BDA0002388953440001571
Rhavi-MrkA-供体-链-互补-His SEQ ID NO：17
Figure BDA0002388953440001572
Figure BDA0002388953440001581
RhaVi-FlaA1-His SEQ ID NO：18
Figure BDA0002388953440001582
Rhavi-FlaA2-His SEQ ID NO：19
Figure BDA0002388953440001583
Figure BDA0002388953440001591
Rhavi-FlaB-His SEQ ID NO：20
Figure BDA0002388953440001592
Rhavi-FlaB-结构域2-His SEQ ID NO：21
Figure BDA0002388953440001593
Rhavi-FlaA2-结构域2-His SEQ ID NO：22
Figure BDA0002388953440001594
Figure BDA0002388953440001601
Rhavi-FlaB-PcrV-His SEQ ID NO：23
Figure BDA0002388953440001602
Rhavi-FlaB-结构域2-MrkA-供体-链-互补-His SEQ ID NO：24
Figure BDA0002388953440001603
Figure BDA0002388953440001611
Rhavi-MrkA-供体-链-互补-PcrV-His SEQ ID NO：25
Figure BDA0002388953440001612
Rhavi-FlaB-结构域2-PcrV-His SEQ ID NO：26
Figure BDA0002388953440001613
Figure BDA0002388953440001621
融合蛋白的纯化
开始纯化时，将细菌沉淀物的每克细胞沉淀物重新悬浮于4ml 的冷却的20mMTris pH 8.0、500mM NaCl、20mM咪唑、10mM MgCl2和2X Halt蛋白酶抑制剂(ThermoFisher)中。用超音波使细菌破裂，接着加入DNA酶I至最终浓度为25μg/ml。不溶的残渣用5000x g 离心20分钟而除去。透明的裂解物用等体积的20mM Tris pH 8.0和 500mM NaCl稀释，使最终缓冲液浓度达到20mM Tris、500mM NaCl、10mM咪唑、5mM MgCl2和1x Halt蛋白酶抑制剂。蛋白质通过与镍亲和树脂结合，用20mM Tris、500mM NaCl、20mM咪唑洗涤，和用20mM Tris、500mM NaCl、500mM咪唑洗脱经结合的蛋白质来纯化。在所期望的目标蛋白二聚体的洗脱中的波峰分馏物经汇集与浓缩。从这些管柱洗脱出的蛋白质进一步通过凝胶过滤层析和/或SEC来纯化。这些蛋白质接着用SDS-PAGE、Western印迹法和 SEC来分析。全部的融合蛋白以预期的分子量在SDS-PAGE中移动。每一个样品的蛋白浓度使用BCA蛋白测定试剂盒(BioRad)测量。将纯化的蛋白质等分，在液态氮中快速冷冻，并储存在-80℃下留待将来使用。
表5中显示了示例性利查维啶融合蛋白和本发明的变体的物理属性的概要。本发明的全部利查维啶融合蛋白经表达且通过尺寸排阻层析术(SEC)显示而确定为二聚体蛋白(表5)。
表5：本发明的大肠杆菌所表达的利查维啶融合蛋白的物理属性
Figure BDA0002388953440001631
鞭毛蛋白融合蛋白中的TLR5活性的评估
为评估所述融合蛋白是否适当地折叠，通过用如图12B中所示的各个试验蛋白或复合物一起培养4小时来刺激HEK293-NFkB：Luc 细胞。先前已有记录HEK293-NFkB：Luc细胞会对鞭毛蛋白反应但不会对LPS或非有鞭毛的沙门氏菌反应(Simon和Samuel，2007)。在细胞溶解之后，用Promega公司的萤火虫荧光素酶确定荧光素酶活性。该测定法测量了NF-kB的活性。(Simon和Samuel，2007)。
在使用HEK293-NFkB：Luc细胞以及天然假单胞菌鞭毛蛋白和利查维啶融合蛋白单独或作为与PnPS 6B的MAPS复合物的测定法中的TLR5生物活性显示于图12B中。这些结果清楚指出利查维啶鞭毛蛋白构建体FlaB、FlaA1、FlaA2仰赖自己来促进TLR5活性或作为与PnPS 6B的MAPS复合物来促进TLR5活性，因而适当地折叠。
示例性融合蛋白的免疫原性
对于所述融合蛋白变体的高效价血清经生成以评估蛋白特异性抗体的体外活性。对于以下融合蛋白(FP)中的每一种的对应免疫原的ELISA IgG效价显示于图14中：Rhavi-FlaB-D2；Rhavi-FlaA2-D2； Rhavi-FlaB-PcrV；Rhavi-FlaB-D2-MrkA和Rhavi-PcrV-MrkA。全部的 FP非常具有免疫原性并引发高效价的FP-特异性IgG抗体。
利用针对含有利查维啶融合蛋白的FlaB所产生的兔血清的FlaB 和FlaA1交叉反应性总结于表6中。
表6：来自于用含有利查维啶融合蛋白的FlaB免疫接种的兔的血清对于纯化自PAPAO1的天然FlaB或纯化自PA PAK的FlaA1的交叉反应性
Figure BDA0002388953440001641
抗-Rhavi-FlaB-D2和-Rhavi-FlaB-PcrV兔血清均具有高效价的 FlaB-特异性抗体，但在比较下抗-Rhavi-FlaB-D2-MrkA血清具有低效价的FlaB特异性抗体。抗-Rhavi-FlaB-PcrV血清具有显著交叉反应性的FlaA1-特异性抗体，因此暗示了该融合蛋白的FlaB组分适当地折叠，且交叉反应性的FlaA1表位可能位于鞭毛蛋白结构域2以外的共同保守的D0和D1结构域(Song和Yoon，2014)，在Rhavi-FlaB-D2 或FlaB-D2-MrkA中并不表达。因此，因为其与FlaA1的显著交叉反应性，Rhavi-FlaB-PcrV是一个可针对假单胞菌感染提供广泛的鞭毛蛋白免疫力的极佳候选融合蛋白。
实施例5：免疫原性复合物的制备
天然OPS主链聚合物的制备
天然OPS
肺炎克雷伯氏菌(KP OPS)血清型O1、O2、O3和O5以及铜绿假单胞菌OPS(PA OPS)血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11 的O-多糖(OPS)分离自生长在CDM中的有机体发酵的生物质，对于 PA OPS该生物质经在1％的乙酸中以100℃沸腾处理，或对于KP OPS 该生物质经乙酸和亚硝酸钠(NaNO2)处理。对于PA LPS，乙酸的处理裂解了LPS内核的KDO键和脂质A(图1A)，并在COPS的还原端产生KDO部分。对于KP LPS，亚硝酸脱胺作用裂解了内核葡萄糖胺残基与LPS内核脂质A部分的其余部分之间的键，并在碳-1上产生还原型2，5-脱水甘露糖残基(图1C)。PA OPS的结构(Knirel等，2006) 和KP OPS的结构(Vinogradov等，2002)分别显示于图1B和1D中。PA 和KP OPS的下游纯化过程显示于图8A中。这些纯化过程产生了高含量(＞50-100mg/L的纯化物质)的高纯度OPS，且其具有低水平的残余蛋白质、核酸和内毒素。OPS的化学和免疫化学特性的确定通过TFA 解聚合作用和Dionex HPAEC-PAD、比较NMR光谱数据的高分辨率 1H-NMR(化学位移和偶联常数)与已发表的文献，以及通过利用以热灭菌的全细菌所产生的KP OPS和PA OPS型特异性的单克隆抗体或抗血清的ELISA免疫反应性(图6C)。由SEC和SEC-MALLS测得的OPS平均分子量范围是约10kDa至30kDa，因其类型而定，且PA OPS通常大于KP OPS。经纯化的KP OPS和PA OPS的HPAEC-PAD (Dionex)单糖组合物分析总结显示于表7中。
表7.经纯化的KP OPS和PA COPS的HPAEC-PAD单糖组合物分析
Figure BDA0002388953440001661
Figure BDA0002388953440001671
主链聚合物OPS
图1E绘示了产酸克雷伯氏菌(KO)荚膜多糖(CPS)K19的重复单元化学结构，其与肺炎克雷伯氏菌K19 CPS相同。图1F绘示了经纯化的KP K19 CPS于950MHz的H-NMR光谱。平均分子量为10-30kDa的天然KP OPS和PA OPS共价连接至较大的K19 CPS(平均分子量为218kDa)上以增加其有效分子量大小及其表位配价。主链聚合物OPS 随后生物素化或在增大过程期间选择性地在K19 CPS主链聚合物上生物素化以产生BP-1、BP-1.2或BP-1.3(图2A-2C)，或随机均在OPS 和CPS上生物素化以产生BP-2a(图3)或选择性地在OPS上生物素化以产生BP-2b(图4)。
主链聚合物在尺寸排阻管柱上明显比单独的K19 CPS或OPS较早洗脱出，暗示了其尺寸比单独的组分显著增加，且显示出相对于起始材料中的数量其游离OPS水平降低而表明掺入到主链聚合物中。
使用诸如K19 CPS的CPS作为主链聚合物的这种增大过程是一种可应用于任何CPS/OPS或小分子量细菌多糖的通用过程，可导致一成分确定且一致的产物，并对OPS/CPS表位的变化最小或没有变化。如图6C中所示，通过ELISA和天然PA OPS O1、O2、O3、O6、 O10和O11以及对应的PA OPS：K19BP-1构建体，并使用来自 HK-PA免疫接种的兔高度免疫血清，这清楚显示了以下的抗原性分析(图6C)。在这些实验中，在天然PA OPS和对应的主链聚合物OPS 之间没有观察到抗原性的差异，表明在增大过程中OPS表位被保留。
主链聚合物(BP)的生物素化
BP-1
OPS通过与NaBH3CN的还原胺化反应而先在其还原端配有在各末端含有伯胺(例如ADH)的短间隔物。在KP OPS上反应的醛位于末端的2，5-脱水甘露糖(2，5-anMan)残基上，该2，5-脱水甘露糖残基在萃取过程期间通过将整个LPS与亚硝酸钠一起处理而产生(图8A)，而在 PA OPS上反应的酮位于PA OPS内核的还原末端KDO残基上，该KDO 残基通过将LPS与乙酸一起处理而产生，如图8A所绘示。ADH衍生化的OPS随后与该部分过碘酸盐氧化的KP 19CPS主链(这些衍生物的示例性SEC-HPLC记录曲线绘示于图6A和6B中)以及与含有伯胺的生物素(诸如胺-PEG3-生物素)混合，且该混合物还原胺化以形成在多糖主链上独特地生物素化的OPS主链聚合物，我们称之为主链聚合物-1(BP-1)(图2A)。
BP-1.2
替代性地，KP 19 CPS主链反应的羧酸盐基团可先用1-乙基-3-(3- 二甲胺丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及含有伯胺的生物素(诸如胺PEG生物素)进行生物素化，接着过碘酸盐氧化，与ADH衍生化的OPS混合，且该混合物还原胺化以形成在多糖主链上独特地生物素化的OPS主链聚合物，我们称之为BP-1.2(图 2B)。替代性地，ADH步骤对于PA OPS可被排除，因为其含有一个氨基酸丙氨基的取代基以及在其外核半乳糖胺残基的碳-2上的游离α-氨基(图1A)。因此，这些可得的氨基可立即用来通过还原胺化而直接与过碘酸盐氧化的K19 CPS聚合物以及该含有胺的生物素偶联，以形成生物素化的BP-1(图2A)或BP-1.2(图2B)。
替代性地，在还原端含有醛或酮的OPS在还原剂的存在下用叠氮化物氨基进行衍生化，以产生在末端具有叠氮化物基团的OPS。多糖主链接着经由多糖羧酸盐基团和EDC而配有炔基。该主链多糖进一步用CDAP和生物素-酰肼化合物进行生物素化，以产生含有生物素化和炔基化的多糖。经衍生化的叠氮基-OPS和经生物素化的炔-CPS 接着用铜催化剂点击连接以形成(OPS)n-CPS BP-1，其中该主链聚合物经生物素化且该OPS未经生物素化(图5B；流程图1)。使用此点击连接化学反应，OPS BP-1的获得也可通过使用羟酸盐和EDC而先将炔基引入CPS，接着使用胺-PEG-叠氮化物和硫酸铜催化剂胺化，用 CDAP和生物素酰肼将CPS生物素化；含有伯氨基团的经生物素化 CPS与天然OPS(在其还原末端含有醛或酮基)混合并用还原剂还原胺化，以产生OPS/CPS BP-1(图5B；流程图2)。BP-2b的获得可通过此点击化学反应，通过先将生物素残基选择性地引入所述在末端以叠氮化物基团衍生化的OPS中，并接着使用CDAP化学和生物素酰肼进行生物素化；并且第二次点击连接所述用炔基化的CPS使经生物素化的OPS叠氮化物衍生化，如图5B；流程图3中所示。
BP-2a
替代性地，ADH衍生化的OPS或未衍生化的OPS与部分过碘酸盐氧化的KP菌株19CPS主链混合并还原胺化，以形成OPS主链聚合物；该主链聚合物进一步用CDAP和生物素PEG胺进行衍生化，以得到随机用生物素在主链多糖和OPS上均生物素化的主链聚合物，我们称之为BP-2a(BP-2a)(图3)。
BP-2b
替代性地，OPS先用CDAP和胺PEG生物素进行衍生化；所得的经生物素化OPS用过碘酸盐部分氧化以将醛引入其内核KDO或庚糖中，并用ADH还原胺化；经生物素化和胺化的OPS接着与部分过碘酸盐氧化的KP 19 CPS主链混合并还原胺化，以形成选择性地在其 OPS上生物素化的OPS主链聚合物，我们称之为BP-2b(图4和图5B，流程图3)。
BP-3
替代性地，ADH衍生化的OPS先用PLL主链的ε-NH2基团进行还原胺化，以产生OPS-PLL主链聚合物。所得的OPS-PLL用酰化剂处理，使得乙酸酐加帽PLL主链的未反应氨基(ε-NH2)，以形成OPS-聚-N- 乙酰基-赖氨酸(OPS-PNAcLL)主链聚合物。此OPS-PNAcLL主链聚合物接着通过先用CDAP在接着用胺PEG生物素处理而在其OPS上进行生物素化。此主链聚合物于其OPS上选择性地进行生物素化，其被称为BP-3(图5A)。
未反应的OPS、生物素、CPS和残余偶联化学物通过FPLC-SEC 用Superdex 200去除或通过50-300kDa TFF UF-DF来去除。
示例性免疫原性复合物的生成和纯化
MAPS复合物或变体MAPS复合物通过在20mM Tris pH8.0、150 mM NaCl中以选定的比例(通常为3∶1，蛋白质∶PS w∶w)将候选的 rRhavi-抗原融合蛋白加入经生物素化的多糖而产生，并添加0.01％乙汞硫水杨酸钠来抑制微生物生长。样品以翻滚旋转方式在25℃下过夜培养，接着用10,000x g离心5分种以除去任何不溶物质(Zhang等， 2013)。收集可溶物质并用尺寸排阻层析术在Superdex 75管柱(天然 OPS PS MAPS)上或在Superdex 200管柱(CPS MAPS和主链聚合物PS 变体MAPS)上用2mM Tris、pH 8.0、150mM NaCl纯化MAPS复合物或变体MAPS复合物(Zhang等，2013)。用还原的样品的SDS-PAGE在不加热的情况下用全蛋白染料可视化来分析波峰分馏物的蛋白含量。含有MAPS或变体MAPS复合物的分馏物通过观察凝胶中大分子量复合物中的染色蛋白质滞留情况而不是观察蛋白质二聚体大小的预期迁移情况来识别(Zhang等，2013)。含有MAPS复合物的分馏物经汇集，且该MAPS或变体MAPS的蛋白质/多糖比例使用BCA蛋白测定试剂盒来确定，并用蒽酮测定法确定多糖(Zhang等，2013)。MAPS 或变体MAPS复合物的完整性用还原的样品的SDS-PAGE在不加热的情况下用全蛋白染料可视化来评估(Zhang等，2013)。MAPS或变体MAPS复合物的游离蛋白含量通过在不加热的情况下SDS-PAGE MAPS或变体MAPS复合物上的蛋白质二聚体含量的光密度测定与对照蛋白质二聚体的标准量相比下而定量(Zhang等，2013)。纳入MAPS 或变体MAPS复合物的蛋白质分子量以还原的且煮过的样品的 SDS-PAGE以全蛋白染料可视化和分子量蛋白标准试剂来分析。
KP/PA OPS使用K19 CPS为主链聚合物而产生成各种OPS主链聚合物形式(1，2a，2b)，并用下列衍生自KP和PA基因体的重组型大肠杆菌利查维啶融合蛋白而复合至变体MAPS内：在SEQ ID NO：16-26 中的Rhavi-PcrV、Rhavi-MrkA、Rhavi-FlaA1、Rhavi-FlaA2、Rhavi-FlaB、Rhavi-FlaB-结构域2、Rhavi-FlaA2-结构域2、 Rhavi-FlaB-PcrV、Rhavi-FlaB-结构域2-MrkA、Rhavi-MrkA-PcrV、 Rhavi-FlaB-结构域2-PcrV，且使用PRO-CN作为对照蛋白质。
与本发明的利查维啶融合蛋白一起生成并与生物素化肺炎球菌 PS 6B、7F和19A型多糖复合的一些MAPS批次的示例性属性显示于表8中。变体MAPS复合物的示例性纯化显示于图10和11中。变体 MAPS复合物通过SEC而纯化自未反应的蛋白质以及SDS-PAGE所分析的凝胶洗脱分馏物，图10中显示了一种典型的分析方法，其中游离蛋白质显示其洗脱于凝胶中后面的部分内且可从变体MAPS分离，如在Zhang等，2013中最初提到的MAPS复合物。图11A-11C绘示纯化后的K19-PA O1 OPS BP-1 MAPS复合物、K19-PA O2 OPS BP-1 MAPS复合物和K19-PA O10 OPS BP-1 MAPS复合物与PRO-CN(图 11A)；Rhavi-FlaB-PcrV(图11B)；Rhavi-FlaB-D2-MrkA(图11C)的 SDS-PAGE分析。纯化后的变体MAPS复合物中的每一种分别以沸腾处理且不加热处理。变体MAPS复合物在没有加热的情况下没有被破坏，且变体MAPS复合物中的蛋白质保留在凝胶的最顶部(Zhang等， 2013)。在沸腾处理的情况下，变体MAPS复合物被破坏，蛋白质被释放并且通过利查维啶分子间的相互作用所形成的蛋白质二聚体也被解离(Zhang等，2013)。接着然后用BCA测定法确定变体MAPS的蛋白质含量，并用蒽酮测定法确定多糖含量。蛋白质与多糖的比例以重量/重量比和摩尔比计算。
全部最后纯化的MAPS和变体MAPS可用0.22μm过滤器进行无菌过滤处理(表8和未示出的数据)。
表8：利查维啶融合蛋白纯化的MAPS属性
Figure BDA0002388953440001711
Figure BDA0002388953440001721
实施例6：免疫接种研究
动物的免疫接种
在兔的免疫接种之前，MAPS或变体MAPS复合物或单独PS在注射前约48小时与佐剂一起配制。MAPS或变体MAPS以各血清型PS的最终浓度为10μg/ml而吸附至佐剂，且其为含有40mM组氨酸pH 5.5、150mM NaCl和0.25mg/ml磷酸铝凝胶的单价或多价混合物，并在4℃下以翻滚方式混合过夜。将该配制的混合物直接以0.5ml体积含5μg剂量的PS进行免疫接种。对于较低的PS剂量，用40mM组氨酸、pH 5.5、150mM NaCl进行适当的稀释。以2周或4周的间隔对4 个月大的新西兰白兔(Cocalico Biologicals公司，每组n＝8至10)给予两次IM免疫接种(0.5ml)。在2周剂量间隔的第一次和第二次免疫接种之后的2周获得血液样品。对于4周的剂量间隔，在第一次免疫接种后的2周和4周，以及第二次免疫接种后的2周收集样品。
