BR112019027387A2 - composições imunogênicas - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a tecnologias para a prevenção e/ou o tratamento de infecções nosocomiais.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS". Referência cruzada a pedidos relacionados
[001] O presente pedido de patente reivindica a prioridade e o benefício deste ao Pedido de Patente dos Estados Unidos Provisório Número 62/524 315, depositado em 23 de junho de 2017, e ao Pedido de Patente dos Estados Unidos Provisório Número 62/633 807, depositado em 22 de fevereiro de 2018, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. Antecedentes da invenção
[002] A infecção nosocomial, também referida como infecção hospitalar adquirida, é um problema importante enfrentado pelos pacientes atualmente. Pesquisas conduzidas nos Estados Unidos em 183 hospitais (Magill et al., 2014) demonstraram que, de 11.282 pacientes, 452 tinham sofrido uma ou mais infecções relacionadas à assistência à saúde (4,0%; intervalo de confiança 95%, 3,7 a 4,4). De 504 de tais infecções, os tipos mais comuns foram pneumonia (21,8%), infecções do sítio cirúrgico (21,8%) e infecções gastrointestinais (17.1%). Clostridium difficile foi o patógeno mais comumente relatado (causando 12,1% das infecções relacionadas à assistência à saúde). As infecções relacionadas a dispositivos (ou seja, infecção de corrente sanguínea relacionada a cateter central, infecção do trato urinário relacionada a cateter e pneumonia relacionada à ventilação mecânica), que têm sido tradicionalmente o foco de programas de prevenção de infecções relacionadas à assistência à saúde, são responsáveis por 25,6% de tais infecções. Os autores estimaram que haviam 648.000 pacientes com 721.800 infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) nos hospitais de assistência aguda dos Estados Unidos (EUA) em 2011.
[003] Com o aumento dramático de bactérias resistentes a múltiplos fármacos (MDR), tornou-se difícil tratar infecções nosocomiais. Os médicos têm tido que recorrer a antibióticos mais tóxicos e menos eficazes. Não obstante, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (Center for Disease Control and Prevention, CDC) dos Estados Unidos estima que ocorrem -23.000 mortes anualmente por infecções causadas por bactérias MDR.
[004] Assim, mantém-se a necessidade de tecnologias eficazes para a prevenção e/ou o tratamento de tais infecções. Sumário da invenção
[005] A presente invenção aborda a falta de tecnologias adequadas para a prevenção e/ou o tratamento de infecções nosocomiais. Entre outros, a presente invenção aborda desafios para prover vacinas com imunogenicidade suficiente para alcançar imunidade e prevenir a colonização.
[006] Entre outros, a presente invenção provê composições e métodos para prevenção e/ou tratamento de infecções nosocomiais em populações de pacientes que o necessitam.
[007] Entre outros, a presente invenção provê composições imunogênicas que compreendem, por exemplo, (i) um estrutura polimérica incluindo um polímero e um ou mais polissacarídeos antigênicos conjugados à polímero; e (ii) um ou mais antígenos polipeptídicos complexados não covalentemente com o polímero ou o polissacarídeo antigênico.
[008] Em algumas modalidades, uma composição imunogênica pode compreender um ou mais polissacarídeos antigênicos conjugados a um polímero com um ligante (linker). Em algumas modalidades, uma composição — imunogênica pode compreender um ou mais polissacarídeos antigênicos conjugados a um polímero sem um ligante. Em algumas modalidades, um ou mais dos polissacarídeos antigênicos são derivados de bactérias Gram-negativas e/ou bactérias Gram-
positivas. Em algumas modalidades, um ou mais dos polissacarídeos antigênicos são derivados de polissacarídeos antigênicos de Klebsiella, Pseudomonas e/ou E. coli.
[009] Em algumas modalidades, um ou mais entre potencial de opsonização e imunogenicidade de um ou mais dos polissacarídeos antigênicos são aumentados em relação a um nível predeterminado, conforme medido por ELISA e/ou por um ensaio funcional com anticorpos. Em algumas modalidades, um ou mais entre opsonização e imunogenicidade de um ou mais dos polissacarídeos antigênicos são aumentados em relação a uma composição de controle, conforme medido por ELISA e/ou por um ensaio funcional com anticorpos. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polissacarídeo antigênico presente na composição imunogênica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição imunogênica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição imunogênica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição imunogênica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição imunogênica e/ou um polissacarídeo antigênico presente na composição imunogênica, e não compreender um polímero presente na composição imunogênica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polissacarídeo antigênico presente na composição vacinal e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição vacinal. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição vacinal e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição vacinal. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição vacinal e/ou um polissacarídeo antigênico presente na composição vacinal, e não compreender um polímero presente na composição vacinal. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polissacarídeo antigênico presente na composição farmacêutica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição farmacêutica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição farmacêutica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição farmacêutica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição farmacêutica e/ou um polissacarídeo antigênico presente na composição farmacêutica, e não compreender um polímero presente na composição farmacêutica.
[0010] Em algumas modalidades, um ou mais entre opsonização e imunogenicidade de um ou mais dos polissacarídeos antigênicos é aumentada pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes em relação a um nível predeterminado, conforme medido por ELISA e/ou por um ensaio funcional com anticorpos. Em algumas modalidades, o nível predeterminado é um nível pré-imune. Em algumas modalidades, a valência dos epítopos de um ou mais dos polissacarídeos antigênicos é pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes acima daquela do polissacarídeo nativo.
[0011] Em algumas modalidades, um ou mais antígenos polipeptídicos podem ser proteínas de transporte para um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição imunogênica induz a produção de anticorpos contra um ou mais patógenos no indivíduo em nível maior do que uma composição compreendendo um polissacarídeo antigênico e não compreender a estrutura polimérica, conforme medido por ELISA. Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição imunogênica induz a produção de anticorpos contra um ou mais patógenos no indivíduo em nível maior do que uma composição compreendendo um antígeno polipeptídico e não compreender a estrutura polimérica, conforme medido por ELISA. Em algumas modalidades, um ou mais dos patógenos são selecionados dentre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli. Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição imunogênica provoca uma resposta imune contra um ou mais entre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli.
[0012] Em algumas modalidades, um antígeno polipeptídico é ou compreende um polipeptídeo bacteriano, um polipeptídeo fúngico e/ou um polipeptídeo viral, ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um antígeno polipeptídico é ou compreende um polipeptídeo ou fragmento imunogênico deste de Klebsiella, Pseudomonas e/ou E. coli. Em algumas modalidades, um antígeno polipeptídico é ou compreende um polipeptídeo derivado de um polipeptídeo de Klebsiella, Pseudomonas e/ou E. coli.
[0013] Em algumas modalidades, um polímero é ou compreende um polissacarídeo, um polipeptídeo ou um dendrímero sintético. Em algumas modalidades, o polímero tem entre cerca de 50 kDa e 2000 kDa de tamanho. Em algumas modalidades, um polímero é ou compreende um polissacarídeo capsular derivado de bactérias Gram- negativas ou Gram-positivas. Em algumas modalidades, um polissacarídeo capsular é ou compreende um polissacarídeo capsular de Klebsiella, exopolissacarídeo de Pseudomonas e/ou polissacarídeo capsular de Escherichia. Em algumas modalidades, um polímero é ou compreende um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um polímero é ou compreende poli-L-lisina linear ou um dendrímero de L-lisina. Em algumas modalidades, um polímero é ou compreende um dendrímeros de um monossacarídeo ou oligossacarídeo sintético.
[0014] Em algumas modalidades, um ou mais antígenos polipeptídicos são complexados não covalentemente com um polímero e/ou um ou mais polissacarídeos antigênicos por formação de pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares, compreendendo (i) uma primeira molécula de afinidade relacionada com o polímero ou um ou mais polissacarídeos antigênicos; e (ii) uma molécula de afinidade complementar relacionada com um ou mais antígenos polipeptídicos. Em algumas modalidades, o par de moléculas de afinidades complementares é selecionado a partir do grupo que consiste em: biotina/proteína de ligação à biotina, anticorpo/antígeno, enzima/substrato, receptor/ligante, metal/proteína de ligação ao metal, carboidrato/proteína de ligação ao carboidrato, lipídio/proteína de ligação ao lipídio e etiqueta His/proteína de ligação à etiqueta His. Em algumas modalidades, a primeira molécula de afinidade é biotina ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade complementar é uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à biotina é rizavidina, avidina, estreptavidina, bradavidina, tamavidina, lentiavidina, zebavidina, NeutrAvidin, CaptAvidinT?Y ou uma combinação das mesmas.
[0015] Em algumas modalidades, uma primeira molécula de afinidade é reticulada ou ligada covalentemente ao polímero ou a um ou mais dos polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, a primeira molécula de afinidade é reticulada ou ligada covalentemente ao polímero da estrutura polimérica. Em algumas modalidades, a primeira molécula de afinidade é reticulada ou ligada covalentemente a um ou mais dos polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, a primeira molécula de afinidade é reticulada ou ligada covalentemente ao polímero da estrutura polimérica e a um ou mais dos polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, o polímero é ou compreende poli-L-lisina. Em algumas modalidades, um ou mais dos polissacarídeos antigênicos é ou compreende um polissacarídeo de um ou mais entre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli.
[0016] Em algumas modalidades, um ou mais dos polissacarídeos antigênicos é ou compreende um OPS do tipo O1, 02, O3, O5 ou uma combinação destes de K. pneumoniae. Em algumas modalidades, um ou mais dos polissacarídeos antigênicos é ou compreende um OPS do tipo 01, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011, 012 ou uma combinação destes de P. aeruginosa. Em algumas modalidades, pelo menos um dos polissacarídeos antigênicos é ou compreende o PsL de P. aeruginosa exopolissacarídeo. Em algumas modalidades, o PsL é ou compreende pelo menos um epítopo que se liga a um anticorpo monocional compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:4 e/ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:5.
[0017] Em algumas modalidades, pelo menos um antígeno polipeptídico é ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:1 (Proteína da fímbria Tipo | de K. pneumoniae), ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos um antígeno polipeptídico é ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 (proteína MrkA conservada da fímbria Tipo Ill de K. pneumoniae) e/ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:3 ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos um antígeno polipeptídico é ou compreende uma Flagelina FIiC subtipo À de P. aeruginosa, Flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos um antígeno polipeptídico é ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:6 (Flagelina FIIC subtipo A1 de P. aeruginosa), uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:9 (Flagelina FIIC subtipo A2 de P. aeruginosa), uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:7 (Flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos um antígeno polipeptídico é ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0018] Em algumas modalidades, uma composição imunogênica da invenção é ou compreende (a) uma estrutura polimérica compreendendo (i) um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp.; e (li) um ou mais polissacarídeos antigênicos compreendendo um polissacarídeo de Klebsiella ou Pseudomonas conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella Spp.; e (b) um ou mais antígenos polipeptídicos complexados não covalentemente com o polímero por formação de pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares, compreendendo (i) uma primeira molécula de afinidade relacionada com o polímero; e (ii) uma molécula de afinidade complementar relacionada com um ou mais dos antígenos polipeptídicos. Em algumas modalidades, um ou mais dos polissacarídeos antigênicos é ou compreende um OPS do tipo 01, O2, O3, O5, ou uma combinação destes de K. pneumoniae. Em algumas modalidades, um ou mais dos polissacarídeos antigênicos é ou compreende um OPS do tipo 01, 02, 03, O4, O5, O6, 010, 011, ou uma combinação destes de P. aeruginosa. Em algumas modalidades, a primeira molécula de afinidade é biotina ou um derivado da mesma e a molécula de afinidade complementar é ou compreende a proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à biotina é ou compreende rizavidina ou seu domínio de ligação à biotina. Em algumas modalidades, um ou mais dos antígenos polipeptídicos são ou compreendem o domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa, PcrV de P. aeruginosa, MrkA de K. pneumoniae, fragmentos antigênicos ou uma combinação dos mesmos.
[0019] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão compreendendo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos, tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FlaB) ou um fragmento — imunogênico do mesmo, e (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 (MrkA de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é ou compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:24 (Ravi-FlaB-Domínio2-MrkA-His).
[0020] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão compreendendo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIiC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo, e (iii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão é ou compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:26 (Ravi-FlaB-Domínio2-PcrV-His).
[0021] Entre outros, a presente invenção provê composições vacinais. Em algumas modalidades, uma composição vacinal pode compreender uma ou mais composições imunogênicas. Em algumas modalidades, uma composição vacinal pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0022] Em algumas modalidades, uma composição vacinal pode compreender uma ou mais entre (a) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (b) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (c) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; e (d) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp., e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada.
[0023] Em algumas modalidades, uma composição vacinal pode compreender uma ou mais entre (a) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (b) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (c) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; e (d) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp., e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada.
[0024] Em algumas modalidades, uma composição vacinal pode compreender uma ou mais entre (a) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (b) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (c) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (d) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (e) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (f) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (9g) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O10 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; e (h) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA 011 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada.
[0025] Em algumas modalidades, uma composição vacinal pode compreender uma ou mais entre (a) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de
Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (b) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (c) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (d) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (e) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (f) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (9g) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O10 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; e (h) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA 011 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada.
[0026] Em algumas modalidades, uma composição vacinal pode compreender uma ou mais entre: (a) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (b) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (c) uma composição imunogênica compreendendo um estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 Dbiotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (d)
uma composição imunogênica compreendendo um estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp, um OPS KP O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (e) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (f) uma composição imunogênica compreendendo um estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp, um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (g) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (h) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (|) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de
Klebsiella spp., um OPS PA O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (j) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (k) uma composição imunogênica compreendendo um estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O10 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; e (1) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA 011 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada.
[0027] Em algumas modalidades, uma composição vacinal pode compreender uma ou mais entre (a) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 Dbiotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (b) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (c) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (d) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (e) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (f) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (g) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 Dbiotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PecrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (h)
uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (|) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (j) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica — biotinilada; (k) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O10 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente àcomplexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; e (|) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O11 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada.
Em algumas modalidades, a proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA é ou compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:24 (Ravi- FlaB-Domínio2-MrkA-His). Em algumas modalidades, a proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV é ou compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:26 (Ravi-FlaB-Domínio2-PcrV-His).
[0028] Em algumas modalidades, o OPS de cada composição imunogênica está presente em uma razão m/m de aproximadamente 1:1. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica de cada composição imunogênica está presente em uma razão m/m de aproximadamente 1:1. Em algumas modalidades, o OPS e o CPS combinados de cada composição imunogênica estão presente em uma razão m/m de aproximadamente 1:1. Em algumas modalidades, o OPS de cada composição imunogênica está presente com aproximadamente 1 vg. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica de cada composição imunogênica está presente com aproximadamente 1 ug. Em algumas modalidades, o OPS e o CPS combinados de cada composição imunogênica estão presentes com aproximadamente 1 ug. Em algumas modalidades, o OPS de cada composição imunogênica está presente com aproximadamente 5 ug. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica de cada composição imunogênica está presente com aproximadamente 5 ug. Em algumas modalidades, o OPS e o CPS combinados de cada composição imunogênica está presente com aproximadamente 5 ug. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica é ou compreende uma estrutura BP-1. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica é ou compreende uma estrutura BP-1.2. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica é ou compreende uma estrutura BP-2a. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica é ou compreende uma estrutura BP-2b. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica é ou compreende uma estrutura BP-3.
[0029] Em algumas modalidades, um ou mais antígenos polipeptídicos são ou compreendem uma ou mais proteínas ou variantes de P. aeruginosa, e em que a molécula de afinidade complementar é ou compreende uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina. Em algumas modalidades, pelo menos um dos antígenos polipeptídicos é ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:7 (Flagelina FlaB de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos um dos antígenos polipeptídicos é ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:6 (Flagelina FIaA1 de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0030] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares é ou compreende uma proteína de fusão incluindo uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:9 (Flagelina FIaA2) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0031] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares é ou compreende uma proteína de fusão, incluindo uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotihna e um polipeptíideco compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FlaB) ou um fragmento imunogênico do mesmo ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:11 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIaA1) ou um fragmento imunogênico do mesmo ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:12 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIaA2) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0032] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares é ou compreende uma proteína de fusão incluindo uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotihna e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FlaB) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0033] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares é ou compreende uma proteína de fusão incluindo uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotiha e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:11 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIaA1) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0034] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares é ou compreende uma proteína de fusão incluindo uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotihna e um polipeptíideo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:12 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FlIaA2) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0035] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares é ou compreende uma proteína de fusão incluindo uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotihta e um polipeptíideo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV do sistema de secreção tipo Ill (TTSS) de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0036] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares é ou compreende uma proteína de fusão incluindo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ |D NO:7 (Flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo, e (iii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0037] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares é ou compreende uma proteína de fusão incluindo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10
(domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIiC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo, e (iii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0038] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares é ou compreende uma proteína de fusão incluindo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:7 (Flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo, e (ili) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 (MrkA de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0039] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares é ou compreende uma proteína de fusão incluindo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIiC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo, e (iii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 (MrkA de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0040] Em algumas modalidades, pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares é ou compreende uma proteína de fusão incluindo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcerV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo, e (iii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 (MrkA de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[0041] Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição imunogênica gera anticorpos que reconhecem MrkA nativa em K. pneumoniae que expressam MrkA. Em algumas modalidades, quando administtada a um indivíduo, a composição vacinal gera anticorpos que reconhecem MrkA nativa em K. pneumoniae que expressam MrkA.
[0042] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende uma ou mais composições imunogênicas ou composições vacinais aqui descritas. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um ou mais adjuvantes. Em algumas modalidades, o adjuvante é selecionado a partir do grupo de fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, hidróxido de alumínio fosfatado, agonistas de TLRs como a saponina de TLR2 (QS21) ou porinas e agonistas de TLR4 como, por exemplo, lipídio A monofosforilado (MPL) e TLR5 como flagelinas, etc.
[0043] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é formulada “para administração intramuscular, intraperitoneal, intradérmica e/ou subcutânea. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para injeção. Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição farmacêutica gera uma resposta de células Th1 e/ou Th17. Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição farmacêutica gera uma resposta opsônica/bactericida contra um ou mais entre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli. Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição farmacêutica reduz a taxa de transmissão e/ou de colonização da superfície de mucosas por um ou mais entre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli. Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição farmacêutica reduz a taxa de transmissão e/ou de colonização do trato GI por um ou mais entre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli.
[0044] Algumas modalidades proveem métodos para imunizar um indivíduo contra infecção por Klebsiella, os quais compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica da invenção. Algumas modalidades proveem métodos para imunizar um indivíduo contra infecção por Klebsiella, os quais compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição vacinal da invenção. Algumas modalidades proveem métodos para imunizar um indivíduo contra infecção por Klebsiella, os quais compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da invenção.
[0045] Algumas modalidades proveem métodos para imunizar um indivíduo contra infecção por P. aeruginosa, os quais compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica da invenção. Algumas modalidades proveem métodos para imunizar um indivíduo contra infecção por P. aeruginosa, os quais compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição vacinal da invenção. Algumas modalidades proveem métodos para imunizar um indivíduo contra infecção por P. aeruginosa,
os quais compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da invenção.
[0046] Algumas modalidades proveem métodos para imunizar um indivíduo contra infecção por E. coli, os quais compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica da invenção. Algumas modalidades proveem métodos para imunizar um indivíduo contra infecção por E. coli, os quais compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição vacinal da invenção. Algumas modalidades proveem métodos para imunizar um indivíduo contra infecção E. coli, os quais compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da invenção.
[0047] Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição imunogênica provoca uma resposta imune contra bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas. Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição vacinal provoca uma resposta imune contra bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas. Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição farmacêutica provoca uma resposta imune contra bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas. Em algumas modalidades, as bactérias Gram-negativas são selecionadas dentre Klebsiella, Pseudomonas, E. coli e uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de anticorpos ou de células B. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de células T CD4+, incluindo resposta de Th1, Th2 ou Th1i7 ou uma resposta de células T CD8+ ou uma resposta de células T CD4+/CD8+. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de anticorpos ou de células B; e uma resposta de células T.
[0048] Algumas modalidades proveem composições de anticorpos que compreendem anticorpos desenvolvidos em um mamífero imunizado com uma composição imunogênica da invenção. Algumas modalidades proveem composições de anticorpos que compreendem anticorpos desenvolvidos em um mamífero imunizado com uma composição vacinal da invenção. Algumas modalidades proveem composições de anticorpos que compreendem anticorpos desenvolvidos em um mamífero imunizado com uma composição farmacêutica da invenção. Em algumas modalidades, a composição de anticorpos compreende pelo menos um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos monoclionais e anticorpos anti- idiotípicos. Em algumas modalidades, a composição de anticorpos compreende uma fração de globulina gama isolada.
[0049] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de purificação de um polissacarídeo de antígeno O de um ou mais componentes celulares de Klebsiella, em que os componentes celulares incluem proteína e/ou ácido nucleico, o método compreendendo as etapas de: colocar um ou mais componentes celulares em contato com um reagente oxidante para obter uma mistura, em que o pH da mistura é entre aproximadamente 3 e 5; separar o polissacarídeo de antígeno O dos componentes celulares; e recuperar o OPS, em que o OPS é substancialmente livre dos outros componentes celulares e contém um aldeído livre em sua extremidade terminal redutora. Em algumas modalidades, o reagente oxidante é nitrito de sódio, o ácido é ácido acético e em que a extremidade terminal redutora do OPS é um resíduo de 2,5-anidromanose contendo um aldeído livre.
[0050] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de purificação de um polissacarídeo de antígeno O de um ou mais componentes celulares de bactérias Gram-negativas, em que os componentes celulares incluem proteína e/ou ácido nucleico, o método compreendendo: colocar um ou mais componentes celulares em contato com um reagente ácido para obter uma mistura em que o pH da mistura é entre aproximadamente 3 e 5, aquecer a mistura até entre cerca de 80ºC e 100ºC; separar o polissacarídeo de antígeno O dos componentes celulares; e recuperar o OPS, em que o OPS é substancialmente livre dos outros componentes celulares e contém uma cetona em sua extremidade terminal redutora.
[0051] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de produção de uma estrutura polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno O não biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno O compreende um grupo amino primário e pelo menos um polissacarídeo biotinilado, o método incluindo: ligar quimicamente o grupo amino primário do polissacarídeo de antígeno O, misturando o polissacarídeo de antígeno O com um polissacarídeo parcialmente oxidado, contendo grupos aldeído, e uma amina primária, contendo biotina, para obter uma mistura; e submeter a mistura à aminação redutiva com um agente redutor para produzir uma estrutura polimérica BP-1, em que o polissacarídeo é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente não é biotinilado. Algumas modalidades proveem uma estrutura polimérica BP-1 produzida pelos métodos aqui revelados.
[0052] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de produção de uma estrutura polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno O não biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno O compreende um grupo amino primário e pelo menos um polissacarídeo biotinilado, o método incluindo: ligar quimicamente o grupo amino primário do polissacarídeo de antígeno O, misturando o polissacarídeo de antígeno O com um polissacarídeo biotinilado e oxidado, obtido tratando primeiramente os grupos carboxilados do polissacarídeo com 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida N- hidroxissuccinimida (EDC) e N-Hidroxissuccinimida (NHS) e uma hidrazida de biotina, a seguir, tratando o polissacarídeo com um agente oxidante; e submeter a mistura à aminação redutiva com um agente redutor para produzir uma estrutura polimérica BP-1.2, em que o polissacarídeo é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente não é biotinilado. Em algumas modalidades, o grupo primário no polissacarídeo de antígeno O é o grupo a-amino de L- Alanina de OPS do outer core (parte central mais externa) de P. aeruginosa ou um grupo amino que foi introduzido na extremidade redutora do polissacarídeo de antígeno O por ligação química de uma molécula espaçadora curta, contendo um grupo primário em cada extremidade, por aminação redutiva com um agente redutor. Em algumas modalidades, o agente oxidante para a oxidação do polissacarídeo é periodato de sódio, o espaçador curto contendo di- amina é di-hidrazida adípica e o agente redutivo da aminação redutiva é cianoborohidreto de sódio. Algumas modalidades proveem uma estrutura polimérica BP-1.2 produzido pelos métodos aqui revelados.
[0053] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de produção de um estrutura polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno O não biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno O compreende um grupo amino primário e pelo menos um polissacarídeo biotinilado, o método incluindo: ligar quimicamente o grupo amino primário do polissacarídeo de antígeno O, misturando o polissacarídeo de antígeno O com um polissacarídeo biotinilado e ativado por CDAP, obtido tratando primeiramente os grupos carboxilados do polissacarídeo com 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida N-hidroxissuccinimida (EDC) e N-Hidroxissuccinimida (NHS) e uma hidrazida de biotina, depois ativando o polissacarídeo biotinilado com CDAP para produzir um estrutura polimérica BP-1.3, em que o polissacarídeo é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente não é biotinilado. Em algumas modalidades, o grupo primário no polissacarídeo de antígeno O é o grupo a-amino de L-Alanina de OPS do outer core de P. aeruginosa ou um grupo amino que foi introduzido na extremidade redutora do polissacarídeo de antígeno O pela ligação química de uma molécula espaçadora curta, contendo um grupo primário em cada extremidade, por aminação redutiva com um agente redutor. Em algumas modalidades, o espaçador curto contendo di-amina é di-hidrazida adípica e o agente redutivo da aminação redutiva é cianoborohidreto de sódio. Algumas modalidades proveem um estrutura polimérica BP-1.3 produzido pelos métodos aqui revelados.
[0054] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de produção de uma estrutura polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno O biotinilado e pelo menos um polissacarídeo — biotinilado, o método compreendendo: ligar quimicamente o polissacarídeo de antígeno O contendo uma amina primária em seu core, obtido quer por ligação de um espaçador curto, contendo uma amina primária em cada extremidade, a um polissacarídeo de antígeno O por aminação redutiva, para obter um polissacarídeo de antígeno O-molécula espaçadora, ou utilizando OPS sem derivação, contendo o grupo a-amino de L-alanina, misturando o polissacarídeo de antígeno O contendo amina primária com um polissacarídeo parcialmente oxidado para obter uma mistura; submeter a mistura à aminação redutiva para formar uma estrutura de OPS; e derivar a estrutura de OPS com CDAP e uma amina primária contendo biotina, formando, assim, uma estrutura polimérica, em que o polissacarídeo e o polissacarídeo de antígeno O ligados quimicamente são biotinilados. Algumas modalidades proveem uma estrutura polimérica produzida pelos métodos aqui revelados.
[0055] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de produção de uma estrutura polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno O biotinilado e pelo menos um polissacarídeo não biotinilado, o método compreendendo: anexar uma biotina a um polissacarídeo de antígeno O compreendendo um ou mais KDOs do core e/ou porções de heptose com CDAP e uma amina primária contendo biotina para obter uma mistura de OPS biotinilado; oxidar parcialmente a mistura de OPS biotinilado com periodato de sódio para introduzir aldeídos nos KDOs do core e/ou porções de heptose; submeter a mistura de biotinilação à aminação redutiva di- hidrazida de ácido adípico; misturar o OPS biotinilado e aminado com um polissacarídeo parcialmente oxidado para formar uma mistura; e submeter a mistura à aminação redutiva; formando, assim, uma estrutura polimérica, em que o polissacarídeo não é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente é biotinilado. Algumas modalidades proveem um estrutura polimérica produzida pelos métodos aqui revelados.
[0056] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de produção de uma estrutura polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno O biotinilado e um polímero de PLL, o método compreendendo: submeter um polissacarídeo de antígeno O, contendo aldeídos terminais ou KDOs alfa, à aminação redutiva com os grupos e-NH2 de um polímero de PLL para produzir um polímero de OPS PLL; derivar o OPS com CDAP para formar uma mistura do derivado; reagir a mistura do derivado com uma amina primária contendo biotina; e tratar a mistura ou não com um reagente de acilação para capeamento dos grupos e-NH2 não reagidos do polímero de PLL; produzindo, assim, uma estrutura polimérica, em que a estrutura de PLL N-acetilado ou de PLL não capeado não é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente é biotinilado. Em algumas modalidades, o agente de acilação é anidrido acético ou cloreto de acetila. Em algumas modalidades, o agente redutor é cianoborohidreto de sódio. Algumas modalidades proveem uma estrutura polimérica produzida pelos métodos aqui revelados.
[0057] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de produção de uma estrutura polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno O não biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno O compreende um grupo azido em sua extremidade terminal redutora e pelo menos um polissacarídeo biotinilado contendo grupos alcinos, o método compreendendo: ligar por química click na presença de um catalisador o polissacarídeo de antígeno O contendo grupos azido em suas extremidades redutoras com um polissacarídeo biotinilado contendo alcinos, formando, assim, uma estrutura polimérica de OPS, em que o polissacarídeo é biotinilado, mas o polissacarídeo de antígeno O ligado por química click não é biotinilado. Algumas modalidades proveem uma estrutura polimérica produzida pelos métodos aqui revelados.
[0058] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de produção de uma estrutura polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno O não biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno O compreende um grupo aldeído ou cetona em sua extremidade terminal redutora e pelo menos um polissacarídeo biotinilado contendo grupos amino primários por ligações de química click na presença de um catalisador, o polissacarídeo biotinilado contendo grupos alcinos com um composto de MW pequena contendo um azido em uma extremidade e um grupo amino livre na outra extremidade, o método compreendendo: ligar quimicamente o polissacarídeo de antígeno O, contendo grupos aldeído ou cetona, misturando o polissacarídeo de antígeno O com um polissacarídeo biotinilado contendo grupos amino primários e submeter a mistura à aminação redutiva com um agente redutor, formando, assim, uma estrutura polimérica, em que o polissacarídeo é biotinilado, mas o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente não é biotinilado. Algumas modalidades proveem uma estrutura polimérica produzida pelos métodos aqui revelados.
[0059] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de produção de uma estrutura polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno O biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno O biotinilado compreende um grupo azida em sua extremidade terminal redutora e pelo menos um polissacarídeo não biotinilado contendo alcinos, o método compreendendo: ligar, por química click na presença de um catalisador, o polissacarídeo de antígeno O biotinilado contendo grupos azido em suas extremidades redutoras, com um polissacarídeo não biotinilado contendo alcinos, formando, assim, uma estrutura polimérica, em que o polissacarídeo é não biotinilado e o polissacarídeo de antígeno O ligado por química click é biotinilado. Em algumas modalidades, o catalisador para ligação de química click do polissacarídeo de antígeno O com o polissacarídeo via a cicloadição alcino-azida é sulfato de cobre. Em algumas modalidades, o grupo alcino para derivar do polissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em 1-amino-3-butino, 1-amino-4-pentino, DBCO-amina e alcino-PEG4-amina. Em algumas modalidades, o grupo azida para derivar do polissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em azido-PEG3-Amina, azido-propilamina e azido-butilamina. Algumas modalidades proveem uma estrutura polimérica produzida pelos métodos aqui revelados.
[0060] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão é ou compreende um domínio de ligação à biotina e um polipeptídeo que é ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NOs:16 a 26. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão é ou compreende um domínio de ligação à biotina e um polipeptídeo que é ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NOs:1-3 ou 6-26.
[0061] Em algumas modalidades, um método de produção de um MAPS variante compreende a complexação de pelo menos uma estrutura polimérica aqui descrito com pelo menos uma proteína de fusão aqui descrita. Em algumas modalidades, o MAPS variante é BP- 1 MAPS, BP-1.2 MAPS, BP-1.3 MAPS, BP-2a MAPS, BP-2b MAPS ou BP-3 MAPS.
[0062] Em algumas modalidades, um método de avaliação da imunogenicidade de uma composição imunogênica aqui descrita compreende avaliar, medir e/ou comparar uma resposta imune por meio de um ou mais bioensaios in vitro incluindo respostas de células B e células T, tais como níveis de anticorpos por ELISA, níveis de anticorpos funcionais por FC, OPK e outros testes funcionais como aglutinação, motilidade, citotoxicidade, células Th1/Th17 e níveis de citocinas, e ensaios in vivo em modelos animais de doença nosocomial (pneumonia, sepse, feridas por queimadura, infecções Gl e do sítio cirúrgico), tais como eliminação de bactérias, proteção passiva e ativa após desafio com os patógenos nosocomiais que são os alvos da composição imunogênica. Em algumas modalidades, a resposta imune é comparada à de uma composição de controle. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polissacarídeo antigênico presente na composição imunogênica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição imunogênica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição imunogênica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição imunogênica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição imunogênica e/ou um polissacarídeo antigênico presente na composição imunogênica, não incluindo um polímero presente na composição imunogênica.
[0063] Em algumas modalidades, um método de avaliação da potência de uma composição imunogênica aqui descrita compreende avaliar, medir e/ou comparar uma resposta imune por meio de um ou mais bioensaios in vitro incluindo respostas de células B e células T, tais como níveis de anticorpos por ELISA, níveis de anticorpos funcionais por FC, OPK e outros testes funcionais como aglutinação, motilidade, citotoxicidade, células Th1/Th17 e níveis de citocinas, e ensaios in vivo em modelos animais de doença nosocomial (pneumonia, sepse, feridas por queimadura, infecções Gl e do sítio cirúrgico), tais como eliminação de bactérias, proteção passiva e ativa após desafio com os patógenos nosocomiais que são os alvos da composição imunogênica. Em algumas modalidades, a resposta imune é comparada à de uma composição de controle. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polissacarídeo antigênico presente na composição imunogênica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição imunogênica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição imunogênica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição imunogênica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição imunogênica e/ou um polissacarídeo antigênico presente na composição imunogênica, não incluindo um polímero presente na composição imunogênica.
[0064] Em algumas modalidades, um método de avaliação da imunogenicidade de uma composição vacinal aqui descrita compreende avaliar, medir e/ou comparar uma resposta imune por meio um ou mais bioensaios in vitro incluindo respostas de células B e células T, tais como níveis de anticorpos por ELISA, níveis de anticorpos funcionais por FC, OPK e outros testes funcionais como aglutinação, motilidade, citotoxicidade, células Th1/Th17 e níveis de citocinas, e ensaios in vivo em modelos animais de doença nosocomial (pneumonia, sepse, feridas por queimadura, infecções Gl e do sítio cirúrgico), tais como eliminação de bactérias, proteção passiva e ativa após desafio com os patógenos nosocomiais que são os alvos da composição vacinal. Em algumas modalidades, a resposta imune é comparada à de uma composição de controle. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polissacarídeo antigênico presente na composição vacinal e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição vacinal. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição vacinal e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição vacinal. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição vacinal e/ou um polissacarídeo antigênico presente na composição vacinal, não incluindo um polímero presente na composição vacinal.
[0065] Em algumas modalidades, um método de avaliação da potência de uma composição vacinal aqui descrita compreende avaliar, medir e/ou comparar uma resposta imune por meio de um ou mais bioensaios in vitro incluindo respostas de células B e células T, tais como níveis de anticorpos por ELISA, níveis de anticorpos funcionais por FC, OPK e outros testes funcionais como aglutinação, motilidade, citotoxicidade, células Th1/Th17 e níveis de citocinas, e ensaios in vivo em modelos animais de doença nosocomial (pneumonia, sepse, feridas por queimadura, infecções Gl e do sítio cirúrgico), tais como eliminação de bactérias, proteção passiva e ativa após desafio com os patógenos nosocomiais que são os alvos da composição vacinal. Em algumas modalidades, a resposta imune é comparada à de uma composição de controle. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polissacarídeo antigênico presente na composição vacinal e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição vacinal. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição vacinal e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição vacinal. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição vacinal e/ou um polissacarídeo antigênico presente na composição vacinal, não incluindo um polímero presente na composição vacinal.
[0066] Em algumas modalidades, um método de avaliação da imunogenicidade de uma composição farmacêutica aqui descrita compreende avaliar, medir e/ou comparar uma resposta imune por meio de um ou mais bioensaios in vitro incluindo respostas de células B e células T, tais como níveis de anticorpos por ELISA, níveis de anticorpos funcionais por FC, OPK e outros testes funcionais como aglutinação, motilidade, citotoxicidade, células Th1/Thi7 e níveis de citocinas, e ensaios in vivo em modelos animais de doença nosocomial (pneumonia, sepse, feridas por queimadura, infecções GI e do sítio cirúrgico), tais como eliminação de bactérias, proteção passiva e ativa após desafio com os patógenos nosocomiais que são os alvos da composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a resposta imune é comparada à de uma composição de controle. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polissacarídeo antigênico presente na composição farmacêutica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição farmacêutica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição farmacêutica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição farmacêutica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição farmacêutica e/ou um polissacarídeo antigênico presente na composição farmacêutica, não incluindo um polímero presente na composição farmacêutica.
[0067] Em algumas modalidades, um método de avaliação da potência de uma composição farmacêutica aqui descrita compreende avaliar, medir e/ou comparar uma resposta imune por meio de um ou mais bioensaios in vitro incluindo respostas de células B e células T, tais como níveis de anticorpos por ELISA, níveis de anticorpos funcionais por FC, OPK e outros testes funcionais como aglutinação, motilidade, citotoxicidade, células Th1/Th17 e níveis de citocinas, e ensaios in vivo em modelos animais de doença nosocomial (pneumonia, sepse, feridas por queimadura, infecções Gl e do sítio cirúrgico), tais como eliminação de bactérias, proteção passiva e ativa após desafio com os patógenos nosocomiais que são os alvos da composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a resposta imune é comparada à de uma composição de controle. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polissacarídeo antigênico presente na composição farmacêutica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição farmacêutica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição farmacêutica e não compreender uma estrutura polimérica presente na composição farmacêutica. Em algumas modalidades, uma composição de controle pode compreender um polipeptídeo antigênico presente na composição farmacêutica e/ou um polissacarídeo antigênico presente na composição farmacêutica, não incluindo um polímero presente na composição farmacêutica.
Lista de abreviações comuns
[0068] ADH: Di-hidrazida adípica; AMR: resistência antimicrobiana; AU: unidade arbitrária; BB: Estrutura; BP: Estrutura polimérica; CDAP: tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridínio; CDC: Centro para Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos; CDM: meio quimicamente definido; CF: Fibrose cística; CP: Parte comum; CPS: Polissacarídeo capsular; CFU: unidades formadoras de colônias; COPS: Polissacarídeo O do core; CT: toxina colérica; DNA: ácido desoxirribonucleico; DTT: Ditiotreitol; EC: Escherichia coli; EDC: 1-etil- 3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida; ELISA: ensaio imunoenzimático de absorção; ELISpot: ensaio imunoenzimático (enzyme linked immunospot); ETEC: E. coli enterotóxica; EUA: Estados Unidos da América; FC: Citometria de fluxo; FT; Flow Through (Fração não adsorvida); Gl: gastrointestinal; GNB: bactérias Gram-negativas; GNR: bastonetes Gram-negativos; HA: hemaglutinação; HK: morta pelo calor: células HL-60: células de leucemia promielocítica humana; HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência; IATS: International Antigenic Typing Scheme [Esquema Internacional para Tipagem Antigênica]; IEC: Cromatografia de troca iônica; IFN: Interferon; IL: Interleucina; IM: intramuscular; IN: intranasal; IP: intraperitoneal; IV: intravenoso; IVIG: imunoglobulina intravenosa; Ig: imunoglobulina; KDO: grupo ceto ácido; KP: Klebsiella pneumoniae; KO: Klebsiella oxytoca; LAL: lisado de amebóticos de Limulus: LPS: Lipopolissacarídeo; mAb: anticorpo monoclonal; MALLS: espalhamento de luz laser multi-ângulo; MAPS: sistema de apresentação de múltiplos antígenos; MDR: resistente a múltiplos fármacos; MHC: complexo maior de histocompatibilidade; MW: massa molecular; NAPLL: N-Acetil poli-L-lisina; NaBH3;CN: Cianoborohidreto de sódio; NalOs: Metaperiodato de sódio; NHS: N-
hidroxissuccinimida; NHS: Soro humano normal; OD: densidade óptica; OMP: proteína da membrana externa; OPA: ensaio de atividade opsonofagocitária, OPK: morte por opsonofagocitose; OPS: Polissacarídeo-O; PA: Pseudomonas aeruginosa; PCR: reação em cadeia da polimerase; PBS: solução salina com tampão fosfato; PEG: Polietilenoglicol; PMN: Leucócitos polimorfonucleares; PLL: Poli-L- lisina; PPG: Polipropilenoglicol; PRO-CN: Proteína de transporte controle; PT: Toxina pertussis; RCB: banco de células de pesquisa; RI: Índice de refração; RIA: radioimunoensaio; RMN: Ressonância magnética nuclear; RMN-H: ressonância magnética nuclear de hidrogênio RNA: ácido ribonucleico; RPM: rotações por minuto; SBA: ensaio bactericida no soro; SC: Via subcutâneo; SDS: dodecil sulfato de sódio; SDS-PAGE: eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio- poliacrilamida: SEC: Cromatografia de exclusão por tamanho; TFF: Filtração em fluxo tangencial; TLR: receptor toll-likce; TNF: fator de necrose tumoral; TTSS: sistema de secreção tipo três, UF: Ultrafiltração; UTI: unidade de terapia intensiva; VO: via oral; WFI: Água para injeção. Breve descrição dos desenhos
[0069] Os presentes ensinamentos descritos serão entendidos mais completamente a partir da descrição a seguir de várias modalidades ilustrativas, quando lidas em conjunto com os desenhos anexos. Deve ser entendido que os desenhos descritos abaixo são para fins de ilustração somente e não se destinam a restringir de modo algum o âmbito dos presentes ensinamentos.
[0070] A Figura 1A mostra a estrutura química do inner core (parte central mais interior) (em cima) e do outer core (parte central mais exterior) (embaixo) do lipopolissacarídeo de P. aeruginosa (PA), uma seta marcada com os pontos de "clivagem" indica o sítio de clivagem mediada por ácido acético entre os "grupos ceto ácidos" (KDO) e a molécula do lipídio A. A Figura 1B mostra a estrutura química das unidades repetidas de polissacarídeo O (OPS) de diversos dos tipos internacionalmente aceitos da tipagem (IATS) padrão do core de PA. À Figura 1C mostra a estrutura de parte do polissacarídeo do core do lipopolissacarídeo (LPS) de com o sítio de clivagem desaminativa entre os resíduos de glicosamina e galacturônico do core quando o LPS é tratado com nitrito de sódio e ácido acético (ácido nitroso), resultando na formação de uma 2,5-anidromanose com um grupo aldeído em C-1 na extremidade redutora da parte comum (CP) do OPS. A Figura 1D mostra a estrutura química das unidades repetidas de diversos OPS de K. pneumoniae (KP) com a 2,5-anidromanose na extremidade redutora da CP do OPS. A Figura 1E mostra a estrutura química da unidade repetida do polissacarídeo capsular (CPS) K19 de K. oxytoca (KO) que é idêntico ao CPS K19 de K. pneumoniae (Brisse et al., 2013), consequentemente, os dois são referidos alternadamente no presente como KP K19 CPS. A Figura 1F é um espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN-H) a 950 MHz de KP K19 CPS purificado.
[0071] A Figura 2A é um desenho esquemático de um processo químico exemplar para a produção de KP/PA OPS marcado com di- hidrazida de ácido adípico (ADH) e ligado por aminação redutiva a um CPS oxidado que é seletivamente biotinilado no CPS (BP-1). A Figura 2B mostra um desenho esquemático de um processo químico exemplar para a produção de KP/PA CPS/OPS BP-1.2, onde resíduos de biotina são ligados nos grupos carboxilados do CPS da estrutura polimérica através de uma reação com 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida N-hidroxissuccinimida (EDC-NHS), OPS marcado com ADH é ligado à estrutura polimérica de CPS biotinilado por aminação redutiva com CPS oxidado por periodato e biotinilado. A Figura 2C mostra um desenho esquemático de um processo químico exemplar para a produção de KP/PA CPS/OPS BP-1.3, onde resíduos de biotina são ligados nos grupos carboxilados do CPS da estrutura polimérica através de reação com 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida N-hidroxissuccinimida (EDC-NHS) e, subsequentemente, OPS marcado com ADH é ligado à estrutura polimérica de CPS biotinilado e ativado por CDAP.
[0072] A Figura 3 mostra um desenho esquemático de um processo químico exemplar para a produção de OPS marcado com ADH ligado a um CPS oxidado seguido pela adição de resíduos de biotina no CPS e no OPS (BP-2a).
[0073] A Figura 4 mostra um desenho esquemático exemplar de um processo químico para a produção de um OPS ligado a um CPS oxidado no qual os resíduos de biotina são seletivamente ligados ao OPS (BP- 2b).
[0074] A Figura 5A mostra um desenho esquemático exemplar de um processo químico para a produção de uma estrutura polimérica de OPS com um polímero de poli-L-lisina (PLL) no qual os resíduos de biotina são seletivamente introduzidos no OPS e os grupos e-amino livres não reagidos da PLL são capeados para gerar uma estrutura polimérica de OPS biotinilado-PLL N-Acetilada (NAPLL) (BP-3). À Figura 5B apresenta três esquemas para produção de estruturas poliméricas exemplares. O esquema 1 e o esquema 2 descrevem duas maneiras para o desenho esquemático do processo químico para a produção de uma estrutura de CPS/OPS 1 (BP-1) utilizando química click; o esquema 3 mostra o desenho esquemático do processo químico utilizando química click para a produção de uma estrutura de CPS/OPS 2b (BP-2b).
[0075] A Figura 6A descreve perfis exemplares de eluição por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (Waters BioAlliance com uma coluna Phenomenex BioSep SEC-4000 e vazão de 1 mL/min. em PBS, pH 7,4, contendo azida sódica (0,02%) de K19 KP CPS oxidado, OPS-ADH derivado com KPO1 (traçado 1), KPOS5 (traçado 5), PAOG6 (traçado 6), PAO 10 (traçado 10). A Figura 6B descreve perfis de eluição por SEC, HPLC (Waters BioAlliance com uma coluna Phenomenex BioSep SEC- 4000 e vazão de 1 mL/min em PBS, pH 7,4, contendo azida sódica (0,02%) de (esquerda): um OPSapH; KP K19 CPSox oxidado (indicado na figura como K190ox); e um K19 CPSox: estrutura polimérica OPSanH e (direita)) um K19 CPSox : estrutura polimérica OPSaDH após dimensionamento molecular por meio de SEC ou ultrafiltração (UF) utilizando uma membrana com corte de 100 kDa para massa molecular nominal (NMWCO). A Figura 6C descreve análises de antigenicidade por imunoensaio enzimático (ELISA) com PA COPS ou PA COPS: construções K19 BP-1, utilizando soro hiper-imune de coelho da imunização com Pseudomonas aeruginosa morta pelo calor (HK) (após a quarta imunização). Um COPS de E. coli enterotóxica (ETEC) é usado como controle negativo no ELISA. A forte atividade do PA COPS K19 BP-1 com o antissoro contra OPS específico de Pseudomonas aeruginosa indica que os epítopos de OPS na estrutura polimérica estão preservados.
[0076] A Figura 7A descreve um desenho esquemático exemplar de um complexo MAPS BP-1 com uma proteína de fusão de rizavidina e um OPS BP-1 ou BP-1.2; a Figura 7B descreve um desenho esquemático exemplar de um complexo MAPS BP-2a com uma proteína de fusão de rizavidina e um OPS BP-2a; a Figura 7C descreve um desenho esquemático exemplar de um complexo MAPS BP-2b com uma proteína de fusão de rizavidina e um OPS BP-2b; a Figura 7D descreve um desenho esquemático de um complexo MAPS BP-3 com uma proteína de fusão de rizavidina e um OPS BP-3; a Figura 7E descreve um desenho esquemático de um complexo MAPS com uma proteína de fusão de rizavidina e um OPS nativo.
[0077] A Figura 8A descreve um fluxograma exemplar de um processo de purificação a jusante de PS de KP e OPS de PA. A Figura 8B descreve um perfil exemplar por SEC-HPLC (Waters BioAlliance com uma coluna phenomenex BioSep SEC-4000, usada a uma vazão de 1 mL/min. em PBS, pH 7,4, contendo azida sódica (0,02%) de traçados sobrepostos de índice de refração (RI) de KP OPS purificado e K19 CPS, da esquerda para a direita: K19 CPS, 01, 03, 026 O5. À Figura 8C descreve um perfil exemplar por SEC-HPLC (Waters BioAlliance com uma coluna phenomenex BioSep SEC-4000, usada a uma vazão de 1 mL/min. em PBS, pH 7,4, contendo azida sódica (0,02%) de traçados sobrepostos de RI de PA OPS purificado, da esquerda para a direita: O2, O6, O3, O4, O5, 01, 010 e 011.
[0078] A Figura 9A descreve um fluxograma exemplar de um processo de purificação a jusante de KO CPS K19. A Figura 9B descreve uma construção de um gene para uma cepa reagente de Pseudomonas que produz excessivamente um exopolissacarídeo PsL. A Figura 9C descreve um fluxograma de um processo de purificação a jusante do exopolissacarídeo PsL de PA.
[0079] A Figura 10 mostra, no painel superior, um perfil de eluição exemplar por SEC em uma coluna Superdex-200 de complexos MAPS- BP-2a da proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA com K19: KPO2-ADH BP-2a. A Figura 10 mostra, no painel inferior, um rastreamento por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e coloração de proteínas totais das frações eluindo da coluna de SEC. As amostras foram processadas sem calor em tampão de dodecil sulfato de sódio (SDS) com ditiotreitol 10 mM (DTT) antes da SDS-PAGE para permitir que os complexos MAPS permanecessem intactos.
[0080] As Figuras 11A-11C mostram exemplos da análise por SDS- PAGE e coloração de proteínas totais de complexos MAPS variantes de BP-1 exemplares, preparados com diferentes proteínas de fusão. A
Figura 11A descreve uma SDS-PAGE exemplar de complexos MAPS- BP-1 variantes entre a proteína de fusão de rizavidina (PRO-CN) formada separadamente com PA O10 OPS BP-1 (bandas 4 e 5), PA O1 OPS BP-1 (bandas 6 e 7) e PA O2 OPS BP-1 (bandas 8 e 9). A Figura 11B descreve uma SDS-PAGE exemplar de complexos MAPS-BP-1 variantes entre a proteína rizavidina-FlaB-PerV (Ravi-FlaB-PcrV) formada separadamente com PA O10 OPS BP-1 (bandas 4 e 5), PA O1 OPS BP-1 (bandas 6 e 7) e PA O2 OPS BP-1 (bandas 8 e 9). Figura 11C descreve uma SDS-PAGE exemplar de complexos MAPS-BP-1 variantes entre a proteína rizavidina-FlaB-D2-MrkA (Ravi-FlaBD2-MrkA) com PA O10 OPS BP-1 (bandas 4 e 5), PA O1 OPS (bandas 6 e 7) e PA O2 OPS BP-1 (bandas 8 e 9). Nas Figuras 11A-11C, a proteína de fusão de rizavidina sozinha foi corrida como controle (bandas 1 e 2). Cada uma das amostras foi processada com calor (fervendo) (bandas 1,4,6 e 8) e sem calor (bandas 2, 5, 7 e 9). Os complexos MAPS-BP-1 variante não foram rompidos sem calor, e a proteína nos complexos MAPS-BP-1 variante ficou retida na parte superior do gel. Com a fervura, os complexos MAPS-BP-1 variante foram rompidos, a proteína foi liberada e o dímero da proteína foi também dissociado. Um marcador da massa molecular de proteínas foi também incluído, e a massa molecular do padrão é indicada à esquerda do gel em kDa.
[0081] A Figura 12A mostra um desenho esquemático de proteínas de fusão rizavidina-antígeno produzidas que são derivadas de Pseudomonas (PcrV; FlaB; FIaA2; FIaA1; FlaB-PcrV; FlaB-D2; FlaA2- D2) ou Klebsiella (MrkA) ou proteínas híbridas derivadas de Klebsiella e Pseudomonas (FlaB-D2-MrkA; PcrV-MrkA). A Figura 12B mostra a bioatividade do receptor do tipo pedágio (TLR) 5 para flagelinas nativas de Pseudomonas e proteínas de fusão Ravi, sozinhas ou como um complexo MAPS variante com polissacarídeos pneumocócicos (PnPS) 6B. Nesse ensaio, células HEK293-NFKkB:Luc responderam à flagelinas,
mas não ao meio isoladamente. Esses resultados indicam que as construções de rizavidina-flagelina (FlaB, FIaA1, FIaA2), isoladamente ou em um complexo MAPS com o PnPS 6B, promoveram a atividade de TLR5, consequentemente, foram devidamente dobradas.
[0082] As Figuras 13A-13B comparam a capacidade de complexos MAPS gerados com várias proteínas de fusão rizavidina-antígeno e polissacarídeos capsulares pneumocócicos (PnCPS) para provocar uma resposta de anticorpos anti-CPS 19A (Figura 13A) ou anti-CPS-6B (Figura 13B) em coelhos, conforme medida por ELISA. Amostras de soro foram avaliadas desde antes da imunização (PO), duas semanas depois da primeira imunização (P1) e duas semanas depois da segunda imunização (P2). A resposta de IgG medida recebeu um valor em unidade arbitrária (AU) a partir de uma curva padrão, em que, para uma AU por mL, atribuiu-se o valor de 12.500. A média geométrica é indicada com uma linha preta horizontal com barras de erro para o intervalo de confiança 95%. Figura 13A, painel superior: resposta de imunoglobulina (IgG) contra PRCPS 19A com PRO-CN; rizavidina sozinha (Ravi); rizavidina-FlaB-D2 (FlaBD2); rizavidina-FlaA2-D2 (FIlaA2D2); rizavidina- FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); rizavidina-FlaB-D2-MrkA (FlaBD2-MrkA); rizavidina-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA). Figura 13A, painel inferior: PRO-CN; rizavidina-PcrV (PcrV); rizavidina-FlaB (FlaB); rizavidina-FIaA1 (FIaA1); rizavidina-FIlIaA2 (FIaA2); rizavidina-MrkA (MrkA). Figura 13B painel superior: resposta de IgG contra PRNCPS 6B com PRO-CN; rizavidina sozinha (Ravi); rizavidina-FlaB-D2 (FIaBD2); rizavidina-FlaA2-D2 (FIaA2D2); rizavidina-FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); rizavidina-FlaB-D2-MrkA (FlaBD2-MrkA); rizavidina-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA). Figura 13B painel inferior: PRO-CN; rizavidina-PcrV (PcrV); rizavidina-FlaB (FlaB); rizavidina-FlIaA1 (FIaA1); rizavidina-FlaA2 (FIaA2); rizavidina-MrkA (MrkA).
[0083] A Figura 14 mostra a resposta imune de coelhos imunizados com proteínas de fusão rizavidina-antígeno (100 ug de proteína em adjuvante de Freund). A IgG de coelho foi medida por ELISA contra o antígeno imunizante em amostras de soro antes da imunização (PO) e duas semanas depois da segunda imunização (P2). A resposta de IgG medida em AU a partir de uma curva padrão, em que, para uma AU por mL, atribuiu-se o valor de 12.500. A média geométrica é indicada como linha preta horizontal. Os títulos são mostrados em AUs para as proteínas Ravi-FlaB-D2 (FlaB-D2); Ravi-FlaA2-D2 (FIlaA2-D2); Ravi- FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); Ravi-FlaB-D2-MrkA (FlaB-D2-MrkA); e Ravi- PcrV-MrkA (PcrV-MrkA).
[0084] A Figura 15 compara a imunogenicidade em coelhos de formulações bivalentes de OPS O6 e 010 PA nativa em complexos de MAPS com a proteína de fusão de rizavidina PRO-CN, ou rizavidina (Rhz). Os títulos de IgG anti-OPS O6 ou O10 são mostrados em unidades de ELISA antes (PO), depois de uma (P1) ou duas injeções (P2).
[0085] A Figura 16 compara a imunogenicidade em coelhos de formulações de KP O1 e KP O5 OPS BP-1 bivalente; KP O1 BP-2a monovalente; e KP O1 BP-2b monovalente em todos os complexos de MAPS variante com a proteína de fusão de rizavidina PRO-CN e com fosfato de alumínio. Os títulos de IgG anti-OPS KP O1 ou KP O5 são mostrados em unidades ELISA antes (PO), depois de uma (P1) ou duas injeções (P2).
[0086] A Figura 17 compara a imunogenicidade em coelhos de formulações de: PA O6, O10 OPS BP-1 bivalente complexado com PRO-CN; PA O6, O10 OPS BP-1 complexado com PRO-CN (sem alumínio); PA O6, O10-BP-1 (sem proteína, p. ex., sem PRO-CN); PA O6, O10 OPS BP-1 (sem MAPS,; p. ex., sem biotinilação, mas a componente estrutura polimérica e PRO-CN incluído); e PA-O6 OPS BP-1 monovalente em complexos de MAPS BP-1 com a proteína de fusão de rizavidina PRO-CN com fosfato de alumínio, a menos que indicado de outra forma. Os títulos de IgG anti-OPS O6 e anti-OPS O10 de PA são mostrados em unidades ELISA antes (PO), depois de uma (P1) ou duas injeções (P2).
[0087] A Figura 18A compara a morte por opsonofagocitose (OPK) com células de leucemia promielocítica humana (HL-60) da cepa 12- 0581 de Klebsiella (01: K62) de antissoros de coelho (dos coelhos AFV651 e AFV667) contra: OPS KP O1 BP-1 PRO-CN MAPS pré e pós- segunda imunização (painel esquerdo); MAS OPS KP O1 BP-2A MAPS/Rizavidina PRO-CN pré e pós-segunda imunização (painel direito). Eliminação aumentada foi observada para os soros BP-2a do soro imune, em comparação ao soro pré-imune do mesmo coelho. À Figura 18B compara a OPK com células HL-60 de cepa PA IATSO6 de Pseudomonas com antissoros de coelho para PA O6, 010-OPS BP-1 PRO-CN MAPS bivalente e PA IATSO6 OPS BP-1 PRO-CN MAPS monovalente. Os soros individuais testados dos coelhos produziram OPK de PA IATSOG6, o soro do coelho AFV643 produziu um efeito prozona que é sugestivo de um título forte de anticorpos contra OPS. À Figura 18C mostra que os quatro soros imunes individuais de coelhos (P2) gerados com uma vacina bivalente PA O6, PA 010 OPS BP-1- PRO-CN-MAPS induziram OPK robusta de bactérias PA O10 com células HL-60.
[0088] A Figura 19a compara ligação por citometria de fluxo (FC) da cepa B5055 de Klebsiella inteira (01: K2) com soros de coelhos individuais ao MAPS PRO-CN variante de KPO1, O5 OPS BP-1 (esquerda) e KPO1 OPS BP-2a (direita). Esses resultados de ligação FC com bactérias inteiras apresentam tendências semelhantes com título por ELISA contra KPO1 OPS purificado, ou seja, título baixo, baixa ligação FC. O número pequeno de eventos duplo-positivos indicou ligação fraca do anticorpo ou exposição limitada ao OPS na superfície da cepa B5055 de Klebsiella. A Figura 19B (painel superior) mostra gráficos de dispersão (gráficos de dispersão) por FC de um soro individual de coelho (AFV667) contra um complexo de PRO-CN BP-2a MAPS com KPO1 OPS BP-2a comparando ligação fracamente a (B5055) e (K. pneumoniae, cepa Caroli, O1: K2) e ligação fraca às cepas O1 de Klebsiella não encapsulada (CVD 3001). A Figura 19B (painel inferior) mostra eventos de ligação total FC às mesmas três cepas O1 de Klebsiella do soro de um coelho vacinado com KP O1, O5 OPS BP- 1 PRO-CN MAPS bivalente. Esses dados de ligação sugerem que a quantidade de CPS afetado após exposição ao OPS foi possivelmente influenciada pelas condições de crescimento.
[0089] A Figura 20 compara a ligação FC à cepa PAK de bactérias Pseudomonas inteiras (O6:FIlaA1) com soros de coelhos (esquerda) de PAOG6-PAO10 OPS nativo-PRO-CN bivalente (soros agrupados de 3 coelhos, após a segunda imunização); soros de coelhos (meio) para PAO6-PAO10 OPS BP-1I-PRO-CN MAPS monovalente (soros agrupados de 3 coelhos, post segunda imunização); soros de coelhos (direita) para PAO6-IATSO6 — OPS BP-1-PRO-CN MAPS monovalente (soros agrupados de 3 coelhos, após a segunda imunização); ligação FC mais forte é observada para o PAO6 OPS BP-1 MAPS quando comparado à forma nativa do OPS MAPS.
[0090] A Figura 21A apresenta dados de ligação FC para a ligação de anti-FlaB de coelho à cepa PAO1 (O5 expressando FlaB): o painel à direita mostra um gráfico de dispersão com alta porcentagem da população PAO1 marcada após a terceira sangria (sangria P3; pool de soros de 10 coelhos) de coelhos vacinados com rizavidina-FlaB-D2 (sem a região de ligação a TLR5) em comparação ao soro pré-sangria (PO) (painel esquerdo). O painel superior da Figura 21B mostra FC para o soro de sangria P3 de um coelho individual contra rizavidina-FlaB-D2; o painel do meio para o soro de sangria P3 de um coelho individual contra rizavidina-FlaB-PcrV,; inferior o soro de sangria P3 de um coelho individual contra rizavidina FlaB-D2-MrkA.
[0091] A Figura 22 descreve OPK com células HL-60 da cepa alvo PAO1 de Pseudomonas (O5: expressando FlaB) com antissoros agrupados anti-Ravi-FlaB-His de coelhos, em comparação a controles positivos: anticorpo anti-PA-FlaB gerado contra PAO1 FlaB, e anticorpo policlonal imunoglobulina intravenosa humana (IVIG), e controle negativo (nenhum anticorpo).
[0092] A Figura 23 mostra o bloqueio da aderência de KP O5 6997 (origem: África do Sul) em células A549 (carcinoma pulmonar) por diferentes diluições de soro anti-FlaBD2-MrkA de coelho. O soro FIlaBD2-MrkA (pós-terceira imunização, P3) inibiu a ligação da cepa 6997 de Klebsiella às células A549 enquanto o soro pré-imune não o fez. Isso indica que o componente proteico MrkA do FlaBD2-MrkA FP foi devidamente dobrado e gerou anticorpos funcionais.
[0093] A Figura 24A mostra a proteção por anticorpos anti-PcrV de células A549 contra intoxicação citotóxica pela cepa PAK (O6:FIaA1) de Pseudomonas. Monocamadas de A549 foram infectadas com a cepa PAK (O6:FIaA1) de Pseudomonas por 4 horas na presença de soro 10% de coelhos (pool de 3) vacinados com uma proteína de fusão Ravi-FlaB- PcrV. O soro anti-Ravi-FlaB-PcrV (P3, após terceira imunização) protegeu as células da intoxicação pela cepa PAK de Pseudomonas quando comparado ao soro pré-imune, conforme visto por menos células redondas e destacadas. Figura 24B, células A549 de monocamadas foram infectadas com a cepa PAK de Pseudomonas por 4 horas na presença de soro de NCBO0O06 Ravi-FlaB-PcrV (pool de 3) em várias diluições. As células foram lavadas com PBS e incubadas por 1 hora com Vermelho Neutro. As células foram lisadas, e a absorbância do corante em cada cavidade foi registrada. O soro anti-Ravi-FlaB-PcrV (P3) protegeu as células de intoxicação citotóxica pela cepa PAK de
Pseudomonas em comparação ao soro pré-imune até uma diluição de 1 para 40.
[0094] A Figura 25 apresenta um ensaio de citotoxicidade utilizando células A549 e um soro anti-FlaB-PcrV de coelho (após a terceira imunização; P3) com várias cepas de Pseudomonas: com PA IATS O1 altamente tóxica (losango fechado), nenhuma proteção pelo soro contra citotoxicidade; com PA M2 O5 citotóxica (círculo fechado), nenhuma proteção pelo soro; com PA 17002 010 citotóxica (retângulo fechado), há proteção evidente pelo soro; com PA IATS O6 não citotóxica (triângulo fechado), sem toxicidade detectada.
[0095] A Figura 26 apresenta um gráfico de sobrevivência de Kaplan-Meier de camundongos que foram queimados e depois infectados com 28 unidades formadoras de colônias (CFU) da cepa M- 2 (O5) de Pseudomonas que expressa FlaB, administradas na ferida queimada. Nesse modelo, camundongos CD-1 receberam passivamente soro pré-imune de coelho e um soro anti-FlaB de coelho e foram infectados por simulação com solução com tampão fosfato (PBS) ou com a cepa M-2 de Pseudomonas em PBS. Os camundongos que receberam antissoro anti-FlaB ficaram protegidos (5/5 ou 100% de sobrevivência) por 10 dias ou mais do desafio na ferida com a cepa M- 2 de Pseudomonas, enquanto que todos os camundongos dos outros grupos, além daqueles infectados por simulação morreram do desafio na ferida.
[0096] A Figura 27 mostra a eliminação (clearance) e carga em órgãos no modelo de infecção por KP em camundongos. Os camundongos (CD1; grupos de 3) receberam passivamente por via intraperitoneal (IP) soro de coelho contra KPO1 BP-2a OPS-PRO-CN MAPS e, depois, foram desafiados por via intravenosa (IV) com a cepa KP B5055 O1: K2 (9x10º CFU) de Klebsiella. Números de KP viáveis no baço foram medidos 14 horas após o desafio. Houve uma redução nítida na contagem de KP viáveis no baço de camundongos que receberam o soro imune (P2) quando comparado ao baço de camundongos que receberam o soro pré-imune (PO). Esses dados indicam que o anticorpo contra OPS O1, gerado pela estrutura polimérica na vacina de MAPS variante, foi capaz de eliminar os organismos do tecido dos camundongos e, consequentemente, apresentava atividade protetora funcional in vivo.
[0097] A Figura 28 apresenta curva de sobrevivência de Kaplan- Meier para proteção passiva de camundongos que receberam soro de coelho contra KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS antes da infecção com a cepa B5055 (01: K2) de Klebsiella cultivada em salicilato para reduzir a expressão de cápsula. Camundongos CD1 (5/grupo) receberam 0,1 mL IP de um pool de soro imune (P2) ou pré-imune (PO) antes do desafio bacteriano IP com 2x 10º CFU da B5055 (O1: K2) de Klebsiella. São mostrados gráficos de sobrevivência de Kaplan-Meier de camundongos que receberam soro PO ou P2 KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS. O soro P2 protegeu no modelo com maior proporção de camundongos, que haviam recebido antissoro KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS, sobrevivendo e por um período prolongado de tempo em relação a camundongos que receberam soro PO.
[0098] A Figura 29 apresenta os resultados dos títulos finais de IgG contra OPS de KP por ELISA para soros agrupados de coelhos imunizados com vacina-1 12-valente contra KP/PA (5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina, grupo de tratamento 5) em comparação a uma vacina contra KP 4-valente (5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina, grupo de tratamento 4).
[0099] A Figura 30 apresenta os resultados dos títulos finais de IgG contra OPS PA por ELISA para soros agrupados de coelhos imunizados com vacina-1 12-valente contra KP/PA (5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina, grupo de tratamento 5) em comparação com uma vacina contra PA 8-valente (5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina, grupo de tratamento 4).
[00100] A Figura 31 apresenta os resultados dos títulos finais de IgG contra OPS PA por ELISA para soros agrupados de coelhos imunizados com vacina-1 12-valente contra KP/PA (p. ex., 60 ug de PS total na vacina; 5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina) em comparação com vacina-1 12-valente contra KP/PA (1 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina, grupo de tratamento 6).
[00101] A Figura 32 representa títulos individuais de IgG contra cada PS na vacina-1 12-valente contra KP/PA na dose de 5 ug (p. ex., 60 ug de PS total na vacina; 5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina).
[00102] A Figura 33 representa títulos individuais de IgG contra cada PS na vacina-1 12-valente contra KP/PA na dose de 1 ug dose (p. ex., 12 ug de PS total na; 1 ug de PS contribuído por cada tipo de BP na vacina).
[00103] A Figura 34 representa o aumento na indução de IgG individual anti-OPS para a vacina1 12-valente contra KP/PA na dose de
49.
[00104] A Figura35 mostra a comparação do aumento na indução de IgG individual anti-OPS para a vacina-1 12-valente contra KP/PA na dose de 5 ug de PS por BP e na dose de 1 ug de PS por BP.