为得到针对候选载体融合蛋白的高效价抗体，分别在第一次免疫接种使用弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)，而第二和第三次免疫接种使用弗氏不完全佐剂。各个载体蛋白(0.1mg)分别与弗氏佐剂混合，最终体积为1ml，在4个不同部位皮下注射0.2ml，每次免疫接种每只兔IM注射0.2ml。在第0天、第14天和第21天对4个月大的新西兰白兔(Cocalico Biologicals)(每组n＝3)给予免疫接种，并在第二次和第三次免疫接种后2周收集血液样品。
抗体的测量
针对荚膜多糖(CPS)或OPS或不同蛋白抗原的兔抗体测定在 Immulon 2HB或Greneir Bio-one培养基结合96微孔盘(Thermo Scientific Waltham Mass公司)中进行，该96微孔盘涂覆有(1μg的与 HSA偶联的CPS或OPS或PS/ml PBS)或蛋白抗原(1μg蛋白质/mlPBS)。用1％BSA的PBS溶液阻断该微孔盘。添加稀释于PBS-T中的抗体并在室温下培养2小时。用PBS-T洗涤微孔盘，加入与兔免疫球蛋白G(获自Sigma公司)的第二HRP偶联抗体并在室温下培养1小时。微孔盘经洗涤并用SureBlue TMB微孔过氧化物酶受质(KPL公司，Gaithersburg，MD)显色。
血清样品中的对不同蛋白抗原有特异性的兔IgG效价用ELISA和标准曲线依据多克隆血清分配任意单位确定。蛋白抗原在室温下在Immulon 2HB 96微孔盘(ThermoScientific公司)中用0.5-1μg蛋白 /ml PBS和每孔100μl涂覆过夜。除去蛋白溶液并用PBS+1.0％BSA 在室温下阻断1小时，并用含有0.05％吐温-20的Dulbeco磷酸盐缓冲盐液(PBS-T)洗涤。兔血清稀释于PBS-T中，并添加至该微孔盘在室温下培养2小时。用PBS-T洗涤微孔盘，将与HRP偶联的二级驴抗兔IgG(Santa Cruz Biotechnology公司)以1∶20,000稀释于PBS-T中，且每孔添加100μl在室温下培养1小时。将微孔盘洗涤并用SureBlue TMB 微孔过氧化物酶受质(KPL公司，Gaithersburg，MD)显色。用等体积的1N HCl终止反应并在Spectramax读盘仪(Molecular Devices公司) 中读取450nm的吸光值。每个微孔盘上包含的多克隆血清标准品的 AU值指定为12,500AU/ml，并使用来自4参数曲线拟合的方程式，基于450nm的吸光值为每个稀释的血清样品指定AU并校正稀释系数。多克隆血清(AFV160，具PRO-CN特异性，利查维啶和6个组氨酸标签)标准曲线验收准则为所述重复之间的4参数曲线拟合的R2为0.99 或更大且小于10％CV。每个微孔盘上还包含了内部对照血清 (AFV151，具PRO-CN特异性，利查维啶和6个组氨酸标签)，并为了数据的验收，微孔盘之间的CV指定值必须等于或小于20％。
运载体功能的评估
利查维啶融合蛋白的对MAPS复合物中的多糖产生增强免疫反应的运载体功能能力经评估，并与单独利查维啶和一个先前对复合的多糖会产生强健免疫反应的对照载体蛋白(PRO-CN)进行比较。所生成的各种融合蛋白与已知免疫原性的多糖(肺炎链球菌6B、7F和19A)复合(Zhang等，2013)，并与有强健功能的载体蛋白对照组 (PRO-CN)进行比较。所有融合蛋白均能够与生物素化的PS复合并形成高分子量复合物，经得起纯化且随后用于兔免疫接种和运载体功能的评估。
兔以用不同利查维啶融合蛋白产生的肺炎球菌多糖(PnPS)6B and 19A所产生的MAPS复合物进行免疫接种。在第一次免疫接种 (P1)和第二次免疫接种(P2)之后的2周收集血清。各个样品中对于 PnPS 19A和6B的兔IgG浓度通过ELISA测量并报告成AU，而AU从一个AU指定为12,500AU/ml的多克隆血清的标准曲线来确定。如图 13A和13B所示，以假单胞菌鞭毛蛋白B(FlaB)作为利查维啶融合蛋白(Rhavi-FlaB)以及以与假单胞菌PcrV融合的假单胞菌FlaB作为利查维啶融合蛋白(Rhavi-FlaB-PcrV)能够产生与先前识别的载体蛋白PRO-CN相似的对于肺炎球菌多糖(PnPS)6B和19A的IgG效价。以假单胞菌FlaA1和FlaA2作为利查维啶融合蛋白(Rhavi-FlaA1和 Rhavi-FlaA2)以及以与克雷伯氏菌MrkA融合的假单胞菌FlaB结构域 2作为利查维啶融合蛋白(Rhavi-FlaBD2-MrkA)显示出效价近似于 Rhavi-FlaB和PRO-CN的2倍或在其2倍的内。0.044μg剂量的克雷伯氏菌MrkA和假单胞菌PcrV显示出其对于攻击19A PS有着非常低到无法测得的IgG效价，而对于攻击6B和7F的效价低下。为克服MrkA 不良的运载体功能，同时产生针对MrkA的抗体，其与强运载体FlaB- 结构体2蛋白融合以保留运载体功能(Rhavi-FlaBD2-MrkA)。
表9总结本发明的示例性利查维啶融合蛋白的运载体属性。与 PRO-CN相比时每种融合蛋白的运载体功能呈现成与载体蛋白 PRO-CN所证明的百分比，并与单独利查维啶蛋白相比，其对6B的免疫反应仅为4％，对19A的免疫反应为5％。Rhavi-FlaB-PcrV是一种双重病原体特异性蛋白(具有FlaB和PcrV两种假单胞菌衍生抗原与利查维啶融合的嵌合蛋白)，相对于PRO-CN(100％)，在提高针对6B 型(62％)和19A型(102％)的强健PnPS特异性兔免疫反应方面其显现为强运载体。相对于PRO-CN，Rhavi-FlaB也显现出强运载体作用，均对6B(66％)和19A(49％)有强健的反应。相对于PRO-CN， Rhavi-MrkA对于6B(27％)和19A(2％)分别有较低的载体蛋白作用。 Rhavi-FlaBD2对于6B(66％)有强健的载体蛋白作用，而对于19A (20％)则有较低的运载体作用。含有假单胞菌(FlaBD2)和克雷伯氏菌 (MrkA)抗原的嵌合Rhavi-FlaBD2-MrkA对于6B(34％)和19A(45％)提供了运载体作用，大约低于载体蛋白PRO-CN两倍，且增加超过单独利查维啶。因为对于两种PnPS所产生的免疫反应大于PRO-CN的 30％，且因为表达较大量的病原体特异性蛋白，Rhavi-FlaB-PcrV和 Rhavi-FlaBD2-MrkA变体均选作候选载体蛋白以在变体MAPS中与本发明的OPS主链聚合物复合。除了显现出载体作用以外，对高度保守的假单胞菌PcrV具有特异性、在某种水平上对FlaB(即假单胞菌菌株表达的FlaB的约45％)具有特异性、且对保守的克雷伯氏菌MrkA具有特异性的载体蛋白IgG针对这些FP所产生，其对于这两种病原体造成的疾病可带来显注额外的广效保护涵盖性。
表9：示例性利查维啶融合蛋白和变体的载体蛋白属性
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Figure BDA0002388953440001771
免疫原性的评估
在图15中显示了在兔中的天然PA O6和O10 OPS的各种制剂作为具有利查维啶融合蛋白PRO-CN或利查维啶的MAPS复合物的比较免疫原性研究。OPS特异性IgG ELISA效价以ELISA单位报告。在2 次免疫接种(P2)之后，比P0大于100倍的OPS特异性IgG抗体效价无法用这些制剂中的任一种产生。这暗示了天然PA OPS(10-30kDa)的分子大小太小，表位配价太低，或者分子结构不适合诱导反应，即使在作为具有载体蛋白PRO-CN的MAPS复合物时。
比较各种复合到变体MAPS中的KP-O1 OPS主链聚合物变体的免疫原性研究在兔中进行。评估了与克雷伯氏菌荚膜多糖(CPS)K19 连接的KP O1 OPS的BP-1、BP-2a和BP-2b变体的免疫原性。还评估了与K19连接的KP O5的BP-1变体。比较了四种变体MAPS复合物的混合物的免疫原性；2价KP-O1和-O5 OPS BP-1(其示意图显示于图 2A中)；KP-O1 BP-2a(图3)和KP-O1 BP-2b(图4)。这些多糖全部均与载体蛋白PRO-CN复合在变体MAPS中，并在注射前与明矾一起配制。对于免疫接种前(P0)、第一次(P1)或第2次免疫接种(P2)之后的血清，抗KP-O1 OPS IgG效价以ELISA单位显示，并显示于图16中。BP-2a OPS(12,000EIA单位)显示了O1 OPS特异性IgG效价比P0大 100倍。O1 OPS BP-1和O5 OPS BP-1显示了比P0高10倍的效价。
同样地，兔中的免疫原性研究比较了PA-O6和-O10 OPS BP-1的各种制剂：具有明矾的2价PA-O6、-O10 OPS BP-1PRO-CN MAPS；不含佐剂(无明矾)的2价PA-O6、-O10 OPS BP-1PRO-CN MAPS；仅2价PA-06、-O10 OPS BP-1多糖(明矾，无蛋白质)；2价PA-O6、 -O10 OPSBP-1混合物，未复合有PRO-CN(未生物素化；明矾；无变体MAPS形成)；以及具有明矾的单价PA-IATS O6 OPS BP-1 PRO-CN MAPS(OPS的另外的PA O6菌株来源)。对于免疫接种前(P0)、第一次(P1)或第2次免疫接种(P2)之后的血清，抗PA-O6和 PA-O10 OPS IgG效价以ELISA单位给定并显示于图17中。只有当OPS 主链聚合物存在于具有明矾的变体MAPS复合物中时，才能实现 PA-O6和PA-O10 OPS-特异性IgG比P0大100倍(在ELISA单位中的范围为5,000-11,000)。
使用实验室标准化的生长条件和化学成分确定的培养基所产生的KP OPS的大小在10-15kDa的范围内，相对小于在类似条件下获得的PA OPS(20-30kDa)的大小，这些大小差异可能部分解释了为什么在此比较免疫原性研究中PA OPS BP-1会比KP OPS BP-1更具免疫原性。另一方面，KP OPS BP-2b构建体具有显著的免疫原性(图 16)。OPS重复单元中的其他结构差异也可能是一个因素，诸如电荷， PA-O6和-O10的重复单元都带负电，而KP-O1OPS则呈中性。
实施例7：功能性抗体测定
调理吞噬灭杀测定
使用HL-60的调理吞噬灭杀(OPK)测定法：测定法如前述并加以修饰后执行(Ramachandran等，2016)。简言之，测定法于96孔圆底盘中执行，使用来自于对数生长期培养物稀释至3x 105细胞/ml的铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌菌株；幼兔补体(BRC)；作为多形核白细胞来源的PMA分化的HL-60细胞(2x 107细胞/ml)；和若干稀释度的兔免疫前/免疫血清。在37℃下培养45分钟之后，从小孔中取出等分试样并涂覆在细菌琼脂盘上(5％Hy-酵母萃取物[Kerry Bio-Science 公司]、10％未含动物的大豆蛋白胨[Teknova公司]、5％NaCl [Americanbio公司]和1.4％琼脂[Americanbio公司]，在下文中称为 HySoy琼脂或HSA)。在HSA上过夜培养之后计数CFU。当用免疫血清处理的细菌的CFU从近似稀释度的免疫前血清的CFU降低时，即获得阳性OPK反应。
图18A用HL-60细胞和兔抗血清比较了克雷伯氏菌菌株KP 12-0581(O1：K62)对于以下各物的反应：免疫接种之前与第二次免疫接种之后的KP-O1 OPS BP-1PRO-CN MAPS(左图)以及免疫接种之前与第二次免疫接种之后的KP-O1 OPS BP-2a/利查维啶 PRO-CN MAPS(右图)。当与在相同兔中的免疫前血清(P0)相比时，在BP-2a免疫血清(P2)中观察到显著的KP灭杀性。对于BP-1免疫血清并未观察到显著的灭杀性，与利用这些构建体所得到的O1-OPS-特异性IgG效价结果一致，即在相对效价上BP-2a＞BP-1。
用HL-60细胞和兔抗血清的假单胞菌菌株PA IATS O6对于二价 PA O6，O10-OPSBP-1PRO-CN MAPS和单价PA IATSO6-OPS BP-1 PRO-CN MAPS的OPK结果显示于图18B中。两个兔对象P2血清(AFV 624；AFV 625)对于PA O6，O10-BP-1MAPS产生了显著的PA IATSO6OPK作用(图块左)，兔免疫后血清(P2)对于PA IATSO6-BP-1MAPS 产生了显著的PA IATSO6OPK作用，尽管血清AFV643(P2)产生了暗示强OPS抗体效价的前带效应。
用2价PA-O6，-O10 OPS BP-1-PRO-CN-MAPS疫苗产生的四个兔对象免疫血清(P2)在HL-60细胞中诱导对假单胞菌O10细菌的强健 OPK作用(图18C)。
用汇集的兔抗-Rhavi-FlaB-His抗血清和HL-60细胞对于标靶菌株铜绿假单胞菌菌株PAO1(O5：表达有FlaB)的OPK结果显示于图 22中。在此实验中，抗-Rhavi-FlaB-His抗血清引发了一些OPK作用(达至稀释度1/100)。用假单胞菌疫苗和抗假单胞菌FlaB血清所产生的人类IVIG显出强OPK作用。(-)对照血清并未诱导任何OPK作用。
使用人类PMN的OPK测定
测定如前述并加以修饰后执行(Cross等，1986)。简言之，测定法于96孔圆底盘中执行，使用来自于健康人类供体以葡聚糖沉降和 Ficoll-Hypaque密度梯度离心新鲜分离出的多形核白细胞(PMN)。 PMN储备液在含有钙/镁的HBSS中调整到23x 106细胞/ml。将60μl 的PMN储备液添加至微测量试孔，以及在各种稀释度中存有在或不存有10μl热灭活的免疫前或免疫后血清的下，添加10-20μl的幼兔补体或新鲜正常人类血清(NHS)、10μl的细菌(～106CFU，MOI～1∶1)。于时间0取得样品并稀释和涂覆于HySoy培养盘上，接着将该96孔培养盘在37℃下震荡培养2小时。在2小时的时候，再次取得样品并稀释和涂覆。在37℃下隔夜培养之后，对培养盘进行计数。每个孔的2 小时读数除以时间0的读数，并以1.0-T2h CFU/T0CFU计算灭杀百分比。替代性地，我们将各孔的CFU转换成log CFU，从时间0的log CFU读数中减去2小时样品的log CFU读数，并将灭杀的差异表示为“Δlog CFU”。我们接着用免疫前血清和免疫后血清与非抗体对照组比较得到每孔的灭杀结果。
基于流式细胞仪分析的结合测定
将对数生长中期的铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌菌株浓缩于 PBS中至OD600为0.8。对于多糖抗原，在添加抗体前将细菌用1％甲醛固定。对于蛋白质抗原，为了保存细胞表面抗原，在添加抗体之前并不用甲醛来固定细菌。将细菌与各种稀释度的兔免疫前免疫血清/ 免疫血清一起培养1小时。未结合的抗体通过将细菌离心沉淀并用 PBS洗涤而除去，洗涤过的细胞与Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG抗体 (Invitrogen公司)在室温下一起培养1小时。未结合的抗体通过将细菌离心沉淀并用PBS洗涤而除去。免疫染色的细菌以1％甲醛固定以灭杀任何存活的生物体。将样品注射入LSR II流式细胞仪(BD公司)并使用FACSDiva(v.6.1.3；BD)和FlowJo(v.9.2；Tree Star)分析。
对于克雷伯氏菌菌株B5055(O1：K2)用兔抗血清对K-19：O1- 和O5-OPS BP-1以及BP-2a PRO-CN MAPS的FC结合结果显示于图19A中。对于完整克雷伯氏菌菌株B5055，显示了个别的兔血清对2 价KP O1，O5OPS BP-1(#651-655)(左图)和KP O1 OPS BP-2a (#666-670)(右图)的FC结合结果。
如表10中所示，这些含有完整细菌的FC结合结果与对于纯化的 KP O1 OPS的对应IgG ELISA效价有很高的关联性，也即，低效价对应了低FC结合水平，少数双阳性事件表明在KP B5055上的抗体结合力弱或OPS抗体的可及性受限。
表10：对于O1-OPS主链聚合物BP-1 MAPS和BP-2a MAPS构建体的KP O1-OPS IgGELISA效价
Figure BDA0002388953440001811
图19B比较三种克雷伯氏菌O1菌株与用KP O1 OPS BP-2a PRO-CN MAPS复合物产生的兔抗血清(AFV667)的FC结合散布图；在上面图块中可观察到对于KP B5055的结合力弱(左)，与克雷伯氏菌菌株K.caroli的结合力弱(中)，而对于未囊封的KP CVD 3001 的结合力强(右)。在下面图块(图19B)中，其对同样三种克雷伯氏菌O1菌株比较用2价KP O1，O5OPS BP-1(AFV651)PRO-CN MAPS免疫接种的兔血清与用单价KP O1 OPS BP-2a PRO-CNMAPS 所产生的兔血清(AFV667)之间的FC全部结合结果。值得注意的是，与O1 OPS BP-2a构建体的FC抗体结合力比与对应的BP-1 OPS的结合力更为显著，且这些数据似乎与对于O1OPS的IgG效价相关联，也即，KP O1 OPS BP-2a比其等效物BP-1有更强的免疫原性。这些结合数据也暗示了CPS量会影响抗体OPS的裸露，这可能受到生长条件的影响。
FC抗体对于完整假单胞菌菌株PAK(O6：FlaA1)的结合力比较结果显示于图20中：兔血清(3只兔的汇集血清，第二次免疫接种之后) 对2价PA-O6，-O10天然OPS-PRO-CN-MAPS(左)；兔血清(3只兔的汇集血清，第二次免疫接种之后)对2价PA O6，O10-OPS BP-1-PRO-CNMAPS(中)；兔血清(3只兔的汇集血清，第二次免疫接种之后)对单价PAO6-IATS-OPS BP-1-PRO-CN MAPS；当与天然形式的PA O6 OPS MAPS相比时，观察到PAO6 OPS BP-1 PRO-CNMAPS与PAK菌株的FC抗体结合更强，表明OPS最低的大小对其免疫原性至关重要，也即，天然PA OPS的大小太小且需要通过化学连接到主链多糖来增大，以增加其表位配价以及其大小。
对于用含有FlaB表位的不同利查维啶FP变体所产生的个别兔抗 FlaB抗体的假单胞菌菌株PAO1(表达FlaB的O5)的结合力通过FC 来检验，并总结在表11中。与第三次免疫接种(P3)之后的血清相比， 3只兔对象血清对于融合蛋白抗原的结果显示出其结合百分比高于阈值且免疫前血清(P0)有高结合力。这些结合数据显现出，利查维啶 FlaB-D2和FlaB-PcrV融合蛋白可以诱导强抗体结合并识别出会表达 FlaB鞭毛的完整假单胞菌菌株PAO1，暗示了这两种蛋白质通过正确的折叠而产生，且对于完整假单胞菌细菌上的天然鞭毛B表位能够特异性地诱导FlaB抗体。抗RhaviFlaB-D2-MrkA融合蛋白血清并没有显著地(或者充其量很差地)识别完整假单胞菌菌株PAO1上的鞭毛，表明利查维啶构建体的FlaB部分并未正确折叠或在评估时单独以一个单白质与弗氏佐剂进行免疫接种的情况下含有MrkA的融合蛋白并没有足够的免疫原性。
表11中列出的一些兔对象血清(#792、#798和#800)的FC散布图也显示于图21B中(上图)且显示出兔对象#792(P3放血)血清与利查维啶FlaB-D2的FC结合力强；(中图)兔血清#798(P3放血)与利查维啶FlaB-PcrV的FC结合力居中；以及(底部)兔对象血清#800 (P3放血)与利查维啶FlaB-D2-MrkA的FC结合力差。在图21A中，来自于用利查维啶FlaB-结构域2融合蛋白(缺乏TL5结合区域)(P3) 进行免疫接种的兔的兔汇集血清显示其与免疫前(P0)相比有高比例的已标记假单胞菌菌株PAO1群体(散布图右图)。
表11：兔抗FlaB抗体对假单胞菌菌株PAO1菌株的FC结合力(表达FlaB的O5)
Figure BDA0002388953440001831
ELISA和FC结合数据支持了含有FlaB的利查维啶融合蛋白(诸如利查维啶FlaB-结构域2和利查维啶FlaB-PcrV)可以通过适当的折叠产生，以诱导能够识别完整假单胞菌生物体上的天然鞭毛B的功能性抗体的看法。
移动性和移动性抑制测定
铜绿假单胞菌菌株PAO1((O5：表达FlaB)在HySoy培养液中生长至对数生长中期。细菌通过离心沉淀，并悬浮于PBS中至OD600读数为0.3，接着在PBS中稀释100倍。在存有或不存有针对鞭毛蛋白培养的各种稀释度的抗血清的情况下，将软琼脂倒入24孔培养盘中。以重复三孔的方式进行抗血清稀释。将烧红过的针浸入细菌悬浮液中，接着用以接种琼脂塞的中心。使培养盘在30℃下培养14小时或更久，直至细菌从接种位点扩散到琼脂表面。通过数字相机捕获培养盘影像以记录细菌菌落的直径。当在具有抗鞭毛蛋白血清的琼脂上的菌落大小相对于免疫前血清显著降低时，即出现阳性移动性抑制试验结果。
用利查维啶FlaB构建体免疫接种的兔血清的ELISA和对应的移动性抑制效价：Rhavi-FlaB-D2；Rhavi-FlaB-PcrV；和 Rhavi-FlaB-D2-MrkA总结于表12中。在此表中，也显示出FlaA1和 FlaB的ELISA效价为第三次免疫接种之后(P3)的抗血清，和使用铜绿假单胞菌菌株PAO1(O5：表达FlaB)的各个P3抗血清的移动性抑制效价。抗-FlaB抗体浓度(ELISA效价)与相应的移动性抑制效价之间有良好的关联性，也即具有高效价的FlaB特异性抗体的Rhavi-FlaB-D2和Rhavi-FlaB-PcrV抗血清均会诱导高水平的PAO1移动性抑制作用，而Rhavi-FlaB-D2-MrkA融合蛋白构建体则没有，可能是因为低水平的FlaB抗体可能由于构建体中FlaB蛋白组分的不当折叠或者在评估时单独以一个单白质与弗氏佐剂进行免疫接种的情况下含有MrkA的融合蛋白并没有免疫原性。
表12：不同含利查维啶FlaB的构建体的ELISA和移动性抑制效价
Figure BDA0002388953440001841
细胞毒性测定(用于PcrV蛋白构建体)
测定如下进行。简言之，将针对细菌分泌系统蛋白PcrV产生的兔抗血清加入到种在平底96孔培养盘(Corning Costar公司)中的A549 细胞内。所有抗血清和细菌的稀释均在不含抗生素的RPMI培养液中进行。将表达ExoU的对数生长期的铜绿假单胞菌菌株PAK以约10的 MOI加入并在37°/5％CO2下培养2小时，在此期间A549细胞中毒并且不再存活。通过细胞摄取活体染剂中性红(Neutral Red)来估计每个孔中的活细胞数量(假单胞菌也代谢阿尔玛蓝而无法使用)。通过测量中性红吸光度并将这些值与未暴露于细菌下的细胞进行比较而估计每个孔中的活细胞百分比。当PcrV抗血清与相等稀释度的免疫前血清相比增加活细胞数量(即能够摄取中性红的细胞)时，此测定即出现阳性测试结果。
用假单胞菌细菌预防细胞毒性的模型(Warrener等，2014)已使用来测试抗Rhavi-FlaB-PcrV FT兔抗体的效价，并显示在图24A中。保护A549(肺癌细胞)不受假单胞菌菌株PAK(O6：FlaA1)中毒的抗PcrV 抗体以下方式获得。在用Rhavi-FlaB-PcrV融合蛋白免疫接种的兔 10％血清(3只的汇集血清，第3次免疫接种之后，P3)的存在下，用单胞菌菌株PAK(O6：FlaA1)感染A549单层4小时。与免疫前血清相比，抗Rhavi-FlaB-PcrV血清保护细胞免于假单胞菌菌株PAK中毒，如同在较少的圆形分离细胞中所观察到。在随后的实验中(图24B)， A549单层细胞在各种稀释度的血清抗Rhavi-FlaB-PcrV(汇集3只， P3)的存在下用假单胞菌菌株PAK感染4小时。细胞用PBS洗涤并与中性红一起培养1小时。将细胞裂解并记录每个孔中的染剂吸光度。与免疫前血清相比，抗Rhavi-FlaB-PcrV(P3)血清在稀释度1至40时可保护细胞免于PAK中毒。
不希望受任何理论束缚下，对于Rhavi-FlaB-PcrV的多克隆反应性质以及其在融合蛋白内的构型可能是抗体对PcrV组分的亲和力增加的原因。若干假单胞菌菌株经过此使用A549细胞和抗FlaB-PcrV兔血清(第3次免疫接种之后，P3)的细胞毒性测定的测试(图25)：高毒性PA IATS O1(闭合菱形)，未观察到受到血清的细胞毒性保护；具细胞毒性的PAM-2O5菌株(闭合圆形)，也没有血清保护作用；非细胞毒性PA IATS O6(闭合三角形)，未发现毒性；具细胞毒性的PA 17002(O10)(闭合矩形)，有明显的血清保护作用；取决于菌株的这些血清保护变化可能反映出假单胞菌菌株上的PcrV靶标表达与水平。
细胞黏附测试
克雷伯氏菌与A549细胞的黏附如前述(Clements等，2008)并加些许修饰后测试。针对菌毛蛋白MrkA所产生的兔抗血清稀释于RPMI 缓冲液(不含补充物)中，并加入到种在96孔培养盘中的A549细胞内。将等体积的肺炎克雷伯氏菌O5菌株6997(104CFU/ml)与抗血清稀释液混合。将感染的细胞在37℃和5％CO2下培养1小时，然后用无菌PBS将孔洗涤6次以除去未结合的细菌。用0.1％Triton X-100的PBS 溶液裂解细胞，并将等分试样的溶液涂覆到HSA上。将培养盘过夜培养并计数CFU数。与相同稀释度的免疫前血清相比，当用MrkA抗血清降低黏附的克雷伯氏菌的数量时，即出现阳性测试结果。
通过抗Rhavi-FlaBD2-MrkA兔血清阻断克雷伯氏菌KP O5 6997 (起源于南非)黏附A549细胞的结果显示于图23中。高效价 Rhavi-FlaBD2-MrkA(第三次免疫接种之后，P3)特异性血清显著抑制KP菌株6997结合到A549细胞直至1/1000的稀释度，而免疫前血清(P0)则不。这表明Rhavi-FlaBD2-MrkA FP的MrkA蛋白组分经正确折叠并且能够引发对于KP细菌表面的天然MrkA具特异性的功能性阻断抗体。第二个实验使用通过用两种MrkA利查维啶融合蛋白 Rhavi-FlaB-D2-MrkA和Rhavi-PcrV-MrkA进行免疫接种而获得的个别抗MrkA兔抗血清来进行，其结果总结于表13中。所有的MrkA FP 兔血清(除了#804以外)均能够降低克雷伯氏菌O5菌株6997对A549 细胞的黏附，表明这2个利查维啶FP具有引发功能性MrkA特异性抗体的潜力。
表13：抗MrkA血清抑制了克雷伯氏菌O5菌株6997结合到A549 细胞
Figure BDA0002388953440001861
Figure BDA0002388953440001871
MrkA抗体反应测定
表达MrkA/3型菌毛的克雷伯氏菌通过抗MrkA抗体而凝集，导致细菌聚集并从溶液中脱落。由已经用Rhavi-MrkA-his、 Rhavi-FlaB-D2-MrkA-his或Rhavi-PcrV-MrkA-his载体蛋白接种的兔来评估免疫前血清或免疫血清。将克雷伯氏菌菌株4425(O5：K57)与血清的PBS稀释液在25℃下于96孔圆底微量滴定盘中培养1小时。轻轻摇动滴定盘以使非凝集的细菌悬浮。小心取出每个孔的上清液并转移到新的微量滴定盘中，测量600nm的光散射以评估溶液浊度。当吸光度从不含抗体的对照孔的吸光度降低即获得阳性测试结果，表明上清液中的细菌数量减少是因为抗体诱导了凝集作用。在通过 600nm的吸光度差异测量时，将测定结果记录为由免疫血清对肺炎克雷伯氏菌凝集高于免疫前血清时的最高抗体稀释度(最低浓度)。
用兔抗血清对不同MrkA利查维啶融合蛋白构建体 Rhavi-FlaB-D2-MrkA和Rhavi-PcrV-MrkA，肺炎克雷伯氏菌O5K57、菌株4425和O1K22、菌株170381的凝集评估结果总结于表14中。第二次(P2)和第三次(P3)免疫接种后对每个构建体具特异性的3只兔对象抗血清的效价为具有可检测到凝集的最高血清稀释度。在此实验中，使凝集的团块沉降，并在光密度(OD)600nm下测量剩余的(非凝集的)的细菌数量。由2种构建体Rhavi-FlaB-D2-MrkA和Rhavi-PcrV-MrkA诱导的MrkA特异性抗体识别在这两种克雷伯氏菌菌株上表达的MrkA，表明这2种融合蛋白上的MrkA组分正确折叠并产生功能性抗体反应。
表14：通过利查维啶FP MrkA-特异性抗体的克雷伯氏菌凝集结果
Figure BDA0002388953440001881
实施例8：铜绿假单胞菌热损伤和菌血症小鼠模型
热损伤和菌血症模型如前述(Neely等，2002)并加以修饰而进行。对于热损伤，将11周龄CD-1远亲杂交小鼠背部剃毛并用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉，之后暴露于具有1×1.5英寸开口的耐热聚合物卡片模板。此平台设计用来诱导12-15％的总体表面积热损伤。将乙醇(0.5ml 100％)均匀地涂抹在窗口所勾勒的背部区域上，点燃并使其确切燃烧 10秒钟然后吹熄。烧伤后立即给予小鼠0.5ml无菌生理盐水进行水合作用。接着在热伤口皮下注射铜绿假单胞菌。不覆盖伤口。感染后密切监测动物的死亡率和器官负荷(即远距扩染)14天。
为了评估抗假单胞菌FlaB兔抗体的效价，使用烧伤败血症小鼠模型(Cryz等，1984)。在此模型中，CD1小鼠如上所述燃烧，并将28 CFU的铜绿假单胞菌菌株M2(O5：FlaB)(烧伤感染LD50＜1x 102)注射入烧伤伤口内。在烧伤攻击之前，向CD-1小鼠IP注射PBS、免疫前或抗-FlaB血清。如图26中的Kaplan-Meier存活图所示，用表达FlaB 的假单胞菌菌株M2攻击伤口的小鼠受到抗-FlaB的保护达10天或更久，而来自其他群组的所有小鼠均死于伤口攻击。
在菌血症模型中，7周龄BALB/c小鼠在用肺炎克雷伯氏菌或铜绿假单胞菌进行IV攻击之前的24小时，通过IP给药方式以对照IgG处理或以疫苗诱导的抗体处理。取决于生物体，以1-4小时的间隔对动物进行放血以监测血液的清除率，并通过在感染后1-24小时对小鼠实施安乐死并收获肝脏和脾脏来进行。
实施例9：小鼠保护测定
清除和器官负荷小鼠模型
KP OPS特异性抗体的预防克雷伯氏菌感染的能力于清除和器官负荷小鼠模型中测试。CD1小鼠(3组)IP给予抗KPO1 BP-2a OPS-PRO-CN MAPS的兔血清，并接着克雷伯氏菌KP B5055 O1 (9x 104CFU)攻击(IV)。在攻击14小时之后测量脾脏KP活菌计数。与接受免疫前血清(P0)的小鼠脾脏相比，观察到接受免疫血清(P2)的小鼠脾脏中KP活菌计数显著降低(图27)。此数据表明由OPS BP-2a MAPS疫苗诱导的O1 OPS特异性抗体具有从小鼠脾脏中清除生物体的能力，因此对克雷伯氏菌感染具有保护性。
在水杨酸钠中生长的KP(O1：K2)
肺炎克雷伯氏菌菌株B5055(O1：K2)隔夜生长在含有2.5mM水杨酸钠(Sigma公司)的HySoy培养液中，以减少CPS的表达(Domenico， 1989)。含有2.5mM水杨酸钠12ml的HySoy培养液以5％过夜培养方式接种且接着生长至对数生长中期(在37℃下震荡)。细菌经离心沉淀并重新悬浮于无菌PBS中至约1x 108CFU/ml的浓度。经浓缩的细菌稀释在PBS中至2x105CFU/ml。IP给予0.1ml兔血清1小时之后，8-12 周龄的雌性小鼠CD-1用0.1ml的2x 104CFUB5055进行IP感染。在7 天的时间内监测小鼠的死亡率。
在实验1中，在用2x 104的KP O1 B5055生物体进行IP攻击之前1 小时，经IP给予CD1小鼠0.1ml的KP O1 OPS BP-1；BP-2a PRO-CN MAPS兔或HK KP O1：K2兔抗血清(以1/10稀释)。实验结果总结于表 15中。
表15：用生长在水杨酸钠中的KP O1：K2进行小鼠被动保护
Figure BDA0002388953440001901
在实验1中，阳性对照组HK KP O1细菌和KP O1 OPS BP 2 PRO-CN MAPS抗血清针对KP O1：K2(B5055)的攻击提供完全保护，其中PBS对照组和KP O1 OPS BP-1 PRO-CN MAPS抗血清并未保护小鼠。
在实验2中，在用2x104的KP O1 B5055细菌进行IP细菌攻击之前， CD1小鼠(每组5只)经IP给予0.1mL的兔免疫或免疫前汇集血清。接受PBS和KPO1 HK血清(以1/10稀释)的小鼠分别作为阴性和阳性对照组。所有KP O1 OPS PRO-CN MAPS能够在该模型中提供保护，尽管接受BP-2a的小鼠(5只中的4只)在攻击中生存得更好。KP O1 OPS BP-1PRO-CN MAPS血清提供了一些保护，5只小鼠中有2只存活。接受PBS的小鼠均未在攻击中存活。这些存活结果非常一致，并且与抗KP O1 OPS特异性IgG ELISA效价的水平非常关联(即，用更高水平的抗体可观察到更好的保护水平)。
在小鼠模型中针对假单胞菌生物体的被动保护
PA OPS特异性抗体的预防假单胞菌感染的能力在被动保护存活小鼠模型中使用被PA菌株17002(O10)IP攻击的CD1-小鼠以及D-半乳糖胺来测试，以使动物对内毒素的致死效应敏感(Galanos等，1979) 并使它们更容易受到感染。在用(1x106CFU)和D-半乳糖胺攻击之前1 小时，小鼠接受兔抗2价PA O6/O10BP-1 PRO-CN MAPS(兔AFV624 或AFV629，以IP方式给予)。结果总结于表16中。在此保护研究中，与免疫前血清(AFV624 P0)相比，PA O6/O10 2v BP-1PRO-CN MAPS 免疫血清(AFV624；P2)给小鼠针对PA O10菌株17002的保护多40％。同样地，与免疫前血清(AFV629 P0)相比，PA O6/O10 2v BP-1 PRO-CN MAPS免疫血清(AFV629；P2)给小鼠针对PA O10菌株17002 的保护多40％。用热灭菌的PA O10细菌所产生的高效价兔抗血清阳性对照组相对于PBS对照组产生显著的保护性。与PBS(AFV624 P0) 相比，来自一些兔的免疫前血清可提供一些保护性。在通过ELISA 测量时，保护水平(存活的)和疫苗诱导的PA O10 OPS特异性IgG 抗体水平之间似乎存在某种关联性(表16)。
表16：在用PA O10菌株17002与来自2价PA O6/O10 BP-1 PRO-CN MAPS群的D-半乳糖胺攻击的小鼠中的被动保护。
Figure BDA0002388953440001911
图28绘示小鼠被动保护的Kaplan-Meier存活结果，其在用生长在水杨酸盐中的克雷伯氏菌菌株B5055(O1：K2)感染之前，针对KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS给予兔血清以降低荚膜的表达。CD1小鼠 (每组5只)在用2x 104CFU克雷伯氏菌菌株B5055(O1：K2)IP细菌攻击之前，IP给予0.1mL的兔免疫(P2)或免疫前(P0)汇集血清。其显示了用于接受P0或P2KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS血清的小鼠的 Kaplan-Meier存活图。相对于给予P0血清的小鼠，P2血清在已接受 KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS抗血清存活的模型中保护了较高比例的小鼠且延长持续时间。
实施例10：示例性多价免疫原性组合物
示例性4价KP疫苗
4种不同的免疫原性复合物单独制备并接着配制在一起以制备示例性4价KP疫苗。
各复合物含有BP-1聚合物，其通过来自于KP单一细菌血清型的 OPS与氧化的K19多糖偶联以及随后K19多糖的生物素化来制备。这些接着与利查维啶融合载体蛋白复合。这些复合物中的每一种的组分详列于表17中。
表17：包含在示例性4价KP疫苗中的复合物组分。
Figure BDA0002388953440001921
这四种复合物与如下面表21中详列的佐剂配制在一起。
示例性8价PA疫苗
8种不同的免疫原性复合物单独制备并接着配制在一起以制备示例性8价PA疫苗。
各复合物含有BP-1聚合物，其通过来自于单一PA细菌血清型的 OPS与氧化的K19多糖偶联以及随后K19多糖的生物素化来制备。这些接着与利查维啶融合载体蛋白复合。这些复合物中的每一种的组分详列于表18中。
表18：包含在示例性8价PA疫苗中的复合物组分。
Figure BDA0002388953440001922
Figure BDA0002388953440001931
这八种复合物与如下面表21中详列的佐剂配制在一起。
示例性12价KP/PA疫苗1
12种不同的免疫原性复合物单独制备并接着配制在一起以制备示例性12价KP/PA疫苗1。
各复合物含有BP-1聚合物，其通过OPS与氧化的K19多糖偶联以及随后K19多糖的生物素化来制备。这些接着与利查维啶融合载体蛋白复合。这些复合物中的每一种的组分详列于表19中。
表19：包含在示例性12价KP/PA疫苗1中的复合物组分。
复合物 BP-1CPS OPS 利查维啶融合载体蛋白
1 KP K19 KPO1 Rhavi-FlaBD2-MrkA
2 KP K19 KPO2 Rhavi-FlaBD2-PcrV
3 KP K19 KPO3 Rhavi-FlaBD2-MrkA
4 KP K19 KPO5 Rhavi-FlaBD2-PcrV
5 KP K19 PAO1 Rhavi-FlaBD2-PcrV
6 KP K19 PAO2 Rhavi-FlaBD2-PcrV
7 KP K19 PAO3 Rhavi-FlaBD2-PcrV
8 KP K19 PAO4 Rhavi-FlaBD2-PcrV
9 KP K19 PAO5 Rhavi-FlaBD2-MrkA
10 KP K19 PAO6 Rhavi-FlaBD2-MrkA
11 KP K19 PAO10 Rhavi-FlaBD2-MrkA
12 KP K19 PAO11 Rhavi-FlaBD2-MrkA