[00105] A Figura 36 apresenta os resultados dos títulos finais de IgG contra OPS de PA e KP por ELISA para soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina-2 12-valente contra KP/PA na dose de 60 ug, 5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na dose da vacina (grupo de tratamento 1) em comparação com a vacina 12-valente contra KP/PA na dose de 12 ug, 1 ug de PS contribuído por cada tipo de BP na vacina (grupo de tratamento 2).
[00106] A Figura 37 representa títulos individuais de IgG contra cada
PS na vacina-2 12-valente contra KP/PA na dose de 5 ug.
[00107] A Figura 38 representa o aumento na indução de IgG individual anti-OPS para a vacina-2 12-valente contra KP/PA na dose de 5 ug.
[00108] A Figura 39 mostra uma análise por ELISA de IgG de coelho contra FIlaBD2 induzida pela administração de vacina-1 12-valente contra KP/PA, vacina-2 12-valente contra KP/PA, vacina 8-valente contra PA e vacina 4-valente contra KP.
[00109] A Figura 40 mostra uma análise por ELISA de IgG de coelho contra MrkA induzida pela administração de vacina-1 12-valente contra KP/PA, vacina-2 12-valente contra KP/PA, vacina 8-valente contra PA e vacina 4-valente contra KP.
[00110] A Figura 41 mostra uma análise por ELISA de IgG de coelho contra PcrV induzida pela administração de vacina-1 12-valente contra KP/PA.
[00111] A Figura 42 representa o aumento na indução de IgG anti- proteína de transporte pela administração de vacina-1 12-valente contra KP/PA, vacina-2 12-valente contra KP/PA, vacina 8-valente contra PA e vacina 4-valente contra KP.
[00112] A Figura 43 representa o aumento na indução de resposta contra FlaB, induzido pela administração de várias formulações vacinais em três estudos de imunogenicidade no coelho: NCBOO07, NCBO0O08 e NCB012.
[00113] A Figura 44 representa o aumento na indução de resposta contra MrkA, induzido pela administração de várias formulações vacinais em três estudos de imunogenicidade no coelho: NCBO007, NCB0O08 e NCB012.
[00114] A Figura 45 representa o aumento na indução de resposta contra PcrV, induzido pela administração de várias formulações vacinais em três estudos de imunogenicidade no coelho: NCBOO07, NCBOO08 e
NCB012.
[00115] A Figura 46 representa a ausência de bioatividade agonista de TLR5 exibida por proteínas de transporte contendo somente o domínio 2 de FlaB.
[00116] A Figura 47 apresenta os resultados de ensaio de OPK em neutrófilos humanos com KP O2 K - Cepa 7380.
[00117] A Figura 48A apresenta os resultados de um ensaio de internalização OPK com a linhagem celular de macrófagos J774 na presença de gentamicina. A Figura 48B apresenta os resultados de um ensaio de internalização OPK com a linhagem celular de macrófagos J774 na ausência de gentamicina.
[00118] A Figura 49 apresenta os resultados de ensaio de proteção por gentamicina de PA e KP opsonizados com soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente. Soro imune (P2) atua como mediador na internalização de bactérias por células J774 semelhantes a macrófagos enquanto o soro pré-imune (PO) não o faz.
[00119] A Figura 50 mostra a análise por microscopia da absorção de bactérias por células J774 semelhantes a macrófagos utilizando PA marcada com GFP. PA é avidamente internalizada após exposição ao soro imune.
[00120] A Figura 51 mostra que soros agrupados de coelhos que receberam uma dose de 5 ug da vacina-1 12-valente contra KP/PA (60 pg de PS total) promove a internalização bacteriana por células fagocitárias.
[00121] A Figura 52 representa o percentual de sobrevivência de células em um ensaio de OPK de HL60 com a cepa7380 de KP O2.
[00122] A Figura 53 apresenta os resultados de ensaios demonstrando que anticorpos contra PcrV protegem células de citotoxicidade. A cepa de PA (sem FlaB) misturada com soro imune 12- valente (pool de 10, alta dose da vacina-1) exibe citotoxicidade celular diminuída em comparação com soro pré-imune dos mesmos coelhos.
[00123] A Figura 54 demonstra que células tratadas com soros agrupados de coelhos imunizados com uma dose de 5 ug (p. ex., 60 ug de PS total na vacina; 5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina) da vacina-1 12-valente contra KP/PA mostram motilidade reduzida da cepa PA O5 FlaB através de anticorpos contra FlaB em comparação ao tratamento com soro pré-imune.
[00124] A Figura 55 mostra que soros agrupados de coelhos imunizados com uma vacina 4-valente contra KP (dose de 5 ug, grupo de tratamento 4), que não contém PA OPS, aumentou a agregação de PA expressando FlaB, demonstrando que o anticorpo gerado contra a proteína de transporte contendo FlaB é funcional.
[00125] A Figura 56 mostra que os soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA, soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina 8-valente contra PA (MrkA é o único antígeno de KP na vacina 8-valente contra PA) e soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina 4-valente contra KP bloqueiam a aderência da cepa 6997 de KP em células A549. Os dados sugerem que o anticorpo contra MrkA, induzido pela proteína de transporte FlaBD2-MrkA, é o responsável.
[00126] A Figura57 apresenta os resultados do ensaio de depuração sanguínea para 3 camundongos desafiados com a cepa B5055 de KP O1, uma hora e 4 horas após o desafio.
[00127] A Figura 58 mostra a carga em órgãos no fígado e baço de camundongos após o desafio com a cepa B5055 de KP O1.
[00128] A Figura 59 apresenta os resultados de depuração sanguínea para 3 camundongos desafiados com a cepa 6997 de KP O5, uma hora e 4 horas após o desafio.
[00129] A Figura 60 mostra a carga em órgãos no baço de camundongos após o desafio com KP OS5 (cepa 6997).
[00130] A Figura 61 apresenta a análise da proteção passiva contra carga em órgãos no baço de camundongos, demonstrando a depuração de KP O2 (cepa KPN-12) da circulação em camundongos tratados com soro de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA.
[00131] A Figura 62 apresenta vários protocolos exemplares de otimização e resultados de experimentos de proteção passiva de camundongos CD-1 com soro pré-imune e imune NCBO012 contra Klebsiella O2 K2.
[00132] A Figura 63 descreve a indução de IL-17a em células esplênicas estimuladas de camundongos imunizados com a vacina KP O1 MAPS seguido pelo desafio bacteriano com a cepa B5055 de KP O1:K2.
[00133] A Figura 64 descreve o protocolo de tratamento e resultados de um estudo de colonização do trato GI com PA O6 em ratos imunizados com duas doses de uma vacina PA O6 MAPS seguido por desafio bacteriano.
[00134] A Figura65 apresenta um desenho esquemático da estrutura dos epítopos OPS Gal-l, Gal-Il e Gal-1ll de KP.
[00135] A Figura 66 apresenta a ligação aos epítopos expressando KP D-Gal-lll e KP D-Gal-| por citometria de fluxo no antissoro de animais imunizados com uma vacina 4-valente PRO-CN MAPS contra KP.
[00136] A Figura67 descreve os resultados da análise por citometria de fluxo demonstrando que anticorpos em soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA ligaram-se a duas de três cepas ST258 de isolados de bacteremia e também se ligaram a três de quatro cepas de sorotipos não presentes na vacina com alelos mutantes de MrkA.
[00137] A Figura 68 apresenta títulos individuais de IgG anti-OPS após a imunização com a vacina 4-valente MAPS BP-1 (Grupo 1) e BP-
1.2 (Grupo 2) contra KP/PA.
[00138] A Figura 69 descreve a resposta de IgG à proteína de transporte, observada em uma comparação entre soros agrupados de MAPS BP-1 (Grupo 1) e MAPS BP-1.2 (Grupo 2).
[00139] A Figura 70 apresenta as respostas de anticorpos em soros individuais à proteína de transporte de FIlIaBD2 para BP-1 e BP-1.2 (KP/PA 4-valente) respectivamente
[00140] A Figura 71 apresenta as respostas de anticorpos em soros individuais à proteína de transporte de MrkA para BP-1 e BP-1.2 (KP/PA 4-valent) respectivamente. Definições
[00141] Neste pedido de patente, a menos que esclarecido de outra forma pelo contexto, (i) o termo "um" pode ser entendido como "pelo menos um"; (ii) o termo "ou" pode ser entendido como "e/ou"; (iii) os termos "compreendendo" e "incluindo" podem ser entendidos no sentido de abrangerem componentes ou etapas detalhados quer apresentados sozinhos ou juntos com um ou mais componentes ou etapas adicionais; e (iv) os termos "cerca de" e "aproximadamente" podem ser entendidos no sentido de permitir uma variação padrão, tal qual seriam entendidos por qualquer técnico no assunto; e (v) quando faixas são fornecidas, os limites são incluídos.
[00142] Aproximadamente: O termo "aproximadamente", quando usado em referência a um valor, refere-se a um valor que é semelhante, no contexto do valor citado. Em geral, os técnicos no assunto, familiarizados com o contexto, apreciarão o grau de variância relevante abrangido por "aproximadamente" naquele contexto. Por exemplo, em algumas modalidades, o termo "aproximadamente" pode abranger uma faixa de valores situados dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos do valor citado.
[00143] Administração: Neste relatório descritivo, o termo
"administração" tipicamente refere-se à administração de uma composição a um indivíduo ou de um sistema para a entrega de um agente que é, ou está incluído em, a composição. Os técnicos no assunto estarão cientes de uma variedade de vias que, nas circunstâncias adequadas, podem ser utilizadas para a administração a um indivíduo, por exemplo, um ser humano. Por exemplo, em algumas modalidades, a administração pode ser ocular, oral, parenteral, tópica, etc. Em algumas modalidades específicas, a administração pode ser brônquica (p. ex., por instilação brônquica), bucal, dérmica (que pode ser ou compreender, por exemplo, uma ou mais dentre tópica à derme, intradérmica, interdérmica, transdérmica, etc.), enteral, intra-arterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, dentro de um órgão específico (p. ex., intra-hepática), mucosa, nasal, oral, retal, subcutânea, sublingual, tópica, traqueal (p. ex, por instilação intratraqueal), vaginal, vítrea, etc. Em algumas modalidades, a administração pode envolver somente uma dose única. Em algumas modalidades, a administração pode envolver a aplicação de um número fixo de doses. Em algumas modalidades, a administração pode envolver doses intermitentes (p. ex., uma pluralidade de doses separadas no tempo) e/ou periódicas (p. ex., doses individuais separadas por um período de tempo comum). Em algumas modalidades, a administração pode envolver administração contínua (p. ex., perfusão) por pelo menos um período de tempo selecionado.
[00144] Agente: Em geral, o termo "agente", neste relatório descritivo, pode ser usado para se referir a um composto ou entidade de qualquer classe química incluindo, por exemplo, um polipeptídeo, ácido nucleico, sacarídeo, lipídio, molécula pequena, metal ou uma combinação ou complexo dos mesmos. Nas circunstâncias adequadas, como ficará claro a partir do contexto para os técnicos no assunto, o termo pode ser utilizado para se referir a uma entidade que é ou compreende uma célula ou organismo, ou uma fração, extrato ou componente destes. Alternativa ou adicionalmente, conforme esclarecido pelo contexto, o termo pode ser usado para se referir a um produto natural pelo fato de ser encontrado e/ou obtido na natureza. Em alguns casos, novamente como será esclarecido pelo contexto, o termo pode ser usado para se referir a uma ou mais entidades que são feitas pelo homem pelo fato de serem projetadas, construídas e/ou produzidas por ação da mão do homem e/ou de não serem encontradas na natureza. Em algumas modalidades, um agente pode ser utilizado em forma isolada ou pura; em algumas modalidades, um agente pode ser utilizado em forma bruta. Em algumas modalidades, agentes potenciais podem ser fornecidos como coleções ou bibliotecas, por exemplo, que podem ser rastreadas para identificar ou caracterizar agentes ativos nas mesmas. Em alguns casos, o termo "agente" pode referir-se a um composto ou entidade que é ou compreende um polímero; em alguns casos, o termo pode referir-se a um composto ou entidade que compreende uma ou mais porções poliméricas. Em algumas modalidades, o termo "agente" pode referir-se a um composto ou entidade que não é um polímero e/ou é substancialmente livre de qualquer polímero e/ou de uma ou mais porções poliméricas em particular. Em algumas modalidades, o termo pode referir-se a um composto ou entidade desprovido ou que é substancialmente livre de qualquer porção polimérica.
[00145] Aminoácido: em seu sentido mais amplo, o termo "aminoácido", neste relatório descritivo, refere-se a qualquer composto e/ou substância que pode ser incorporada em uma cadeia polipeptídica, p. ex., através da formação de uma ou mais ligações peptídicas. Em algumas modalidades, um aminoácido possui a estrutura geral HoN- C(H)(R)- COOH. Em algumas modalidades, um aminoácido é um aminoácido natural. Em algumas modalidades, um aminoácido é um aminoácido não natural; em algumas modalidades, um aminoácido é um D-aminoácido; em algumas modalidades, um aminoácido é um L-aminoácido. "Aminoácido padrão" refere-se a qualquer um dos vinte L-aminoácidos padrão comumente encontrados em peptídeos naturais. "Aminoácido não padrão" refere-se a qualquer aminoácido, excluindo os aminoácidos — padrão, independentemente de ser preparado sinteticamente ou obtido de uma fonte natural. Em algumas modalidades, um aminoácido, incluindo um aminoácido carboxi- e/ou amino-terminal em um polipeptídeo, pode conter uma modificação estrutural em comparação a estrutura geral acima. Por exemplo, em algumas modalidades, um aminoácido pode ser modificado por metilação, amidação, acetilação, peguilação, glicosilação, fosforilação e/ou substituição (p. ex., do grupo amino, do grupo carboxílico, de um ou mais prótons e/ou do grupo hidroxila) em comparação à estrutura geral. Em algumas modalidades, tal modificação pode, por exemplo, alterar a meia-vida circulante de um polipeptídeo contendo o aminoácido modificado em comparação àquele contendo um aminoácido idêntico do contrário não modificado. Em algumas modalidades, tal modificação não altera significativamente uma atividade relevante de um polipeptídeo contendo o aminoácido modificado, em comparação àquele contendo um aminoácido idêntico do contrário não modificado. Tal qual ficará claro pelo contexto, em algumas modalidades, o termo "aminoácido" pode ser usado para se referir a um aminoácido livre; em algumas modalidades, pode ser usado para se referir a um resíduo de aminoácido de um polipeptídeo.
[00146] —Anticorpo: Neste relatório descritivo, o termo "anticorpo" refere-se a um polipeptídeo que inclui elementos canônicos da sequência de imunoglobulinas suficientes para conferir ligação específica a um determinado antígeno alvo. Tal qual conhecido na técnica, anticorpos intactos como produzidos na natureza são agentes tetraméricos de aproximadamente 150 kDa, compostos por dois polipeptídeos idênticos de cadeia pesada (aproximadamente 50 kDa cada) e dois polipeptídeos idênticos de cadeia leve (aproximadamente kDa cada) que se associam entre si naquilo que é comumente referido como uma estrutura "em forma de Y". Cada cadeia pesada é composta por pelo menos quatro domínios (cada um com aproximadamente 110 aminoácidos de comprimento) - um domínio variável (VH) amino-terminal (localizado nas pontas da estrutura em Y), seguido por três domínios constantes: CH1, CH2 e o CH3 carboxi- terminal (localizado na base da haste do Y). Uma região curta, conhecida como o "switch", conecta a região variável da cadeia pesada e as regiões constantes.
O "hinge" conecta os domínios CH2 e CH3 ao resto do anticorpo.
Duas ligações dissulfeto nessa região hinge (dobradiça) conectam os dois polipeptídeos da cadeia pesada um ao outro em um anticorpo intacto.
Cada cadeia leve é composta por dois domínios — um domínio variável amino-terminal (VL), seguido por um domínio constante carbóxi-terminal (CL), separados um do outro por outro "switch". Os tetrâmeros do anticorpo intacto são compostos por dois dímeros de cadeia pesada-cadeia leve, em que as cadeias leves e pesadas são unidas umas às outras por uma única ligação dissulfeto; duas outras ligações dissulfeto conectam as regiões hinge da cadeia pesada uma à outra, de modo que os dímeros estão conectados um ao outro e o tetrâmero é formado.
Anticorpos produzidos naturalmente não também glicosilados, tipicamente no domínio CH2. Cada domínio em um anticorpo natural possui uma estrutura caracterizada por uma "dobra de imunoglobulina" formada por duas folhas beta (p. ex., folhas de 3, 4 ou 5 fitas) embrulhada uma contra a outra em um barril beta antiparalelo comprimido.
Cada domínio variável contém três alças hipervariáveis conhecidas como "regiões determinantes de complementaridade"
(CDR1, CDR2, e CDR3) e quatro regiões "framework" (arcabouço) (FR1, FR2, FR3, e FR4) um pouco invariáveis.
Quando anticorpos naturais se dobram, as regiões FR formam as folhas beta que fornecem o arcabouço estrutural para os domínios, e as regiões de alças com CDR das cadeias pesadas e leves são aproximadas no espaço tridimensional de modo que criam um único sítio hipervariável de ligação ao antígeno localizado na ponta da estrutura em Y.
A região Fc de anticorpos naturais liga-se a elementos do sistema complemento, e também a receptores em células efetoras, incluindo, por exemplo, células efetoras que medeiam a citotoxicidade.
Tal qual é conhecido na técnica, a afinidade e/ou outros atributos de ligação de regiões Fc por receptores Fc podem ser modulados através de glicosilação ou outra modificação.
Em algumas modalidades, anticorpos produzidos e/ou utilizados de acordo com a presente invenção incluem domínios Fc glicosilados, entre os quais domínios Fc com tal glicosilação modificada ou construída.
Para fins da presente invenção, em certas modalidades, qualquer polipeptídeo ou complexo de polipeptídeos que inclua sequências suficientes de domínios de imunoglobulinas como encontradas em anticorpos naturais podem ser referidos e/ou usados como um "anticorpo", quer tal polipeptídeo seja produzido naturalmente (p. ex., gerado por um organismo em reação a um antígeno), ou produzido por engenharia recombinante, síntese química ou outro sistema artificial ou metodologia.
Em algumas modalidades, um anticorpo é policlonal; em algumas modalidades, um anticorpo é monoclonal.
Em algumas modalidades, um anticorpo possui sequências de região constante que são características de anticorpos de camundongo, coelho, primata ou humanos.
Em algumas modalidades, elementos da sequência do anticorpo são humanizados, primatizados, quiméricos, etc., tal qual é conhecido na técnica.
Além disso, o termo "anticorpo", neste relatório descritivo, pode referir-se em modalidades adequadas (a menos que declarado ou esclarecido de outra forma pelo contexto) a qualquer uma das construções conhecidas na técnica ou desenvolvidas ou formatos para utilizar características estruturais e funcionais do anticorpo em apresentação alternativa. Por exemplo, modalidades, um anticorpo utilizado de acordo com a presente invenção está em um formato selecionado a partir de, entre outros, anticorpos intactos IgA, IgG, IgE ou IgM; anticorpos bi- ou multi-específicos (p. ex., Zybodiesº, etc.); fragmentos de anticorpos como fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd', fragmentos Fd e CDRs isoladas ou conjuntos das mesmas; Fvs de cadeia única; fusões polipeptídeo-Fc; anticorpos de domínio único (p. ex., anticorpos de domínio único de tubarão como IgNAR ou fragmentos do mesmo); anticorpos camelídeos; anticorpos mascarados (p. ex., Probodiesº); Small Modular ImmunoPharmaceuticals ("SMIPST'Y); diabodies de cadeia única ou em tandem (TandAbº); VHHs; Anticalinsº; Nanobodiesº minibodies; BiTEºs; proteínas com repetições de anquirina ou DARPINsºE; Avimersº; DARTs; anticorpos semelhantes a TCR; Adnectinsº; — Affiinsº; Trans-bodiesº; Affibodiesº; TrimerXº; Microproteínas; Fynomersº, Centyrinsº; e KALBITORºs. Em algumas modalidades, um anticorpo pode não ter uma modificação covalente (p. ex., ligação de um glicano) que teria caso fosse produzido naturalmente. Em algumas modalidades, um anticorpo pode conter uma modificação covalente (p. ex., ligação de um glicano, um payload [p. ex., uma porção detectável, uma porção terapêutica, uma porção catalítica, etc.], ou outro grupo pendente [p. ex., polietilenoglicol, etc.]
[00147] —Antígeno: O termo "antígeno", neste relatório descritivo, refere-se a (i) um agente que gera uma resposta imune; e/ou (ii) um agente que se liga a um receptor de células T (p. ex., quando apresentados por uma molécula MHC) ou a um anticorpo. Em algumas modalidades, um antígeno gera uma resposta humoral (p. ex., incluindo a produção de anticorpos antígeno-específicos); em algumas modalidades, um antígeno gera uma resposta celular (p. ex, envolvendo células T cujos receptores interagem especificamente com o antígeno). Em algumas modalidades, um antígeno gera uma resposta humoral e uma resposta celular. Em algumas modalidades, um antígeno liga-se a um anticorpo e pode induzir ou não induzir uma determinada resposta fisiológica em um organismo. Em geral, um antígeno pode ser ou incluir qualquer entidade química como, por exemplo, uma molécula pequena, um ácido nucleico, um polipeptídeo, um carboidrato, um lipídio, um polímero (em algumas modalidades diferente de um polímero biológico (p. ex., diferente de um ácido nucleico ou polímero de aminoácidos)), etc. Em algumas modalidades, um antígeno é ou compreende um polipeptídeo. Em algumas modalidades, um antígeno é ou compreende um polissacarídeo. Os técnicos na área apreciará que, em geral, um antígeno pode ser fornecido em forma isolada ou pura ou, alternativamente, pode ser fornecido em forma bruta (p. ex., junto com outros materiais, por exemplo, em um extrato tal como um extrato celular ou outro preparado relativamente bruto de uma fonte contendo um antígeno). Em algumas modalidades, os antígenos utilizados de acordo com a presente invenção são fornecidos em forma bruta. Em algumas modalidades, um antígeno é um antígeno recombinante.
[00148] Relacionada com: Duas entidades são "relacionadas" uma com a outra, como esse termo é usado no presente, se a presença, o nível e/ou a forma de uma está correlacionado com aquele da outra. Em algumas modalidades, duas ou mais entidades são fisicamente "relacionadas" uma com a outra se interagirem, direta ou indiretamente, de modo que estejam e/ou permaneçam em proximidade física uma com a outra. Em algumas modalidades, duas ou mais entidades que são fisicamente relacionadas umas com as outras estão ligadas covalentemente uma à outra; em algumas modalidades, duas ou mais entidades que são fisicamente relacionadas umas com as outras não estão ligadas covalentemente uma à outra, mas são relacionadas não covalentemente, por exemplo, por meio de interações por afinidade, ligações de hidrogênio, interação de van der Waals, interações hidrofóbicas, magnetismo e combinações dos mesmos.
[00149] Estrutura polimérica: Neste relatório descritivo, o termo "estrutura polimérica" refere-se a um polímero ao qual um ou mais polissacarídeos (p. ex., polissacarídeos antigênicos) são ou podem ser conjugados. Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica é um polímero e um ou mais polissacarídeos (p. ex., polissacarídeos antigênicos) conjugados à polímero.
[00150] Ligação: Será entendido que o termo "ligação", neste relatório descritivo, refere-se tipicamente a uma associação não covalente entre duas ou mais entidades. A ligação "direta" envolve o contato físico entre entidades ou porções; a ligação indireta envolve a interação física por meio do contato físico com uma ou mais entidades intermediárias. A ligação entre duas ou mais entidades pode ser avaliada tipicamente em qualquer um de uma variedade de contextos — incluindo quando entidades ou porções interagindo são estudadas em isolamento ou no contexto de sistemas mais complexos (p. ex, enquanto relacionadas covalentemente ou não com uma entidade transportadora e/ou em um sistema biológico ou célula.
[00151] Proteína de transporte: Neste relatório descritivo, o termo "proteína de transporte" refere-se a uma proteína ou peptídeo que gera ou melhora uma resposta imune a um hapteno acoplado ou complexado. Em algumas modalidades, uma resposta imune gerada ou melhorada por uma proteína de transporte é uma resposta ao hapteno. Em algumas modalidades, não ocorre resposta significativa à própria proteína de transporte; em algumas modalidades, pode ser detectada resposta à proteína de transporte. Em algumas modalidades, uma proteína de transporte é complexada com uma ou mais outras moléculas.
[00152] Química click: Neste relatório descritivo, o termo "química click" refere-se a uma reação rápida e com alto rendimento, p. ex., como descrito por K. B. Sharpless em 2001. Em algumas modalidades, uma reação de química click cria subprodutos que podem ser removidos sem cromatografia. Em algumas modalidades, uma reação de química click somente cria subprodutos que podem ser removidos sem cromatografia. Em algumas modalidades, uma reação de química click é estereoespecífica. Em algumas modalidades, uma reação de química click pode ser conduzida utilizando um ou mais solventes facilmente removíveis. Em algumas modalidades, uma reação de química click pode ser conduzida utilizando um ou mais solventes benignos. Em algumas modalidades, uma reação de química click utiliza uma reação de cicloadição de azida-alcino catalisada por cobre para conectar uma ou mais entidades moleculares. Em algumas modalidades, uma ou mais das entidades moleculares não são limitadas pelo tamanho molecular. Em algumas modalidades, uma reação de química click pode ser bio- ortogonal; p. ex., nem os reagentes nem os grupos funcionais de seus produtos interagem com biomoléculas funcionalizadas e/ou a reação prossegue com facilidade sob condições não tóxicas leves, tais como à temperatura ambiente e, de preferência, em água. Em algumas modalidades, uma reação de química click pode ser a cicloadição de Huisgen catalisada por cobre, a cicloadição [3+2] dipolar de azida- alcino, a ligação de Staudinger ou a ligação azida-fosfina. Em algumas modalidades, a química click pode ser usada para unir dois biopolímeros (p. ex., dois ácidos nucleicos, ou um ácido nucleico e uma proteína ou um peptídeo ou dois glicopolímeros, etc.).
[00153] Colonização (p. ex., de mucosa ou trato GI): Neste relatório descritivo, o termo "colonização" refere-se à capacidade de um micróbio para estabelecer um nicho em um sítio anatômico, p. ex, uma membrana mucosa, sítio de lesão, órgão, etc.
[00154] Terapia combinada: Neste relatório descritivo, o termo "terapia combinada" refere-se àquelas situações em que um indivíduo é exposto simultaneamente a dois ou mais esquemas terapêuticos (p. ex., dois ou mais agentes terapêuticos). Em algumas modalidades, os dois ou mais esquemas podem ser administrados simultaneamente; em algumas modalidades, tais esquemas podem ser administrados sequencialmente (p. ex., todas as "doses" de um primeiro esquema são administradas antes que quaisquer doses de um segundo esquema); em algumas modalidades, tais agentes são administrados em esquemas de administração que se sobrepõem. Em algumas modalidades, a "administração" da terapia combinada pode envolver a administração de um ou mais agente(s) ou modalidade(s) a um indivíduo que que recebe o(s) outro(s) agente(s) ou modalidade(s) na combinação. Para maior clareza, terapia combinada não requer que os agentes individuais sejam administrados juntos em uma única composição (ou mesmo necessariamente ao mesmo tempo), embora, em algumas modalidades, dois ou mais agentes, ou suas porções ativas, possam ser administrados juntos em uma composição combinada ou mesmo em um composto combinado (p. ex., como parte de um único complexo químico ou entidade covalente).
[00155] “Composição: Os técnicos no assunto apreciarão que o termo "composição", neste relatório descritivo, pode ser usado para se referir a uma entidade física distinta que compreende um ou mais componentes especificados. Em geral, a menos que especificado de outra forma, uma composição pode ser de qualquer forma — p. ex., gás, gel, líquido, sólido, etc.
[00156] Derivado: Neste relatório descritivo, o termo "derivado" refere-se a um análogo estrutural de uma substância de referência. Ou seja, um "derivado" é uma substância que exibe similaridade estrutural significativa com a substância de referência, por exemplo, compartilham um núcleo ou estrutura consenso, mas também diferem em certos modos distintos. Em algumas modalidades, um derivado é uma substância que pode ser gerada a partir da substância de referência por manipulação química. Em algumas modalidades, um derivado é uma substância que pode ser gerada pela execução de um processo sintético substancialmente semelhante (p. ex., com o qual compartilha uma pluralidade de etapas) àquele que gera a substância de referência.
[00157] “Domínio: O termo "domínio", neste relatório descritivo, refere-se a uma seção ou porção de uma entidade. Em algumas modalidades, um "domínio" está relacionado com uma determinada característica estrutural e/ou funcional da entidade de modo que, quando é fisicamente separado do resto de sua entidade original, o domínio retém substancial ou inteiramente a determinada característica estrutural e/ou funcional. Alternativa ou adicionalmente, um domínio pode ser ou incluir uma porção de uma entidade que, quando separada daquela entidade (original) e ligada a uma entidade diferente (receptor), retém substancialmente e/ou transfere para a entidade receptora uma ou mais características estruturais e/ou funcionais que a caracterizavam na entidade original. Em algumas modalidades, um domínio é uma seção ou porção de uma molécula (p. ex., uma molécula pequena, carboidrato, lipídio, ácido nucleico ou polipeptídeo). Em algumas modalidades, um domínio é uma seção de um polipeptídeo; em algumas de tais modalidades, um domínio é caracterizado por um determinado elemento estrutural (p. ex., uma determinada sequência de aminoácidos ou motivo da sequência, caráter de hélice a, caráter de folha B, caráter de espiral enrolada, caráter de espiral aleatória, etc.) e/ou por uma determinada característica funcional (p. ex., atividade de ligação, atividade enzimática, atividade de dobramento, atividade de sinalização,
etc.).
[00158] Forma farmacêutica ou forma de dose unitária: Os técnicos no assunto apreciarão que o termo "forma farmacêutica" pode ser usado para referir-se a uma unidade fisicamente distinta de um agente ativo (p. ex., um agente terapêutico ou diagnóstico) a ser administrado a um indivíduo. Tipicamente, cada um de tais unidades contém uma quantidade predeterminada de agente ativo. Em algumas modalidades, tal quantidade é uma quantidade de dose unitária (ou uma fração inteira desta) adequada para administração de acordo com um esquema posológico que se determinou correlacionar-se com um resultado desejado ou benéfico quando administrada a uma população relevante (ou seja, com um esquema terapêutico de administração). Os técnicos no assunto reconhecem que a quantidade total de uma composição ou agente terapêutico, administrada a um determinado indivíduo, é determinada por um ou mais médicos atendentes e pode envolver a administração de formas farmacêuticas múltiplas.
[00159] Esquema de administração: Os técnicos no assunto apreciarão que o termo "esquema de administração" pode ser usado para se referir a um conjunto de doses unitárias (tipicamente mais de uma) que são administradas individualmente a uma pessoa, tipicamente separado por períodos de tempo. Em algumas modalidades, um dado agente terapêutico tem um esquema de administração recomendado, o qual pode envolver uma ou mais doses. Em algumas modalidades, um esquema de administração compreende uma pluralidade de doses, cada qual separada no tempo de outras doses. Em algumas modalidades, as doses individuais são separadas uma da outra por um período de tempo de mesma extensão; em algumas modalidades, um esquema de administração compreende uma pluralidade de doses e pelo menos dois períodos diferentes de tempo separado as doses individuais. Em algumas modalidades, todas as doses em um esquema de administração são da mesma quantidade de dose unitária. Em algumas “modalidades, doses diferentes em um esquema de administtação são de quantidades diferentes. Em algumas modalidades, um esquema de administração compreende uma primeira dose em uma primeira quantidade de dose, seguida por uma ou mais doses adicionais em uma segunda quantidade de dose diferente da quantidade da primeira dose. Em algumas modalidades, um esquema de administração compreende uma primeira dose em uma primeira quantidade de dose, seguida por uma ou mais doses adicionais em uma segunda quantidade de dose igual à quantidade da primeira dose. Em algumas — modalidades, um esquema de administração está correlacionado com um resultado desejado ou benéfico quando administrado em uma população relevante (ou seja, é um esquema terapêutico de administração).
[00160] Epítopo: Neste relatório descritivo, o termo "epítopo" inclui qualquer porção que é reconhecida especificamente por um componente de ligação de uma imunoglobulina (p. ex., anticorpo ou receptor). Em algumas modalidades, um epítopo é composto por uma pluralidade de átomos ou grupos químicos em um antígeno. Em algumas modalidades, tais átomos ou grupos químicos são expostos na superfície quando o antígeno adota uma conformação tridimensional pertinente. Em algumas modalidades, tais átomos ou grupos químicos estão fisicamente próximos uns dos outros no espaço quando o antígeno adota tal conformação. Em algumas modalidades, pelo menos alguns de tais átomos químicos são grupos que estão fisicamente separados uns dos outros quando o antígeno adopta uma conformação alternativa (p. ex., é linearizado).
[00161] Exopolissacarídeo: O termo "exopolissacarídeo", neste relatório descritivo, refere-se a polímeros naturais de alto peso molecular, compostos por resíduos de açúcar e secretados por microrganismos em seus ambiente. Exopolissacarídeos podem ser referidos alternadamente como polissacarídeos extracelulares (EPSs). Os EPSs estabelecem a integridade funcional e estrutural de biofilmes, e são considerados o componente fundamental que determina as propriedades físico-químicas de um biofilme. EPSs constituem 50% a 90% da matéria orgânica total de um biofilme.
[00162] Fragmento: Um "fragmento" de um material ou entidade como aqui descrita possui uma estrutura que inclui uma porção distinta do todo, mas sem uma ou mais porções encontradas no inteiro. Em algumas modalidades, um fragmento consiste em tal porção distinta. Em algumas modalidades, um fragmento inclui uma porção distinta do inteiro, sendo que a porção distinta compartilha uma ou mais características funcionais encontradas no inteiro. Em algumas modalidades, um fragmento consiste em tal porção distinta. Em algumas modalidades, um fragmento consiste ou compreende um elemento estrutural característico ou porção encontrado no inteiro. Em algumas modalidades, um fragmento de polímero compreende ou consiste em pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ou mais unidades monoméricas (p. ex., resíduos) encontradas no polímero inteiro. Em algumas modalidades, um fragmento de polímero compreende ou consiste em pelo menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais das unidades monoméricas (p. ex., resíduos) encontradas no polímero inteiro. O material ou a entidade inteiro pode, em algumas modalidades, ser referido como o "original" do inteiro.