这十二种复合物与如下面表21中详列的佐剂配制在一起。
示例性12价KP/PA疫苗2
12种不同的免疫原性复合物单独制备并接着配制在一起以制备示例性12价KP/PA疫苗2。
各复合物含有BP-1聚合物，其通过OPS与氧化的K19多糖偶联以及随后K19多糖的生物素化来制备。这些接着与利查维啶融合载体蛋白复合。这些复合物中的每一种的组分详列于表20中。
表20：包含在示例性12价KP/PA疫苗2中的复合物组分。
复合物 BP-1CPS OPS 利查维啶融合载体蛋白
1 KP K19 KPO1 Rhavi-FlaBD2-MrkA
2 KP K19 KPO2 Rhavi-FlaBD2-MrkA
3 KP K19 KPO3 Rhavi-FlaBD2-MrkA
4 KP K19 KPO5 Rhavi-FlaBD2-MrkA
5 KP K19 PAO1 Rhavi-FlaBD2-MrkA
6 KP K19 PAO2 Rhavi-FlaBD2-MrkA
7 KP K19 PAO3 Rhavi-FlaBD2-MrkA
8 KP K19 PAO4 Rhavi-FlaBD2-MrkA
9 KP K19 PAO5 Rhavi-FlaBD2-MrkA
10 KP K19 PAO6 Rhavi-FlaBD2-MrkA
11 KP K19 PAO10 Rhavi-FlaBD2-MrkA
12 KP K19 PAO11 Rhavi-FlaBD2-MrkA
这十二种复合物与如下面表21中详列的佐剂配制在一起。
实施例11：铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯氏菌12价疫苗的兔免疫接种研究
动物的免疫接种
在兔免疫接种前约48小时，在注射前用佐剂配制示例性4价KP 疫苗、示例性8价PA疫苗、示例性12价KP/PA疫苗1和示例性12价 KP/PA疫苗2。对于每种血清型BP-1的5μg PS剂量，复合物以10μg/ml 的最终浓度吸附至佐剂，而对于1μg PS剂量，复合物以2μg/ml的最终浓度吸附至佐剂，用具有40mM组氨酸、pH 5.5、150mM NaCl和 1.25mg/ml磷酸铝凝胶的单价或多价混合物在4℃下翻滚混合过夜。这些配制的混合物以每剂0.5ml的体积直接用于免疫接种。示例性4 价KP疫苗、示例性8价PA疫苗、示例性12价KP/PA疫苗1和示例性12 价KP/PA疫苗2的组合物总结提供于表21中。
表21：兔研究NCB012中所使用的疫苗制剂总结。
Figure BDA0002388953440001951
Figure BDA0002388953440001961
Figure BDA0002388953440001971
将12价KP/PA疫苗1给予治疗组5和6(用FlaBD2-MrkA和 FlaBD2-PcrV作为载体蛋白)，并将12价KP/PA疫苗2给予治疗组1和 2(用FlaBD2-MrkA作为载体蛋白)。此研究包含了两个接受8价PA 疫苗或4价KP疫苗的额外治疗组以进行比较。治疗组3接受8价PA疫苗，而治疗组4接受4价KP疫苗。第1、3、4和5组接受5μg的各种疫苗多糖(PS)，治疗组2和6接受较低剂量的1μg各种疫苗PS。所有疫苗均含相同量的磷酸铝佐剂(625μg)。
以4周的间隔向4个月大的新西兰白兔(Cocalico Biologicals公司，每组n＝10)给予两次IM免疫接种(0.5ml)。在第一次免疫接种后4周和第二次免疫接种后2周收集血液样品。
对于OPS的免疫反应
与4价KP疫苗相比下的对于12价KP/PA疫苗1的KP OPS的免疫反应
图29绘示与4价KP疫苗(剂量5μg，治疗组4)相比下的对于用 12价KP/PA疫苗1(剂量5μg，治疗组5)免疫接种的兔汇集血清的 KP OPS IgG终点ELISA效价的结果。
对所有KP OPS疫苗血清型(以及KP19 CPS)的强健IgG反应显现出，4价KP疫苗中的各种KP OPS类型之间的效价与12价KP/PA疫苗1的各个对应KP OPS IgG效价没有显著差异。用12价KP/PA疫苗1 诱导有着KP OPS反应稍好的趋势。这些结果也表明，当其与包含在 12价KP/PA疫苗1中的另外8种PA OPS(均制备为BP-1MAPS)组合时，对于4价KP疫苗的各种KPOPS的免疫反应没有负面干扰。
与8价PA疫苗相比下的对于12价KP/PA疫苗1的PA OPS的免疫反应
图30绘示与8价PA疫苗(剂量5μg，治疗组3)相比下的对于用 12价KP/PA疫苗1免疫接种的兔汇集血清的PA OPS IgG终点ELISA效价的结果(剂量5μg，治疗组5)。
如针对KP OPS反应所观察到的，对所有PA OPS疫苗血清型的强健IgG反应显现出，8价PA MAPS疫苗中的各种PA OPS类型之间的效价与12价KP/PA疫苗1的各个对应PA OPSIgG效价没有显著差异。这些结果表明，当其与12价KP/PA疫苗1中的另外4种KP OPS(均制备为BP-1MAPS)组合时，对于8价疫苗的各种PA OPS的免疫反应没有负面干扰。强健的IgG反应也显现出，在一次免疫接种(P1)之后的各种PA OPS在第二次免疫接种(P2)之后没有显著增加。
在两次不同剂量浓度下的对于12价KP/PA疫苗1的免疫反应
图31绘示在与疫苗中有1μg的各类BP所占的PS的12价KP/PA疫苗1(治疗组6)相比的下，以在疫苗剂量中有5μg的各类BP所占的 PS的12价KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔汇集血清的PA OPS IgG终点ELISA效价的结果(治疗组5)。
当在一次免疫接种(P1)之后或两次免疫接种(P2)之后对5μg剂量和1μg剂量治疗组进行比较时，观察到12价KP/PA疫苗1的对于PA和 KP OPS的IgG效价没有显著差异，除了KP O3的第二次免疫接种显示出IgG反应有改善以外。
第一次免疫接种(P1)后第28天和第二次免疫接种(P2)后第14天的12价KP/PA疫苗1的个别IgG OPS特异性ELISA效价显示于图32和图33中。5μg剂量(图32)和1μg剂量(图33)的12价KP/PA疫苗1 显现出对于所有12种OPS疫苗血清型和对于KP K19 CPS有强健IgG 反应。然而，尽管有强健的反应，但对OPS KPO2和KPO3的IgG反应幅度不如对KPO1和KPO5的反应那么大，特别是在第一次免疫接种后。观察到KO K19有最高的反应。
对5μg剂量治疗组进行了对于12价KP/PA疫苗1的抗OPS IgG的个别诱导x倍数比较。结果显示于图34中。除了两个异常值以外，所有动物对于各种OPS血清型均显示出诱导了ELISA效价超过基线 (P2/P0)至少4倍。对于12价KP/PA疫苗1，所有OPS血清型平均均诱导超过20倍。观察到KO 19有最高诱导结果。
图35提供了比较5μg和1μg剂量的12价KP/PA疫苗1的抗OPS IgG ELISA效价超过于基线(P2/P0)的个别诱导x倍数结果。有趣的是，如已对于5μg剂量治疗组所述，1μg剂量治疗组的所有动物均显示出比基线增加至少4倍。对于以5μg以及1μg给予动物的所有OPS血清型，包含在12价KP/PA疫苗1中的所有OPS血清型的IgG效价平均增加 x倍数超过基线增加20倍。在两个剂量浓度均观察到KO K19有最高的诱导x倍数，且观察到KP O2和KP O3有最低的诱导x倍数。
在两个不同剂量水平下的对于12价KP/PA疫苗2的免疫反应
图36显示用12价KP/PA疫苗2进行免疫接种的兔在第一次免疫接种(P1)后第28天和第二次免疫接种后第14天(P2)的汇集血清中的KP/PA OPS反应的比较结果。值得注意的是，在5μg剂量治疗组中，疫苗在第一次免疫接种之后对所有OPS血清型诱导了强健的IgG反应，在第二次免疫接种后的效价没有显著增加，除了KP O2和KP O3 OPS以外。对于那些OPS血清型，第二次免疫接种产生了显著的效价增加。对于5μg和1μg剂量治疗组，OPS IgG反应是相等的，除了KP O3 OPS在较低剂量下显示出较低的免疫原性反应。
第一次免疫接种(P1)后28天和第二次免疫接种后第14天(P2)的对于12价KP/PA疫苗2的个别IgG OPS特异性ELISA效价显示于图37 和图38中。5μg剂量(图37)和1μg剂量(图38)的12价KP/PA疫苗 2显现出对于所有12种OPS疫苗血清型以及KP K19 CPS的强健IgG反应。在第二次免疫接种后14天，各种OPS血清型的效价进一步增加。然而，除了KP O3以外，此增加幅度并不显著。如在12价KP/PA疫苗 1所观察到的，5μg和1μg剂量治疗组之间的免疫反应差异很小。观察到OPS血清型KO K19有最高的效价，且观察到KP O2和KP O3有最低的反应。
12价KP/PA疫苗1和12价KP/PA疫苗2的OPS免疫反应总结
对于兔汇集血清中的12价KP/PA疫苗1中的所有PA OPS的抗OPS 免疫反应相当于8价PA MAPS疫苗的抗OPS免疫反应。
对于兔汇集血清中的12价KP/PA疫苗1中的所有KP OPS的抗OPS 免疫反应近似于或稍好于4价KP MAPS疫苗的抗OPS免疫反应。
观察到PA OPS抗体超过基线约200倍，而KP OPS抗体超过基线约50倍。
在12价KP/PA疫苗1和12价KP/PA疫苗2之间，在汇集血清中的用于每BP剂量5μg PS和每BP剂量1μg PS的治疗组的抗体是相似的，除了KP O3以外。
对于12价KP/PA疫苗1，用于每BP剂量5μg PS和每BP剂量1μg PS的治疗组的个别血清分析显现出，在单次免疫接种后对所有KP和 PA OPS有强健反应，在第二次免疫接种后几乎没有增加，除了对KP O2和KP O3 OPS的反应以外，其中第二次免疫接种产生显著的IgG抗体效价增加。
对于12价KP/PA疫苗2，用于每BP剂量5μg PS和每BP剂量1μg PS的治疗组的个别血清分析也显现出，在单次免疫接种后对所有KP 和PA OPS有强健反应，在第二次免疫接种后几乎没有增加，除了对 KP O3 OPS的反应以外，其中第二次免疫接种产生显著的IgG效价增加。
载体蛋白的性能
对于载体蛋白的抗体反应
用FlaBD2-MrkA和FlaBD2-PcrV作为载体蛋白的12价KP/PA疫苗 1和仅用FlaBD2-MrkA作为载体蛋白的12价KP/PA疫苗2所诱导的载体蛋白抗体反应经评估。对于对象兔载体蛋白的反应表示为免疫前 (P0)水平的ELISA IgG单位，并在一次(P1)和两次免疫接种(P2)之后获得。使用相应的个别重组蛋白组分作为包被抗原(即FlaBD2、MrkA 和PcrV)来确定个别兔IgG对于载体蛋白的ELISA分析。在每个分析中，将对于疫苗1和2的载体蛋白组分的反应与对于8价PA FlaBD2-MrkA疫苗和4价KP FlaBD2-MrkA疫苗的反应进行比较。表 21中提供了疫苗剂量和治疗组的详细说明。
(a)不同载体蛋白的ELISA结果
FlaB-D2的ELISA IgG效价的结果提供于图39中。在第一次免疫接种之后观察到IgG效价强健增加，然后在所有比较的群组中第二次免疫接种之后其效价第二次增加。在每次免疫接种后的抗体浓度在所有群组之间是相似的，所述群组分别为两个不同的剂量组(由存在于疫苗组合物中的各类复合物所占的1μg或5μg的总PS，例如，存在于12价KP/PA疫苗1和疫苗2组合物中的全部12μg或60μg的PS)的 12价KP/PA疫苗1和12价KP/PA疫苗2和8价PA疫苗和4价KP疫苗(在疫苗中均有5μg的PS，例如，分别总共有40μg或20μg的PS存在于疫苗中)。
MrkA的ELISA IgG效价的结果提供于图40中。如对于FlaBD2所观察到的，在第一次免疫接种之后观察到IgG效价强健增加，且在所有群组的第二次免疫接种之后有另一次每组增加相似的上升，所述群组分别为两个不同的剂量组(由存在于疫苗组合物中的各类复合物所献出的1μg或5μg的总PS)的12价KP/PA疫苗1和12价KP/PA疫苗2和8价PA疫苗和4价KP疫苗(在疫苗中均有由各类复合物所占的5 μg的PS)。
图41显示在用12价KP/PA疫苗1(在该疫苗中有1μg和5μg的各种PS)进行免疫接种后针对PcrV的抗体反应结果。第一次免疫接种后有强健的IgG反应，且在第二次免疫接种后的效价进一步增加。然而，两个剂量组之间的反应相似。
用FlaBD2-MrkA和FlaBD2-PcrV作为载体蛋白来诱导12价KP/PA 疫苗1的载体蛋白反应，用FlaBD2-MrkA作为载体蛋白来诱导12价 KP/PA疫苗2的载体蛋白反应，8价PA疫苗(FlaBD2-MrkA)和4价KP疫苗(FlaBD2-MrkA)在一次(P1)和两次免疫接种(P2)后的超过免疫前 (P0)效价水平的ELISA效价x倍数变化显示于图42中。
12价KP/PA疫苗1中的三种载体蛋白FlaBD2、MrkA和PcrV中的每一种显现出强健的反应，在第一次免疫接种后有超过30倍的变化，且在第二次免疫接种后有超过500倍的变化。在5μg和1μg剂量组之间并未观察到对三种蛋白质的免疫原性有显著差异。
在一次免疫接种后已观察到对两种蛋白组分中的每一种有强健的IgG反应，对于12价KP/PA疫苗2中的两种融合蛋白组分FlaBD2和 MrkA增加超过30倍。在第二次免疫接种后观察到有增加超过1000倍的额外显著增加。在5μg和1μg剂量组之间，FlaBD2和MrkA的x倍数变化并未观察到有显著差异。
在接受8价PA疫苗或4价KP疫苗的群组之间并未观察到FlaBD2 和MrkA两个组分的免疫原性有显著差异。然而，与12价KP/PA疫苗2 组和8价PA疫苗组相比，4价疫苗组中的这些反应略低。
(b)在三个研究中对于不同载体蛋白的IgG反应的x-倍数变化比较
对于FlaB的IgG反应的x-倍数变化比较在三个兔免疫原性研究中检验：NCB007、NCB008和NCB012。在NCB007中，5μg剂量的6价 PA FlaBD2-MrkA(含有PA O1、O2、O3、O6、O10和O11 OPS)与相等的6价PA FlaB-PcrV比较，在NCB008中将5μg剂量的4价(O1、 O2、O3、O5)KP FlaBD2-MrkA的剂量与4价KP FlaB-PcrV进行比较，并在NCB012中将5μg剂量的具有FlaBD2-MrkA的12价KP/PA疫苗2 与具有FlaBD2-MrkA和FlaBD2-PcrV的12价KP/PA疫苗1进行比较。所有疫苗均为BP-1支架型。x倍数变化的结果提供于图43、图44和图45 中。
图43显示对FlaB的IgG反应的x倍数变化，对12价KP/PA疫苗1和 12价KP/PA疫苗2的反应增加最高。在第一次免疫接种后已观察到良好反应，且在第二次免疫接种后有进一步的增加。在NCB008中对于 4价KP FlaBD2-MrkA和4价FlaB-PcrV复合物的反应显示出在第一次免疫接种后有良好的反应，且在FlaBD-2-MrkA的第二次免疫接种后几乎没有额外的增加，并且在任一次的FlaB-PcrV免疫接种后基本上没有反应。在NCB007中的第一次免疫接种之后，也观察到6价PA FlaBD2-MrkA对FlaB的反应不佳，但在第二次免疫接种后即引发显著的增加。在NCB007中对FlaB-PcrV的反应于第一次免疫接种后是强健的，在第二次免疫接种后则未额外增加。
图44显示当与对于NCB008中的4价KP FlaBD2-MrkA和NCB007 中的6价PA FlaBD2-MrkA的反应相比时，NCK012中的12价KP/PA疫苗2和12价KP/PA疫苗1对于MrkA的反应有最高的相对基线的反应变化。在第一次和第二次免疫接种后，在NCB008中几乎没有观察到对MrkA的反应，而在6价PA FlaBD2-MrkA第一次免疫接种后观察到对于MrkA有强健的反应，且在第二次免疫接种后进一步增加。
图45显示在NCB012研究中的第一次和第二次免疫接种后12价 KP/PA疫苗1对于PcrV的IgG反应的x倍数变化有最高的增加。在 NCB008的4价KP FlaB-PcrV研究中几乎没有观察到对PcrV的反应。在NCB007研究中的第一次和第二次免疫接种后观察到对PcrV的强健反应。
(c)结果总结
·12价KP/PA疫苗1和12价KP/PA疫苗2显现出对全部三种载体蛋白有强健的IgG抗体反应。
·1μg和5μg剂量组对载体蛋白的反应相似。
·12价KP/PA疫苗1对三种载体蛋白中的每一种所产生的x倍数增加约为500至1000倍。
·在未经验过的动物中在第一次给药与第二次给药之间会持续增加。在不希望受任何理论的束缚下，在经验过的成体中，在给药一次后和在7-10天内预期有接近最大的反应。
·在用12价KP/PA疫苗1或12价KP/PA疫苗2进行免疫接种的动物中并未观察到在用4价KP疫苗进行免疫接种的动物中所遭遇到对 MrkA和PcrV的反应较低的前述问题。
在仅含有FlaB2的载体蛋白中缺少TLR5激动剂生物活性
图12B使用表达NF-kB驱动的荧光素酶报告基因的HEK293细胞描述融合蛋白和含有FlaA和FlaB蛋白的MAPS复合物的TLR5生物活性。鞭毛蛋白TLR5的活化致使报告基因表达上调。
已发现仅含有FlaB结构域2(FlaBD2)的KP/PA MAPS载体蛋白缺乏TLR5激动剂生物活性，如图46中由FlaBD2-MrkA和FlaBD2-PcrV 的荧光素酶测定数据所证明。FlaBD2-MrkA和FlaBD2-PcrV是12价 KP/PA疫苗1中的两种载体蛋白。
FlaB对照和融合蛋白Rhavi-FlaB-his显示出强烈的TLR5激动剂生物活性，而FlaBD2、FlaBD2-MrkA和FlaBD2-PcrV均仅含有FlaB结构域2(FlaBD2)，在此测定中未显示活性。
通过FACS的结合广泛性和非OPS疫苗菌株的凝集
非OPS疫苗血清型的KP和KA菌株通过流式细胞仪分析和凝集测定法进行试验，以研究抗体对12价KP/PA疫苗1的覆盖广泛性。
表22显示用兔汇集血清(AFV1502-1511)获得的非OPS KP菌株的 FACS结合和细菌凝集的结果，所述血清以每种BP-1为5μg剂量的12 价KP/PA疫苗1进行免疫接种。测试的14个菌株中的12个在凝集测定中显示出P0和P2血清识别上的明显差异，并且通过流式细胞仪分析以1∶100的血清稀释度测量到细菌结合的增加。
表22：对于12价KP/PA疫苗1的反应-非OPS KP疫苗菌株的结合与凝集
Figure BDA0002388953440002051
Figure BDA0002388953440002061
表23显示非OPS PA菌株与以各血清型BP-1为5μg剂量的12价 KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔汇集血清(AFV1502-1511)的FACS结合和细菌凝集结果。对于鞭毛蛋白B，7种菌株中的6种有凝集现象，通过流式细胞仪分析7种菌株中的7种有抗体结合现象。对于鞭毛蛋白A1，通过流式细胞仪分析4种菌株中的3种有抗体结合现象。对于鞭毛蛋白A2，在4种菌株中未观察到有抗体识别的证据。
表23：对于12价KP/PA疫苗1的反应-非OPS PA疫苗菌株的结合与凝集
Figure BDA0002388953440002062
Figure BDA0002388953440002071
非OPS疫苗血清型的14种KP和15种PA菌株经测试以确定兔中对 12价KP/PA疫苗1所产生的抗体的覆盖广泛性。总结如下：
·引发的抗体结合且凝集14种非OPS KP血清型菌株中的12种：
·不含MrkA基因的血清型不会与抗体结合
·与这些菌株的结合可能由于MrkA定向抗体
·引发的抗体结合15种非OPS PA疫苗血清型中的10种：
·对于具有FlaB的菌株和一些具有FlaA1的菌株会发生结合
·结合很可能因为FlaB定向抗体以及因为与FlaA1的交叉反应
·针对载体蛋白(FlaBD2和MrkA)的抗体扩大了非OPS疫苗血清型的覆盖广泛性。
由载体蛋白抗体诱导的动物被动保护
使用如表24中详述的抗O1血清和抗MrkA血清，在具有克雷伯氏菌KP B5055(O 1：K2)的烧伤感染模型中评估载体蛋白诱导小鼠被动保护的潜力。
结果表明存在有MrkA(FlaBD2-MrkA)在预防经囊封的KP菌株感染的动物死亡中有保护作用的趋势。在攻击后第6天，60％(3/5) 的动物仍然存活着。在此实验中，OPS O1抗体无法防止感染。
表24：使用抗O1和抗MrkA血清抵御KP B5055(O1：K2)的烧伤感染
Figure BDA0002388953440002081
*小鼠经用200ul血清被动转移两次，烧伤后用12CFU B5055进行SC感染。
KPO1抗体：来自NCB008 FlaB-PcrV 4价KP MAPS的3个最高效价汇集血清
MrkA抗体：NCB010FlaBD2-MrkA 1v PA MAPS的10个汇集血清疫苗制剂中两种载体蛋白的性能总结：
·12价KP/PA疫苗1和12价KP/PA疫苗2中的载体蛋白 FlaBD2-MrkA和FlaBD2-PcrV被证明为KP/PA OPS的强健运载体。
·12价KP/PA疫苗1中的FlaBD2-MrkA和FlaBD2-PcrV以及12价 KP/PA疫苗2中的FlaBD2-MrkA均出现强烈的抗蛋白反应。
·针对12价KP/PA疫苗1中的载体蛋白的抗体扩大了非OPS疫苗血清型的覆盖广泛性。
·与仅包含FlaB结构域2(FlaBD2)的FlaB的实验设计一致，证实了FlaBD2融合蛋白的TLR5激动剂活性完全消除。
·小鼠克雷伯氏菌感染的烧伤模型中的第一次攻击的结果显示出针对MrkA的抗体的保护趋势。
实施例12：铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯氏菌12价疫苗的功能性测定
调理吞噬灭杀(OPK)测定法
人类嗜中性粒细胞的OPK测定
使用人类嗜中性粒细胞调理吞噬灭杀(OPK)测定法来评估以使用了无荚膜KP血清型O2(KP O2 K-)菌株7380的5μg剂量的12价 KP/PA疫苗1(NCB012，表21)所产生的兔汇集血清(P2)的功能性反应。OPK的测定结果显示于图47中。
免疫血清在培养24小时后以1/10稀释度提供KP O2细菌的100％杀灭，而1/100稀释度不具有细菌杀灭活性。血清的杀灭活性可归因于KP O2 OPS或MrkA，或两种疫苗组分的组合。
J774巨噬细胞系OPK测定
此OPK测定法在抗生素庆大霉素存在或不存在的情况下使用 J774巨噬细胞系来评估功能活性。有几种抗生素无法穿透真核细胞。因此，这些抗生素不会伤害已经内化的细菌。使用这类抗生素可以区分成功穿透真核细胞的细菌和不能穿透真核细胞的细菌。将这类抗生素应用于被细菌感染的真核细胞培养物会杀死保留在细胞外的细菌，同时保留那些渗透细菌的细菌。此测定法所选择的抗生素是氨基糖苷类庆大霉素。
来自治疗组5的兔的兔汇集血清用于J774巨噬细胞细胞系的OPK 测定中，其中治疗组5接受NCB012中的5μg剂量的12价KP/PA疫苗1 并且显示出最高的OPS效价(1502，1506，1508，1511)，以评估血清对克雷伯氏菌菌株KP O1、KP O2、KP O3和KP O5的吞噬摄取的影响。
在实验前24小时，将J774巨噬细胞种在96孔培养盘中。各种O型克雷伯氏菌菌株于培养液中生长至对数生长中期，并将汇集的血清用于灭杀测定。将大约1x105CFU细菌与汇集的免疫前(P0)或免疫 (P2)血清一起培养30分钟。将经过调理的细菌与J774细胞在室温下一起培养15分钟，该时间足以让抗体介导吞噬作用。从细胞中除去未结合的细菌，并加入新鲜缓冲液±50μg/ml庆大霉素再培养20分钟。用PBS洗涤细胞两次，接着加入纯水裂解。从每个孔中以二重复方式种入10ml，并在第二天计数菌落形成单位(CFU)。
该测定结果显示于图48A和48B中。以1/20、1/100和1/500稀释度的免疫或免疫前血清进行调理调节的J774细胞对克雷伯氏菌的吞噬摄取显现出，在免疫血清和庆大霉素的存在下，KP O1、KP O2、KP O3和KP O5的摄取作用增加(图48A)。对于KP O1、KP O2和KP O3，在1/100稀释度下观察到最高的摄取作用。对于KP O5，在1/20和1/100 的稀释度下的摄取作用相似。
在不存在庆大霉素的情况下，与具有较低细菌摄取的免疫前相比，用P2血清也观察到J774细胞对KP O1、KP O3和KP O5有显著的摄取作用。对于KP O2，没有给出结果，因为CFU计数太高而无法计数(图48B)。对于KP O1和KP O3，摄取随着稀释度的增加而降低，而对于KP O5，观察到1/100稀释度的摄取作用最高，1/20稀释度的摄取作用略低，且1/500稀释度的摄取作用最低。
来自接受NCB012中的5μg剂量的12价KP/PA疫苗1且显示最高 OPS效价(1502、1506、1508、1511)的兔汇集血清也用于J774巨噬细胞细胞株的OPK测定中，以评估血清对假单胞菌PA(O5：FlaB和 O6：FlaA1)和克雷伯氏菌菌株KP O5(菌株6997)的吞噬摄取的影响。测定法如上所述对克雷伯氏菌菌株KP O1、KP O2、KP O3和KP O5 的J774 OPK测试进行。
此测定结果显示于图49、50和51中。免疫血清(P0)介导了吞噬细胞对这些细菌菌株的摄取，如图49所示。巨噬细胞样J774细胞的细菌摄取进一步通过显微镜使用GFP标记的PA(PA O1、PA O5 FlaB) 来显示，如图50中所示。暴露于免疫血清的PA被细胞强烈吸收。每个J774细胞中的多个P2处理的PA分离物显示于图50的放大视图中。图51显示，对于那些用免疫血清处理的细胞在与用免疫前血清处理的细胞相比下，观察到更高比例的细胞(左图)和每个细胞中有更高数量的细菌(右图)。
HL-60 OPK测定
在此类测定中，KP O2菌株7380细菌先以血清进行调理，接着将分化的HL-60细胞加入混合物中。在培养混合物45分钟后，计数活菌量。OPK效价的定义为相对于阴性对照组(仅细菌+HL-60细胞)存活的细菌小于50％时的效价。
图52和表25显示用KP O2菌株7380以及用5μg剂量的12价KP/PA 疫苗1进行免疫接种的兔汇集血清进行的HL60 OPK的测定结果。免疫接种前和免疫接种后的抗KP O2热灭杀(HK)兔血清作为阳性对照。此测定使用1/200至1/204,800稀释度的血清进行。
用12价KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔血清显示出针对KP O2菌株7380有显著的OPK活性，而对应的免疫前血清则显示出杀死细菌的效果低得多。灭杀活性可归因于KP O2OPS抗体或MrkA或此二者。关于免疫接种前和免疫接种后的血清以及阳性对照组的OPK效价的详细说明显示于表25中。在免疫前血清(1/800)和免疫后血清 (1/12，800)之间的灭杀活性有显著的差异(增加＞15倍)。
表25：KP O2菌株7380在HL-60测定中的OPK效价
Figure BDA0002388953440002111
使用菌株KP O5菌株6997进行类似的测定。将细菌与来自 NCB012的免疫前(P0)或免疫血清(P2)汇集物混合，并在有补体的存在下加入HL-60细胞(表26)。免疫血清以1∶1,280的效价观察到存活率降低50％，而免疫前的汇集血清在1∶40血清稀释度下展现出适度的降低。
表26：在使用汇集血清的HL-60细胞中的KP O5菌株6997的存活百分率
Figure BDA0002388953440002112
不同OPK测定的结论
使用三次不同的OPK测定来评估在给予两次12价KP/PA疫苗1 后，在兔中诱导的抗体的功效。可在使用人类PMN、J774巨噬细胞或分化的HL60细胞的测定中显现出对KP类型O1、O2、O3和O5血清型有显著的OPK活性。此OPK活性可归因于OPS特异性抗体和/或抗载体蛋白MrkA的抗体。由12价免疫血清所促进的巨噬细胞对KP和 PA的摄取可能是因为OPS抗体。
对于细胞毒性的保护
根据实施例7中描述的实验方案(对于假单胞菌PcrV蛋白构建体的细胞毒性测定)，假单胞菌菌株PAK(O6FlaA1)在过夜生长后，在不同浓度(10％、5％、2.5％或不存在)的经用12价KP/PA疫苗-1 免疫接种的兔血清的存在下来感染源自人类肺上皮细胞的A549单层细胞，所述血清含有抗PcrV抗体，该抗体由针对MAPS载体蛋白的免疫反应产生，或所述细胞含有来自同样这些兔的相同血清浓度范围的免疫前血清。假单胞菌诱导的A549细胞毒性通过细胞变圆来定性，因为细胞变成细胞凋亡状态并从组织培养板的表面脱离。当与用相似浓度的免疫前血清处理的细胞相比时，在给定显微镜视野中变圆的(细胞凋亡)细胞数量减少即表明有抗PcrV抗体介导的细胞毒性保护。在血清浓度为2.5％时可观察到于免疫和免疫前血清治疗之间的变圆(细胞凋亡)细胞有最大的差异(图53，左图)。用2.5％血清处理的代表性经PAK感染的A549细胞的显微照片显现出此差异，即在免疫血清处理的样品中高度折射的圆形细胞的数量减少(图53，右图)。类似的影像用于估计在各血清浓度下受影响的细胞数量(图 53，左图)。
通过抗FlaB的抗体降低铜绿假单胞菌的移动性
如图54中所示，经用5μg/PS剂量(例如，疫苗中的全部PS为60μg；疫苗中各类BP献出5μg的PS)的12价KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔汇集血清处理的细胞显示，当与用免疫前血清处理相比时，PA O5 FlaB菌株通过抗FlaB的抗体会降低移动性。
经由FlaB抗体的铜绿假单胞菌聚集
使铜绿假单胞菌菌株PAO1(O5 FlaB)隔夜生长并悬浮于PBS中至浓度107CFU/ml，接着与来自于经用4价KP疫苗免疫接种的1％血清或与来自于相同兔的免疫前血清一起在室温下培养1小时。由对 Rhavi-FlaBD2-MrkA-His载体蛋白的免疫反应所产生的血清中的抗 FlaB抗体能够凝集表达有FlaB的假单胞菌，如在显微照片中看到的黑色杆状和标记的聚集细菌簇所显现(图55，右图)，而用免疫前血清处理的细菌则未观察到这样的聚集(图55，左图)。FlaBD2是此疫苗制剂中唯一的假单胞菌抗原，且观察到交联细菌即表明载体蛋白诱导了能够识别细菌鞭毛蛋白中所产生的天然表位的功能性抗体产生。用12价KP/PAMAPS疫苗-1进行免疫接种的兔血清能够凝集具有在疫苗中所不含的O型的表达FlaB的假单胞菌(数据未显示)，这强烈暗示了含有FlaBD2的载体蛋白会引发12价制剂中的功能性抗FlaB抗体，虽然不能排除假单胞菌O型之间的交叉反应性会促成所观察到的凝集。
黏着抑制测定
在此测定中，来自NCB012的汇集血清用于评估对不同示例性疫苗所产生的抗体反应的黏着抑制性。将表达3型菌毛的KP O5菌株 6997细菌细胞与免疫前和免疫血清(10％)混合，并与A549上皮细胞株细胞一起培养。在裂解细胞和确定黏着细菌的数量之前，从细胞中洗去非黏着的细菌。黏着抑制导致培养盘上的CFU更低。图56显示用12价KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔汇集血清、用8价PA疫苗进行免疫接种的兔汇集血清(MrkA为该8价PA疫苗中唯一的KP抗原)、用4价KP疫苗进行免疫接种的兔汇集血清会阻断KP O5菌株6997对于A549细胞的黏着性。在不希望受任何理论的束缚下，由于用只有8 价PA OPS的疫苗进行免疫接种的兔汇集血清也抑制了黏着性，这暗示了由载体蛋白诱导的MrkA抗体会提供保护性。
实施例13：小鼠保护测定
被动免疫接种的研究用获自用KP/PA疫苗进行免疫接种的兔的抗血清在小鼠中进行。表21提供了用于兔免疫接种的疫苗制剂信息。来自兔免疫接种前和免疫接种后的血清(汇集血清)如针对不同模型所述而用于小鼠的被动免疫接种。也根据研究而描述不同攻击菌株的细节。
使用用12价KP/PA疫苗免疫1进行免疫接种的兔血清在小鼠中针对致死性PA感染的被动保护研究
使用以NCB012研究中的各PS剂量为5μg(例如，在疫苗中的全部PS为60μg；在疫苗中各类BP占5μg的PS)的12价KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔汇集血清在小鼠中进行的被动保护研究(表21，群组5)。用免疫前血清或免疫血清(兔汇集血清)预先处理小鼠，并用不同的PA菌株以IP攻击。
在致死的PA攻击剂量下，免疫血清保护小鼠免于PA O5和PA O6 的感染。可看到对于PA O10和O11的攻击有保护趋势，但是在用免疫前血清处理并用1x 108CFU和仅低3倍的剂量攻击的小鼠中有显著的存活率差异说明了对于许多革兰氏阴性细菌的剂量反应曲线陡峭水平。这经常在进行这些测定时带来攻击。存活率的详细说明呈现于表27中。
表27：在用PA的致死攻击研究中的小鼠存活率
Figure BDA0002388953440002141
使用12价KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔血清在小鼠中对于克雷伯氏菌KP O3的被动保护研究
将来自于以NCB012中的各PS剂量为5μg的12价KP/PA疫苗1(例如，在疫苗中总共有60μg的PS；疫苗中有由各类BP献出的5μg PS) (群组5)进行免疫接种的四个有最高抗KP-O3反应种(兔1502、1506、1508和1511；表28)的血清汇集，并在用KP O3菌株700603进行IV 攻击前的20小时和2小时以含有50,000CFU的0.1ml量进行IP注射 (免疫前或免疫血清)。
表28：包含在汇集样品中的兔血清的免疫前免疫和免疫效价
兔编号/血清样品 免疫前O3效价 免疫O3效价
1502 5 1,017
1506 10 2,306
1508 19 4,024
1511 5 704
攻击后4小时，将小鼠安乐死并收获血液、肝脏和脾脏，并确定菌落计数。结果提供于表29中。与用来自相同兔的免疫前血清处理的小鼠相比，给予汇集免疫血清的小鼠显示出在肝脏和脾脏中有对存活细菌的数量减少和血液清除现象。这些结果与使用来自于NCB008研究的4价KP MAPS进行免疫接种的兔的等效效价血清进行细菌清除的结果相似。
表29：在用克雷伯氏菌KP O3攻击后在器官中的血液清除和存活细菌的几何平均CFU
血清样品 血液 肝脏 脾脏
NCB008免疫前 5,235 12,590 7,353,290
NCB008免疫 无细菌 3,302 89,159
NCB012免疫前 10,020 27,180 2,635,845
NCB012免疫 无细菌 2,952 195,421
使用用12价KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔血清在小鼠中对克雷伯氏菌KP O1菌株B5055的被动保护研究
在此研究中，每组三只的小鼠经注射来自于NCB012研究中的用各PS剂量为5μg的12价KP/PA疫苗1(例如，在疫苗中总共有60μg 的PS；疫苗中有由各类BP献出的5μg PS)(表21，群组5)进行免疫接种的兔汇集血清(免疫前和免疫血清)，接着用KP O1菌株B5055 以5x106进行静脉内(IV)攻击。在攻击后1小时和4小时的血液清除测定结果以几何平均CFU/ml血液而列在表30中，并针对个别小鼠显示于图57。
在攻击后4小时，来自免疫血清组的小鼠血液中的CFU/ml显著降低，而接受免疫前血清的小鼠中的CFU/ml是保持升高的。
表30：在用KP O1菌株B5055攻击后，以几何平均CFU/ml呈现的小鼠血液清除测定结果
Figure BDA0002388953440002161
这些小鼠中脾脏和肝脏的器官负荷结果以三只小鼠的几何平均 CFU/g组织列举于表31中。图58显示在攻击后20小时的三只小鼠的脾脏和肝脏的器官负荷结果。
与接受免疫前血清的小鼠相比，三只接受免疫血清的小鼠中的两只显示出肝脏中的几何平均CFU计数减少。与接受具有显著更高细菌数的免疫前血清的小鼠相比，脾脏的结果显示用免疫血清预处理的小鼠显示有在攻击后20小时显著降低的近似模式。
表31：用KP O1菌株B5055攻击后的以几何平均CFU/g组织呈现的小鼠器官负荷
剂量 脾脏 肝脏
免疫前 5x 10<sup>6</sup>CFU 672,204,849 21,447,778
免疫 5x 10<sup>6</sup>CFU 12,867,923 3,308,911
使用用12价KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔血清在小鼠中对克雷伯氏菌KP O5菌株6997的被动保护研究
在此研究中，每组三只的小鼠经注射来自于NCB012研究中的用各PS剂量为5μg的12价KP/PA疫苗1(例如，在疫苗中总共有60μg 的PS；疫苗中有由各类BP占5μg PS)进行免疫接种的兔汇集血清(表 21，群组5，免疫前和免疫血清)，接着用KP O5菌株6997以5x 106以IV方式进行攻击。在攻击后1小时和4小时的血液清除测定结果以平均CFU/ml血液而列在表32中，并针对个别小鼠显示于图59。
在攻击后4小时，来自免疫血清组3只小鼠中的2只的血液已清除细菌且在第3只小鼠中的CFU负荷显著降低，而接受免疫前血清的小鼠中的CFU在攻击后4小时是保持升高的(3只小鼠中的2只)。
表32：在用KP O5菌株6997攻击后，以小鼠中的几何平均 CFU/ml呈现的血液清除测定
Figure BDA0002388953440002171
在这些小鼠中的脾脏器官负荷结果以三只小鼠的几何平均CFU/g组织列在表33中，且图60显示攻击后20小时三只小鼠的脾脏器官负荷结果。
对于脾脏，观察到接受免疫血清的小鼠在攻击后20小时具有比接受免疫前血清的小鼠更低得多的细菌计数。
表33：用KP O5菌株6997攻击后的以几何平均CFU/g组织呈现的小鼠器官负荷
Figure BDA0002388953440002172
用12价KP/PA疫苗1进行免疫接种的兔在小鼠中对于克雷伯氏菌KP O2(菌株KPN12)的被动保护研究