[00163] “Homologia: Neste relatório descritivo, o termo "homologia"
refere-se à relação global entre moléculas poliméricas, p. ex., entre moléculas de ácido nucleico (p. ex., moléculas de DNA e/ou moléculas de RNA) e/ou entre moléculas de polipeptídeos. Em algumas modalidades, moléculas poliméricas são consideradas "homólogas" uma com a outra se as suas sequências forem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas. Em algumas modalidades, moléculas poliméricas são consideradas "homólogas" uma com a outra se as suas sequências forem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% semelhante.
[00164] Identidade: Neste relatório descritivo, o termo "identidade" refere-se à relação global entre moléculas poliméricas, p. ex., entre moléculas de ácido nucleico (p. ex., moléculas de DNA e/ou moléculas de RNA) e/ou entre moléculas de polipeptídeos. Em algumas modalidades, moléculas poliméricas são consideradas "substancialmente idênticas" entre si se as suas sequências forem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas. O cálculo do percentual de identidade de duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, por exemplo, pode ser realizado alinhando as duas sequências para fins de comparação ótima (p. ex., lacunas (gaps) podem ser introduzidas em uma ou em ambas de uma primeira e uma segunda sequência para alinhamento ótimo e sequências não idênticas podem ser desconsideradas para fins comparativos). Em certas modalidades, o comprimento de uma sequência alinhada para fins comparativos é pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou substancialmente 100% do comprimento de uma sequência de referência. Os nucleotídeos em posições correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo (p. ex., nucleotídeo ou aminoácido) que na posição correspondente da segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição. O percentual de identidade entre as duas sequências é em função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em conta o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzido para alinhamento ótimo entre as duas sequências. A comparação de sequências e a determinação do percentual de identidade entre duas sequências podem ser realizadas utilizando um algoritmo matemático. Por exemplo, o percentual de identidade entre duas sequências nucleotídicas pode ser determinado utilizando o algoritmo de Meyers e Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17), o qual foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0). Em algumas modalidades exemplares, as comparações entre sequências de ácido nucleico feitas com o programa ALIGN utilizando uma tabela PAM120 de resíduos ponderados, uma penalidade por comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade por lacuna de 4. O percentual de identidade entre duas sequências nucleotídicas pode ser determinado, alternativamente, utilizando o programa GAP no pacote de softwares GCG utilizando uma matriz NWSgapdna.CMP.
[00165] "Melhorar", "aumentar", "inibir" ou "reduzir": Neste relatório descritivo, os termos "melhorar", "aumentar", "inibir, "reduzir" ou equivalentes gramaticais dos mesmos indicam valores que são relativos em relação a um basal ou outra medição de referência. Em algumas modalidades, uma medição de referência adequada pode ser ou compreender uma medição em um sistema particular (p. ex., em um único indivíduo) sob a presença de condições do contrário comparáveis ausentes (p. ex., antes e/ou depois) de um agente ou tratamento em particular, ou na presença de um agente de referência comparável adequado. Em algumas modalidades, uma medição de referência adequada pode compreender uma medição em um sistema comparável conhecido por ou que se prevê responda de uma maneira em particular, na presença do agente ou tratamento pertinente.
[00166] Isolado: Neste relatório descritivo, referesse a uma substância e/ou entidade que foi (1) separada de pelo menos alguns dos componentes com os quais estava associada quando inicialmente produzida (seja na natureza e/ou em um contexto experimental) e/ou (2) projetada, produzida, preparada e/ou fabricada pela mão do homem. Substâncias e/ou entidades isoladas podem ser separadas de aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 291%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% ou mais de aproximadamente 99% dos outros componentes com os quais estavam inicialmente associadas. Em algumas modalidades, agentes isolados são aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 294%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% ou mais de aproximadamente 99% puros. Neste relatório descritivo, uma substância é "pura" se for substancialmente livre dos outros componentes. Em algumas modalidades, como será entendido pelos técnicos no assunto, uma substância pode ser ainda considerada "isolada" ou mesmo "pura", após ter sido combinada com certos outros componentes como, por exemplo, um ou mais veículos ou excipientes (p. ex., tampão, solvente, água, etc.); em tais modalidades, o percentual de isolamento ou pureza da substância é calculado sem incluir tais veículos ou excipientes. Para fornecer um exemplo, em algumas modalidades, um polímero biológico, tal como um polipeptídeo ou polinucleotídeo, que ocorre na natureza é considerado "isolado" quando, a) em virtude de sua origem ou fonte de derivação, não está associado com alguns ou todos os componentes que o acompanham em seu estado nativo na natureza; b) é substancialmente livre de outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos da mesma espécie que a espécie que o produz na natureza; c) é expresso por ou está do contrário em associação com componentes de uma célula ou outro sistema de expressão que não é da espécie que o produz na natureza. Assim, por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo que é sintetizado quimicamente ou é sintetizado em um sistema celular diferente daquele que o produz na natureza é considerado um polipeptídeo "isolado". Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, um polipeptídeo que foi submetido a uma ou mais técnicas de purificação pode ser considerado um polipeptídeo "isolado" desde que tenha sido separado de outros componentes a) com os quais está associado na natureza; e/ou b) com os quais estava associado quando produzido inicialmente.
[00167] Ligante: Neste relatório descritivo, é usado para se referir àquela porção de um agente com múltiplos elementos que conecta elementos diferentes uns aos outros. Por exemplo, os técnicos no assunto reconhecem que um polipeptídeo cuja estrutura inclui dois ou mais domínios funcionais ou organizacionais frequentemente inclui um trecho de aminoácidos entre tais domínios que os liga entre si. Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo um elemento ligante possui uma estrutura global da forma geral S1-L-S2, em que S1 e S2 podem ser iguais ou diferentes e representam dois domínios associados um ao outro pelo ligante. Em algumas modalidades, um linker polipeptídico tem pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, um ligante é caracterizado pelo fato de que tende não adotar uma estrutura tridimensional rígido, mas em vez disso proporciona flexibilidade ao polipeptídeo. Vários elementos ligantes diferentes que podem ser adequadamente usados quando se projetam polipeptídeos (p. ex., polipeptídeos de fusão) são conhecidos na técnica (Holliger et a/., 1993; Poljak, 1994).
[00168] Composição farmacêutica: Neste relatório descritivo, o termo "composição farmacêutica" refere-se a uma composição na qual um agente ativo é formulado junto com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, o agente ativo está presente em uma quantidade de dose unitária adequada para administtação em um esquema terapêutico que mostra uma probabilidade estatisticamente significante de alcançar um efeito terapêutico predeterminado quando administrada a uma população relevante. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser especialmente formulada para administração em forma sólida ou líquida, incluindo aquelas adaptadas para o seguinte: administração oral, por exemplo, soluções de nutrientes (soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas), comprimidos, p. ex., aqueles destinados para absorção bucal, sublingual, e sistêmica, bolo, pós, grânulos, pastas para aplicação à língua; administração parenteral, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural em, por exemplo, solução ou suspensão estéril, ou formulação de liberação sustentada; aplicação tópica, por exemplo, em creme, pomada, ou adesivo de liberação controlada ou spray aplicado à pele, aos pulmões ou à cavidade oral; via intravaginal ou intra-retal, por exemplo, como preçário, creme ou espuma; via sublingual; via ocular; via transdérmica;
ou via nasal, pulmonar e à superfície de outras mucosas.
[00169] Farmaceuticamente aceitável: Neste relatório descritivo, o termo "farmaceuticamente aceitável" aplicado ao veículo, diluente ou excipiente usado para formular uma composição como aqui revelada significa que o veículo, diluente ou excipiente deve ser compatível com os outros ingredientes da composição e não prejudiciais ao receptor da mesma.
[00170] Polissacarídeo: O termo "polissacarídeo", neste relatório descritivo, refere-se a uma molécula polimérica de carboidrato composta por cadeias longas de unidades de monossacarídeo unidas por ligações glicosídicas e que, na hidrólise, fornecem os monossacarídeos ou oligossacarídeos constituintes. Os polissacarídeos variam em estrutura de linear a altamente ramificada. Os exemplos incluem polissacarídeos de depósito, como amido e glicogênio, polissacarídeos estruturais, como celulose e quitina, e polissacarídeos antigênicos encontrados em microrganismos incluindo, entre outros, OPS, CPS, COPS e LPS.
[00171] Prevenir ou prevenção: Neste relatório descritivo, quando usados em conexão com a ocorrência de uma doença, transtorno e/ou condição, prevenir ou prevenção refere-se a reduzir o risco de desenvolver a doença, transtorno e/ou condição e/ou a retardar o início de uma ou mais características ou sintomas da doença, transtorno ou condição. A prevenção pode ser considerada completa quando o início de uma doença, transtorno ou condição foi retardado por um período de tempo predefinido.
[00172] Proteína: Neste relatório descritivo, o termo "proteína" refere- se a um polipeptídeo (ou seja, uma cadeia com pelo menos dois aminoácidos unidos um ao outro por ligações peptídicas). As proteínas podem incluir porções além de aminoácidos (p. ex, podem ser glicoproteínas, proteoglicanos, etc.) e/ou podem ser de outra forma processadas ou modificadas. Os técnicos no assunto apreciarão que uma "proteína" pode ser uma cadeia polipeptídica completa como produzida por uma célula (com ou sem uma sequência sinal), ou pode ser uma parte característica da mesma. Os técnicos no assunto reconhecerão que uma proteína pode às vezes incluir mais de uma cadeia polipeptídica, por exemplo, unidas por uma ou mais ligações dissulfeto ou associadas por outros meios. Os polipeptídeos podem conter L-aminoácidos, D-aminoácidos, ou ambos, e podem conter qualquer uma de várias modificações em aminoácidos ou análogos conhecidos na técnica. As modificações úteis incluem, p. ex., acetilação terminal, amidação, metilação, etc. Em algumas modalidades, as proteínas podem compreender aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, aminoácidos sintéticos e combinações dos mesmos. O termo "peptídeo" é geralmente usado para se referir a um polipeptídeo medindo menos de aproximadamente 100 aminoácidos, menos de aproximadamente 50 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos ou menos de 10 aminoácidos. Em algumas modalidades, as proteínas são anticorpos, fragmentos de anticorpos, porções biologicamente ativas e/ou porções características dos mesmos.
[00173] Polipeptídeo: O termo "polipeptídeo", neste relatório descritivo, geralmente possui seu significado reconhecido na técnica de um polímero com pelo menos três aminoácidos. Os técnicos no assunto apreciarão que o termo "polipeptídeo" destina-se a ser suficientemente generalizado para abranger não só polipeptídeos com uma sequência completa aqui recitada, mas também abranger polipeptídeos que representam fragmentos funcionais (ou seja, fragmentos retendo pelo menos uma atividade) de tais polipeptídeos completos. Além disso, os técnicos no assunto entendem que as sequências proteicas em geral toleram alguma substituição sem destruir a atividade. Assim, qualquer polipeptídeo que retenha atividade e compartilhe pelo menos cerca de
30-40% de identidade de sequência global, frequentemente superior a cerca de 50%, 60%, 70% ou 80% e incluindo, normalmente, ainda menos a uma parte região de identidade muito maior, frequentemente maior que 90% ou mesmo 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em uma ou mais regiões altamente conservadas, normalmente abrangendo pelo menos 3-4 e muitas vezes até 20 ou mais aminoácidos, com outro polipeptídeo da mesma classe, é abrangido pelo termo pertinente "polipeptídeo" neste relatório descritivo. Os polipeptídeos podem conter L-aminoácidos, D-aminoácidos, ou ambos, e podem conter qualquer uma de várias modificações em aminoácidos ou análogos conhecidos na técnica. As modificações úteis incluem, p. ex., acetilação terminal, amidação, metilação, etc. Em algumas modalidades, as proteínas podem compreender aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, aminoácidos sintéticos e combinações dos mesmos.
[00174] Prevenção: O termo "prevenção", neste relatório descritivo, refere-se a retardar o início e/ou reduzir a frequência e/ou gravidade de um ou mais sintomas de uma doença, transtorno ou condição em particular. Em algumas modalidades, a prevenção é avaliada em base populacional, de modo que se considera que um agente "preveni" uma doença, transtorno ou condição em particular se uma diminuição estatisticamente significante no desenvolvimento, na frequência e/ou na intensidade de um ou mais sintomas da doença, transtorno ou condição for observada em uma população suscetível à doença, transtorno ou condição. A prevenção pode ser considerada completa quando o início de uma doença, transtorno ou condição foi retardado por um período de tempo predefinido.
[00175] Proteína: Neste relatório descritivo, o termo "proteína" refere- se a um polipeptídeo (ou seja, uma cadeia com pelo menos dois aminoácidos unidos um ao outro por ligações peptídicas). As proteínas podem incluir porções além de aminoácidos (p. ex, podem ser glicoproteínas, proteoglicanos, etc.) e/ou podem ser de outra forma processadas ou modificadas. Os técnicos no assunto apreciarão que uma "proteína" pode ser uma cadeia polipeptídica completa como produzida por uma célula (com ou sem uma sequência sinal), ou pode ser uma parte característica da mesma. Os técnicos no assunto reconhecerão que uma proteína pode às vezes incluir mais de uma cadeia polipeptídica, por exemplo, unidas por uma ou mais ligações dissulfeto ou associadas por outros meios. Os polipeptídeos podem conter L-aminoácidos, D-aminoácidos, ou ambos, e podem conter qualquer uma de várias modificações em aminoácidos ou análogos conhecidos na técnica. As modificações úteis incluem, p. ex., acetilação terminal, amidação, metilação, etc. Em algumas modalidades, as proteínas podem compreender aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, aminoácidos sintéticos e combinações dos mesmos. O termo "peptídeo" é geralmente usado para se referir a um polipeptídeo medindo menos de aproximadamente 100 aminoácidos, menos de aproximadamente 50 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos ou menos de 10 aminoácidos. Em algumas modalidades, as proteínas são anticorpos, fragmentos de anticorpos, porções biologicamente ativas e/ou porções características dos mesmos.
[00176] Recombinante: Neste relatório descritivo, a intenção é que se refira a polipeptídeos que são projetados, construídos, preparados, expressos, criados, fabricados e/ou isolados por meios recombinantes, como polipeptídeos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira; polipeptídeos isolados de uma biblioteca combinatória de polipeptídeos humanos recombinantes; polipeptídeos isolados de um animal (p. ex., um camundongo, coelho, ovelha, peixe, etc.) que é transgênico para ou que do contrário foi manipulado para expressar um gene ou genes ou componentes gênicos que codificam e/ou direcionam a expressão do polipeptídeo ou de um ou mais componentes, parte(s), elemento(s) ou domínio(s) do mesmo; e/ou polipeptídeos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva junção ou ligação de elementos selecionados da sequência de ácido nucleico a outros “elementos selecionados da sequência, sintetizados quimicamente e/ou do contrário a geração de um ácido nucleico que codifica e/ou direciona a expressão do polipeptídeo ou de um ou mais componentes, parte(s), elemento(s) ou domínio(s) do mesmo. Em algumas modalidades, um ou mais entre tais elementos selecionados da sequência são encontrados na natureza. Em algumas modalidades, um ou mais entre tais elementos selecionados da sequência são projetados in silico. Em algumas modalidades, um ou mais tais elementos selecionados da sequência resultam da mutagênese (p. ex., in vivo ou in vitro) de um elemento conhecido da sequência, p. ex., de uma fonte natural ou sintética tal como, por exemplo, na linhagem germinativa de um organismo de interesse usado como fonte (p. ex., de um ser humano, um camundongo, etc.).
[00177] Referência: Neste relatório descritivo, descreve um padrão ou controle em relação ao qual é feita uma comparação. Por exemplo, em algumas modalidades, um agente, animal, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de interesse é comparado a um agente, animal, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de referência ou controle. Em algumas modalidades, uma referência ou controle é testada e/ou determinada substancialmente de modo simultâneo com o teste ou a determinação de interesse. Em algumas modalidades, uma referência ou controle é uma referência ou controle histórico, opcionalmente incorporada em um meio tangível. Tipicamente, como seria entendido pelos técnicos no assunto, uma referência ou controle é determinada ou caracterizada sob condições ou circunstâncias comparáveis àquelas sob avaliação. Os técnicos no assunto reconhecerão que similaridades suficientes estão presentes para justificar a confiança em e/ou a comparação com uma possível referência ou controle em particular.
[00178] Resposta: Neste relatório descritivo, uma resposta ao tratamento pode referir-se a qualquer alteração benéfica na condição de um indivíduo que ocorre como resultado ou se correlaciona com o tratamento. Tal alteração pode incluir estabilização da condição (p. ex., prevenção da deterioração que teria acontecido na ausência do tratamento), melhora de sintomas da condição e/ou melhoria dos prospectos para cura da condição, etc. Pode referir-se a uma resposta do indivíduo ou a uma resposta do tumor. A resposta tumoral ou do indivíduo pode ser medida de acordo com uma grande variedade de critérios, incluindo critérios clínicos e critérios objetivos. As técnicas para avaliar a resposta incluem, entre outras, exame clínico, tomografia por emissão de pósitrons, radiograffa de tórax, tomografia computadorizada, imagem por ressonância magnética, ultrassonografia, endoscopia, laparoscopia, presença ou nível de marcadores tumorais em uma amostra obtida de um indivíduo, citologia e/ou histologia. Muitas dessas técnicas tentam determinar o tamanho de um tumor ou então determinar a carga tumoral total. Métodos e diretrizes para avaliar a resposta ao tratamento são discutidos em Therasse et. al. (2000) "New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors", European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada. Os critérios de resposta exatos podem ser selecionados de qualquer maneira adequada, desde que, na comparação de grupos de tumores e/ou pacientes, os grupos a serem comparados sejam avaliados com base nos mesmos critérios ou comparáveis para determinar a data de resposta. Qualquer técnico no assunto será capaz de selecionar critérios adequados.
[00179] Risco: Como será entendido pelo contexto, o "risco" de uma doença, transtorno e/ou condição refere-se a uma probabilidade de que um indivíduo em particular venha a desenvolver a doença, transtorno e/ou condição. Em algumas modalidades, o risco é expresso em porcentagem. Em algumas modalidades, o risco é de 0, 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 até 100%. Em algumas modalidades, o risco é expresso como risco relativo a um risco relacionado com uma amostra de referência ou grupo de amostras de referência. Em algumas modalidades, uma amostra de referência ou grupo de amostras de referência exibem um risco conhecido de uma doença, transtorno condição e/ou evento. Em algumas modalidades, uma amostra de referência ou grupo de amostras de referência são de indivíduos comparáveis a um indivíduo em particular. Em algumas modalidades, o risco relativo é 0,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais.
[00180] Sorotipo: Neste relatório descritivo, o termo "sorotipo", também referido como sorovar, refere-se a uma variação distinta dentro de uma espécie de bactéria ou vírus ou entre células imunes de indivíduos diferentes. Esses microrganismos, vírus ou células são classificados juntos com base em seus antígenos na superfície celular, permitindo a classificação epidemiológica dos organismos em nível de subespécie. Um grupo de sorovares com antígenos comuns pode ser referido como um sorogrupo ou, às vezes, soro complexo.
[00181] —Oligossacarídeo curto: Para fins da presente invenção, um oligossacarídeo é tipicamente considerado "curto" se tiver menos de 4 ou certamente menos de 3 resíduos em qualquer cadeia linear.
[00182] Indivíduo: Neste relatório descritivo, o termo "indivíduo" refere-se a um organismo, tipicamente um mamífero (p. ex., um ser humano, em algumas modalidades, incluindo formas humanas pré- natal). Em algumas modalidades, um indivíduo está sofrendo de uma doença, transtorno ou condição relevante. Em algumas modalidades,
um indivíduo é suscetível a uma doença, transtorno ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo exibe um ou mais sintomas ou características de uma doença, transtorno ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo não exibe qualquer sintoma ou característica de uma doença, transtorno, ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo é alguém com um ou mais atributos característicos da susceptibilidade ou risco de uma doença, transtorno ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo é um paciente. Em algumas modalidades, um indivíduo é um peso para quem o diagnóstico e/ou terapia é e/ou foi administrado.
[00183] Suscetívela: Um indivíduo que é "suscetível a" uma doença, transtorno, ou condição está em risco de desenvolver a doença, transtorno ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo que é suscetível a uma doença, transtorno ou condição não exibe quaisquer sintomas da doença, transtorno ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo que é suscetível a uma doença, transtorno ou condição não foi diagnosticado com a doença, transtorno e/ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo que é suscetível a uma doença, transtorno ou condição é um indivíduo que foi exposto a condições associadas com o desenvolvimento da doença, transtorno ou condição. Em algumas modalidades, um risco de desenvolver uma doença, transtorno e/ou condição é um risco com base populacional (p. ex., familiares de indivíduos que sofrem da doença, transtorno ou condição).
[00184] Sintomas são reduzidos: De acordo com a presente invenção, "sintomas são reduzidos" quando um ou mais sintomas de uma determinada doença, transtorno ou condição são reduzidos em magnitude (p. ex., intensidade, gravidade, etc.) e/ou frequência. Por uma questão de clareza, uma demora no início de um determinado sintoma é considerada uma forma de reduzir a frequência daquele sintoma.
[00185] Quantidade terapeuticamente eficaz' Neste relatório descritivo, significa uma quantidade que produz o efeito desejado para o qual é administrada.
Em algumas modalidades, o termo refere-se a uma quantidade que é suficiente, quando administrada a uma população que sofre ou é suscetível a uma doença, transtorno e/ou condição de acordo com esquema terapêutico de administração, para tratar a doença, transtorno e/ou condição.
Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela que reduz a incidência e/ou gravidade e/ou que retarda o início de um ou mais sintomas da doença, transtorno e/ou condição.
Os técnicos no assunto apreciarão que o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" não requer de fato que o tratamento seja bem-sucedido em um indivíduo em particular.
Em vez disso, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser aquela quantidade que proporciona uma resposta farmacológica desejada específica em um número significativo de indivíduos quando administrada a pacientes com necessidade de tal tratamento.
Em algumas modalidades, a referência a uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma referência a uma quantidade como medida em um ou mais tecidos (p. ex., um tecido afetado pela doença, transtorno ou condição) ou líquidos específicos (p. ex., sangue, saliva, soro, suor, lágrimas, urina, etc.). Os técnicos no assunto apreciarão que, em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um determinado agente ou terapia pode ser formulada e/ou administrada em uma dose única.
Em algumas modalidades, um agente terapeuticamente eficaz pode ser formulado e/ou administrado em uma pluralidade de doses, por exemplo, como parte de um esquema de administração.
Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode referir-se a uma quantidade de uma composição imunogênica ou vacina que é adequada para provocar uma resposta imune.
Por exemplo, a "quantidade terapeuticamente eficaz"
refere-se a uma quantidade não tóxica, mas suficiente que pode ser uma quantidade para tratar, atenuar ou prevenir uma infecção e/ou doença (p. ex., infecção bacteriana, infecção pneumocócica, etc.) em qualquer indivíduo.
[00186] Tratamento: Neste relatório descritivo, o termo "tratamento" (também "tratar" ou "tratando") refere-se a qualquer administração de uma terapia que alivia parcial ou completamente, melhora, abranda, inibe, retarda o início, reduz a gravidade e/ou reduz a incidência de um ou mais sintomas, características e/ou causas de uma determinada doença, transtorno e/ou condição. Em algumas modalidades, tal tratamento pode ser de um indivíduo que não exibe sinais da doença, transtorno e/ou condição relevante e/ou de um indivíduo que exibe apenas sinais iniciais da doença, transtorno e/ou condição. Alternativa ou adicionalmente, tal tratamento pode ser de um indivíduo que exibe um ou mais sinais estabelecidos da doença, transtorno e/ou condição relevante. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser de um indivíduo foi diagnosticado como portador da doença, transtorno e/ou condição relevante. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser de um indivíduo conhecido por ser portador de um ou mais fatores de suscetibilidade que estão correlacionados estatisticamente com risco aumento de desenvolvimento da doença, transtorno e/ou condição relevante.
[00187] Variante: Neste relatório descritivo, no contexto de moléculas, p. ex., ácidos nucleicos, proteínas ou pequenas moléculas, o termo "variante" refere-se a uma molécula que exibe identidade estrutural significativa com uma molécula de referência, mas que difere estruturalmente da molécula de referência, p. ex., na presença ou ausência ou no nível de um ou mais grupos químicos quando comparada à entidade de referência. Em algumas modalidades, uma variante também difere funcionalmente de sua molécula de referência.
Em geral, se uma molécula em particular é devidamente considerada uma "variante" de uma molécula de referência baseia-se em seu grau de identidade estrutural com a molécula de referência.
Como será apreciado pelos técnicos no assunto, qualquer molécula de referência biológica ou química possui certos elementos estruturais característicos.
Uma variante, por definição, é uma molécula distinta que compartilha um ou mais de tais elementos estruturais característicos, mas difere em pelo menos um aspecto da molécula de referência.
Para fornecer apenas alguns exemplos, um polipeptídeo pode ter um elemento característico da sequência, composto por uma pluralidade de aminoácidos com posições designadas um em relação ao outro em espaço linear ou tridimensional e/ou que contribuem para um determinado motivo estrutural e/ou função biológica; um ácido nucleico pode ter um elemento característico da sequência, composto por uma pluralidade de resíduos de nucleotídeos com posições designadas um em relação ao outro em espaço linear ou tridimensional.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante pode diferir de um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência como resultado de uma ou mais diferenças na sequência de aminoácidos ou nucleotídeos e/ou um ou mais diferenças em grupos químicos (p. ex., carboidratos, lipídios, grupos fosfato) que são componentes ligados covalentemente do polipeptídeo ou ácido nucleico (p. ex., que são anexados à estrutura do polipeptídeo ou ácido nucleico). Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante exibe uma identidade de sequência global com um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 99%. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante não compartilha ao menos um elemento característico da sequência com um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência possui uma ou mais atividades biológicas.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante compartilha uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo ou ácido nucleico de referência Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante é desprovido de uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo ou ácido nucleico de referência.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante exibe um nível reduzido de uma ou mais atividades biológicas quando comparado ao polipeptídeo ou ácido nucleico de referência.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico de interesse é considerado uma "variante" de um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência se tiver uma sequência de aminoácidos ou nucleotídeos que seja idêntica àquela da referência, exceto por um número pequeno de alterações na sequência em posições específicas.
Tipicamente, menos de aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 9%, aproximadamente 8%, aproximadamente 7%, aproximadamente 6%, aproximadamente 5%, aproximadamente 4%, aproximadamente 3% ou aproximadamente 2% dos resíduos em uma variante são substituídos, inseridos ou deletados, quando comparada à referência.
Em algumas modalidades, um polipeptideco ou ácido nucleico variante compreende aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 ou aproximadamente 1 resíduo substituído quando comparado a uma referência.
Frequentemente, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante compreende um número muito pequeno (p. ex, menos de aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 ou aproximadamente 1) de resíduos funcionais substituídos, inseridos ou deletados (ou seja, resíduos que participam em uma determinada atividade biológica) em relação à referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante compreende não mais de aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 ou aproximadamente 1 adição ou deleção e, em algumas modalidades, não compreende adições nem deleções, quando comparado à referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante compreende menos de aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6 e comumente menos de aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3 ou aproximadamente 2 adições ou deleções quando comparado à referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência é aquele encontrado na natureza. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência é um polipeptídeo ou ácido nucleico humano.
[00188] Vacinação: Neste relatório descritivo, o termo "vacinação" refere-se à administração de uma composição destinada a gerar uma resposta imune, por exemplo, a um agente causador de doença. Para fins da presente invenção, a vacina pode ser administrada antes, durante e/ou depois da exposição a um agente causador de doença e, em certas modalidades, antes, durante e/ou pouco depois da exposição ao agente. Em algumas modalidades, a vacinação inclui múltiplas administrações, devidamente espaçadas no tempo, de uma composição vacinal. Descrição detalhada de certas modalidades
[00189] A presente invenção refere-se, em geral, a composições, sistema e métodos que incluem proteínas e polissacarídeos complexados, p. ex, vacinas de proteínas e polissacarídeos complexados. Tais complexos podem ser utilizados, p. ex., para induzir e/ou aumentar uma resposta imunoprotetora em pacientes em risco de infecção nosocomial.
[00190] Uma infecção nosocomial é uma infecção que é adquirida em um hospital ou outra instalação de assistência à saúde pelo menos aproximadamente 48 horas depois da internação. Para enfatizar ambientes hospitalares e não hospitalares, uma infecção nosocomial é às vezes chamada de infecção relacionada à assistência à saúde (IRAS). Em algumas modalidades, uma infecção nosocomial pode ser adquirida em hospital, casa de repouso de idosos, instalações de reabilitação, clínica ambulatorial ou outros ambientes clínicos. Em algumas modalidades, a infecção nosocomial é disseminada para o paciente suscetível no ambiente clínico por vários meios. Em algumas modalidades, a equipe de assistência à saúde pode disseminar a infecção nosocomial, além de equipamento contaminado, lençóis ou gotículas aéreas. Em algumas modalidades, a infecção nosocomial pode originar-se do ambiente externo, de outro paciente infectado, da equipe que pode estar infectada ou, em alguns casos, a fonte da infecção nosocomial não pode ser determinada. Em alguns casos, um microrganismo causador de infecção nosocomial é originário da própria microbiota cutânea do paciente, tornando-se oportunista após cirurgia ou outros procedimentos que comprometem a barreira cutânea protetora. Embora um paciente possa ter contraído a infecção de sua própria pele, tal infecção é ainda considerada nosocomial, pois se desenvolve no ambiente de assistência à saúde. Resistência antimicrobiana
[00191] Há uma apreciação cada vez maior do papel de vacinas na confrontação do problema de resistência antimicrobiana (AMR). As vacinas podem reduzir a prevalência da resistência ao reduzirem a necessidade do uso de antimicrobianos, e podem reduzir seu impacto pela redução do número total de casos. Ao reduzirem o número de patógenos que podem ser responsáveis por uma síndrome clínica em particular, as vacinas podem permitir o uso de antibióticos de espectro mais estreito para terapia empírica. Esses efeitos podem ser amplificados por imunidade coletiva, estendendo a proteção para pessoas não vacinadas na população. Pelo fato de muita seleção para resistência dever-se à seleção em membros observadores da flora normal, a vacinação pode reduzir a pressão por resistência mesmo em patógenos não incluídos na vacina. Algumas vacinas tiveram efeitos desproporcionais sobre linhagens resistentes a fármacos dentro da espécie-alvo, um benefício que poderia ser explorado mais deliberadamente no desenho de vacinas (Lipsitch and Siber, 2016). O benefício de vacinas no combate a AMR por cada um desses mecanismos pode ser amplificado pela proteção indireta, ou imunidade coletiva (Fine, 1993), que resulta quando indivíduos vacinados não se tornam infectados ou colonizados e, consequentemente, não transmite o patógeno para outros. Desse modo, infecções, infecções resistentes o uso de antimicrobianos podem ser reduzidos não só em indivíduos vacinados, mas também em seus contatos. Finalmente, para vacinas contra organismos que colonizam assintomaticamente a nasofaringe, a pele, os intestinos ou outros locais, existe a possibilidade teórica de que, reduzindo a densidade de populações microbianas pela vacinação, reduzem as oportunidades para troca genética de elementos de resistência (Levin et a/., 1979; Levin and Cornejo, 2009).
[00192] Asvacinas de interesse em particular são aquelas que visam as causas mais importantes de IRAS que são frequentemente resistentes a múltiplos antibióticos (CDC, 2013; Chang et a/., 2015). As causas mais comuns de IRAS incluem bactérias Gram-negativas múltiplo-resistentes; publicações recentes relatam isolados de todo o mundo que se tornaram resistentes aos agentes de último recurso, polimixina B e colistina (Du et a/., 2015: Liu et a/., 2016). A resistência aos agentes de primeira e de segunda linha é também um problema em organismos Gram-positivos. Espécies de Candida são causas importantes de infecções de mucosa e disseminadas em pacientes imunocomprometidos e como consequência de terapia antimicrobiana (CDC, 2013). As espécies Gram-negativas E. coli Pseudomonas, Klebsiella e Acinetobacter estão também se tornando cada vez mais resistentes a múltiplos antibióticos (McGann et al., 2016; Collignon, 2009; Agodi et a/l., 2011, relatório da OMS, 2014). Para aborda essa lacuna no conhecimento, o CDC começou uma iniciativa de três fases em 2009 para desenvolver e conduzir uma pesquisa multiestadual sobre a prevalência de IRAS e o uso de agentes antimicrobianos. As pesquisas de prevalência têm sido utilizadas em outros países para descrever o alcance e a magnitude do problema de tais infecções. À iniciativa do CDC culminou em 2011 em uma pesquisa em grande escala que estimou a prevalência de IRAS em hospitais de cuidados agudos, determinou a distribuição dessas infecções de acordo com o local da infecção e o patógeno, como vistos na Tabela 1, e gerou estimativas atualizadas da carga nacional dessas infecções (Magill et al., 2014).
[00193] As pesquisas foram conduzidas nos Estados Unidos em 183 hospitais (Magill et al/., 2014) de 11.282 pacientes, 452 sofreu 1 ou mais IRAS (4,0%; intervalo de confiança 95%, 3,7 a 4,4). De 504 de tais infecções, os tipos mais comuns foram pneumonia (21,8%), infecções do sítio cirúrgico (21,8%) e infecções gastrointestinais (GI) (17,1%). C. difficile foi o patógeno mais comumente relatado (causando 12,1% das infecções relacionadas à assistência à saúde). Infecções relacionadas a dispositivos (ou seja, infecção de corrente sanguínea relacionada a cateter central, infecção do trato urinário relacionada a cateter, e pneumonia relacionada à ventilação mecânica), que têm sido tradicionalmente o foco de programas para prevenção de IRAS, foram responsáveis por 25,6% de tais infecções. Segundo estimativas dos autores, houve 648.000 pacientes com 721.800 IRAS em hospitais de cuidados intensivos dos Estados Unidos em 2011. Atingir K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli ou uma combinação das mesmas por vacinação em ambientes hospitalares teria um impacto significativo sobre a incidência das infecções IRAS mais comuns, como pneumonia, do sítio cirúrgico e infecções do trato urinário, bem como reduziria a prevalência da resistência antibiótica como mostrada na Tabela 1. Tabela 1: Pesquisa multiestadual sobre a prevalência pontual de IRAS: de acordo com o tipo de infecção (Magill et al., 2014) Todos Infecções . Patógeno os Pneumonia do sítio BSI UTI Infecções locais cirúrgico & pneumoniae Complexos imunogênicos
[00194] A presente invenção abrange complexos imunogênicos que incluem estruturas poliméricas, polissacarídeos e polipeptídeos.
[00195] Em algumas modalidades, os complexos imunogênicos são sistemas apresentadores de múltiplos antígenos (MAPS). Certos sistemas MAPS foram descritos antes em WO 2012/155007. Em geral, um complexo imunogênico aqui descrito representa novos complexos tipo MAPS variantes que incluem (i) uma estrutura polimérica compreendendo um polímero e um ou mais polissacarídeos (p. ex., polissacarídeos antigênicos) conjugados à polímero; e (ii) um ou mais polipeptídeos (p. ex., polipeptídeos antigênicos e/ou peptídeos de transporte) complexados não covalentemente com o polímero e/ou o polissacarídeo antigênico. Algumas estruturas poliméricas exemplares são representados nos complexos imunogênicos mostrados nas Figuras 7A-7D. Em algumas modalidades, o complexo de MAPS variante é um BP-1 MAPS. Em algumas modalidades o complexo de MAPS variante é um BP-1.2 MAPS. Em algumas modalidades, o complexo de MAPS variante é um BP-2a MAPS. Em algumas modalidades, o complexo de MAPS variante é um BP-2b MAPS. Em algumas modalidades, o complexo de MAPS variante é um BP-3 MAPS.
[00196] Em algumas modalidades, um ou mais antígenos polipeptídicos are complexados não covalentemente com uma estrutura polimérica e/ou um polissacarídeo antigênico conjugado ao dito polímero, por formação de pelo menos um par de molécula de afinidade/molécula de afinidade complementar compreendendo (i) uma primeira molécula de afinidade relacionada com o polímero e/ou polissacarídeo —antigênico; e (ii) uma molécula de afinidade complementar relacionada com um ou mais antígenos polipeptídicos. Em algumas modalidades, um ou mais dos polissacarídeos são ligados quimicamente ao polímero. Em algumas modalidades, um ou mais dos polissacarídeos antigênicos são derivados de bactérias Gram-negativas e/ou bactérias Gram-positivas. Em algumas modalidades, um ou mais polissacarídeos — antigênicos — microbianos são derivados de polissacarídeos antigênicos de K. pneumoniae, P. aeruginosa e E. coli.
[00197] Em algumas modalidades, um ou mais polipeptídeos são ligados covalentemente (p. ex., fundidos) a uma molécula de afinidade complementar aqui descrita.
[00198] Em algumas modalidades, um ou mais polissacarídeos antigênicos são conjugados a uma estrutura polimérica. Em algumas modalidades, um ou mais polissacarídeos antigênicos são conjugados à estrutura polimérica em uma razão entre aproximadamente 0,01 e 10 m/m. Em algumas modalidades, um ou mais polissacarídeos antigênicos são conjugados à estrutura polimérica em uma razão entre aproximadamente 0,01 e 0,1 m/m. Em algumas modalidades, um ou mais polissacarídeos antigênicos são conjugados à estrutura polimérica em uma razão entre aproximadamente 0,01 e 1 m/m. Em algumas modalidades, um ou mais polissacarídeos antigênicos são conjugados à estrutura polimérica em uma razão entre aproximadamente 0.1 e 1 m/m. Em algumas modalidades, um ou mais polissacarídeos antigênicos são conjugados à estrutura polimérica em uma razão entre aproximadamente 0,1 e 10 m/m. Em algumas modalidades, um ou mais polissacarídeos antigênicos são conjugados à estrutura polimérica em uma razão entre aproximadamente 1 e 10 m/m.
[00199] Em algumas modalidades, um ou mais polissacarídeos antigênicos são derivados de um ou mais patógenos. Em algumas modalidades, um ou mais polissacarídeos antigênicos são derivados de 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 sorotipos ou cepas de um patógeno.
[00200] Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica compreende uma ou mais moléculas de afinidade conjugadas à estrutura polimérica. Em algumas modalidades, os polissacarídeos antigênicos compreendem uma ou mais moléculas de afinidade conjugados às polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica e os polissacarídeos antigênicos são conjugados a uma ou mais moléculas de afinidade. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica é conjugada a uma ou mais moléculas de afinidade e os polissacarídeos antigênicos não são conjugados a uma molécula de afinidade. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica não é conjugada a uma molécula de afinidade e os polissacarídeos antigênicos são conjugados a uma ou mais moléculas de afinidade. Em algumas modalidades, as moléculas de afinidade compreendem biotina ou derivados da biotina.
[00201] Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica compreende uma pluralidade de moléculas de afinidade conjugadas à estrutura polimérica. Em algumas modalidades, os polissacarídeos antigênicos compreendem uma pluralidade de moléculas de afinidade conjugadas aos polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica e os polissacarídeos antigênicos são conjugados a uma pluralidade de moléculas de afinidade. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica é conjugada a uma pluralidade de moléculas de afinidade e os polissacarídeos antigênicos não são conjugados a uma molécula de afinidade. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica não é conjugada a uma molécula de afinidade e os polissacarídeos antigênicos são conjugados a uma pluralidade de moléculas de afinidade. Em algumas modalidades, as moléculas com afinidade compreendem biotina ou derivados da biotina.
[00202] Em algumas modalidades, os polissacarídeos e/ou polipeptídeos que podem ser incluídos nos complexos imunogênicos são produzidos por recombinação ou sinteticamente. Em algumas modalidades, os polissacarídeos e/ou polipeptídeos que podem ser incluídos nos complexos imunogênicos são isolados e/ou derivados de fontes naturais. Polissacarídeos e/ou polipeptídeos exemplares são descritos abaixo. Klebsiella
[00203] A vasta maioria das infecções por Klebsiella estão relacionadas com hospitalização. Como patógenos oportunistas, Klebsiella spp. Atacam primariamente indivíduos imunocomprometidos que estão hospitalizados e sofrem de doenças subjacentes graves como diabetes mellitus ou obstrução pulmonar crônica. As infecções nosocomiais por Klebsiella são causadas principalmente por K. pneumoniae, a espécie do gênero mais importante medicamente. Estima-se que Klebsiella spp. causem 8% de todas as infecções bacterianas nosocomiais nos Estados Unidos e na Europa (Podschun and Ullmann, 1998). Não foram observadas grandes variações geográficas, exceto pelas cepas K1 encapsuladas hipervirulentas que são encontradas predominantemente na Ásia e são incomuns na Europa e no Hemisfério Ocidental. Nos Estados Unidos, Klebsiella é responsável por 3 a 7% de todas as infecções bacterianas nosocomiais, colocando-as entre os oito patógenos infecciosos mais importantes em hospitais (Horan et a/., 1988; Schaberg et a/., 1991), e dados coletados do Reino Unido (Bergogne-Berezin, 1995) e da Alemanha (Ullmann, 1986) são acentuadamente semelhantes àqueles relatado pelo CDC. Assim, em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um ou mais polissacarídeos e/ou polipeptídeos de Klebsiella.
[00204] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um ou mais polissacarídeos derivados de LPS e/ou CPS de Klebsiella. Em algumas modalidades, os polissacarídeos derivados de LPS são OPS. Em algumas modalidades, os polissacarídeos derivados de LPS são COPS. Cápsulas são produzidas por quase todas as cepas de Klebsiella; elas representam a camada mais externa de estruturas superficiais em contato com o meio do hospedeiro, e comprovaram ser altamente imunogênicas e não tóxicas (Cryz et al., 1985). Uma desvantagem de uma vacina com CPS de Klebsiella pneumoniae (KP) é o grande número de antígenos na cápsula (K) (mais de 80 antígenos diferentes). No entanto, em um estudo da incidência de tipos de cápsula entre isolados bacterêmicos de Klebsiella, foi observado que 25 sorotipos apenas totalizavam 70% de todas as cepas bacterêmicas (Cryz et al., 1986a). Com base em seus achados soro- epidemiológicos, uma vacina 24-valente com CPS de KP foi formulada e subsequentemente comprovou ser segura e imunogênica (Edelman et al., 1994). No entanto, polissacarídeos puros não são suficientemente imunogênicos por si mesmos para montar e sustentar uma resposta de memória longa e eficaz e precisam muitas vezes ser conjugados a proteínas para que sejam eficazes. O desenvolvimento de uma vacina 24-valente de polissacarídeos conjugados de KP é complicado e desafiador, pois combinar 24 glicoconjugados em uma vacina pode o equilibrar a imunogenicidade gerada por cada componente.
[00205] Devido às suas propriedades endotóxicas, os LPS são considerados — importantes na patologia da septicemia. Até recentemente, considerava-se que, em geral, antígenos O de LPS de Klebsiella eram mascarados pelo CPS e, assim, não expostos na superfície bacteriana. Diversos estudos, contudo, demonstraram a exposição na superfície e a acessibilidade de antígenos O em cepas que expressam certos sorotipos capsulares (Tomas et al/., 1988). Em contraste com os antígenos K, são conhecidos apenas oito tipos O, sendo O1 o tipo O mais comumente encontrado em isolados clínicos. Quatro isolados de KP (O1, O2, O3, O5) são responsáveis pela maioria dos isolados clínicos (Hansen et a/.,, 1999). Foi relatado que a administração de anticorpos monoclonais (mAbs) contra o antígeno O1 de Klebsiella era protetora em um modelo de endotoxemia letal em camundongos (Mandine et a/., 1990).
[00206] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui uma proteína ou polipeptídeo de pili tipo 3 de Klebsiella. Diferentemente de outras fímbrias, pili tipo 3 aglutinam eritrócitos que foram tratados com tanino. Apesar de seu nome, hemaglutinina manose-resistente Klebsiella-like (MR/K-HA), implicar que seu tipo de fímbria é sintetizado somente por Klebsiella, estudos posteriores demonstraram que pili tipo 3 ocorrem em muitos gêneros entéricos (Clegg and Gerlach, 1987). Além disso, pili tipo 3 aparentemente não são idênticas em todos os gêneros de enterobactérias, uma vez que estudos sorológicos revelaram diversidade antigênica considerável (Old and Adegbola, 1985). Originalmente descritas como organelas de adesão de Klebsiella que habitam raízes de plantas, foi verificado mais tarde que essas pili eram capazes de se ligar a várias células humanas. Cepas de K. pneumoniae que expressam pili tipo 3 se aderem em células endoteliais, no epitélio do trato respiratório e em células uroepiteliais (Hornick et a/., 1992; Tarkkanen et al., 1997; Wúrker et al, 1990). Nos rins, essas pili nedeiam a adesão bacteriana a membranas basais tubulares, às cápsulas de Bowman e a vasos renais (Tarkkanen et al., 1990). MrkA é uma proteína importante do complexo de fímbrias tipo Il e foi implicada na ligação à célula hospedeira e formação de biofime (Murphy and Clegg, 2012), uma estratégia usada pelos patógenos bacterianos para estabelecer infecção (Burmolle et al, 2008). MrkA, mas não adesina (MrkD), demonstrou previamente facilitar a formação de biofilme (Langstraat et a/., 2001). O antígeno MrkA exibe alto grau de conservação da sequência entre diferentes isolados de KP e é em geral acessível como um alvo extracelular (Wang et al., 2016). MFrkA dos dois isolados patogênicos mais dominantes, K. pneumoniae e Klebsiella oxytoca, exibe 95% de homologia. Além disso, a homologia de MrkA entre membros representativos da família Enterobacteriaceae é >90% e, assim, esses dados da sequência sugerem uma oportunidade potencial para desenvolver uma estratégia com base em MFrkA contra K. pneumoniae e pan-bactérias Gram-negativas. Polissacarídeos de Klebsiella pneumoniae
[00207] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um ou mais polissacarídeos de K. pneumoniae. Além do CPS (p. ex., antígeno K), o OPS é outro importante fator de virulência de K. pneumoniae. Existem pelo menos 9 subtipos de OPS de K. pneumoniae, cada um com uma estrutura química diferente de polissacarídeo. Em algumas modalidades, polissacarídeos OPS são incluídos em um complexo imune aqui descrito. Cada uma das designações de sorotipo neste relatório descritivo é feita de acordo com o Centro Colaborador da Organização Mundial da Saúde (OMS) para Referência e Pesquisa sobre Escherichia e Klebsiella.
[00208] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico inclui um ou mais polissacarídeos de Klebsiella que são ou são derivados de um ou mais sorotipos de K. pneumoniae selecionados a partir de 01 (e d-Gal-lIll variantes), O2 (e d-Gal-lll variantes), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 e 012. Em algumas modalidades, um complexo imune inclui polissacarídeos de Klebsiella ou derivados de um ou mais entre os sorotipos O1, O2, O3 e O5, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, um complexo imune inclui polissacarídeos de Klebsiella e ou derivados de cada um dos sorotipos O1, 02, 03 e O5.
[00209] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico inclui um ou mais polissacarídeos de Klebsiella que são ou são derivados de um OPS. Em algumas modalidades, o OPS é ou é derivado de Klebsiella do sorotipo O1, O2, O3, O5, e variantes ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, um complexo imune inclui OPS de Klebsiella selecionados ou derivados de um ou mais entre os sorotipos doi, O2, O3 e O5, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, um complexo imune inclui OPS de Klebsiella de ou derivado de cada um dos sorotipos O1, 02, O3 e O5.
[00210] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico inclui um ou mais polissacarídeos de Klebsiella que são ou são derivados de um CPS. Em algumas modalidades, o CPS é ou é derivado de K1, K2, K10, K16 e K19 de Klebsiella. Em algumas modalidades, o CPS é ou é derivado de K19 de Klebsiella.
Polipeptídeos de Klebsiella pneumoniae
[00211] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um ou mais polipeptídeos de K. pneumoniae. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de K. pneumoniae é ou é derivado da proteína da fímbria Tipo | de K pneumoniae ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de K. pneumoniae é ou compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:1 publicada em Gerlach et a/., 2012, J Bacteriology, ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de K. pneumoniae é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:1, ou um fragmento imunogênico deste.
[00212] Proteína da fímbria Tipo | de K. pneumoniae, SEQ ID NO:1
[00213] Em algumas modalidades, um polipeptideco de K pneumoniae é ou é derivado da proteína MrkA conservada da fímbria Tipo Ill de K. pneumoniae ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de K. pneumoniae é ou compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:2 ou um fragmento imunogênico deste. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de K. pneumoniae é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2, ou um fragmento imunogênico deste.
[00214] Proteína MrkA conservada da fímbria Tipo Ill de K. pneumoniae, SEQ ID NO:2
[00215] Em algumas modalidades, um polipeptideco de K pneumoniae é ou é derivado da proteína MrkA da fímbria Tipo Ill de K. ou um fragmento imunogênico, p. ex., um fragmento com sequências repetidas para permitir interações estabilizadas a uma proteína com monômero MrkA. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de K. pneumoniae é ou compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:3 ou um fragmento imunogênico deste. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de K. pneumoniae é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:3, ou um fragmento imunogênico deste.
[00216] Proteína MrkA da fímbria Tipo Ill estabilizada de K. pneumoniae, SEQ ID NO:3
ADTTVGGGQVNFFGKVTDVS Pseudomonas
[00217] Pseudomonas é uma causa importante de infecções IRAS, especialmente em pacientes imunocomprometidos por neutropenia e ventilação mecânica, e é uma das principais causas de morte em pacientes com fibrose cística. Infecção por Pseudomonas está também implicada em lesão de queimadura, lesão ocular (p. ex., na córnea), trauma, etc. Assim, em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um ou mais polissacarídeos e/ou polipeptídeos de Pseudomonas.
[00218] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um antígeno O de Pseudomonas.
À Wellcome Research conduziu grande parte dos esforços iniciais para desenvolver uma vacina baseada nesse antígeno, combinando extratos purificados contendo 16 dos 20 sorotipos de antígeno O na vacina contra PEV-1. Os resultados de, no total, cinco estudos clínicos de Fase |-ll foram publicados entre 1976 e 1984 (Jones et al., 1976, 1978, 1979, 1980; Langford and Hiller, 1984). Dados de segurança da vacina indicam que ela foi bem tolerada.
A soroconversão pareceu relativamente consistente em grupos vacinados de voluntários normais e queimados ou em pacientes com fibrose cística (FC) pacientes.
A vacinação teve efeitos variáveis sobre a colonização de feridas por queimadura desde pouco ou nenhum efeito a efeito significativo.
Hemoculturas mostraram uma redução de quase 10 vezes devido à vacinação em um estudo.
Em cada estudo em pacientes queimados, houve redução em morte, que variou de 70-100%, embora o número de óbitos devido a P. aeruginosa nem sempre fosse claro.
No estudo de fibrose cística (Langford and Hiller, 1984), pareceu não ter havido benefício clínico nem diferença na colonização de P. aeruginosa com a vacinação, nem houve correlação entre títulos de anticorpos por ELISA e leituras clínicas e bacteriológicas.
O Swiss Serum Institute, Berna Biotech e Crucell desenvolveram uma vacina octavalente conjugada antígeno O- exotoxina A (Aerugen), que passou por três estudos clínicos de Fase |- Il publicados (Schaad, et a/., 1991; Lang, et a/., 1995; Cryz et al., 1994). A vacina deles administrada por via intramuscular (IM) pareceu ser bem tolerada, e a soroconversão para todos os sorotipos foi considerada significativa em todos os estudos.
A vacinação resultou em diminuição significativa da colonização na maioria dos estudos, e nenhum óbito relacionado a PA foi relatado em grupos da vacina ou placebo.
Em um estudo de Fase Ill da Crucell com 476 pacientes com fibrose cística, a vacina não atingiu o desfecho desejado nem repetiu os resultados observados em estudos anteriores.
[00219] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um flagelo ou porção antigênica deste de Pseudomonas. Estudos iniciais de pesquisa sobre eficácia (Holder et a/., 1982; Holder and Naglich, 1986; Montie, et a/., 1987) estabeleceram que qualquer flagelo tipo a ou b poderia fornecer proteção tipo-específica contra morte em modelos de queimadura em murinos, mas aquele flagelo do tipo b parecer um pouco mais competente em assim o fazer. Em estudos pré- clínicos, IMMUNO AG (Crowe, et a/., 1991) usou vacinas individuais que consistiam em flagelos a0O, a0a1la2, aOa2, a0a3, aOa3ad4 e tipo b para determinar que o antígeno b parecia ser um imunógeno melhor, fornecendo altas taxas de proteção em um modelo de camundongos imunocomprometidos do que os preparados do tipo a. Um estudo de Fase | no mesmo artigo mostrou que todos esses imunógenos provocaram altos títulos de anticorpos séricos de longa duração, como o fez um único imunógeno tipo b em um estudo de Fase |l de acompanhamento (Dôring, et a/, 1995), que também mostrou a soroconversão de IgG, IgA e sIgA em lavados broncoalveolares. À administração de uma vacina com flagelos combinados tipo a (a0a1a2) + tipo b em pacientes com fibrose cística (Fase Ill) resultou em altos títulos de IgG sérico de longa duração. No entanto, apesar de ter havido alguma eficácia protetora versus infecção pulmonar. P. aeruginosa, a presença de sorotipos não relacionados com a vacina obscureceu a interpretação do resultado (Dôring and Dorner, 1997; Dôring, et al 2007). Em uma revisão subsequente, Doring e Pier (2008) sugeriram que uma vacina bivalente de flagelos pode não ser ideal e, dito isso, não parecem existir dados sobre uma vacina única que inclua flagelos do tipo b e de todos os subtipos do tipo a.
[00220] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui uma flagelinas de Pseudomonas ou fragmento antigênico desta. Estudos sobre as subunidades de flagelos, flagelinas, não progrediram além da fase de pesquisa. Estudos incluíram flagelina purificada (Campodonico, et al., 2010; Faezi, et al., 2013), vacina de DNA com flagelina (Saha, et al., 2007), bem como um conjugado flagelina/ácido polimanurônico (Campodonico, et al., 2011). Embora todos sejam imunogênicos e protetores, esses não parecem atingir os níveis obtidos por preparados com flagelos. A imunização passiva também foi estuda com soro anti-tipo b (Barnea, et a/., 2006), mAb anti- tipo a (Barnea, et a/., 2009) soro anti-tipo a (Faezi, et a/., 2011). Todos os preparados revelaram reduções em morte no modelo de queimadura em camundongos.
[00221] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um PcrV (Secreção Tipo Ill) de Pseudomonas ou fragmento antigênico deste. Um fator de virulência fundamental relacionado com gravidade da doença gravidade é o sistema de secreção tipo Ill de P. aeruginosa (T3SS), que injeta toxinas bacterianas diretamente no citoplasma de células hospedeiras. A proteína PcrV, localizada na ponta do complexo injetissoma T3SS, é necessária para a função de T3SS e é um alvo bem validado em modelos animais de estratégias imunoprofiláticas direcionadas contra P. aeruginosa. Com base no trabalho de base sobre PcrV, no qual imunização ativa e passiva (Sawa, et al/., 1999; Holder, et a/., 2001; Shime, et al., 2001; Frank, et al., 2002) mostraram proteção em vários modelos animais, a KaloBios desenvolveu um "Fab peguilhado, humanizado de alta afinidade" (KB-001), que foi investigado como terapia passiva em estudos pré-clínicos (Baer, et a/., 2009) e clínicos (Francois et a/., 2012; Milla et al/., 2014). Apesar de mAbs de camundongos e "humanizados e fragmentos Fab' destes tenham provado ser eficazes em estudos animais, um estudo clínico com KB-001 revelou não haver diferenças significativas em contagens de colônias de P. aeruginosa, sintomas ou espirometria, e uma nova versão melhorada, KB-001A para tratar infecções por P. aeruginosa em pacientes com fibrose cística não atendeu a seus desfechos primários em um estudo clínico de Fase |l em humanos (ClinTrials.gov, 2014). Em relação a seu uso como uma vacina ativa até a presente invenção, pouco trabalho foi realizado com o antígeno da proteína PcrV.
[00222] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um exopolissacarídeo de Pseudomonas. Em algumas modalidades, um complexo imune aqui descrito inclui um PsL de Pseudomonas. Esse exopolissacarídeo é importante para ligação de P. aeruginosa a células de mamíferos e para a formação e manutenção de biofilmes produzidos por isolados não mucoides e mucoides de P. aeruginosa. O polissacarídeo PsL tem como função manter juntas as células do biofilme e, consequentemente, o papel essencial de PsL na adesão (Ma et al., 2006). Rastreamentos funcionais revelaram que mAbs contra um epítopo de PsL exibem atividade superior em ensaios de OPK e de ligação celular, e conferem proteção significativa em múltiplos modelos animais.
[00223] O polissacarídeo Psl é uma característica de superfície acessível ao anticorpo, independente do sorotipo que é prevalente entre isolados clínicos não mucoides e mucoides (DiGiandomenico et al., 2012). Em animais, anticorpos contra Psl medeiam OPK na presença de células efetoras e inibem a ligação de P. aeruginosa a células epiteliais. O suposto mAb específico contra PsL, Cam-003, protegeu passivamente e reduziu a carga bacteriana nos órgãos de camundongos de maneira dose-dependente (DiGiandomenico et al., 2012). O mAb Cam-003 protege também contra múltiplos sorotipos de P. aeruginosa em um modelo de pneumonia em camundongos. Resultados semelhantes foram obtidos nos modelos de lesão da córnea por arranhão ou em camundongos queimados, em ambos os casos, Cam-003 foi eficaz em diminuir a infecção. MEDI 3902 é um anticorpo biespecífico direcionado contra o fator de virulência TTSS independente do sorotipo, PcrV, e o exopolissacarídeo PsL do fator de persistência (DiGiandomenico et a/., 2014). Um estudo de segurança de Fase | com MEDI 3902 para a prevenção de pneumonia (Pneumonia relacionada à ventilação mecânica) causada por Pseudomonas foi concluído (https://clinicaltrials. gov/NCOT02255760). Em relação a seu uso como uma vacina ativa até a presente invenção, pouco trabalho foi realizado com o antígeno PsL do PsL.
Polissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa
[00224] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um ou mais polissacarídeos de P. aeruginosa. Existem aproximadamente 20 sorotipos conhecidos do antígeno O pelo método IATS. O polissacarídeo de antígeno O da molécula fornece um alvo potencial não tóxico para o desenvolvimento de vacinas. Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um ou mais Pseudomonas OPS, LPS, e/ou exopolissacarídeos. Em algumas modalidades, os polissacarídeos derivados de LPS are OPS. Em algumas modalidades, polissacarídeos derivados com LPS são COPS.
[00225] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico inclui um ou mais Pseudomonas polissacarídeos que são ou derivam de um ou mais sorotipos de P. aeruginosa selecionados a partir de O1, 02, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, 010, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019 e 020 (IATS). Em algumas modalidades, um complexo imune inclui um ou mais polissacarídeos de Pseudomonas que são ou derivam de um ou mais sorotipos de P. aeruginosa selecionados a partir de O1, 02, 03, O4, O5, O6, 010 e O11, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, um complexo imune inclui polissacarídeos de Pseudomonas polissacarídeos que são ou derivam de cada um dos sorotipos de P. aeruginosa selecionados a partir de O1, 02, 03, O4, O5, O6, 010 e 011.
[00226] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico inclui um ou mais polissacarídeos de Pseudomonas que são ou derivam tipo O1, 02, 03, O4, O5, O6, 07, O8, O9, 010, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019 e 020 de um OPS. Em algumas modalidades, o OPS é ou é derivado de Pseudomonas do tipo 01, 02, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, 010, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, O19 e 020, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, o OPS é ou é derivado de Pseudomonas do tipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, 010, ou O11, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, o OPS é ou é derivado de cada Pseudomonas do tipo 01, 02, O3, O4, O5, O6, 010 ou 011.
[00227] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico inclui um ou mais polissacarídeos de Pseudomonas que são ou derivam de um polissacarídeo capsular ou extracelular semelhante ao capsular. Em algumas modalidades, o polissacarídeo capsular ou semelhante ao capsular é ou é derivado de alginato, Ps| ou Pel de Pseudomonas.
[00228] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico inclui um ou mais polissacarídeos de Pseudomonas que são ou derivam de um exopolissacarídeo. Em algumas modalidades, o exopolissacarídeo é ou é derivado de PsL. Em algumas modalidades, o Psl. compreende pelo menos um epítopo que se liga a um anticorpo monocional compreendendo SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclional que se liga a pelo menos um epítopo de PsL é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:4, ou o fragmento de ligação ao PsL deste. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclional que se liga a pelo menos um epítopo de PsL é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:5, ou o fragmento de ligação ao PsL deste. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal que se liga a pelo menos um epítopo de PsL é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:4, ou o fragmento de ligação ao PsL deste e um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:5, ou o fragmento de ligação ao PsL deste.
[00229] Sequência de ligação a PsL no mAb Cam-003, SEQ ID NO:4
[00230] Sequência de ligação a PsL no mAb Cam-003, SEQ ID NO:5
GNHVVFGGGTKLTVL Polipeptídeos de Pseudomonas aeruginosa
[00231] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui um ou mais polipeptídeos de P. aeruginosa. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou é derivado de Flagelina FIIC subtipo A1 de P. aeruginosa ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:6 ou um fragmento imunogênico deste. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:6, ou um fragmento imunogênico deste.
[00232] —Flagelina FIIC subtipo A1 de P. aeruginosa, SEQ ID NO:6
[00233] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou é derivado de Flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:7 ou um fragmento imunogênico deste. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:7, ou um fragmento imunogênico deste.
[00234] —Flagelina FIiC subtipo B de P. aeruginosa, SEQ ID NO:7
[00235] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou é derivado do domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIiC subtipo B de P. aeruginosa ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:10 ou um fragmento imunogênico deste. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10, ou um fragmento imunogênico deste.
[00236] Domínio D2 da Flagelina FIIC subtipo B sem o motivo de ligação a TLR5 de P. aeruginosa, SEQ ID NO:10
[00237] Emalgumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou é derivado de um sistema de secreção tipo três (TTSS) do fator de virulência PcrV de P. aeruginosa ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:8 ou um fragmento imunogênico deste. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de P. aeruginosa é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8, ou um fragmento imunogênico deste.
[00238] Sistema de secreção tipo três (TTSS) do fator de virulência PcrV de P. aeruginosa, SEQ ID NO:8
SVLRDILSAI Escherichia coli
[00239] A mortalidade associada à sepse por E. coli é 20%-40% mesmo com terapia antimicrobiana ideal e cuidados de suporte (Grandsen et a/., 1990; Kreger et al., 1980; Rayner and Willcox, 1988; Bryan et a/., 1983; Cross et a/., 1983). Novas abordagens profiláticas e terapêuticas, incluindo o tratamento adjuvante com anticorpos contra essas e outras bactérias Gram-negativas, são claramente necessárias. Embora anticorpos específicos contra o antígeno O protejam contra infecção por cepas bacterianas homólogas, os investigadores consideraram que a imunoterapia com tais anticorpos é valor limitado em vista da diversidade de sorotipos de bactérias Gram-negativas (Baumgartner, 1990). No entanto, pesquisas epidemiológicas de sorotipos bacterianos relacionados com infecção extra-intestinal invasiva por E. coli revelam que um número limitado de sorogrupos O é responsável por quase 60% dos casos de bacteremia (Grandsen et al., 1990; Cross et a/., 1984; McCabe et a/., 1978). Assim, continua havendo necessidade de tecnologias eficazes para prevenção e/ou tratamento de tais infecções.
Métodos de purificação dos polissacarídeos
[00240] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de purificação de um ou mais polissacarídeos aqui descritos de um ou mais componentes celulares das bactérias. Em algumas modalidades, os métodos envolvem purificar um polissacarídeo de antígeno O de um ou mais componentes celulares das bactérias. Em algumas modalidades, métodos envolve purificar CPS de um ou mais componentes celulares das bactérias.
[00241] Emalgumas modalidades, as bactérias são Gram-negativas. Em algumas modalidades, K. pneumoniae, P. aeruginosa e E. coli.
[00242] Em algumas modalidades, os componentes celulares incluem proteína. Em algumas modalidades, as proteínas celulares incluem ácido nucleico. Em algumas modalidades, os componentes celulares incluem lipídios. Em algumas modalidades, os componentes celulares incluem polissacarídeos. Em algumas modalidades, os componentes celulares são parte de um lisado.
[00243] Em algumas modalidades, um método para purificar um polissacarídeo de um ou mais componentes celulares das bactérias compreende colocar os componentes celulares em contato com um reagente oxidante e um ácido para obter uma mistura. Em algumas modalidades, o agente oxidante compreende nitrito de sódio. Em algumas modalidades, o ácido é ácido acético. Em algumas modalidades, o pH da mistura é entre aproximadamente 3 e 5. Em algumas modalidades, o método compreende separar o polissacarídeo de antígeno O de um ou mais componentes celulares na mistura. Em algumas modalidades, o OPS separado contém um aldeído livre em sua extremidade terminal redutora. Em algumas modalidades, o OPS separado contém um resíduo de 2,5-anidromanose contendo um aldeído livre em sua extremidade terminal redutora. Em algumas modalidades, o método compreende recuperar o OPS, em que o OPS recuperado é substancialmente livre de um ou mais outros componentes celulares. Em algumas modalidades, o OPS recuperado contém um aldeído livre em sua extremidade terminal redutora. Em algumas modalidades, o OPS recuperado contém um resíduo de 2,5- anidromanose contendo um aldeído livre em sua extremidade terminal redutora.
[00244] Em algumas modalidades, um método para purificar um polissacarídeo de um ou mais componentes celulares das bactérias
Gram-negativas compreende colocar os componentes celulares em contato com um reagente ácido para obter uma mistura. Em algumas modalidades, o pH da mistura é entre aproximadamente 3 e 5. Em algumas modalidades, o método compreende aquecer a mistura até entre cerca de 80ºC e 135ºC. Em algumas modalidades, o método compreende separar o core (parte mais central) e o polissacarídeo do antígeno O (COPS) de um ou mais componentes celulares na mistura. Em algumas modalidades, o COPS separado contém um KDO em sua extremidade terminal redutora. Em algumas modalidades, o COPS separado contém uma cetona no KDO em sua extremidade terminal redutora. Em algumas modalidades, o método compreende recuperar o COPS, em que o COPS recuperado é substancialmente livre de um ou mais outros componentes celulares. Em algumas modalidades, o COPS recuperado contém uma cetona em sua extremidade terminal redutora. Pares de moléculas de afinidade
[00245] Talcomo descrito, em algumas modalidades, os complexos imunes da invenção incluem um ou mais polipeptídeos complexados não covalentemente com um ou mais polímeros e/ou um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, um ou mais polipeptídeos são complexados via interação por afinidade com um ou mais polímeros e/ou um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, os complexos imunes da invenção incluem um ou mais polipeptídeos complexados não covalentemente com um ou mais polímeros e/ou um ou mais polissacarídeos antigênicos utilizando um ou mais pares de moléculas de afinidade/moléculas de afinidade complementar. Em algumas modalidades, um complexo imune inclui (i) uma primeira molécula de afinidade aqui descrita conjugada a um ou mais polímeros e/ou conjugada a um ou mais polissacarídeos antigênicos, e (ii) uma proteína de fusão que é ou compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita e um polipeptídeo.
Quando da associação entre a primeira molécula de afinidade e a molécula de afinidade complementar, um ou mais dos polipeptídeos são complexados não covalentemente a um ou mais dos polímeros e/ou um ou mais dos polissacarídeos antigênicos.
[00246] Em algumas modalidades, o par de molécula de afinidade/ molécula de afinidade complementar é selecionado a partir de um ou mais entre biotina/proteína de ligação à biotina, anticorpo/antígeno, enzima/substrato, receptor/ligante, metal/proteína de ligação ao metal, carboidrato/proteína de ligação ao carboidrato, lipídio/proteíina de ligação ao lipídio e etiqueta His/proteína de ligação à etiqueta His.