在此研究中，CD-1小鼠(每组3只)于静脉内给予2x 105CFU KP O2菌株KPN-12之前24小时和2小时，给予0.2ml的免疫前或免疫血清汇集物(每汇集物有10只兔，研究NCB012)。在感染后72小时收获脾脏，确定每克组织的细菌负荷。与用免疫前血清处理的小鼠相比，接受免疫血清的小鼠显示了存活的细菌数量减少(7,978比114,687 平均CFU；图61)。汇集的免疫血清从血液循环中促进了KP O2(菌株KPN-12)的清除。
使用NCB012免疫前和免疫血清进行了若干实验，以研发和优化使用克雷伯氏菌KPO2的致死攻击模型中的被动保护实验方案。可进行类似的实验以研发和优化用于其他生物体、其他疫苗或免疫原性组合物和/或其他病原体/菌株的被动保护实验方案。诸如细菌攻击剂量、接种物的递送(例如在注射前调理该细菌的吞噬)以及用于被动保护的血清数量、时间和强度(例如用5μg或1μg多糖剂量所生成的血清)等变因经检验。测试的示例性参数和结果绘示于图62中。
在攻击下的CD-1小鼠的Th17反应和定殖
此实验设计用来确定三种给予小鼠的含有FlaBD2和MrkA的KP O1 MAPS剂量在最后一次免疫接种后两星期的细菌攻击之后降低细菌的定殖的能力，每次剂量于先前剂量后的14天给药。两组CD-1小鼠经受细菌攻击；一组用KPO1/FlaBD2-MrkA MAPS疫苗进行免疫接种，另一组单仅用缓冲液(PBS)进行免疫接种。
每组五只的小鼠经气管内(IT)方式用3-5x103CFU KP B5055 (O1：K2)攻击。在细菌攻击后48小时收获肺并秤重，涂覆均匀混合物以进行细菌计数并接着离心。评估上清液的IL-17a浓度。同时，如上所述将脾与PBS、FlaBD2和MrkA一起培养，并在三天后评估上清液的IL-17a水平。
图63显示细菌攻击后的经刺激的脾细胞的IL-17a诱导结果。经 FlaBD2刺激的脾细胞中观察到显著的诱导(p＝0.02)。
免疫接种对铜绿假单胞菌的胃肠道定殖的影响
以下实验方案设计来检验以单价PA O6 MAPS疫苗进行免疫接种对于铜绿假单胞菌的胃肠道(GI)定殖的影响。
八只Sprague-Dawley大鼠以2周的间隔经皮下给予0.5ml的单价 MAPS疫苗MA6-93-PAO6两次(肺炎克雷伯氏菌K19：铜绿假单胞菌O6/Rhavi-FlaBD2-MrkA-his BP-1)。7只大鼠仅用缓冲液进行免疫接种。第二次免疫接种后14天，大鼠用头孢噻肟(50mg/kg IM)处理，并持续接受每天一次抗生素剂量9天。大鼠给予抗生素以克服胃肠道中机会致病细菌(诸如PA)的定殖抗性，并模拟临床情况。单独给予抗生素4天后，通过灌服方式给大鼠给药108CFU的铜绿假单胞菌 (PA，IATS O6)总共5天。在5次每日给予PA和9次每日给予头孢噻肟之后，对大鼠实施安乐死，并取出盲肠、秤重，接着培养。在给予抗生素和细菌之前取得血液测量抗体浓度，并且在第一剂PA之前一天和之后两天取得粪便样品以用于PA培养。也可以在图64的上半部分找到详细说明。
在具有两剂量PA O6 FlaBD2-MrkA MAPS疫苗的大鼠中的定殖研究结果显示在图64的底部。接受PA O6疫苗的大鼠具有比接受PBS 的大鼠更高的ELISA IgG效价(图的左下角)。与中位数＞104CFU/g 的对照大鼠(图的右下方)相比，经免疫接种的大鼠也显示出小于 103CFU/g细菌的中位数。研究结果表明，用单价PA O6 MAPS疫苗进行两次免疫接种后，PA O6的盲肠定殖情况减少。
实施例14：表达Gal-III表位的抗碳青霉烯KP(CRKP)菌株的抗 OPS抗体
与其他种类的细菌碳青霉烯酶(例如氧杂-48或金属-β-内酰胺酶)相反，KPC(肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶)的扩散似乎至少部分是克隆事件。称为序列类型(ST)258的特定谱已显示是造成在几个地理区域中特有的大多数产生KPC的克雷伯氏菌感染的原因。目前在美国东北部各州，所有院内肺炎克雷伯氏菌感染中有超过30％由 CRKP引起的，其中约70％属于产生KPC的ST258克隆。同样地，此克隆(包含单个基因座ST变体)在世界其他地区流行，包含以色列、波兰、意大利、希腊、南美和中国。最近，一个对ST258分子进化的调查识别出两个与不同荚膜多糖表达相关的演化支(Chen 2014a， Chen 2014b，DeLeo 2014)。肺炎克雷伯氏菌ST258是一种散布全球且极具耐药性的院内克隆，其治疗选择有限。
KP O1和KP O2抗原由半乳糖的均聚物(即半乳聚糖)所构成。称为d-半乳聚糖-I(gal-I)的KP O2抗原由半乳糖双糖重复单元所组成。在KP O1的例子中，gal-I被称为d半乳聚糖-II(gal-II)的抗原性不同的重复半乳糖双糖所加帽，且其决定血清型特异性。罕见的血清型KP O2ac具有类似的结构，即重复的gal-I亚基被不同的聚合物加帽，在这种情况下该聚合物是非半乳聚糖重复单元。因此，KP O1、 KP O2和KP O2ac菌株均共享gal-I抗原，然而，在KP O2中，这是唯一的O-抗原决定因子，在KP O1和KP O2ac的例子中，gal-I被外部重复单位所遮蔽。此外，gal-I双糖重复单元可以通过在KP O2血清群内的产生亚型的化学计量和非化学计量加成的O-乙酰基-或半乳糖基进行修饰(图65)。绝大多数的ST258分离株表达经修饰的d-半乳聚糖-I脂多糖O-抗原，其中半乳糖基修饰的Gal-I在下文中称为d-半乳聚糖-III(Szijártó V.等，2016)。
KP O1 OPS由一个含有D-Gal-I或D-Gal-III的短“引物”段和随后的含有D-Gal-II的长段所组成。KP O2 OPS仅由D-Gal-I或D-Gal-III 所组成(图65)。Gal-II表位仅对KP O1血清型具有特异性。
作为MAPS疫苗中的KP O1抗原来源的B5055 OPS具有含 D-Gal-II的短段和随后的长D-Gal-II聚合物。KP 7380(KP O2疫苗抗原来源)仅具有D-Gal-I。
为了研究KP/PA MAPS疫苗是否具有产生抗Gal-III表位的抗体的潜力，因此调查了是否具有预防由于KPCR ST 258克隆菌株引起感染的潜力。来自用5μg剂量的4价KP PRO-CN MAPS疫苗进行免疫接种的兔汇集血清(P2)用于流式细胞仪测定法中以显现对于表达KPD-Gal-III和KP D-Gal-I的表位的结合能力。在这种情况下，唯一相关的反应为OPS识别的D-Gal-I O2和D-Gal-III O2 OPS、D-Gal-II O1 OPS。结果显示出，在D-Gal III和D-Gal IOPS的KP O1和KP O2的对应免疫前血清(P0)上的结合增加(图66)。因此，抗体可能针对所有三种KP D-Gal类型产生。
如于表34和图67中提供的流式细胞仪分析显示，用12价KP/PA 疫苗1进行免疫接种的兔汇集血清中的抗体与来自菌血症分离株的三种ST258菌株中的两种结合。12价KP/PA疫苗1抗血清与未包含在疫苗中的四种血清型菌株中的三种结合，包含具有次要序列变体的 MrkA等位基因的菌株(图67)。在不希望受任何理论的束缚下，这些数据暗示了大多数的KP菌株，不仅仅是那些具有12价KP/PA疫苗1 的OPS成分的血清型的菌株，将被经由疫苗的MrkA融合蛋白组分所产生的抗体识别。
表34：12价血清疫苗-1对于未包含在疫苗中的血清型的具有 MrkA的突变等位基因的克雷伯氏菌菌株的流式细胞仪结果
Figure BDA0002388953440002211
4价KP MAPS疫苗对于表达KP D-Gal-I与D-Gal-III表位的结合能力的结果表明12价KP/PA疫苗具有产生抗Gal-III表位的抗体并预防因KPCR ST 258克隆菌株引起的感染的潜力。
实施例15：BP-1.2的制备
BP-1得益于具有仅位于BP的CPS方面的生物素残基，这在产物定性和最低的OPS表位干扰方面可以是有利的。已研发出此方法的变体以用于制备这类主链，其仰赖于使用多糖的糖醛酸残基的与醛相对的羧酸盐，将生物素残基连接到正交位点处的CPS。此涉及使用碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的反应是可高度控制的，且允许在CPS和所得的BP中有一致水平的生物素化。通过这种方法制备的BP称为BP-1.2。制备BP-1.2的示例性方法示意图描绘于图2B中。
此方法的一些优点包含提供一致的生物素化过程，且对生物素衍生化水平有更好控制，且有更好的产品一致性，因为所有BP均衍生自相同的生物素化CPS批次，提供稳定且可大批次储存的生物素化中间产物，并且有在BP中达到更高的OPS/CPS比例的潜力，因为CPS 上有更多可用的醛基团，导致对相同结合位点的竞争较少。
实施例16：BP-1和BP-1.2免疫原性复合物的免疫接种研究
将4价疫苗制备为BP-1MAPS或BP-1.2MAPS，并根据表35配制。这些组合物使用上述实验方案给予兔，例如实施例6和11。
表35：用于BP-1和BP-1.2比较研究的疫苗制剂总结。
Figure BDA0002388953440002221
Figure BDA0002388953440002231
对于BP-1和BP-1.2组观察到对KP和PA OPS均有强健的IgG抗体反应。组1和组2的个别OPS和CPS K19 IgG效价显示于图68中。对PA O6和PA O11 OPS二者的抗OPS免疫反应对于BP-1和BP-1.2MAPS构建体是相等的。同样地，观察到KP O3和KP O5 OPS有相等的反应，即使具有BP-1.2MAPS构建体的KP O3有明显较好的效价(几何平均效价高约5至6倍)。BP-1和BP-1.2MAPS构建体对于K19 CPS的IgG 效价是相等的。BP-1和1.2组对于FlaB-D2和MrkA载体蛋白也都有强健的IgG抗体反应。对于两种载体蛋白的抗体反应(汇集血清)在BP-1 和BP-1.2组都是相当的(图69)。结果的总结如表36中所示。
表36：BP-1MAPS(组1)与BP-1.2MAPS(组2)的免疫原性比较：OPS IgG反应
Figure BDA0002388953440002241
组1和组2的个别OPS和CPS K19 IgG效价显示于图68中。BP-1和 BP-1.2MAPS构建体对PA O6和PA O11 OPS的抗OPS免疫反应是相等的。同样地，观察到KP O3和KP O5 OPS有相等的反应，即使具有 BP-1.2MAPS构建体的KP O3有明显较好的效价(几何平均效价高约5至6倍)。BP-1和BP-1.2MAPS构建体对K19 CPS的IgG效价是相等的。
在NCB013研究中，在兔中进行BP-1(支架-1)和BP-1.2(支架 -1.2)2价KP/PA疫苗的比较(关于疫苗制剂的描述也参见表35)。图70和图71分别显示了BP-1和BP-1.2(KP/PA 4价)对两种载体蛋白 FlaBD2和MrkA的个别抗体反应。两种支架在针对两种载体蛋白的第一次免疫接种后观察到抗体效价显著增加。在第二次免疫接种后抗体效价进一步增加。BP-1和BP-1.2组观察到对FlaBD2和MrkA有强健的抗体反应，且BP-1和BP-1.2组对两种蛋白质的抗体反应是相当的。
序列表
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等效物
本领域技术人员将意识到，或能够使用不超过常规实验确定，本文中所述的发明特定实施例的许多等效物。本发明的范畴并不意欲受限于以上的描述，而是如以下申请专利范围中所陈述。

Claims (135)

1.一种免疫原性组合物，包括：(i)主链聚合物，其包括聚合物和与所述聚合物偶联的一或多种抗原性多糖；以及(ii)与所述聚合物或抗原性多糖非共价复合的一或多种多肽抗原。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种抗原性多糖以接头或未以接头与所述聚合物偶联。
3.如权利要求1至2中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种抗原性多糖衍生自革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌。
4.如权利要求1至3中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原性多糖衍生自克雷伯氏菌、假单胞菌和/或大肠杆菌抗原性多糖。
5.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种抗原性多糖的免疫原性或调理作用潜能中的一或多种在用ELISA和/或用抗体功能测定法测量时相对于预定水平增加。
6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种抗原性多糖的免疫原性或调理作用潜能中的一或多种在用ELISA和/或用抗体功能测定法测量时相对于对照组合物增加。
7.如权利要求5或6所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种抗原性多糖的免疫原性或调理作用潜能中的一或多种在用ELISA和/或用抗体功能测定法测量时相对于预定水平增加至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
8.如权利要求5至7中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述预定水平是免疫前水平。
9.如权利要求5至7中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种抗原性多糖的表位配价高于天然多糖至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
10.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种多肽抗原是一或多种抗原性多糖的载体蛋白。
11.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中当给予对象时，所述免疫原性组合物用ELISA测量以大于包括抗原性多糖而不包括所述主链聚合物的组合物的水平，诱导所述对象中的抗一或多种病原体的抗体产生。
12.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中当给予对象时，所述免疫原性组合物用ELISA测量以大于包括多肽抗原而不包括所述主链聚合物的组合物的水平，诱导所述对象中的抗一或多种病原体的抗体产生。
13.如权利要求11或12所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种病原体选自克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌。
14.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中当给予对象时，所述免疫原性组合物引发对抗克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种的免疫反应。
15.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种多肽抗原包括细菌多肽、真菌多肽和/或病毒多肽。
16.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种多肽抗原包括衍生自克雷伯氏菌、假单胞菌和/或大肠杆菌多肽的多肽。
17.如权利要求1、2和4至16中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述聚合物是多糖、多肽或合成树状聚合物。
18.如权利要求1、2和4至17中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述聚合物大小是约50kDa至约2000kDa。
19.如权利要求1、2和4至18中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述聚合物是衍生自革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌的荚膜多糖。
20.如权利要求19所述的免疫原性组合物，其中所述荚膜多糖是克雷伯氏菌荚膜多糖、假单胞菌外泌多糖和/或大肠杆菌荚膜多糖。
21.如权利要求20所述的免疫原性组合物，其中所述聚合物是克雷伯氏菌种K19荚膜多糖。
22.如权利要求17所述的免疫原性组合物，其中所述聚合物是线性聚L-赖氨酸，或L-赖氨酸的树状聚合物。
23.如权利要求17所述的免疫原性组合物，其中所述聚合物是合成单糖或寡糖的树状聚合物。
24.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种多肽抗原通过形成至少一互补亲和分子对而与所述聚合物或所述一或多种抗原性多糖非共价复合，所述互补亲和分子对包括：(i)第一亲和分子，其与所述聚合物或所述一或多种抗原性多糖结合；和(ii)互补亲和分子，其与一或多种多肽抗原结合。
25.如权利要求24所述的免疫原性组合物，其中所述互补亲和分子对选自由以下组成的组：生物素/生物素结合蛋白、抗体/抗原、酶/底物、受体/配体、金属/金属结合蛋白、碳水化合物/碳水化合物结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、和His标签/His标签结合分子。
26.如权利要求25所述的免疫原性组合物，其中所述第一亲和分子是生物素或其衍生物。
27.如权利要求25或26所述的免疫原性组合物，其中所述互补亲和分子是生物素结合蛋白或其生物素结合结构域。
28.如权利要求27所述的免疫原性组合物，其中所述生物素结合蛋白是利查维啶、亲和素、链霉亲和素、巴达维啶、塔马维啶、伦蒂维啶、西勃维啶、中性亲和素、生物素连接蛋白(CaptAvidinTM)、或其组合。
29.如权利要求24至28中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述第一亲和分子交联或共价键合至所述聚合物或所述一或多种抗原性多糖上。
30.如权利要求29所述的免疫原性组合物，其中所述第一亲和分子交联或共价键合至所述主链聚合物的聚合物上。
31.如权利要求29所述的免疫原性组合物，其中所述第一亲和分子交联或共价键合至所述一或多种抗原性多糖上。
32.如权利要求29所述的免疫原性组合物，其中所述第一亲和分子交联或共价键合至所述主链聚合物的聚合物上和所述一或多种抗原性多糖上。
33.如权利要求30所述的免疫原性组合物，其中所述聚合物是聚L-赖氨酸。
34.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种抗原性多糖包括克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种的多糖。