[00247] Em algumas modalidades, a primeira molécula de afinidade é biotina (ou um derivado ou fragmento da mesma), e a molécula de afinidade complementar é uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à biotina é rizavidina, avidina, estreptavidina, bradavidina, tamavidina, lentiavidina, zebavidina, NeutrAvidin, CaptAvidinTY, ou seu fragmento de ligação à biotina ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à biotina é rizavidina ou seu fragmento de ligação à biotina. Em algumas modalidades, proteína de ligação à biotina compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:13 ou seu fragmento de ligação à biotina. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à biotina compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:14 ou seu fragmento de ligação à biotina. Proteínas de fusão
[00248] Em algumas modalidades, um complexo imune aqui descrito inclui uma proteína de fusão que é ou compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita e um ou mais polipeptídeos aqui descritos. Em algumas modalidades, tais proteínas de fusão possuem propriedades de transportador e/ou antigênicas. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão é ou compreende a proteína de ligação à biotina, ou seu domínio de ligação à biotina, e um polipeptídeo.
[00249] Em algumas modalidades, a proteína de ligação à biotina compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:13 ou seu fragmento de ligação à biotina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:13, ou seu fragmento de ligação à biotihna. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à biotina compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:14 ou seu fragmento de ligação à biotina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:14, ou seu fragmento de ligação à biotina.
[00250] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um ou mais polipeptídeos derivados de um ou mais entre K. pneumoniae, P. aeruginosa e E. coli.
[00251] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende um ou mais ligantes e/ou etiqueta de histidina. Em algumas modalidades, um ligante compreende um polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15 (GGGGSSS). Em algumas modalidades, um ligante compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:15.
[00252] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos
80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:7 (Flagelina FlaB de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, uma proteina de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:6 (Flagelina FlIaA1 de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:9 (Flagelina FIaA2 de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[00253] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (Domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FlaB de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:11 (Domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIaA1 de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, uma proteina de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:12 (Domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIaA2 de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descritas (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (sistema de secreção tipo Ill (TTSS) PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[00254] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:7 (Flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:23. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (Domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:26.
[00255] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:7 (Flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 (MrkA conservada de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
[00256] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (Domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:3 (MrkA estabilizada de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO:24.
[00257] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreende uma molécula de afinidade complementar aqui descrita (p. ex., uma proteína de ligação à biotina aqui descrita) e um polipeptídeo um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:3 (MrkA estabilizada de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico do mesmo. Estruturas poliméricas
[00258] Talcomo descrito, em algumas modalidades, os complexos imunes da invenção incluem uma estrutura polimérica compreendendo um polímero conjugado a um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, o polímero é ou compreende um polissacarídeo, um polipeptídeo ou um dendrímero sintético. Em algumas modalidades, o polímero é ou compreende uma poli-L-lisina (PLL). Em algumas modalidades, o polímero é ou compreende uma PLL linear ou um dendrímero de L-lisina. Em algumas modalidades, o polímero é um CPS derivado de bactérias Gram-negativas ou Gram-positivas. Em algumas modalidades, o CPS é um CPS de K. pneumoniae, exopolissacarídeo de P. aeruginosa e/ou um CPS de E. coli. Em algumas modalidades, o polímero é um CPS K19 de KP. Em algumas modalidades, o polímero é um dendrímero de um monossacarídeo ou oligossacarídeo sintético. Em algumas modalidades, o polímero tem entre cerca de 50 KDa de tamanho. Em algumas modalidades, o polímero possui propriedades antigênicas. Em algumas modalidades, o polímero não é antigênico. Em algumas modalidades, o polímero é ou compreende um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, um ou mais dos polissacarídeos antigênicos podem ser um OPS de K. pneumoniae, um OPS de P. aeruginosa ou uma combinação destes. Estrutura polimérica 1 (BP-1)
[00259] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui uma estrutura polimérica compreendendo um polímero conjugado a um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica inclui uma primeira molécula de afinidade aqui descrita (p. ex., biotina) conjugada (p. ex., reticulada ou ligada covalentemente) ao polímero. Em algumas modalidades, o polímero é um polissacarídeo. Em algumas modalidades, o polissacarídeo antigênico é um polissacarídeo de antígeno O, antígeno O do core ou polissacarídeo do core. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica inclui pelo menos um polímero (p. ex, polissacarídeo) que é biotinilado e pelo menos um polissacarídeo antigênico (p. ex, pelo menos um polissacarídeo de antígeno O polissacarídeo) que não é biotinilado.
[00260] Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica que inclui pelo menos um polímero biotinilado (p. ex., polissacarídeo biotinilado) e pelo menos um polissacarídeo de antígeno O não biotinilado é produzido pela combinação de um polissacarídeo de antígeno O não biotinilado que contém um grupo de amina primária (nativo ou com um ligante) com um polissacarídeo parcialmente oxidado contendo um grupo aldeído e uma amina primária contendo biotina para obter uma mistura; e aminação redutiva da mistura com um agente redutor para ligar quimicamente o polissacarídeo de antígeno O (ou seja, polissacarídeo antigênico) com o polissacarídeo (ou seja, polímero), formando, assim, uma estrutura polimérica que inclui um polissacarídeo biotinilado ligado quimicamente a um polissacarídeo antigênico não biotinilado (ou seja, polissacarídeo de antígeno O não biotinilado).
[00261] Em algumas modalidades, o polissacarídeo de antígeno O é ligado quimicamente a um polímero parcialmente oxidado (p. ex., polissacarídeo) por meio de um espaçador. Em algumas modalidades, o espaçador é um espaçador curto. Em algumas modalidades, o espaçador curto contém uma amina primária em cada uma de suas extremidades. Em algumas modalidades, o espaçador pode ser di- hidrazida do ácido adípico. Em algumas modalidades, o polímero (p. ex., polissacarídeo) é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente não é biotinilado.
[00262] Em algumas modalidades, um polissacarídeo de antígeno O compreende um grupo amino primário. Em algumas modalidades, o grupo amino primário é o grupo a-amino de L-alanina do polissacarídeo O do outer core de P. aeruginosa ou um grupo amino que foi introduzido na extremidade redutora do polissacarídeo de antígeno O ligando quimicamente uma molécula espaçadora, contendo um grupo primário em cada extremidade, por aminação redutiva com um agente redutor. Em algumas modalidades, um polissacarídeo de antígeno O compreendendo um grupo amino primário é ligado quimicamente misturando o polissacarídeo de antígeno O, compreendendo um grupo amino primário, com um polímero parcialmente oxidado (p. ex. polissacarídeo) contendo um grupo aldeído e uma amina primária contendo biotina para obter uma mistura; e submeter a mistura à aminação redutiva com um agente redutor, formando, assim, uma estrutura polimérica, em que o polímero (p. ex., polissacarídeo) é biotinilado, mas o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente não é biotinilado.
[00263] Em algumas modalidades, o polímero (p. ex., polissacarídeo) é parcialmente oxidado com um agente oxidante. Em algumas modalidades, o agente oxidante compreende periodato de sódio. Em algumas modalidades, o agente redutor compreende cianoborohidreto de sódio ou borohidreto de sódio.
Estrutura polimérica 1.2 (BP-1.2)
[00264] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui uma estrutura polimérica compreendendo um polímero conjugado a um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica inclui uma primeira molécula de afinidade aqui descrita (p. ex., biotina) conjugada (p. ex., reticulada ou ligada covalentemente) ao polímero. Em algumas modalidades, o polímero é um polissacarídeo. Em algumas modalidades, o polissacarídeo antigênico é um polissacarídeo de antígeno O, core-O- antígeno O do core ou polissacarídeo do core. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica inclui pelo menos um polímero (p. ex., polissacarídeo) que é biotinilado e pelo menos um polissacarídeo antigênico (p. ex., pelo menos um polissacarídeo de antígeno O) que não é biotinilado.
[00265] Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica que inclui pelo menos um polímero biotinilado (p. ex., polissacarídeo biotinilado) e pelo menos um polissacarídeo de antígeno O não biotinilado é produzido pela combinação de um polissacarídeo de antígeno O não biotinilado que contém um grupo de amina primária (nativo ou com um ligante) com um polissacarídeo parcialmente oxidado, contendo um ou mais grupos aldeído, e um ou mais resíduos de biotina introduzidos em um sítio ortogonal por reação com carbodiimida (EDC) e N hidroxissuccinimida (NHS) e utilizando os carboxilatos dos resíduos de ácido urônico do polissacarídeo, e aminação redutiva da mistura com um agente redutor para ligar quimicamente o polissacarídeo de antígeno O (ou seja, polissacarídeo antigênico) ao polissacarídeo (ou seja, polímero), formando, assim, uma estrutura polimérica que inclui um polissacarídeo biotinilado ligado quimicamente a um polissacarídeo antigênico não biotinilado (ou seja, polissacarídeo de antígeno O não biotinilado) Em algumas modalidades, o polissacarídeo de antígeno O é ligado quimicamente ao polímero parcialmente oxidado (p. ex., polissacarídeo) por meio de um espaçador. Em algumas modalidades, o espaçador é um espaçador curto. Em algumas modalidades, o espaçador curto contém uma amina primária em cada uma de suas extremidades. Em algumas modalidades, o espaçador pode ser di-hidrazida do ácido adípico. Em algumas modalidades, o polímero (p. ex., polissacarídeo) é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente não é biotinilado.
[00266] Em algumas modalidades, um polissacarídeo de antígeno O compreende um grupo amino primário. Em algumas modalidades, o grupo amino primário é o grupo a-amino de L-alanina do polissacarídeo O do outer core de P. aeruginosa ou um grupo amino que foi introduzido na extremidade redutora do polissacarídeo de antígeno O ligando quimicamente uma molécula espaçadora, contendo um grupo primário em cada extremidade, por aminação redutiva com um agente redutor. Em algumas modalidades, um polissacarídeo de antígeno O compreendendo um grupo amino primário é ligado quimicamente misturando o polissacarídeo de antígeno O, compreendendo um grupo amino primário, com polímero parcialmente oxidado (p. ex, polissacarídeo) contendo um grupo aldeído e uma amina primária contendo biotina para obter uma mistura; e submeter a mistura à aminação redutiva com um agente redutor, formando, assim, uma estrutura polimérica, em que o polímero (p. ex., polissacarídeo) é biotinilado, mas o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente não é biotinilado.
[00267] Emalgumas modalidades, o polímero (p. ex., polissacarídeo) é parcialmente oxidado com um agente oxidante. Em algumas modalidades, o agente oxidante compreende periodato de sódio. Em algumas modalidades, o agente redutor compreende cianoborohidreto de sódio ou borohidreto de sódio.
[00268] Em algumas modalidades, um OPS compreendendo um aldeído ou cetona é aminado em sua extremidade terminal redutora utilizando um espaçador curto que contém uma amina primária em cada extremidade (p. ex., di-hidrazida adípica ADH), por aminação redutiva com cianoborohidreto de sódio (NabBH3CN) para produzir um OPS derivado com hidrazida. Em algumas modalidades, uma estrutura de CPS KP19 é biotinilado, com um ou mais resíduos de biotina introduzidos em um sítio ortogonal, pela reação dos carboxilatos dos resíduos de ácido urônico do polissacarídeo com carbodiimida (EDC), N-hidroxissuccinimida (NHS) e um derivado da biotina contendo amina primária (como, p. ex., amina-PEG3-biotina). Em algumas modalidades, o polímero de CPS KP19 biotinilado é, a seguir, parcialmente oxidado com periodato para gerar um ou mais grupos aldeído, misturado com o OPS derivado com hidrazida, e a mistura é aminada por redução com agente redutor, como cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN), para formar uma estrutura polimérica BP-1.2 compreendendo uma ou mais porções de biotina nos resíduos urônicos da estrutura polimérica e nenhuma biotina no polissacarídeo de antígeno O. Estrutura polimérica 1.3 (BP-1.3)
[00269] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui uma estrutura polimérica compreendendo um polímero conjugado a um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica inclui uma primeira molécula de afinidade aqui descrita (p. ex., biotina) conjugada (p. ex., reticulada ou ligada covalentemente) ao polímero. Em algumas modalidades, o polímero é um polissacarídeo. Em algumas modalidades, o polissacarídeo antigênico é um polissacarídeo de antígeno O, antígeno O do core ou polissacarídeo do core. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica inclui pelo menos um polímero (p. ex, polissacarídeo) que é biotinilado e pelo menos um polissacarídeo antigênico (p. ex., pelo menos um polissacarídeo de antígeno O) que não é biotinilado.
[00270] Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica que inclui pelo menos um polímero biotinilado (p. ex., polissacarídeo biotinilado) e pelo menos um polissacarídeo de antígeno O não biotinilado é produzido pela combinação de um polissacarídeo de antígeno O não biotinilado que contém um grupo de amina primária (nativo ou com um ligante) com um polissacarídeo ativado por CDAP, e um ou mais resíduos de biotina introduzidos em um sítio ortogonal pela reação com carbodiimida (EDC) e N hidroxissuccinimida (NHS) e utiizando os carboxilatos dos resíduos de ácido urônico do polissacarídeo, formando, assim, uma estrutura polimérica que inclui um polissacarídeo biotinilado ligado quimicamente a um polissacarídeo antigênico não biotinilado (ou seja, polissacarídeo de antígeno O não biotinilado). Em algumas modalidades, o polissacarídeo de antígeno O é ligado quimicamente a um polímero ativado por CDAP (p. ex., polissacarídeo) por meio de um espaçador. Em algumas modalidades, o espaçador é um espaçador curto. Em algumas modalidades, o espaçador curto contém uma amina primária em cada uma de suas extremidades. Em algumas modalidades, o espaçador pode ser di- hidrazida do ácido adípico. Em algumas modalidades, o polímero (p.
ex., polissacarídeo) é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente não é biotinilado.
[00271] Em algumas modalidades, um OPS compreendendo um aldeído ou cetona é aminado em sua extremidade terminal redutora utilizando um espaçador curto, contendo uma amina primária em cada extremidade (p. ex., di-hidrazida adípica ADH), por aminação redutiva com cianoborohidreto de sódio (NabBH3CN) para produzir um OPS derivado com hidrazida. Em algumas modalidades, uma estrutura de CPS KP19 é biotinilado com um ou mais resíduos de biotina introduzidos em um sítio ortogonal pela reação dos carboxilatos dos resíduos de ácido urônico do polissacarídeo com carbodiimida (EDC), N-hidroxissuccinimida (NHS) e um derivado da biotina contendo amina primária (como, p. ex., amina-PEG3-biotina). Em algumas modalidades, o polímero de CPS K19 biotinilado é, a seguir, ativado com CDAP, misturado com o OPS derivado com hidrazida, para formar uma estrutura polimérica BP-1.3 compreendendo uma ou mais porções de biotina nos resíduos urônicos da estrutura polimérica e nenhuma biotina no polissacarídeo de antígeno O.
Estrutura polimérica 2a (BP-2a)
[00272] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui uma estrutura polimérica compreendendo um polímero conjugado a um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica inclui uma primeira molécula de afinidade aqui descrita (p. ex., biotina) conjugada (p. ex., reticulada ou ligada covalentemente) ao polímero, e inclui uma primeira molécula de afinidade aqui descrita (p. ex., biotina) conjugada (p. ex., reticulada ou ligada covalentemente) a um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, o polímero é um polissacarídeo. Em algumas modalidades, o polissacarídeo antigênico é um polissacarídeo de antígeno O. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica inclui pelo menos um polímero (p. ex., polissacarídeo) que é biotinilado e pelo menos um polissacarídeo de antígeno O que é biotinilado.
[00273] Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica que inclui pelo menos um polímero biotinilado (p. ex., polissacarídeo biotinilado) e pelo menos um polissacarídeo de antígeno O biotinilado é produzido pela combinação de um polissacarídeo de antígeno O com um polímero parcialmente oxidado (p. ex., polissacarídeo) contendo um grupo aldeído para obter uma mistura; e aminação redutiva da mistura com um agente redutor para ligar quimicamente o polissacarídeo de antígeno O ao polímero (p. ex., polissacarídeo), formando, assim, uma estrutura polimérica que inclui um polissacarídeo de antígeno O e um polímero (p. ex., polissacarídeo); e derivação da estrutura polimérica com CDAP ou outro reagente de cianização (p. ex., CNBr) e uma amina primária contendo biotina, formando, assim, uma estrutura polimérica que inclui um polímero biotinilado (p. ex., polissacarídeo biotinilado) ligado quimicamente a um polissacarídeo polimérico do antígeno O biotinilado.
[00274] Em algumas modalidades, o polissacarídeo de antígeno O é ligado quimicamente a uma estrutura polissacarídica parcialmente oxidado por meio de um espaçador. Em algumas modalidades, o espaçador é um espaçador curto. Em algumas modalidades, o espaçador curto contém uma amina primária em cada uma de suas extremidades. Em algumas modalidades, o espaçador pode ser di- hidrazida do ácido adípico.
[00275] Em algumas modalidades, um polissacarídeo de antígeno O compreende um grupo amino primário. Em algumas modalidades, o grupo amino primário é o grupo a-amino de L-alanina do polissacarídeo de antígeno O do outer core de P. aeruginosa ou um grupo amino que foi introduzido na extremidade redutora do polissacarídeo de antígeno O ligando quimicamente uma molécula espaçadora curta, contendo um grupo primário em cada extremidade, por aminação redutiva com um agente redutor.
[00276] Emalgumas modalidades, o polímero (p. ex., polissacarídeo) é parcialmente oxidado com um agente oxidante. Em algumas modalidades, o agente oxidante compreende periodato de sódio. Em algumas modalidades, o agente redutor compreende cianoborohidreto de sódio ou borohidreto de sódio. Estrutura polimérica 2b (BP-2b)
[00277] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui uma estrutura polimérica compreendendo um polímero conjugados a um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica inclui uma primeira molécula de afinidade aqui descrita (p. ex., biotina) conjugada (p. ex., reticulada ou ligada covalentemente) ao polissacarídeo antigênico. Em algumas modalidades, o polínero é um polissacarídeo. Em algumas modalidades, o polissacarídeo antigênico é um polissacarídeo de antígeno O. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica inclui pelo menos um polímero (p. ex., polissacarídeo) que não é biotinilado e pelo menos um polissacarídeo de antígeno O biotinilado.
[00278] Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica que inclui pelo menos um polímero não biotinilado (p. ex., polissacarídeo não biotinilado) e pelo menos um polissacarídeo de antígeno O biotinilado é produzido pela biotinilação de um polissacarídeo de antígeno O, compreendendo as repetições do polissacarídeo o e um ou mais KDOs alfa do core e/ou porções de heptose com CDAP e uma amina primária contendo biotina, para obter uma mistura do polissacarídeo de antígeno O biotinilado; oxidação parcial da mistura de OPS biotinilado com periodato de sódio para introduzir aldeídos nos KDOs do core e/ou porções de heptose e/ou resíduos de OPS; aminação redutiva do polissacarídeo biotinilado com di-hidrazida de ácido adípico; mistura do
OPS biotinilado e aminado com o polímero parcialmente oxidado (p. ex., polissacarídeo) para formar uma mistura; e aminação redutiva da mistura; formando, assim, uma estrutura polimérica que inclui um polímero (p. ex., polissacarídeo) que não é biotinilado e um polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente que é biotinilado.
[00279] Em algumas modalidades, o polissacarídeo de antígeno O é parcialmente oxidado com um agente oxidante. Em algumas modalidades, o agente oxidante compreende periodato de sódio. Em algumas modalidades, o agente redutor compreende cianoborohidreto de sódio ou borohidreto de sódio. Estrutura polimérica 3 (BP-3)
[00280] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito inclui uma estrutura polimérica compreendendo um polímero conjugado a um ou mais polissacarídeos antigênicos. Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica inclui uma primeira molécula de afinidade aqui descrita (p. ex., biotina) conjugada (p. ex., reticulada ou ligada covalentemente) ao polissacarídeo antigênico. Em algumas modalidades, o polímero é um polímero de poli-L-lisina (PLL). Em algumas modalidades, o polissacarídeo antigênico é um polissacarídeo de antígeno O. Em algumas modalidades, a estrutura polimérica inclui pelo menos um polissacarídeo de antígeno O biotinilado e um polímero de PLL.
[00281] Em algumas modalidades, uma estrutura polimérica que inclui pelo menos um polímero não biotinilado (p. ex., PLL polímero de PLL não biotinilado) e pelo menos um polissacarídeo de antígeno O biotinilado é produzido por aminação redutiva de um polissacarídeo de antígeno O, contendo aldeídos terminais ou KDOs, com os grupos £- NH2 de um polímero de PLL para produzir um polímero de OPS PLL; tratamento ou não da mistura com um reagente de acilação para capeamento dos grupos e-NH2 não reagidos do polímero de PLL;
derivação do OPS com CDAP para formar uma mistura do derivado; e reação da mistura do derivado com uma amina primária contendo biotina; produzindo, assim, uma estrutura polimérica, em que o polímero de PLL capeado ou PLL não capeado N-acetilado não é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno O ligado quimicamente é biotinilado.
[00282] Em algumas modalidades, o agente de acilação é anidrido acético ou cloreto de acetila.
[00283] Em algumas modalidades, a "química click" é utilizada para ligar o polímero (p. ex., polissacarídeo), equipado com um grupo alcino funcional em seus grupos carboxilato, ou oxidar aldeídos do polissacarídeo ao polissacarídeo de antígeno O derivado com grupos azido em sua extremidade terminal. A ligação de química click dos 2 polissacarídeos é realizada com um catalisador em meio aquoso. A ligação de química click do polissacarídeo de antígeno O ao polissacarídeo pode ser utilizada de maneira inversa quer com o grupo azido anexado ao OPS e o grupo alcino anexado ao polissacarídeo ou vice-versa. A biotinilação pode ser efetuada utilizando essa química seletivamente no polissacarídeo para gerar a estrutura polimérica-1 ou no polissacarídeo de antígeno O para gerar a estrutura polimérica-2b.
[00284] Em algumas modalidades, o catalisador para a cicloadição alcino-azida é sulfato de cobre. Em algumas modalidades, o grupo alcino para derivar do polissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em 1-Amino-3-butino, 1-Amino-4-pentino, DBCO-amina e Alcino-PEG4-Amina.
[00285] Em algumas modalidades, o grupo azida para derivar do polissacarídeo de antígeno O em sua extremidade redutora é selecionado a partir do grupo que consiste em Amino-PEG-Azida, Azido-PEG3-Amine, Azido-Propilamina e Azido-Butilamina. Usos de complexos imunogênicos
[00286] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito que inclui um ou mais polissacarídeos antigênicos é caracterizado pelo fato de que um ou mais entre opsonização e imunogenicidade de um ou mais polissacarídeos antigênicos são aumentados em relação a um nível predeterminado, conforme medido por ELISA e/ou por um ensaio funcional com anticorpos. Em algumas modalidades, um ou mais entre opsonização e imunogenicidade de um ou mais dos polissacarídeos antigênicos são aumentados pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes em relação a um nível predeterminado, conforme medido por ELISA e/ou por um ensaio funcional com anticorpos. Em algumas modalidades, o nível predeterminado é um nível pré-imune. Em algumas modalidades, a valência dos epítopos de um ou mais dos polissacarídeos antigênicos é pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes acima daquela do polissacarídeo nativo. Em algumas modalidades, um ou mais antígenos polipeptídicos são proteínas de transporte de um ou mais polissacarídeos antigênicos.
[00287] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito, quando administrada a um indivíduo, induz a produção de anticorpos contra um ou mais patógenos no indivíduo em um nível maior do que uma composição compreendendo um polissacarídeo antigênico sozinho e não compreendendo a estrutura polimérica, conforme medido por ELISA. Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito, quando administrada a um indivíduo, induz a produção de anticorpos contra um ou mais patógenos no indivíduo em um nível maior do que uma composição compreendendo a estrutura polimérica e não um polissacarídeo antigênico sozinho, conforme medido por ELISA.
[00288] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito, quando administrada a um indivíduo, induz uma resposta imune contra um ou mais patógenos no indivíduo em um nível maior do que uma composição compreendendo um polissacarídeo antigênico sozinho e não compreendendo a estrutura polimérica. Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito, quando administrada a um indivíduo, induz uma resposta imune contra um ou mais patógenos no indivíduo em um nível maior do que uma composição compreendendo a estrutura polimérica e não um polissacarídeo antigênico sozinho. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de anticorpos ou de células B. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de células T CD4+, incluindo resposta de Th1, Th2 ou Thi7, ou uma resposta de células T CD8+ ou resposta de células T CD4+/CD8+. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de anticorpos ou de células B e uma resposta de células T.
[00289] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito, quando administrada a um indivíduo, induz a produção de anticorpos contra um ou mais patógenos no indivíduo em nível maior do que uma composição compreendendo um antígeno polipeptídico sozinho e não compreendendo a estrutura polimérica, conforme medido por ELISA. Em algumas modalidades, um ou mais dos patógenos são selecionados dentre K. pneumoniae, P. aeruginosa e E. coli Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito, quando administrada a um indivíduo, provoca uma resposta imune contra um ou mais entre K. pneumoniae, P. aeruginosa e E. coli.
[00290] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito, quando administrada a um indivíduo, provoca uma resposta imune contra bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas. Em algumas modalidades, as bactérias Gram-negativas são selecionadas dentre K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli. e uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito, quando administrada a um indivíduo, gera anticorpos que reconhecem MrkA nativo em K. pneumoniae que expressam MrkA.
[00291] Em algumas modalidades, um complexo imunogênico aqui descrito compreende um ou mais antígenos polipeptídicos. Em algumas modalidades, um ou mais dos antígenos polipeptídicos é um polipeptídeo bacteriano, um polipeptídeo fúngico e/ou um polipeptídeo viral. Em algumas modalidades, um ou mais dos antígenos polipeptídicos é um polipeptídeo derivado de Klebsiella, Pseudomonas, e/ou um polipeptídeo de E. coli.
[00292] Em algumas modalidades, pelo menos um dos polissacarídeos antigênicos é o exopolissacarídeo PsL de P. aeruginosa. Em algumas modalidades, o PslL compreende pelo menos um epítopo que se liga a um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:4 e/ou uma sequência tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:5 (Cam-003). Em algumas modalidades, pelo menos um antígeno polipeptídico compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:1 (Proteína da fímbria Tipo | de K. pneumoniae). Em algumas modalidades, pelo menos um antígeno polipeptídico compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 (proteína MrkA conservada da fímbria Tipo Ill de K. pneumoniae) ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência do monômero de MrkA estabilizada, SEQ ID NO:3 ou um fragmento imunogênico da mesma. Em algumas modalidades, pelo menos um antígeno polipeptídico é uma Flagelina FIiC subtipo A de P. aeruginosa, Flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa ou um fragmento imunogênico das mesmas. Em algumas modalidades, pelo menos um antígeno polipeptídico compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:6 (subtipo A1), uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:9 (subtipo A2), ou um fragmento imunogênico da mesma. Produção de complexos imunogênicos
[00293] A presente invenção inclui métodos para produzir os complexos imunogênicos aqui descritos. Em algumas modalidades, um método para produção dos complexos imunogênicos compreende complexar pelo menos uma estrutura polimérica biotinilada com pelo menos uma proteína de fusão que se liga à biotina. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com qualquer uma dentre SEQ ID NOs:16-
26. Doenças, Transtornos, e Condições
[00294] Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, um complexo imunogênico aqui revelado (p. ex., uma composição compreendendo um complexo imunogênico aqui descrito) induz a produção de anticorpos contra um ou mais patógenos no indivíduo em nível maior do que uma composição compreendendo um polissacarídeo antigênico e não compreendendo a estrutura polimérica, conforme medido por ELISA. Em algumas modalidades, um ou mais dos patógenos são selecionados dentre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli.
[00295] Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, um complexo imunogênico aqui revelado (p. ex., uma composição compreendendo um complexo imunogênico aqui descrito) provoca uma resposta imune contra um ou mais patógenos no indivíduo.
Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, um complexo imunogênico aqui revelado provoca uma resposta imune contra um ou mais patógenos no indivíduo em nível maior do que uma composição compreendendo um polissacarídeo antigênico e não compreendendo a estrutura polimérica. Em algumas modalidades, um ou mais dos patógenos são selecionados dentre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli.
[00296] Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, um complexo imunogênico aqui revelado (p. ex., uma composição compreendendo um complexo imunogênico aqui descrito) é utilizado para tratar ou prevenir uma infecção. Em algumas modalidades, a infecção é infecção de ferida por queimadura, infecção Gl, infecção do sítio cirúrgico, infecção do trato urinário, infecção da córnea, infecção cutânea e/ou de tecidos moles, infecção da ferida diabética, infecção relacionada a dispositivos (p. ex., cateter, implante cirúrgico, prótese). Em algumas modalidades, quando administrada a um indivíduo, uma composição imunogênica aqui revelada é utilizada para tratar ou prevenir pneumonia, sepse e/ou colonização. Composições imunogênicas e formulações
[00297] O relatório descritivo também provê composições que incluem um ou mais complexos imunogênicos aqui descritos. Por exemplo, uma composição imunogênica, p. ex., composição vacinal, pode incluir um ou mais complexos imunogênicos aqui descritos. Em algumas modalidades, tais composições podem incluir uma pluralidade de um tipo de complexo imunogênico aqui descrito. Além de ou alternativamente, tais composições podem incluir uma pluralidade de mais de um tipo de complexo imunogênico aqui descrito. Em algumas modalidades, os complexos imunogênicos aqui descritos são formulados em uma composição farmacêutica Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser uma vacina. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00298] Em algumas modalidades, a composição vacinal é uma vacina polivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, a valência de uma composição vacinal refere-se ao número de tipos de complexos imunogênicos presentes na composição vacinal. A valência de uma vacina aqui descrita não é limitante no que diz respeito aos antígenos totais presentes na referida composição farmacêutica, complexo imunogênico ou vacina, ou ao número de capas patogênicas contra os quais a administração da referida composição farmacêutica, complexo imunogênico, composição imunogênica ou composição vacinal pode induzir uma resposta imunoprotetora. Em um exemplo não limitante, uma composição vacinal 12-valente pode compreender mais de 12 componentes antigênicos (p. ex, componentes peptídicos e/ou polissacarídicos) e pode induzir uma resposta imunoprotetora contra mais de 12 patógenos ou cepas patogênicas.
[00299] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende entre 1-50 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende entre 1-25 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende entre 1-15 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende entre 1-10 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende entre 1-5 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma vacina é uma vacina polivalente.
[00300] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende 1 tipo de complexo imunogênico. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende 2 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende 4 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende 6 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende 8 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende 10 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende 12 tipos de complexos imunogênicos. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende dois ou mais tipos de complexos imunogênicos em quantidades tais que a massa de OPS na composição vacinal de cada composição imunogênica é diferente, p. ex., presentes em uma razão m/m que não é próxima de 1:1. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende dois ou mais tipos de complexos imunogênicos em quantidades tais que a massa de OPS na composição vacinal de cada composição imunogênica é quase a mesma, p. ex., presentes em uma razão m/m próxima de 1:1. Em algumas modalidades, a massa de OPS na vacina de cada composição imunogênica é próxima de 1 ug. Em algumas modalidades, a massa de OPS na vacina de cada composição imunogênica é próxima de 2 ug. Em algumas modalidades, a massa de OPS na vacina de cada composição imunogênica é próxima de 3 ug. Em algumas modalidades, a massa de OPS na vacina de cada composição imunogênica é próxima de 4 ug. Em algumas modalidades, a massa de OPS na vacina de cada composição imunogênica é próxima de 5 ug.
[00301] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende dois ou mais tipos de complexos imunogênicos em quantidades tais que a massa combinada de OPS e CPS na composição vacinal de cada composição imunogênica é diferente, p. ex., presentes em uma razão m/m que não é próxima de 1:1. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende dois ou mais tipos de complexos imunogênicos em quantidades tais que a massa combinada de OPS e CPS na composição vacinal de cada composição imunogênica é diferente, p. ex., presentes em uma razão m/m que não é próxima de 1:1. Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende dois ou mais tipos de complexos imunogênicos em quantidades tais que a massa combinada de OPS e CPS na composição vacinal de cada composição imunogênica é quase a mesma, p. ex., presentes em uma razão m/m próxima de 1:1. Em algumas modalidades, a massa combinada de OPS e CPS na vacina de cada composição imunogênica é próxima de 1 ug. Em algumas modalidades, a massa combinada de OPS e CPS na vacina de cada composição imunogênica é próxima de 2 ug. Em algumas modalidades, a massa de OPS na vacina de cada composição imunogênica é próxima de 3 ug. Em algumas modalidades, a massa combinada de OPS e CPS na vacina de cada composição imunogênica é próxima de 4 ug. Em algumas modalidades, a massa combinada de OPS e CPS na vacina de cada composição imunogênica é próxima de 5 ug.
[00302] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende dois ou mais tipos de composições imunogênicas selecionados a partir de: (a) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente àcomplexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(b) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O?2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(b') uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(c) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(d) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP OS5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(d') uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP OB5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(e) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp., e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(e) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp., e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(f) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(f) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(g) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(9) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(h) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(') uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(i) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA OS5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(])) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA OG6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(k) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O10 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; e (l) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O11 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada.
[00303] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende dois ou mais tipos de composições imunogênicas selecionados a partir de: (a) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (a) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (b) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP
O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(b') uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O?2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(c) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(C') uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(d) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP OB5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(d') uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP
OB5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(e) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(e) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(f) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(f) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O?2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(g) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA
O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(9') uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(h) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(') uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(i) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA OB5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(1) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA
OB5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(])) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(1) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA OG6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(k) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA 010 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(K) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O10 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(l) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA
O11 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (P) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O11 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada.
[00304] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (b) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O?2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (c) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (d) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP OB5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(e) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(f) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(9) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp., e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(h) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(i) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA OB5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (])) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA OG6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; (k) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA 010 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; e (l) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O11 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada.
[00305] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(b) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(c) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(d) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(e) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(f) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(g) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(h) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(i) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(])) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA OG6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada;
(k) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA 010 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada; e (1) uma composição imunogênica compreendendo uma estrutura polimérica incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O11 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente à estrutura polimérica biotinilada.
[00306] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende dois ou mais tipos de composições imunogênicas selecionados a partir de: (a) uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O1 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (a') uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O1 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV; (b) uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O?2 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (b') uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O2 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV; (c) uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O3 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (c') uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O3 e uma proteína de fusão FlaBD2-PecrV; (d) uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O5 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (d') uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O5 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV; (e) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O1 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (e) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O1 e uma proteína de fusão FlaBD2-PerV;
(f) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O2 e uma fusão FlaBD2-MrkA; (f) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O2 e uma proteína de fusão FlaBD2-PerV; (9) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O3 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (9) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O3 e uma proteína de fusão FlaBD2-PerV; (h) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O4 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (h') uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O4 e uma proteína de fusão FlaBD2-PerV; (i) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O5 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (1) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O5 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV; (]) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O6 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (1) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O6 e uma proteína de fusão FlaBD2-PerV; (K) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA 010 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (K') uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O10 e uma proteína de fusão FlaBD2-PerV; (l) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O11 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; e (P) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O11 e uma proteína de fusão FlaBD2-PerV.
[00307] Em algumas modalidades, um ou mais entre os tipos de composições imunogênicas compreendem ainda um ou mais polímeros.
Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FIlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem PLL.
[00308] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende uma composição imunogênica selecionada a partir de: (a) uma composição imunogênica compreendendo uma combinação de OPS de K. pneumoniae do tipo 01, O2, 03, O5 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; e (b) uma composição imunogênica compreendendo uma combinação de OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA.
[00309] Em algumas modalidades, um ou mais entre os tipos de composições imunogênicas compreendem ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS de K. pneumoniae é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FIlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades, o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem PLL.
[00310] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) uma composição imunogênica compreendendo: (1) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, O2, O3, O5 e qualquer combinação destes; e (ii) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; e/ou (b) uma composição imunogênica compreendendo: (i) um ou mais OPS de P. aeruginosa OPS do tipo O1, O2, 03, O4, O5, O6, 010, 011 e qualquer combinação destes; e (ii) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA.
[00311] Em algumas modalidades, um ou mais entre os tipos de composições imunogênicas compreendem ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem PLL.
[00312] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende uma composição imunogênica selecionada a partir de: (a) uma composição imunogênica compreendendo uma combinação de OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5, uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; e (b) uma composição imunogênica compreendendo uma combinação de OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6,
010, 011, uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV e uma proteína de fusão FIlaBD2-MrkA.
[00313] Em algumas modalidades, a vacina compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FIlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FIlaBD2-MrkA são conjugados ao polímero. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados ao polímero. Em algumas modalidades, o polímero compreende um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades, o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00314] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS K. pneumoniae do tipo 01, 02, 03, O5; e (b) um ou mais polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26.
[00315] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos OPS são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, o polímero compreende um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiela spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00316] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (b) um ou mais polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26.
[00317] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e um ou mais polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00318] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (c) um ou mais polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26.
[00319] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00320] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5;e (b) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA.
[00321] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00322] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (b) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA.
[00323] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00324] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, Os; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA.
[00325] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00326] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3,
O5;e (b) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV.
[00327] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00328] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (b) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV.
[00329] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00330] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3,
O5; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-PerV.
[00331] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00332] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo 01, O2, O3, Os; (b) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-PcerV.
[00333] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-
MFrkA e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugadas a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiela spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00334] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (b) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV.
[00335] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FIlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2- MFrkA e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugadas a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS, a proteína de fusão FIlaBD2-MrkA e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular
K19 de Klebsiela spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00336] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; e (d) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV.
[00337] Em algumas modalidades, a composição vacinal compreende ainda um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, um OPS é conjugado a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FIlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2- MFrkA e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugadas a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiela spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00338] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende:
(a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é conjugado a um ou mais polímeros; e (b) um ou mais polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26.
[00339] Em algumas modalidades, um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00340] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é conjugado a um ou mais polímeros; e (b) um ou mais polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26.
[00341] Emalgumas modalidades, um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00342] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, O2, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é conjugado a um ou mais primeiros polímeros; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é conjugado a um ou mais segundos polímeros; e (c) um ou mais polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26.
[00343] Emalgumas modalidades, um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos primeiros polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polipeptídeos são conjugados a um ou mais dos primeiros polímeros e a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros e um ou mais dos segundos polímeros são iguais. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros e um ou mais dos segundos polímeros são diferentes. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros compreendem um polissacarídeo capsular de um primeiro patógeno. Em algumas modalidades, um ou mais dos segundos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular de um segundo patógeno. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são bactérias diferentes. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são a mesma bactéria do mesmo sorotipo. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são a mesma bactéria de sorotipos diferentes. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros compreendem PLL. Em algumas modalidades, um ou mais dos segundos polímeros compreendem PLL.
[00344] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, O2, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é conjugado a um ou mais polímeros; e (b) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA.
[00345] Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiela spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00346] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é conjugado a um ou mais polímeros; e (b) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA.
[00347] Emalgumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiela spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00348] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, O2, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é conjugado a um ou mais polímeros; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, OA4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é conjugado a um ou mais segundos polímeros; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA.
[00349] Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros e a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros e um ou mais dos segundos polímeros são iguais. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros e um ou mais dos segundos polímeros são diferentes. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros compreendem um polissacarídeo capsular de um primeiro patógeno. Em algumas modalidades, um ou mais dos segundos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular de um segundo patógeno. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são bactérias diferentes. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são a mesma bactéria do mesmo sorotipo. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são a mesma bactéria de sorotipos diferentes. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros compreendem PLL. Em algumas modalidades, um ou mais dos segundos polímeros compreendem PLL.
[00350] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é conjugado a um ou mais polímeros; e (b) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV.
[00351] Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PerV é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiela spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00352] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo 01, O2, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é conjugado a um ou mais primeiros polímeros; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é conjugado a um ou mais segundos polímeros; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-PerV.
[00353] Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PerV é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros e a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros e um ou mais dos segundos polímeros são iguais. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros e um ou mais dos segundos polímeros são diferentes. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros compreendem um polissacarídeo capsular de um primeiro patógeno. Em algumas modalidades, um ou mais dos segundos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular de um segundo patógeno. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são bactérias diferentes. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são a mesma bactéria do mesmo sorotipo. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são a mesma bactéria de sorotipos diferentes. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros compreendem PLL. Em algumas modalidades, um ou mais dos segundos polímeros compreendem PLL.
[00354] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é conjugado a um ou mais polímeros; (b) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV.
[00355] Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugadas a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA e a proteína de fusão FlaBD2-
PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00356] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é conjugado a um ou mais polímeros; (b) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-PerV.
[00357] Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FIlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FIlaBD2-MrkA são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV são conjugadas a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um OPS, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA e a proteína de fusão FIlaBD2- PcrV são conjugados a um ou mais dos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00358] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3,
O5, em que o OPS de K. pneumoniae é conjugado a um ou mais primeiros polímeros; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é conjugado a um ou mais segundos polímeros; (c) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; e (d) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV.
[00359] Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros e um ou mais dos segundos polímeros são iguais. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros e um ou mais dos segundos polímeros são diferentes. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros compreendem um polissacarídeo capsular de um primeiro patógeno. Em algumas modalidades, um ou mais dos segundos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular de um segundo patógeno. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são bactérias diferentes. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são a mesma bactéria do mesmo sorotipo. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são a mesma bactéria de sorotipos diferentes. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros compreendem PLL. Em algumas modalidades, um ou mais dos segundos polímeros compreendem PLL. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FIaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FIlaBD2-PcrV é conjugado a um ou mais dos primeiros polímeros e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros e a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros e a um ou mais dos segundos polímeros.
[00360] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende dois ou mais tipos de composições imunogênicas selecionadas a partir de: (a) uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O1 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (a') uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O1 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV; (b) uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O?2 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (b') uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O?2 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV; (c) uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O3 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (0') uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP O3 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV; (d) uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP OB ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (d') uma composição imunogênica compreendendo um OPS KP OB ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PecrV; (e) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O1 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA;
(e') uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O1 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV; (f) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O?2 ligado covalentemente a uma fusão FlaBD2-MrkA; (f) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O?2 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PerV; (9) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O3 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (9) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O3 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV; (h) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O4 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (h') uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O4 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PecrV; (i) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA OS5 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (1) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA OB ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PecrV; (])) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O6 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (]) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O6 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PecrV; (k) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O10 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; (K') uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O10 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV; (1) uma composição imunogênica compreendendo um OPS PA O11 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA; e (1) uma composição imunogênica compreendendo um OPS
PA O11 ligado covalentemente a uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV.
[00361] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende dois ou mais tipos de composições imunogênicas selecionadas a partir de: (a) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O1 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao KP O1 OPS; (a') uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O1 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao KP O1 OPS; (b) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O?2 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao KP O2 OPS; (b') uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O2 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao KP O2 OPS; (c) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O3 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao KP O3 OPS; (c') uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O3 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao KP O3 OPS; (d) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O5 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao KP O5 OPS; (d') uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O5 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao KP O5
(e) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O1 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O1 OPS;
(e) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O1 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O1 OPS;
(f) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O? e uma fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O2 OPS;
(f) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O? e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O2 OPS;
(9) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O3 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O3 OPS;
(9') uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O3 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O3 OPS;
(h) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O4 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O4 OPS;
(h') uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O4 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O4 OPS;
(1) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O5 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O5 OPS; (1) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O5 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O5 OPS; (]) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O6 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O6 OPS; (1) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O6 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA O6 OPS; (K) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA 010 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA 010 OPS; (K') uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA 010 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA 010 OPS; (1) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA 011 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA 011 OPS; e (P) uma composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA 011 e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou ao PA 011 OPS.
[00362] Em algumas modalidades, pelo menos um polímero compreende um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades, o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00363] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende uma composição imunogênica selecionada a partir de: (a) uma composição imunogênica incluindo um polímero, uma combinação de OPS de K. pneumoniae do tipo 01, 02, 03, O5 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou a pelo menos um dos tipos de OPS; e (b) uma composição imunogênica incluindo um polímero, uma combinação de OPS de P. aeruginosa do tipo 01, 02, 03, O4, O5, O6, 010, 011 e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão é ligada covalentemente ao polímero e/ou a pelo menos um dos tipos de OPS.
[00364] Em algumas modalidades, pelo menos um polímero compreende um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, o polímero compreende uma PLL.
[00365] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende uma composição imunogênica selecionada a partir de: (a) uma composição imunogênica compreendendo um ou mais primeiros polímeros, uma combinação de OPS de K. pneumoniae do tipo O1, O2, 03, O5, uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos primeiros polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos primeiros polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS; e (b) uma composição imunogênica compreendendo um ou mais segundos polímeros, uma combinação de OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, 010, 011, uma proteína de fusão FIlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos segundos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS, e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos segundos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00366] Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros e a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros e a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros e a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, a proteína de fusão FIlaBD2-PecrV é conjugada a um ou mais dos primeiros polímeros e a um ou mais dos segundos polímeros. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros e um ou mais dos segundos polímeros são iguais. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros e um ou mais dos segundos polímeros são diferentes. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros compreendem um polissacarídeo capsular de um primeiro patógeno. Em algumas modalidades, um ou mais dos segundos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular de um segundo patógeno. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são bactérias diferentes. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são a mesma bactéria do mesmo sorotipo. Em algumas modalidades, o primeiro patógeno e o segundo patógeno são a mesma bactéria de sorotipos diferentes. Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros polímeros compreendem PLL. Em algumas modalidades, um ou mais dos segundos polímeros compreendem PLL.
[00367] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros; (b) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5; e (c) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26, em que o polipeptídeo é ligado covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00368] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00369] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (c) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26, em que o polipeptídeo é ligado covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00370] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00371] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, Os; (c) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (d) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26, em que o polipeptídeo é ligado covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00372] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella Spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00373] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, O2, O3, O5;e (c) uma fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão
FIlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00374] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00375] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00376] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00377] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo 01, O2, O3, Os; (c) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (d) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00378] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00379] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5;e (c) uma fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00380] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella Spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00381] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00382] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende
[00383] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5; (c) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (d) uma fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FIlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00384] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00385] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, Os; (c) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS; e (d) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00386] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00387] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS; e (d) uma fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00388] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella Spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00389] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5; (c) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, 06, 010, O11; e (d) uma fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS; e (e) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00390] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00391] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo 01, O2, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; e (b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26, em que o polipeptídeo é ligado covalentemente ao menos a uma parte do polímero e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00392] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00393] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; e (b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre
SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26, em que o polipeptídeo é ligado covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00394] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00395] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, O2, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; e (c) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de uma ou mais dentre SEQ ID NOs: 1-3, 6-12 ou 16-26, em que o polipeptídeo é ligado covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00396] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella Spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00397] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3,
O5, em que o OPS de K. pneumoniae é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; e (b) uma fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00398] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00399] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; e (b) uma fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FIlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00400] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00401] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; e (c) uma fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00402] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00403] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais polímeros, (b) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5;e (c) uma fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00404] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00405] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; e (b) uma fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00406] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00407] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; e (c) uma fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00408] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella Spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00409] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo 01, O2, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; (b) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS; e (c) uma fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão
FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00410] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00411] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; (b) uma fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS; e (c) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00412] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00413] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) um ou mais OPS de K. pneumoniae do tipo O1, 02, O3, O5, em que o OPS de K. pneumoniae é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; (b) um ou mais OPS de P. aeruginosa do tipo O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011, em que o OPS de P. aeruginosa é ligado covalentemente a um ou mais polímeros; (c) uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA, em que a proteína de fusão FlaBD2-MrkA é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS; e (d) uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV, em que a proteína de fusão FlaBD2-PcrV é ligada covalentemente ao menos a uma parte de um ou mais dos polímeros e/ou ao menos a um dos tipos de OPS.
[00414] Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreendem um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00415] Em algumas modalidades, uma composição vacinal compreende: (a) uma primeira composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O1 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA ligada covalentemente ao polímero; (b) uma segunda composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O2 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV ligada covalentemente ao polímero; (c) uma terceira composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O3 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA ligada covalentemente ao polímero; (d) uma quarta composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS KP O5 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV ligada covalentemente ao polímero; (e) uma quinta composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O1 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV ligada covalentemente ao polímero; (f) uma sexta composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O2 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV ligada covalentemente ao polímero; (g) uma sétima composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O3 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV ligada covalentemente ao polímero; (h) uma oitava composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O4 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-PcrV ligada covalentemente ao polímero; (i) uma nona composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O5 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA ligada covalentemente ao polímero; ()) uma décima composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O6 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA ligada covalentemente ao polímero; (k) uma décima primeira composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA 010 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA ligada covalentemente ao polímero; e (1) uma décima segunda composição imunogênica incluindo um polímero, um OPS PA O11 conjugado ao polímero e uma proteína de fusão FlaBD2-MrkA ligada covalentemente ao polímero.
[00416] Em algumas modalidades, pelo menos um dos polímeros compreende um polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella Spp. Em algumas modalidades, um ou mais dos polímeros compreende PLL.
[00417] Quantidades ótimas de componentes para uma vacina em particular podem ser apuradas por estudos padrão envolvendo a observação de respostas imunes adequadas em indivíduos. Após uma vacina inicial, os indivíduos podem receber uma ou diversas imunizações de reforço adequadamente espaçadas no tempo.
[00418] Os complexos imunogênicos aqui descritos e/ou preparados destes podem ser formulados em uma forma de dose unitária para facilidade de administração e uniformidade das doses. O nível específico terapeuticamente eficaz da dose para qualquer paciente ou organismo em particular pode depender de vários fatores, incluindo a gravidade ou grau de risco de infecção; a atividade da vacina específica ou composição vacinal empregada; outras características da vacina específica ou composição vacinal empregada; a idade, peso corporal, saúde em geral, sexo do indivíduo, dieta do indivíduo, condição farmacocinética do indivíduo, o momento de administração (p. ex., em relação a outras atividades do indivíduo como comer, dormir, receber outros medicamentos incluindo outras doses de vacinas, etc.), a via de administração, taxa de da vacina específica ou composição vacinal empregada; vacinas usadas em combinação ou coincidentemente com a composição vacinal empregada; e fatores semelhantes bem conhecidos no campo da medicina.
[00419] Complexos imunogênicos para uso de acordo com a presente invenção podem ser formulados em composições (p. ex., composições farmacêuticas) de acordo com técnicas conhecidas. À preparação de vacinas é geralmente descrita em Vaccine Design (Powell and Newman, 1995). Por exemplo, uma quantidade imunogênica de um produto vacinal pode ser formulada junto com materiais carreadores orgânicos ou inorgânicos, líquidos ou sólidos, farmaceuticamente aceitáveis. A preparação de vacinas conjugadas e de polissacarídeos pneumocócicos é descrita, por exemplo, em USSN 11/395 593, depositado em 31 de março 2006, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.
[00420] Em geral, o(s) veículo(s) farmaceuticamente aceitável(is) incluifem) solventes, meios de dispersão e os semelhantes, os quais são compatíveis com a administração farmacêutica. Por exemplo, os materials que podem server como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, açúcares como lactose, glicose, dextrose e sacarose; amidos como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados como carboximetilcelulose sódica, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanta em pó; malte; gelatina; talco; excipientes como manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos como óleo de amendoim, óleo de sementes de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; polióis como glicerol, propilenoglico!l e polietilenoglico! líquido; ésteres como etil oleato e etil laurato; ágar; agentes de tamponamento como hidróxido de magnésio; ácido algínico; água livre de pirógenos; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico e soluções tampão com fosfato, bem como outros lubrificantes compatíveis não tóxicos como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, além de conservantes e antioxidantes que também podem estar presentes na composição, de acordo com o juízo do formulador (Martin, 1975).
[00421] Vacinas podem ser formuladas combinando um ou mais dos complexos imunogênicos aqui revelados com veículos e/ou outros componentes opcionais por qualquer meio disponível, incluindo, por exemplo, mistura convencional, granulação, dissolução, liofilização ou processos similares.
[00422] “Composições vacinais úteis nos métodos providos podem ser liofilizadas até que próximas de serem utilizadas, em cujo momento são reconstituídas extemporaneamente com diluente. Em algumas modalidades, os componentes ou composições vacinais são liofilizados na presença de um ou mais outros componentes (p. ex., adjuvantes), e são reconstituídos extemporaneamente com solução salina. Alternativamente, componentes individuais ou grupos de componentes podem ser liofilizados e/ou armazenados separadamente (p. ex., em um kit de vacinação), os componentes sendo reconstituídos e misturados antes do uso ou administrados separadamente ao indivíduo.
[00423] A liofiização pode produzir uma composição mais estável (por exemplo, prevenindo ou reduzindo a decomposição de antígenos polissacarídeos). A liofiização de vacinas ou componentes vacinais é bem conhecida na técnica. Tipicamente, uma vacina ou componente vacinal líquido é seco por congelamento, frequentemente na presença de um agente antiaglomerante (como, por exemplo, açúcares como sacarose ou lactose) Em algumas modalidades, o agente antiaglomerante está presente, por exemplo, em uma concentração inicial de 10-200 mg/mL. A liofilização ocorre tipicamente ao longo de uma série de etapas, por exemplo, um ciclo iniciando a -69 “ºC, gradualmente ajustando para -24 ºC ao longo de 3 horas, então mantendo essa temperatura por 18 horas, depois ajustando gradualmente para -16 ºC ao longo de 1 hora, então mantendo essa temperatura por 6 horas, depois ajustando gradualmente para +34 ºC ao longo de 3 horas e, finalmente, mantendo essa temperatura ao longo de 9 horas.
[00424] As vacinas ou componentes vacinais para uso de acordo com a presente invenção podem ser incorporados em lipossomas, cocleatos, polímeros biodegradáveis, como poli-lactídeo, poli-glicolídeo e poli-lactídeo-co-glicolídeos, ou complexos imunoestimulantes (ISCOMS).
[00425] Em certas situações, pode ser desejável prolongar o efeito de uma vacina ou para uso de acordo com a presente invenção, por exemplo, tornando mais lenta a absorção de um ou mais componentes da vacina. Tal atraso da absorção pode ser conseguido, por exemplo, pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com baixa solubilidade em água. A taxa de absorção do produto depende, então, de sua taxa de dissolução, a qual, por sua vez, pode depender do tamanho e forma. Alternativa ou adicionalmente, a absorção retardada pode ser alcançada dissolvendo ou suspendendo um ou mais componentes da vacina em um veículo oleoso. Formas injetáveis de depósito também podem ser empregadas para retardar a absorção. Tais formas de depósito podem ser preparadas formando matrizes de microcápsulas de um ou mais componentes da vacina em uma rede de polímeros biodegradáveis. Dependendo da razão polímero/componente da vacina, e da natureza do(s) polímero(s) empregado(s) em particular, a taxa de liberação pode ser controlada.
[00426] Os exemplos de polímeros biodegradáveis que podem ser empregados de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Um polímero exemplar em particular é de polilactídeo-poliglicolídeo.
[00427] Formulações injetáveis de depósito podem também ser preparadas retendo o produto em lipossomas ou microemulsões, os quais são compatíveis com os tecidos corporais.
[00428] Sistemas poliméricos de liberação podem também ser empregados em formulações não são de depósito, incluindo, por exemplo, formulações orais. Por exemplo, polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, como acetato de vinil etileno, poli-anidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico, etc., podem ser utilizados em formulações orais. Antígenos ou conjugados polissacarídicos podem ser formulados com tais polímeros, por exemplo, para preparar partículas, micropartículas, extrudados, dispersões sólidas, misturas ou outras combinações visando facilitar a preparação de formulações úteis (p. ex., oral).
[00429] As vacinas para uso de acordo com a presente invenção incluem composições imunogênicas, e, além disso, podem incluir um ou mais agentes ativos adicionais (ou seja, agentes que exercem um efeito biológico — não ingredientes inertes). Será apreciado que tais agentes adicionais podem ser formulados junto com um ou mais outros componentes vacinais, ou podem ser mantidos separadamente e combinado no momento ou próximo da administração. Em algumas modalidades, tais componentes adicionais podem ser administrados separadamente de alguns ou de todos os outros componentes da vacina, dentro de um intervalo de tempo adequado para que o efeito pertinente seja alcançado. Por exemplo, é comum na preparação de vacinas incluir um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes, em geral, são agentes que aprimoram a resposta imune a um antígeno. Em algumas modalidades, são utilizados adjuvantes que aprimoram uma resposta imune do tipo Th1. Em algumas modalidades, são utilizados adjuvantes que aprimoram uma resposta imune do tipo Th17.
Adjuvantes
[00430] Em algumas modalidades, os complexos imunogênicos aqui descritos são formulados e/ou administrados em combinação com um adjuvante. Em algumas modalidades, o adjuvante é selecionado a partir do grupo de hidróxido de alumínio, hidróxido de alumínio e fosfato, fosfato de alumínio, um agonista de TLR, um agonista de TLR2 (p. ex., uma saponina (p. ex., QS21, etc.), uma porina, etc.), um agonista de TLR3 (p. ex., dsRNA, polil:poliC, poli-|CLC, HiltonolS, etc.), um agonista de TLRA4 (p. ex., lipídio A monofosforilado (MPL A)), um agonista de TLRS5 (p. ex., uma flagelina); um agonista de TLR 7, 8 ou 9 (p. ex., CpG- oligonucleotídeo, etc.).
[00431] Em algumas modalidades, os adjuvantes adequados para uso de acordo com a presente invenção incluem, entre outros: (1) sais de alumínio (alúmen), como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações de emulsão óleo em água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos como peptídeos de muramila (definidos abaixo) ou componentes da parede celular bacteriana, como, por exemplo:
(a) MF59 (Publicação PCT Nº WO 90/14837), contendo esqualeno 5%, Tween 80 0,5% e Span 85 0,5% (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE (ver abaixo, embora não necessário)) formulado em partículas submicrométricas utilizando um microfluidizador como microfluidizador do Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA),
(b) SAF, contendo esqualeno 10%, Tween 80 0,4%, polímero plurônico L121em bloco 5% e thr-MDP (ver abaixo), microfluidizado em uma emulsão submicrométrica ou misturado em vórtice para gerar uma emulsão de partículas com tamanho maior e
(c) Sistema adjuvante Ribi"y (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) contendo esqualeno 2%, Tween 80 0,2% e um ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo que consiste em lipídio A monofosforilado 3-O-desacetilado (MPL'Y), descrito na Patente U.S.
Nº 4 912 094 (Corixa), dimicolato de trealose (TDM) estrutura da parede celular (CWS), de preferência MPL + CWS (Detox'"“);
(3) adjuvantes de saponina, como Quil A ou STIMULONTY QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Patente U.S.
Nº 5 057 540) podem ser utilizados ou partículas serem geradas a partir dos mesmos, como ISCOMs (complexos imunoestimulantes);
(4) lipopolissacarídeos bacterianos, análogos sintéticos do lipídio A como compostos aminoalquil glicosamina fosfato (AGP), ou derivados ou análogos destes, disponibilizados pela Corixa, e que são descritos na Patente U.S.
Nº 6 113 918; um desses AGP é 2-[(R)-3- 2- Desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranosídeo de tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etila, que é também conhecido como 529 (anteriormente conhecido como RC529), e formulado em forma aquosa ou como uma emulsão estável, polinucleotídeos sintéticos como oligonucleotídeos contendo motivo(s) CpG (Patente U.S. Nº 6 207 646); agonistas de TLR3 (dsRNA sintético, polil:poliC, Hiltonolº, disponibilizado pela InvivoGen); (5) citocinas, como interleucinas (p. ex., IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, 11-12, 11-15, 11-18, etc.), interferons (p. ex., interferon gama), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), fator de necrose tumoral (TNF), moléculas coestimulatórias B7-1 e B7-2, etc.; (6) mutantes detoxificados de uma toxina bacteriana ADP- ribosilante como toxina colérica (CT), em forma do tipo selvagem ou de mutante, por exemplo, em que o ácido glutâmico no aminoácido de posição 29 é substituído por outro aminoácido, de preferência uma histidina, de acordo com a Publicação do Pedido de Patente Internacional número WO 00/18434 (ver também WO 02/098368 e WO 02/098369), toxina pertussis (PT), ou uma toxina sensível ao calor de E. coli sensível ao calor (LT), especialmente LT-K63, LT-R72 e um novo mutante de LT, designado LT(R192G/L211A), ou dmLT podem gerar respostas de Th1i7 a antígenos vacinais (Andreasen, 2009; Norton, 2011; Norton, 2012; Leach, 2012; Toprani, 2017), CT-S109, PT- K9/G129 (ver, p. ex., WO 93/13302 e WO 92/19265); e (7) outras substâncias que atuam como agentes imunoestimulantes para reforçar a eficácia da composição., p. ex., delta inulina (Advaxº), Matriz M.
[00432] Os peptídeos de muramila incluem, entre outros, N-acetil- muramil-L-treonil-D-isoglutamina — (thr-MDP), — N-acetil-normuramil-L- alanina-2-(1"-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforilóxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
[00433] As vacinas para uso de acordo com a presente invenção podem incluir, ou ser administradas simultaneamente com, outra terapia antibacteriana. Por exemplo, tais vacinas podem incluir ou ser administradas com um ou mais agentes que eliminam ou retardam o crescimento de um patógeno. Tais agentes incluem, por exemplo, penicilina, vancomicina, eritromicina, azitromicina e claritromicina, cefotaxima, ceftriaxona, levoflaxino, gatifloxacino.
[00434] Alternativa ou adicionalmente, as vacinas para uso de acordo com a presente invenção podem incluir, ou ser administradas com, uma ou mais outras vacinas ou terapias. Por exemplo, um ou mais antígenos não pneumocócicos podem ser incluídos ou administrados com as vacinas. Administração
[00435] Em algumas modalidades, os complexos imunogênicos são administrados a um indivíduo em risco de doença, p. ex., pacientes hospitalizados. Será apreciado que um indivíduo pode ser considerado em risco de desenvolver uma doença sem que tenha sido diagnosticado com quaisquer sintomas da doença. Por exemplo, se sabidamente o indivíduo esteve ou se pretende estar em situações com risco relativamente alto de exposição à infecção, esse indivíduo será considerado em risco de desenvolver a doença (p. ex., paciente hospitalizado, um idoso vivendo por muito tempo em estabelecimento de assistência, etc.).
[00436] Qualquer via de administração eficaz pode ser utilizada, tal como, por exemplo, via oral, nasal, enteral, parenteral, intramuscular ou intravenosa, subcutânea, intradérmica, retal, vaginal, tópica, ocular, pulmonar ou aplicação por contato. Em algumas modalidades, as composições vacinais podem ser injetadas (p. ex., via intramuscular, intraperitoneal, intradérmica e/ou subcutânea); ou liberadas através da mucosa (p. ex., ao trato oral/alimentar, respiratório e/ou geniturinário. A administração intranasal de vacinas pode ser especialmente útil em alguns contextos, por exemplo, para o tratamento de pneumonia ou otite média (como a colonização nasofaríngea por pneumococos pode ser evitada mais efetivamente, atenuando, assim, a infecção em seu estágio mais precoce). Em algumas modalidades da invenção, pode ser desejável administrar doses diferentes de uma vacina por vias diferentes; em algumas modalidades, pode ser desejável administrar componentes diferentes de uma dose por vias diferentes.
[00437] Em algumas modalidades da presente invenção, as composições farmacêuticas (p. ex., vacinas) são administradas por via intradérmica. A técnica convencional de injeção intradérmica, o " procedimento de Mantoux", compreende as etapas de limpar a pele e, então, esticando com uma mão, e com a ponta bevel de uma agulha de calibre estreito (calibre 26-31) voltada para cima, a agulha é inserida em um ângulo entre 10-15º. Assim que a ponta bevel da agulha é inserida, o cilindro da agulha é abaixado e avançado mais enquanto pressionando levemente para levantá-lo sob a pele. O líquido é então injetado muito lentamente, formando, assim, uma bolha ou elevação na superfície da pele, seguido pela retirada lenta da agulha.
[00438] Dispositivos que são especificamente projetados para administrar agentes líquidos na ou através da pele foram descritos, por exemplo, os dispositivos descritos em WO 99/34850 e EP 1092444, também os dispositivos para injeção por jato, descritos, por exemplo, em WO 01/13977; Patente U.S. Nº 5 480 381, Patente U.S. Nº 5 599 302, Patente U.S. Nº 5 334 144, Patente U.S. Nº 5 993 412, Patente U.S. Nº 5 649 912, Patente U.S. Nº 5 569 189, Patente U.S. Nº 5 704 911, Patente U.S. Nº 5 383 851, Patente U.S. Nº 5 893 397, Patente U.S. Nº 5 466 220, Patente U.S. Nº 5 339 163, Patente U.S. Nº 5 312 335, Patente U.S. Nº 5 503 627, Patente U.S. Nº 5 064 413, Patente U.S. Nº 5 520 639, Patente U.S. Nº 4 596 556, Patente U.S. Nº 4 790 824, Patente U.S. Nº 4 941 880, Patente U.S. Nº 4 940 460, WO 97/38/7705 e WO 97/13537. Outros métodos de administração intradérmica dos preparados vacinais podem incluir seringas e agulhas convencionais, ou dispositivos criados para entrega balística de vacinas sólidas (WO 99/27961), ou adesivos transdérmicos (WO 97/48440; WO 98/28037); ou aplicados à superfície da pele (liberação transdérmica ou transcutânea, WO 98/20734; WO 98/28037).
[00439] “Como descrito acima, as composições farmacêuticas (p. ex., vacinas) podem ser administradas em dose única ou doses múltiplas. Será apreciado que uma administração é uma "dose" única desde que todos os componentes relevantes sejam administrados a um indivíduo dentro de um período de tempo; não é necessário que todo componente esteja presente em uma composição única. Por exemplo, a administração de duas composições imunogênicas diferentes, dentro de um período inferior a 24 horas, é considerada uma dose única. Para fornecer apenas um exemplo, composições imunogênicas contendo componentes antigênicos diferentes podem ser administradas em composições separadas, mas como parte de uma dose única. Como observado “acima, tais composições separadas podem ser administradas por vias diferentes ou pela mesma via. Alternativa ou adicionalmente, em modalidades em que uma vacina compreende uma combinação de composições imunogênicas e tipos adicionais de agentes "ativos, as composições imunogênicas podem ser administradas por uma via, e um segundo agente ativo pode ser administrado pela mesma via ou por uma via diferente.
[00440] As composições farmacêuticas (p. ex, vacinas) são administradas em tais quantidades e pelo tempo necessárias para alcançar um resultado desejado. Em certas modalidades da presente invenção, uma composição vacinal compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma composição imunogênica. A quantidade exata necessária para obter uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar, dependendo da composição imunogênica e de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie,
idade e condição geral do indivíduo, o estágio da doença, a mistura farmacêutica em particular, seu modo de administração e fatores semelhantes.
[00441] A quantidade de antígenois) ou conjugado(s) polissacarídeo(s) em cada dose da composição farmacêutica (p. ex., vacina) é selecionada para permitir que a vacina, quando administrada como aqui descrito, induza uma resposta imunoprotetora adequada sem efeitos — colaterais! adversos — significativos. Uma resposta "imunoprotetora" ou "de proteção imune", neste relatório descritivo, é uma resposta imune suficiente para proteger um indivíduo imunizado de infecção produtiva por um determinado patógeno ou patógenos contra os quais uma vacina é dirigida (p. ex., infecção por K. pneumoniae). Tais quantidades podem variar, dependendo de qual composição imunogênica ou composições específicas são empregadas e o modo como ela é apresentada.
[00442] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreendendo um complexo imunogênico aqui revelado gera uma resposta de células Th1 e/ou Th17 quando administrada a um indivíduo. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreendendo um complexo imunogênico aqui revelado gera uma resposta opsônica/bactericida contra um ou mais entre K. pneumoniae, P. aeruginosa e E. coli quando administrada a um indivíduo. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreendendo um complexo imunogênico aqui revelado reduz a taxa de transmissão e/ou de colonização da superfície de mucosas por um ou mais entre K. pneumoniae, P. aeruginosa e E. coli quando administrada a um indivíduo.
[00443] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreendendo um complexo imunogênico aqui revelado reduz a taxa de transmissão e/ou de colonização do trato GI por um ou mais entre K.
pneumoniae, P. aeruginosa e E. coli quando da transmissão.
[00444] Em algumas modalidades, é provido um método de imunização de um indivíduo contra infecção por K. pneumoniae, o qual compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um complexo imunogênico aqui descrito. Em algumas modalidades, é provido um método de imunização de um indivíduo contra infecção por K. pneumoniae, o qual compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica aqui descrita.