35.如权利要求34所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种抗原性多糖包括O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS或其组合。
36.如权利要求34所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种抗原性多糖包括O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11、O12型铜绿假单胞菌OPS或其组合。
37.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原性多糖中的至少一种是铜绿假单胞菌外泌多糖PsL。
38.如权利要求37所述的免疫原性组合物，其中所述PsL包括至少一表位与单克隆抗体结合，所述单克隆抗体包括与SEQ ID NO：4序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO：5序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
39.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一多肽抗原包括与SEQID NO：1序列(肺炎克雷伯氏菌I型菌毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其免疫原性片段。
40.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一多肽抗原包括与SEQID NO：2序列(肺炎克雷伯氏菌保守III型菌毛蛋白MrkA)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO：3序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段。
41.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一多肽抗原是铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型A、铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B、或其免疫原性片段。
42.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一多肽抗原包括与SEQID NO：6序列(铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型A1)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO：9序列(铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型A2)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：7序列(铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段。
43.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一多肽抗原包括与SEQID NO：8序列(铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其免疫原性片段。
44.一种如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，包括：
(a)主链聚合物，包括：
(i)聚合物，其包括克雷伯氏菌种K19荚膜多糖；和
(ii)一或多种抗原性多糖，其包括与克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的克雷伯氏菌或假单胞菌的多糖；以及
(b)一或多种多肽抗原，其通过形成至少一互补亲和分子对而与所述聚合物非共价复合，所述互补亲和分子对包括：
(i)第一亲和分子，其与所述聚合物结合；和
(ii)互补亲和分子，其与所述一或多种多肽抗原结合。
45.如权利要求44所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种抗原性多糖包括O1、O2、O3、O5型肺炎克雷伯氏菌OPS或其组合。
46.如权利要求44或45所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种抗原性多糖包括O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型铜绿假单胞菌OPS或其组合。
47.如权利要求44至46中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述第一亲和分子是生物素或其衍生物且所述互补亲和分子是生物素结合蛋白或其生物素结合结构域。
48.如权利要求47所述的免疫原性组合物，其中所述生物素结合蛋白是利查维啶或其生物素结合结构域。
49.如权利要求44至48中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一或多种多肽抗原选自铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B的缺少TLR5结合基序的D2结构域、铜绿假单胞菌PcrV、肺炎克雷伯氏菌MrkA、其抗原性片段、或其组合。
50.如权利要求44至49中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的FlaB鞭毛蛋白D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列(肺炎克雷伯氏菌MrkA)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
51.如权利要求44至50中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述融合蛋白包括包括与SEQ ID NO：24序列(Rhavi-FlaB-结构域2-MrkA-His)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
52.如权利要求44至51中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
53.如权利要求44至52中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述融合蛋白包括包括与SEQ ID NO：26序列(RhaVi-FlaB-结构域2-PcrV-His)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
54.一种疫苗组合物，包括：
(a)第一免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(b)第二免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(c)第三免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(d)第四免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
55.一种疫苗组合物，包括：
(a)第一免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(b)第二免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(c)第三免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(d)第四免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白。
56.一种疫苗组合物，包括：
(a)第一免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(b)第二免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(c)第三免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(d)第四免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(e)第五免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(f)第六免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(g)第七免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(h)第八免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
57.一种疫苗组合物，包括：
(a)第一免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(b)第二免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(c)第三免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(d)第四免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(e)第五免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(f)第六免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(g)第七免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(h)第八免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
58.一种疫苗组合物，包括：
(a)第一免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(b)第二免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(c)第三免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(d)第四免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(e)第五免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(f)第六免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(g)第七免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(h)第八免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(i)第九免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(j)第十免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(k)第十一免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(1)第十二免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
59.一种疫苗组合物，包括：
(a)第一免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O1 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(b)第二免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O2 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(c)第三免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O3 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(d)第四免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的KP O5 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(e)第五免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O1 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(f)第六免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O2 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(g)第七免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O3 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(h)第八免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O4 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；
(i)第九免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O5 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(j)第十免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O6 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；
(k)第十一免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O10 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及
(1)第十二免疫原性组合物，包括包括聚合物的主链聚合物，所述聚合物包括生物素化克雷伯氏菌种K19荚膜多糖、与所述克雷伯氏菌种K19荚膜多糖偶联的PA O11 OPS、和与所述生物素化主链聚合物非共价复合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
60.如权利要求54至59中任一项所述的疫苗组合物，其中所述Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白包括包括与SEQ ID NO：24序列(Rhavi-FlaB-结构域2-MrkA-His)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
61.如权利要求55、57、59至60中任一项所述的疫苗组合物，其中所述Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白包括包括与SEQ ID NO：26序列(Rhavi-FlaB-结构域2-PcrV-His)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
62.如权利要求54至61中任一项所述的疫苗组合物，其中各免疫原性组合物的OPS以约1∶1的w/w比例存在。
63.如权利要求54至61中任一项所述的疫苗组合物，其中各免疫原性组合物的主链聚合物以约1∶1的w/w比例存在。
64.如权利要求54至61中任一项所述的疫苗组合物，其中各免疫原性组合物的合并的OPS与CPS以约1∶1的w/w比例存在。
65.如权利要求54至64中任一项所述的疫苗组合物，其中各免疫原性组合物的OPS以约1μg存在。
66.如权利要求54至64中任一项所述的疫苗组合物，其中各免疫原性组合物的主链聚合物以约1μg存在。
67.如权利要求54至64中任一项所述的疫苗组合物，其中各免疫原性组合物的合并的OPS与CPS以约1μg存在。
68.如权利要求54至64中任一项所述的疫苗组合物，其中各免疫原性组合物的OPS以约5μg存在。
69.如权利要求54至64中任一项所述的疫苗组合物，其中各免疫原性组合物的主链聚合物以约5μg存在。
70.如权利要求54至64中任一项所述的疫苗组合物，其中各免疫原性组合物的合并的OPS与CPS以约5μg存在。
71.如权利要求54至70中任一项所述的疫苗组合物，其中所述主链聚合物是BP-1主链。
72.如权利要求54至70中任一项所述的疫苗组合物，其中所述主链聚合物是BP-1.2主链。
73.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中当给予对象时，所述免疫原性组合物引发对抗革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌的免疫反应。
74.如权利要求73所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中所述免疫反应是抗体反应或B细胞反应。
75.如权利要求74所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中所述免疫反应是CD4+ T细胞反应，包含Th1、Th2或Th17反应，或CD8+ T细胞反应，或CD4+/CD8+ T细胞反应。
76.如权利要求75所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中所述免疫反应是：
抗体反应或B细胞反应；以及
T细胞反应。
77.如权利要求70至76中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中所述革兰氏阴性细菌选自克雷伯氏菌、假单胞菌、大肠杆菌、及其组合。
78.如权利要求24至77中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中所述一或多种多肽抗原包括一或多种铜绿假单胞菌蛋白或变体，且其中所述互补亲和分子包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域。
79.如权利要求24至78中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中所述多肽抗原中的至少一种包括与SEQ ID NO：7序列(铜绿假单胞菌FlaB鞭毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段。
80.如权利要求24至79中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中所述多肽抗原中的至少一种包括与SEQ ID NO：6序列(铜绿假单胞菌FlaA1鞭毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段。
81.如权利要求24至80中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与SEQ ID NO：9序列(FlaA2鞭毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
82.如权利要求24至81中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的FlaB鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽、或包括与SEQ ID NO：11序列(缺少TLR5结合基序的FlaA1鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽、或包括与SEQ ID NO：12序列(缺少TLR5结合基序的FlaA2鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
83.如权利要求24至82中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的FlaB鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
84.如权利要求24至83中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与SEQ ID NO：11序列(缺少TLR5结合基序的FlaA1鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
85.如权利要求24至84中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与SEQ ID NO：12序列(缺少TLR5结合基序的FlaA2鞭毛蛋白的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
86.如权利要求24至85中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括生物素结合蛋白或其生物素结合结构域以及包括与SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌III型分泌系统(TTSS)PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
87.如权利要求24至86中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：7序列(铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
88.如权利要求24至87中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的铜绿假单胞菌FliC鞭毛蛋白亚型B的D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
89.如权利要求24至88中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：7序列(铜绿假单胞菌FliC亚型B鞭毛蛋白)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列(肺炎克雷伯氏菌MrkA)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
90.如权利要求24至89中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：10序列(缺少TLR5结合基序的铜绿假单胞菌FliC亚型B鞭毛蛋白D2结构域)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列(肺炎克雷伯氏菌MrkA)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
91.如权利要求24至90中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中至少一互补亲和分子对包括融合蛋白，所述融合蛋白包括：(i)生物素结合蛋白或其生物素结合结构域；(ii)包括与SEQ ID NO：8序列(铜绿假单胞菌PcrV)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽；和(iii)包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列(肺炎克雷伯氏菌MrkA)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
92.如权利要求83至91中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中当给予对象时，所述组合物引发识别表达MrkA的肺炎克雷伯氏菌上的天然MrkA的抗体。
93.一种医药组合物，其包括如权利要求1至92中所述的免疫原性组合物或疫苗组合物中的一或多种，以及医药学上可接受的运载体。
94.如权利要求93所述的医药组合物，其进一步包括一或多种佐剂。
95.如权利要求94所述的医药组合物，其中所述佐剂选自由以下组成的组：磷酸铝、氢氧化铝、磷酸化氢氧化铝、诸如TLR2皂素(QS21)或孔蛋白的TLR激动剂和诸如(例如)单磷酰脂A(MPL)的TLR4激动剂和诸如鞭毛蛋白的TLR5等。
96.如权利要求93至95中任一项所述的医药组合物，其中所述组合物经配制用于注射。
97.如权利要求93至96中任一项所述的医药组合物，其中当给予对象时，所述医药组合物引发Th1和/或Th17细胞反应。
98.如权利要求93至97中任一项所述的医药组合物，其中当给予对象时，所述医药组合物引发对抗克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种的调理反应/杀菌反应。
99.如权利要求93至98中任一项所述的医药组合物，其中当给予对象时，所述医药组合物降低克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种于黏膜表面的穿透率和/或定殖率。
100.如权利要求93至99中任一项所述的医药组合物，其中当给予对象时，所述医药组合物降低克雷伯氏菌、假单胞菌和大肠杆菌中的一或多种于GI道的穿透率和/或定殖率。
101.一种对对象进行免疫接种以抗克雷伯氏菌感染的方法，其包括将有效量的如权利要求1至92中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物给予所述对象。
102.一种对对象进行免疫接种以抗克雷伯氏菌感染的方法，其包括将有效量的如权利要求93至100中任一项所述的医药组合物给予所述对象。
103.一种对对象进行免疫接种以抗铜绿假单胞菌感染的方法，其包括将有效量的如权利要求1至92中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物给予所述对象。
104.一种对对象进行免疫接种以抗铜绿假单胞菌感染的方法，其包括将有效量的如权利要求93至100中任一项所述的医药组合物给予所述对象。
105.一种对对象进行免疫接种以抗大肠杆菌感染的方法，其包括将有效量的如权利要求1至92中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物给予所述对象。
106.一种对对象进行免疫接种以抗大肠杆菌感染的方法，其包括将有效量的如权利要求93至100中任一项所述的医药组合物给予所述对象。
107.一种抗体组合物，其包括在以如权利要求1至92中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物免疫接种的哺乳动物中所产生的抗体。
108.如权利要求107所述的抗体组合物，其中所述抗体组合物包括至少一选自由单克隆抗体和抗对象遗传型抗体组成的组的抗体。
109.如权利要求107或108所述的抗体组合物，其中所述抗体组合物包括分离的γ球蛋白部分。
110.一种从克雷伯氏菌的一或多种细胞组分纯化O-抗原多糖的方法，其中所述细胞组分包含蛋白质和/或核酸，所述方法包括以下步骤：
使一或多种细胞组分与氧化剂接触以得到混合物，其中所述混合物的pH是约3和5之间；
从所述细胞组分中分离出O-抗原多糖；以及
回收OPS，其中所述OPS基本上不含有其他细胞组分且于其还原末端含有游离醛。
111.如权利要求110所述的方法，其中所述氧化剂是亚硝酸钠，所述酸是乙酸，且其中所述OPS的还原末端是含有游离醛的2，5-脱水甘露糖残基。
112.一种从革兰氏阴性细菌的一或多种细胞组分纯化O-抗原多糖的方法，其中所述细胞组分包含蛋白质和/或核酸，所述方法包括：
使一或多种细胞组分与酸性试剂接触以得到混合物，其中所述混合物的pH是约3和5之间；
将所述混合物加热至约80℃至约100℃之间；
从所述细胞组分中分离出O-抗原多糖；以及
回收OPS，其中所述OPS基本上不含有其他细胞组分且于其还原末端含有酮。
113.一种制备包括至少一非生物素化O-抗原多糖的主链聚合物的方法，其中所述O-抗原多糖包括伯氨基，和至少一生物素化多糖，所述方法包括：
通过将O-抗原多糖与含有醛基的部分氧化的多糖以及含有伯胺的生物素混合而使所述O-抗原多糖伯氨基化学连接以得到混合物；且用还原剂还原胺化所述混合物而产生BP-1聚合物主链，其中所述多糖是经生物素化的，而所述化学连接的O-抗原多糖是非经生物素化的。
114.一种制备包括至少一非生物素化O-抗原多糖的主链聚合物的方法，其中所述O-抗原多糖包括伯氨基，和至少一生物素化多糖，所述方法包括：
由将O-抗原多糖与经生物素化和氧化的多糖混合而使所述O-抗原多糖伯氨基化学连接，所述经生物素化和氧化的多糖先用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和生物素酰肼处理多糖的羧酸盐基团，并接着用氧化剂处理多糖而获得；且用还原剂还原胺化所述混合物而产生BP-1.2聚合物主链，其中所述多糖是经生物素化的，而所述化学连接的O-抗原多糖是非经生物素化的。
115.一种制备包括至少一非生物素化O-抗原多糖的主链聚合物的方法，其中所述O-抗原多糖包括伯氨基，和至少一生物素化多糖，所述方法包括：
由将O-抗原多糖与经生物素化和CDAP活化的多糖混合而使所述O-抗原多糖伯氨基化学连接，所述经生物素化和CDAP活化的多糖先用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和生物素酰肼处理多糖的羧酸盐基团，并接着用CDAP处理多糖而获得，由此产生BP-1.3聚合物主链，其中所述多糖是经生物素化的，而所述化学连接的O-抗原多糖是非经生物素化的。
116.如权利要求113至115中任一项所述的方法，其中所述O-抗原多糖上的伯氨基是铜绿假单胞菌OPS外核的L-丙氨酸α-氨基，或是通过用还原剂还原胺化使得在每个末端含有伯氨基的短间隔分子化学连接而已引入到O-抗原多糖的还原端的氨基。
117.如权利要求114所述的方法，其中用于氧化多糖的氧化剂是过碘酸钠，含有二胺的短间隔物是己二酸二酰肼，而还原胺化的还原剂是氰基硼氢化钠。
118.一种制备包括至少一生物素化O-抗原多糖和至少一生物素化多糖的主链聚合物的方法，所述方法包括：
使在核部含有伯胺的O-抗原多糖化学连接，其通过还原胺化作用将在各末端含有伯胺的短间隔物与O-抗原多糖连接以得到O-抗原多糖-间隔分子，或使用含有L-丙氨酸α-氨基的未衍生化的OPS；
将含有伯胺的O-抗原多糖与部分氧化的多糖混合以得到混合物；
还原胺化所述混合物以形成OPS主链；以及
用CDAP和含有伯胺的生物素将所述OPS主链衍生化；
由此形成主链聚合物，其中所述多糖和化学连接的O-抗原多糖经生物素化。
119.一种制备包括至少一生物素化O-抗原多糖和至少一非生物素化多糖的主链聚合物的方法，所述方法包括：
用CDAP和含有伯胺的生物素将包括一或多个核心KDO和/或庚糖部分的O-抗原多糖生物素化，以得到经生物素化的OPS混合物；
用过碘酸钠将经生物素化的OPS混合物部分氧化，以将醛引入到所述核心KDO和/或庚糖部分；
用己二酸二酰肼将所述生物素化混合物还原胺化；
将经生物素化和胺化的OPS与部分氧化的多糖混合，以形成混合物；以及
还原胺化所述混合物；
由此形成主链聚合物，其中所述多糖未经生物素化而所述化学连接的O-抗原多糖经生物素化。
120.一种制备包括至少一生物素化O-抗原多糖和PLL聚合物的主链聚合物的方法，所述方法包括：
用PLL聚合物的ε-NH2基团将含有末端醛或αKDO的O-抗原多糖还原胺化，以产生OPSPLL聚合物；
用CDAP将OPS衍生化，以形成衍生混合物；
使所述衍生混合物与含有伯胺的生物素反应；以及
用酰化剂处理或不处理所述混合物，以加帽PLL聚合物的未反应的ε-NH2基团；
由此制备主链聚合物，其中经加帽的N-酰化PLL主链或未经加帽的PLL未经生物素化，而所述化学连接的O-抗原多糖经生物素化。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述酰化剂是醋酸酐或乙酰氯。
122.如权利要求120或121所述的方法，其中所述还原剂是氰基硼氢化钠。
123.一种制备包括至少一非生物素化O-抗原多糖的主链聚合物的方法，其中所述O-抗原多糖于其还原末端包括叠氮基团，以及至少一含有炔基团的生物素化多糖，所述方法包括：
在催化剂的存在下使在还原端含有叠氮基团的O-抗原多糖与含有炔的生物素化多糖化学点击连接；
由此形成OPS主链聚合物，其中所述多糖经生物素化，但化学点击连接的O-抗原多糖未经生物素化。
124.一种制备包括至少一非生物素化O-抗原多糖的主链聚合物的方法，其中所述O-抗原多糖于其还原末端包括醛或酮基团，以及在催化剂的存在下使含有炔基团的生物素化多糖与小分子量化合物点击连接而得到的至少一含有伯氨基的生物素化多糖，所述小分子量化合物于一端含有叠氮且于另一端含有游离氨基，所述方法包括：
通过将O-抗原多糖与含有伯氨基的生物素化多糖混合并用还原剂还原胺化所述混合物而化学连接所述含有醛或酮基团的O-抗原多糖；
由此形成主链聚合物，其中所述多糖经生物素化，但化学连接的O-抗原多糖未经生物素化。
125.一种制备包括至少一生物素化O-抗原多糖的主链聚合物的方法，其中所述生物素化O-抗原多糖于其还原末端包括叠氮基团，以及至少一含有炔的非生物素化多糖，所述方法包括：
在催化剂的存在下使在还原端含有叠氮基团的生物素化O-抗原多糖与含有炔的非生物素化多糖化学点击连接；
由此形成主链聚合物，其中所述多糖非经生物素化，并且化学点击连接的O-抗原多糖经生物素化。
126.如权利要求123至125中任一项所述的方法，其中用于经由炔-叠氮化物环加成使所述O-抗原多糖与所述多糖点击连接的催化剂是硫酸铜。
127.如权利要求123至126中任一项所述的方法，其中使所述多糖衍生化的炔基团选自由以下组成的组：1-氨基-3-丁炔、1-氨基-4-戊炔、DBCO-胺和炔-PEG4-胺。
128.如权利要求123至127中任一项所述的方法，其中使多糖衍生化的叠氮基团选自由以下组成的组：叠氮基-PEG3-胺、叠氮基-丙胺和叠氮基-丁胺。
129.一种主链聚合物，其由如权利要求113至128中任一项所述的方法所制成。
130.一种融合蛋白，其包括生物素结合结构域和多肽，所述多肽包括与SEQ ID NO：16至26中的任一种序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
131.一种融合蛋白，其包括生物素结合结构域和多肽，所述多肽包括与SEQ ID NO：1至3或6至26中的任一种序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
132.一种制备变体MAPS的方法，其包括将权利要求128所述的至少一主链聚合物与权利要求129至130中任一项所述的融合蛋白中的至少一种复合。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述变体MAPS是BP-1 MAPS、BP-1.2 MAPS、BP-2aMAPS、BP-2b MAPS或BP-3 MAPS。
134.一种评估如权利要求1至92中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物的免疫原性和/或效价的方法，其中免疫反应使用包含B细胞和T细胞反应的一系列体外生物测定法中的一或多种来评估，诸如通过ELISA的抗体水平、通过FC的功能性抗体水平、OPK和其他功能性测试如凝集作用、移动性、细胞毒性、Th1/Th17细胞和细胞因子水平、和院内疾病(肺炎、败血症、烧烫伤、GI和手术部位感染)的体内测定法，诸如对于所述免疫原性组合物的靶标院内病原体攻击后的细菌清除、被动和主动保护。
135.一种评估如权利要求93至100中任一项所述的医药组合物的免疫原性和/或效价的方法，其中免疫反应使用包含B细胞和T细胞反应的一系列体外生物测定法中的一或多种来评估，诸如通过ELISA的抗体水平、通过FC的功能性抗体水平、OPK和其他功能性测试如凝集作用、移动性、细胞毒性、Th1/Th17细胞和细胞因子水平、和院内疾病(肺炎、败血症、烧烫伤、GI和手术部位感染)的体内测定法，诸如对于所述免疫原性组合物的靶标院内病原体攻击后的细菌清除、被动和主动保护。
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