[00445] Em algumas modalidades, é provido um método de imunização de um indivíduo contra infecção por P. aeruginosa, o qual compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um complexo imunogênico aqui descrito. Em algumas modalidades, é provido um método de imunização de um indivíduo contra infecção por P. aeruginosa, o qual compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica.
[00446] Em algumas modalidades, é provido um método de imunização de um indivíduo contra infecção por E. coli, o qual compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um complexo imunogênico aqui descrito. Em algumas modalidades, é provido um método de imunização de um indivíduo contra infecção por E. coli, o qual compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica. Dose
[00447] De acordo com a presente invenção, a administração da composição farmacêutica (p. ex., vacina) pode envolver a entrega de uma dose única ou, alternativamente, pode envolver uma dose inicial seguida por uma ou mais doses adicionais de imunização, adequadamente espaçadas. Um esquema de imunização é um programa para a administração de uma ou mais doses especificadas de uma ou mais vacinas pneumocócicas especificadas, por uma ou mais vias de administração especificadas em uma ou mais idades especificadas de um indivíduo.
[00448] A presente invenção provê métodos de imunização que envolvem administrar pelo menos uma dose de uma vacina a um indivíduo jovem. Em algumas modalidades, o indivíduo jovem tem 18 anos de idade ou menos. Em algumas modalidades, o indivíduo jovem já recebeu antes uma ou mais doses de uma vacina conjugada de polissacarídeo pneumocócico; em outras modalidades, o indivíduo jovem é naive (virgem) para vacinas pneumocócicas. Em algumas modalidades, o indivíduo jovem já foi infectado antes ou foi exposto à infecção por Klebsiella, Pseudomonas e/ou E. coli.
[00449] A presente invenção provê métodos de imunização que envolvem administrar pelo menos uma dose de uma vacina a um indivíduo adulto. Em algumas modalidades, o indivíduo adulto tem mais de aproximadamente 50 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo adulto tem mais de 65 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo adulto já recebeu antes uma ou mais doses de uma vacina conjugada de polissacarídeo pneumocócico; em outras modalidades, o indivíduo adulto é naiíve para vacinas pneumocócicas. Em algumas modalidades, o indivíduo adulto já foi infectado antes ou foi exposto à infecção por Klebsiella, Pseudomonas elou E. coli.
[00450] Os esquemas de imunização da presente invenção visam provocar ou induzir uma resposta imune (p. ex, uma resposta imunoprotetora) em um indivíduo, suficiente para reduzir pelo menos uma medida selecionada a partir do grupo que consiste em incidência, prevalência, frequência e/ou gravidade de pelo menos uma infecção, doença ou transtorno, e/ou de pelo menos um marcador substituto da infecção, doença ou transtorno, em uma população e/ou subpopulação do(s) indivíduo(s). Um esquema de imunização suplementar é aquele cujo efeito é relativo ao esquema padrão ao qual suplementa. Com um esquema suplementar, pode haver necessidade de administrações adicionais e/ou doses supraimunogênicas das composições imunogênicas aqui revelada, encontradas no esquema padrão, ou para a administração de vacinas que não integram o esquema padrão. Um esquema completo de imunização da presente invenção pode compreender um esquema padrão e um esquema suplementar. Esquemas exemplares de vacinação de amostra são fornecidos para fins ilustrativos. As descrições detalhadas de métodos para avaliar a resposta imunogênica aqui discutida permitem desenvolver alterações aos esquemas de imunização de amostra sem indevida experimentação.
[00451] Em uma modalidade da presente invenção, uma primeira administração de uma vacina pneumocócica normalmente ocorre quando um indivíduo tem mais de aproximadamente 50 anos de idade, mais de aproximadamente 55 anos de idade, mais de aproximadamente 60 anos de idade, mais de aproximadamente 65 anos de idade ou mais de aproximadamente 70 anos de idade.
[00452] Em algumas modalidades da invenção, é empregada uma única administração da vacina. É possível que para que a presente invenção possa ser apresentada com uma única administração, especialmente quando um ou mais polissacarídeos e/ou conjugados utilizados na vacina, ou combinações destes, são fortes e, em tal situação, um esquema de dose única é suficiente para induzir uma resposta imunoprotetora duradoura.
[00453] Em certas modalidades, é desejável administrar duas ou mais doses de vacina, para maior eficácia imunoprotetora e cobertura. Assim, em algumas modalidades, um número de doses é pelo menos dois, pelo menos três ou mais doses. Não há um número máximo definido de doses, no entanto, é boa prática clínica não imunizar mais frequentemente do que necessário para alcançar o efeito desejado.
[00454] Sem estar vinculado à teoria, uma primeira dose de vacina administrada de acordo com a invenção pode ser considerada uma dose "inicial" (priming).. Em certas modalidades, em um esquema de imunização, é incluída mais de uma dose. Em tal cenário, uma dose subsequente pode ser considerada uma dose de "reforço".
[00455] “Uma dose inicial pode ser administrada a um indivíduo naive (um indivíduo que nunca recebeu antes uma vacina do polissacarídeo). Em algumas modalidades, uma dose inicial pode ser administrada a um indivíduo que recebeu anteriormente a vacina do polissacarídeo pelo menos cinco ou mais anos antes da administração de uma dose inicial da vacina de acordo com a invenção. Em outras modalidades, uma dose inicial pode ser administrada a um indivíduo que recebeu anteriormente a vacina conjugada pelo menos vinte ou mais anos antes da administração de uma vacina inicial de acordo com a invenção.
[00456] Quando um esquema de imunização necessita de duas ou mais doses separadas, o intervalo entre as doses é considerado. O intervalo entre duas doses sucessivas pode ser igual por todo um esquema de imunização, ou pode mudar à medida que o indivíduo envelhece. Em esquemas de imunização da presente invenção, assim que uma primeira dose da vacina tenha sido administrada, há um primeiro intervalo antes da administração de uma dose subsequente. Um primeiro intervalo é, em geral, pelo menos próximo de 2 semanas, 1 mês, 6 semanas, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses ou mais longo. Quando mais de uma dose subsequente são administradas, podem haver segundos intervalos (ou maiores) entre tais doses subsequentes. Em algumas modalidades, todos os intervalos entre doses subsequentes são da mesma extensão; em outras modalidades, os segundos intervalos podem variar de extensão. Em algumas modalidades, o intervalo entre doses subsequentes pode ser pelo menos próximo de 12 meses, pelo menos próximo de 15 meses, pelo menos próximo de 18 meses, pelo menos próximo de 21 meses ou pelo menos próximo de 2 anos. Em certas modalidades, o intervalo entre as doses pode ser de até 3 anos, até próximo de 4 anos ou até próximo de anos ou 10 anos ou mais. Em certas modalidades, os intervalos entre doses subsequentes podem diminuir à medida que o indivíduo envelhece.
[00457] Será apreciado pelos técnicos no assunto que existe uma variedade de possíveis combinações e subcombinações das várias condições entre o momento da primeira administração, intervalo mais curto, intervalo mais longo e número total de administrações (em termos absolutos ou dentro de um período declarado), e todas essas combinações e subcombinações devem ser consideradas contempladas pelo inventor, embora não explicitamente enumeradas no presente. Ensaios para determinação de resposta imunogênica
[00458] Em algumas modalidades, um método de avaliação da imunogenicidade e/ou potência de um complexo imunogênico (e/ou da composição compreendendo um complexo imunogênico) compreende avaliar uma resposta imune à composição imunogênica. Em algumas modalidades, a avaliação é efetuada realizado um ou mais de uma bateria de ensaios in vitro. Em algumas modalidades, a resposta imune avaliada é uma resposta de células B ou de células T.
[00459] Em algumas modalidades, o ensaio in vitro é selecionado a partir de um ou mais entre ELISA, citometria de fluxo, resposta de células Th1i/ Thi7, medição do nível de citocinas e níveis de anticorpos funcionais, conforme medido por OPK, atividade bactericida no soro (SBA), aglutinação, motilidade, citotoxicidade, aderência, aglutinação.
[00460] Em algumas modalidades, a avaliação é efetuada realizado um ou mais de uma bateria de ensaios in vivo. Em algumas modalidades, um ensaio in vivo utiliza um modelo animal de doença nosocomial. Em algumas modalidades, o modelo animal é um modelo para um ou mais entre pneumonia, sepse, feridas por queimadura, infecção G ou infecções do sítio cirúrgico. Em algumas modalidades, um ensaio in vivo mede uma ou mais entre eliminação bacteriana, colonização e mortalidade com proteção passiva após o desafio com um ou mais patógenos-alvo, ou proteção ativa após o desafio com um ou mais patógenos-alvo. Em algumas modalidades, o patógeno-alvo é um patógeno nosocomial.
[00461] Em termos gerais, pode ser desejável avaliar respostas humorais, respostas celulares e/ou interações entre as duas. Quando respostas humorais estão sendo avaliadas, os títulos e/ou tipos de anticorpos (p. ex., IgG total, I9G1, IgG2, IgM, IgA, etc.) contra sorotipos específicos de patógenos podem ser determinados, por exemplo, antes e/ou depois da administração de uma dose inicial ou de reforço da vacina (e/ou em comparação aos níveis do anticorpo na ausência de estimulação antigênica). As respostas celulares podem ser avaliadas monitorando reações, tais como respostas de hipersensibilidade do tipo tardia, etc., à proteína de transporte. As respostas celulares podem também ser medidas diretamente avaliando a resposta de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), monócitos, à estimulação com os antígenos de interesse. Populações de células B precursoras e de memória podem ser avaliadas em ensaios imunoenzimático Immunospot (ELISpot) direcionados contra patógenos específicos CPS e/ou OPS.
[00462] “Qualquer um de uma variedade de ensaios pode ser empregado para detectar os níveis e/ou a atividade de anticorpos no soro do indivíduo. Os ensaios adequados incluem, por exemplo, ensaios de ligação a ligante, tais como radioimunoensaio (RIAs), ELISAs e ensaios multiplex (Luminex, Bioplex); ensaios funcionais, como ensaios de atividade opsonofagocitária (OPA); e ensaio de proteção in vivo
(modelos de proteção a ratos lactentes e de colonização em pulmão de camundongos e Gl em roedores e de mortalidade).
[00463] O método RIA detecta anticorpos contra tipos específicos através de incubação do soro com polissacarídeos de tipos específicos radiomarcados em suspensão (p. ex., Schiffiman et a/., 1980). Os complexos antígeno-anticorpo são então precipitados com sulfato de amônio, e os péletes radiomarcados são analisados por contagens por minuto (cpm).
[00464] No método de detecção por ELISA, anticorpos contra sorotipos específicos do soro de indivíduos vacinados são quantificados por incubação com polissacarídeos de sorotipos específicos que foram adsorvidos em um suporte sólido (p. ex., Koskela and Leinonen (1981); Kojima et a/., 1990; Concepcion and Frasch, 2001). O anticorpo ligado é detectado utilizando anticorpos secundário de detecção conjugados a enzimas. O ELISA também permite a isotipagem e a subclassificação da resposta imune (ou seja, IgM versus IgG ou IgG1 versus IgG2), utilizando anticorpos secundários contra isotipos ou subclasses específicos, além de poder ser adaptado para avaliar a avidez dos anticorpos sorotipo-específicos (Anttila, et a/, 1998; Romero-Steiner, et al., 2005). Ensaios multiplex (p. ex., Luminex, Bioplex) possibilitam a detecção simultânea de anticorpos contra múltiplos sorotipos. CPS e/ou OPS sorotipo-específicos são conjugados a microesferas com espectros distintos, as quais são misturadas junto e incubadas com o soro diluído. O anticorpo ligado é detectado com um anticorpo secundário conjugado à ficoeritrina e quantificado em um citômetro de fluxo especializado que utiliza um laser para identificar o tipo de microesfera (sorotipo) e um segundo laser para quantificar o anticorpo secundário ligado (Pickering, et a/., 2002; Lal, et al. 2005).
[00465] “Uma abordagem para avaliar anticorpos funcionais no soro é o OPA que quantifica somente os anticorpos que podem opsonizar as bactérias, levando à ingestão e morte das bactérias. O ensaio-padrão utiiza uma célula efetora fagocitária humana, uma fonte de complemento, bactérias e soro diluído. A leitura do ensaio é o título final do soro no qual >50% de morte em comparação a bactérias incubadas com complemento e células humanas isoladamente (Romero-Steiner, et al, 1997). Esse OPA da eliminação pode também ser multiplicado utilizando cepas alvos de patógenos que carregam marcadores diferentes de resistência antibiótica (Kim, et a/, 2003). Um título final igual ou superior a 1:8 é considerado um resultado positivo nessa eliminação tipo OPA. Outro tipo de ensaio multiplex opsônico é um ensaio de não eliminação, no qual a internalização por células efetoras fagocitárias do patógeno encapsulado fluorescente corado ou microesferas fluorescentes conjugadas com CPS e/ou OPS antigênicos de um patógeno-alvo, na presença de soro diluído mais uma fonte de complemento, é avaliada por FC (Martinez, et a/., 1999). A atividade opsônica do anticorpo mais complemento no soro pode também ser avaliada medindo a resposta oxidativa de células efetoras fagocitárias humanas ao patógeno ingerido (Munro, et a/. 1985; Ojo-Amaize, et al. 1995).
[00466] Certos sistemas de modelo in vivo podem ser utilizados para avaliar a proteção conferida por anticorpos séricos gerados por varinas da presente invenção. Em tais sistemas de proteção passive, camundongos ou ratos são desafiados com o patógeno mais soro diluído, e o título final do soro que fornece proteção contra bacteremia, colonização de órgãos ou tecidos ou mortalidade é determinado (Stack, et al. 1998; Saeland, et al. 2000). Composições de anticorpos
[00467] Em algumas modalidades, é provida uma composição de anticorpos compreendendo anticorpos desenvolvidos em um mamífero imunizado com um complexo imunogênico da invenção. Em algumas modalidades, um anticorpo compreende pelo menos um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em mAbs e anticorpos anti- idiotípicos. Em algumas modalidades, uma composição de anticorpos compreende uma fração de globulina gama isolada. Kits
[00468] A presente invenção também provê kits para produção de um complexo imunogênico como aqui revelado, e que são úteis para um investigador adaptar um complexo imunogênico com seus antígenos preferidos, p. ex., para fins de pesquisa na avaliação do efeito de um antígeno, ou uma combinação de OPS de antígenos sobre a resposta imune. Tais kits podem ser preparados com materiais e reagentes facilmente disponíveis. Por exemplo, tais kits podem compreender um ou mais entre os seguintes materiais: um recipiente compreendendo uma estrutura polimérica reticulado com uma pluralidade de primeiras moléculas de afinidade; e um recipiente compreendendo uma molécula de afinidade complementar que se associa com a primeira molécula de afinidade, em que a molécula de afinidade complementar se associa com um antígeno.
[00469] Em outramodalidade, o kit pode compreender um recipiente incluindo um polímero, p. ex., um polissacarídeo, um recipiente incluindo uma pluralidade de primeiras moléculas de afinidade e um recipiente incluindo um reagente reticulante para reticulação das primeiras moléculas de afinidade com a estrutura polimérica.
[00470] Em algumas modalidades, o Kit compreende ainda um meio para fixar a molécula de afinidade complementar ao antígeno, em que o meio pode ser um reagente reticulante ou alguma proteína de fusão intermediária. Em algumas modalidades, o kit pode compreender pelo menos um fator de coestimulção que pode ser adicionado ao polímero. Em algumas modalidades, o kit compreende um reagente reticulante, por exemplo, entre outros, CDAP (tetrafluoroborato de 1-ciano-4-
dimetilaminopiridínio), EDC (cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida), cianoborohidreto de sódio; brometo de cianogênio; bicarbonato de amônio/ácido iodoacético para ligação do cofator ao polímero.
[00471] Uma variedade de kits e componentes pode ser preparada para uso nos métodos aqui descritos, dependendo do uso pretendido do kit, do antígeno alvo em particular e das necessidades do usuário. Exemplificação
[00472] Paraque a invenção aqui descrita possa ser entendida mais completamente, os exemplos seguintes são apresentados. Os exemplos representativos contêm informação, exemplificação e orientação, os quais podem ser adaptados para prática desta invenção em suas várias modalidades e os seus equivalentes. Deve ser entendido que esses exemplos são para fins ilustrativos somente e não deverão ser interpretados como limitações de alguma forma a esta invenção. Exemplo 1: Cepas bacterianas
[00473] As cepas reagentes foram submetidas a três passagens em um meio livre de produto animal para remover quaisquer possíveis contaminantes de produtos animais. As características das cepas foram comparadas antes da passagem, durante a passagem e após a passagem. Para Pseudomonas: coloração Gram, morfologia da colônia, API, teste com oxidase, crescimento em ágar de MacConkey, IATS sorotipagem, cinética do crescimento. Para Klebsiella: coloração Gram, morfologia da colônia, API, sorotipagem molecular por reação em cadeia da polimerase (PCR), confirmação de mutações por PCR e sequenciamento (se necessário), tipagem de K (por PCR), cinética do crescimento. Tabela 2: Cepas de Klebsiella e cepas reagentes usadas no estudo o Tipo de Tipo de Espécie Cepas Cepa reagente?
O K AguaBA K. pneumoniae B5055 1 2 Awzabc . Sem K. pneumoniae 7380 2 . Tipo selvagem cápsula E AguaBA = mutante na biossíntese de guanina (atenuado); Awzabc = mutante na cápsula. pb Klebsiella oxytoca
[00474] Os genes guaBA e wzabc foram deletados utilizando recombinação lambda red. Resumidamente, o DNA a montante e a jusante dos genes guaBA e wzabc, foi fundido a um cassete de resistência à canamicina, e o DNA linear foi transformado nas cepas de K. pneumoniae que também continham um plasmídeo auxiliar que pode expressar genes recombinase do fago lambda. Quando da indução, esses genes promoveram recombinação homóloga que permitiu que os genes guaBA e wzabc fossem substituídos pelo cassete de resistência à canamicina. O cassete de resistência à canamicina foi subsequentemente removido utilizando uma enzima flippase que promove a recombinação entre os sítios FRT que flanqueiam o cassete. Confirmou-se que os mutantes eram sensíveis à canamiíicina, e a deleção foi confirmada por PCR e sequenciamento da deleção. Tabela 3: Cepas de Pseudomonas aeruginosa (PA) usadas no estudo IATS-O1 Tipo selvagem
[os sos | riosevasem [or [sor | rposevagem Criação da cepa de PA superprodutora do exopolissacarídeo PsL
[00475] As abordagens genéticas exemplares para reconstruir a cepa PAO1 induzível de PsL de P. aeruginosa, Apsl/pBAD-psl, utilizando um DNA sintético com 1886 bp da Genscript, Piscataway, NJ, são mostradas na Figura 9B.
[00476] O promotor araC-pBAD foi inserido a montante do gene ps/A de P. aeruginosa PAO1 por recombinação homóloga. Essencialmente, o DNA de P. aeruginosa PAO1 a montante de psl/A foi amplificado e fundido a montante de um cassete de resistência à gentamicina. Uma construção, que consistia em DNA sintético contendo o promotor araC- pBAD e o gene psl/A, foi fundida a jusante do cassete de resistência à gentamicina. Essa construção toda foi inserida no plasmídeo pEX100T para mutagênese de Pseudomonas. A mutagênese foi realizada como descrita anteriormente (Schweizer et a/., 1992). O gene de resistência à gentamicina foi subsequentemente removido e a inserção do promotor araC-pBAD confirmada por PCR e sequenciamento. Exemplo 2: Produção de antígenos polissacarídicos O e K Crescimento de cepas de Klebsiella spp. e P. aeruginosa
[00477] Todas as cepas reagentes de Klebsiella e PA foram submetidas a três passagens em meio livre de produto animal para remover quaisquer possíveis contaminantes de produtos animais. Bancos de células para pesquisa (RCBs) foram cultivados em frascos agitados e caldo Hy-Soy e transferidos assepticamente em alíquotas para tubos com glicerol em 15% de concentração final. As bactérias foram cultivadas em um Fermentador BioFlo 415 de 8 litros em meio quimicamente definido (CDM) contendo fosfato de potássio monobásico, fosfato de amônio, ácido cítrico monohidratado, sulfato de magnésio (MgSO:u) polipropilenoglico! (PPG) (antiespumante), glicerol 3% como fonte de carbono, vitaminas e elementos traços e aminoácidos selecionados, conforme necessário. Oxigênio dissolvido foi mantido a 30% com modo cascata configurado com taxa de agitação mínima de 200 RPM, e o pH foi corrigido para 7 com hidróxido de amônio. Durante a fermentação, o meio foi suplementado em modo descontínuo, quando necessário, com glicerol 50% glicerol, MgSO;, vitaminas e elementos traços. As bactérias foram cultivadas por 12-18 horas até ser atingida a fase estacionária, quando então, foi efetuada a colheita das culturas para obter o polissacarídeo.
Purificação de polissacarídeo-O de KP e polissacarídeo core-O de PA
[00478] Um fluxograma do processo de purificação a jusante dos OPSs de KP e PA é mostrado na Figura 8A. Resumidamente, no final da fermentação, a cultura inteira da fermentação foi tratada com ácido acético 1% a 100ºC por 4 horas, para cultura celular de P. aeruginosa, ou com nitrito de sódio em ácido acético a 4ºC para cultura celular de K. pneumoniae por 12 horas. Após clarificação por centrifugação e filtração de profundidade (0,45 um), a solução clara contendo o OPS hidrolisado e liberado foi submetida à filtração em fluxo tangencial (TFF) UF-DF com uma membrana NMWCO de 10 kDa ou 30 kDa e diafiltração contra NaCl 1M e, depois, tampão Tris. O retentado foi então passado através de uma membrana de troca aniônica forte para a cromatografia de troca iônica (IEC) em tampão Tris. Os OPSs de PA com carga negativa foram capturados pela membrana (Figura 8A) e, a seguir, eluíram com cloreto de sódio. Os OPS neutros de KP e neutros ou fracamente ácidos de PA foram obtidos na fração Flow-thru (FT) da membrana de IEC. A fração não adsorvida ou eluída da IEC foi então submetida à precipitação com sulfato de amônio a fim de remover a proteína residual. Os OPSs de KP no sobrenadante com sulfato de amônio foram então submetidos a duas filtrações TFF sucessivas, iniciando com uma membrana NUWCO de 300 kDa, da qual a fração FT foi então concentrada e diafiltrada com uma membrana NMWCO de 5 ou 10 kDa NMWCO. O retentado dessa última fração FT de TFF continha os OPSs neutros purificados de KP (Figura 8A). Os OPSs neutros e ácidos purificados de PA no sobrenadante com sulfato de amônio (NH4SO,4) foram submetidos à TFF com membrana de 5-10 kDa (Figura 8A) e foram recuperados no retentado. A MW média do produto final OPS, conforme medida por SEC-espalhamento de luz laser multi-ângulo (SEC-MALLS), variou de 10-30 kDa, dependendo do tipo de O, e apresentou baixos teores de endotoxina, proteína e ácido nucleico.
Purificação do polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella oxytoca (KP K19 CPS)
[00479] Um fluxograma do processo de purificação a jusante do KP K19 CPS é mostrado na Figura 9A. Resumidamente, após inativação com formaldeído e clarificação por centrifugação descontínua e filtração superficial (0,45 um), a solução clara contendo o CPS foi concentrada e diafiltrtcada por TFF com uma membrana NMWCO de 30 kDa. O retentado de 30 kDa foi precipitado por CTAB. O precipitado foi novamente solubilizado com cloreto de cálcio e precipitado com etanol 20% para remover ácidos nucleicos e proteínas contaminantes. Após a centrifugação, o sobrenadante coletado foi precipitado com etanol 80%. O CPS contido no precipitado voltou a ser solubilizado em tampão Tris e foi capturado em uma resina de troca aniônica fraca. O CPS K19 eluindo da resina foi tratado ainda (detoxificado) com NaOH 0,1 M em etanol 90% para remover qualquer lipídio terminal residual contribuindo para sua agregação e endotoxinas (atividade medida em lisado de amebócitos de Limulus (LAL)) (Figura 9A). O produto final polissacarídeo K19 exibiu MW média de 220 kDa, medida por SEC- MALLS, e baixos teores de endotoxina, proteína e ácido nucleico. Purificação do exopolissacarídeo PsL de PA
[00480] “Um fluxograma de um processo de purificação exemplar do exoPS PsL é mostrado na Figura 9C. Resumidamente, uma cultura bacteriana de PA foi clarificada por centrifugação a 10.000x g por 40 minutos à temperatura ambiente, e o sobrenadante passado através de um filtro de profundidade de 0,5-0,3 um. O sobrenadante filtrado foi diafiltrado por TFF utilizando uma membrana PES MWCO de 100 kDa com 10 diavolumes de água para injeção (WFI), e o permeado coletado e concentrado utilizando uma membrana Hydrosart de 2 kDa por 10-20x UF, diafiltrado com 10 diavolumes de Tris-HCI 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5. O eluído concentrado foi então aplicado à cromatografia de resina de troca aniônica forte (IEX) em uma coluna GE Q-Sepharose Fast Flow e a fração flow-through foi coletada com um ou mais volumes da coluna para lavagem do eluente. O eluído foi concentrado e diafiltrado com WFI utilizando uma membrana Hydrosart de 2 kDa e, a seguir, precipitado com etanol 80% à temperatura ambiente por 18 horas. Após centrifugação a 4000 x g por 30 minutos, o pélete foi dissolvido em WFI, filtrado estéril através de um filtro de 0,2 um e liofilizado. O material final purificado do polissacarídeo foi analisado por HPAEC/PAD (cromatografia de troca aniônica de alta eficiência com detecção eletroquímica pulsada), com um instrumento capilar Dionex ICS-4000, coluna CarboPac PAIO, e utilizando padrões de monossacarídeos disponíveis comercialmente para composição de monossacarídeos, para proteína residual com o ensaio de Bradford, ácidos nucleicos residuais com o kit quant-IT da Q-bit Life Technologies, endotoxina pelo ensaio de LAL e carboidrato total pelo ensaio com antrona. O material final foi também analisado por RMN-H de alta resolução para confirmar sua estrutura e por SEC-HPLC para estimativa da massa molecular. Métodos analíticos para a caracterização dos antígenos O e K
[00481] A pureza e identidade dos OPS e CPS obtidos pelos processos descritos acima foram determinadas como segue. À concentração de proteína residual foi determinada pelos ensaios de Bradford e/ou BCA; a concentração de ácido nucleico foi determinada utilizando o ensaio pico green ou absorbância a 260 nm; os níveis de endotoxinas foram medidos pelo ensaio de LAL; e a composição de açúcares dos polissacarídeos foi determinada por hidrólise ácida, seguida pela separação individual dos monossacarídeos por HPAEC- PAD (Dionex) como descrito acima. A integridade física dos polissacarídeos foi determinada por RMN-1H de alta resolução a 500, 800 ou 950 MHz, utilizando um espectrômetro Bruker para registrar os espectros, e comparando os espectros obtidos com aqueles publicados na literatura. A identidade do polissacarídeo e a integridade dos epítopos nos polissacarídeos nativos e quimicamente derivados purificados, durante o processo e como produtos finais foram confirmadas por ELISA utilizando anticorpos monoclonais específicos contra OPS e CPS e antissoro policlonal desenvolvido de coelho contra os tipos específicos das bactérias mortas por calor. A presença de grupos O-acetila nos polissacarídeos foi determinada pelo ensaio colorimétrico de Hestrin e por RMN-1H. O tamanho dos polissacarídeos foi determinado por SEC-HPLC (Figuras 8B e 8C) e SEC-MALLS utilizando colunas apropriadas de dimensionamento. A concentração dos polissacarídeos foi determinada pelo ensaio com antrona. Exemplo 3: Método geral biotinilação de OPS e CPS
[00482] A biotinilação de polissacarídeos (PSs) contendo grupos hidroxila foi realizada utilizando CDAP como reagente de ativação. Os polissacarídeos foram dissolvidos em água livre de LPS (grau de cultura celular; HyClone) para uma concentração final de 1-5 mg/mL. No tempo O, um volume de CDARP (fresco a uma concentração de 100 mg/mL em acetonitrila) foi adicionado até uma razão final de 1 mg de CDAP por 1 mg de PS durante agitação por vórtice. Em 30 segundos, um volume de trietilamina 0,2 M (TEA; Sigma-Aldrich) foi adicionado para aumentar o pH para 8 (Para PS neutro, o volume de TEA é igual ao volume de CDARP; para PS ácido, o volume de TEA é dobrado). Em 2,5 minutos, um volume de derivado de biotina (Pierce EZ-Link Amina-PEG3-Biotina, mg/mL em água) foi adicionado até uma razão final de 1 mg de biotina para 1 mg de PS, seguido por incubação à temperatura ambiente por 1-4 horas. Para amostras mais diluídas (<1 mg/ mL), usou-se incubação durante a noite. A reação foi encerrada adicionando glicina mM, e o excesso de biotina foi removido por diálise extensiva contra PBS.
[00483] Para a estrutura polimérica BP-1.2, a biotinilação do polímero K19 CPS prosseguiu por ativação dos grupos carboxilados dos resíduos de ácido urônico com cloridrcato de 1-etil-3-[3- dimetilaminopropil]|carbodiimida (EDC, Pierce) e N-hidroxissuccinimida (NHS) para melhorar a eficiência ou criar intermediários estáveis a seco (amina reativa). EDC acopla NHS às carboxilas, formando um éster de NHS que é consideravelmente mais estável que o intermediário O- acilisoureia ao mesmo tempo em que permite a conjugação eficiente com amina primária em pH fisiológico. O derivado amina com biotina (Pierce EZ-Link Amina-PEG3-Biotina) é então utilizado para a biotinilação dos intermediários com éster de NHS do CPS K19.
[00484] As concentrações de açúcar total foram determinadas pelo ensaio com antrona, para o OPS/CPS de Klebsiella OPS/CPS, o ensaio com resorcinol para o OPS de PA.
Exemplo 4: Construção de antígenos com rizavidina recombinante e proteína de fusão de rizavidina Desenho e engenharia de construções de expressão de proteínas de fusão de rizavidina derivadas de K. pneumoniae e P. aeruginosa
[00485] Para as flagelinas de Pseudomonas (FIIC) A (FlaA) e B (FlaB), uma construção in silico de um filamento flagelar tendo por base o empacotamento de FIliC de Pseudomonas no cristal sugere que o Domínio 2 (D2) ficaria exposto à solução e poderia desempenhar um papel importante na imunogenicidade (Song, 2014). Além disso, FIiC de Pseudomonas ativa respostas imunes inatas através de seu reconhecimento por TLR5, possivelmente levado à reatogenicidade, portanto, foram geradas e avaliadas algumas das flagelinas de Pseudomonas com o domínio de ligação ao TLR5 e as regiões adjacentes removidos, deixando apenas o Domínio 2. As sequências resultantes FlaA2-Domínio2 e FlaB-Domínio2 sem o domínio TLR5 foram expressas como uma fusão com rizavidina sozinha ou com rizavidina e Klebsiella MrkA ou PcerV. Um desenho esquemático das variantes da proteína de fusão rizavidina-antígeno geradas e expressas, derivadas de Pseudomonas (FlaB; FIaA1; FIaA2; PcrV; FlaB-PecrV; FIlaB-D2; FIaA2-D2; FlaB-D2-PcrV) e das proteínas de fusão de rizavidina híbridas de Klebsiella e Pseudomonas (FlaB-D2-MrkA; PcrV- MFrkA) é mostrado na Figura 12A.
[00486] Para P. aeruginosa, flagelina foi escolhida como uma provável proteína de transporte e antígeno protetor, pois é o principal componente dos flagelos e, segundo se sabe, anticorpos contra flagelina inibem a motilidade requerida para infecções disseminadas e demonstraram ser protetores em um modelo animal de infecção. Em relação à flagelina, o sorotipo A2 é altamente conservado, mas varia ligeiramente de A1 e significativamente no domínio 2 do sorotipo B. Para avaliar a atividade dessas variações, as flagelinas do sorotipo A1
(FIaA1), A2 (FIaA2) e B (FlaB) foram clonadas e expressas como proteínas completas. Somente o domínio 2 das flagelinas A2 e B foi também clonado e expresso, uma vez que esse domínio ornamenta o exterior dos flagelos reunidos e é um alvo provável para anticorpos neutralizantes. Isso permitiu uma avaliação separada da contribuição do domínio de ligação a TLR5 à resposta imune adaptativa. As sequências selecionadas foram sintetizadas e clonadas em plasmídeos para direcionar a expressão em E. coli de uma fusão amino-terminal de rizavidina com um tag (etiqueta) de seis histidinas para purificação inicial por afinidade (Figura 12A).
[00487] ParaP. aeruginosa, PcrV foi também escolhido, uma vez que codifica a proteína da ponta do aparelho de secreção Tipo Ill. É conhecido também como um antígeno protetor, pois anticorpos específicos contra PcrV conseguem proteger contra infecção invasiva. A sequência é altamente conservada tendo somente 4 posições com alterações de aminoácidos dentre 294 aminoácidos em 18 cepas diferentes de P. aeruginosa. A sequência foi sintetizada e clonada em um plasmídeo para direcionar a expressão em E. coli de uma fusão amino-terminal de rizavidina com um tag (etiqueta) de seis histidinas para purificação inicial por afinidade (Figura 12A).
[00488] Para K pneumoniae, MrkA foi escolhido, uma vez que codifica a principal subunidade fímbria de pilli tipo 3 e a parte imunologicamente dominante das fímbrias. As fímbrias tipo 3 são necessárias para mediar a formação de biofilme, e MrkA desempenha um papel importante na formação de biofilme e aderência, sugerindo que esse antígeno poderia conferir proteção em uma formulação vacinal. MrkA demonstrou ser altamente conservado com 9 genótipos diferentes de K. pneumoniae, fornecendo apenas 1 posição com alteração de aminoácido nos 180 aminoácidos. Um genótipo adicional forneceu alterações ligeiramente maiores exibindo 9 posições com alterações nos 180 aminoácidos (Tabela 4). Em relação a outras subunidades de fímbrias tipo 3 pili, uma estratégia para estabilizar o monômero durante a expressão foi desenvolvida, denominada método de complementação com fita doadora (Walczak, 2014). Essa estratégia usa a sequência amino terminal e a repete na terminação carboxila, de modo que esta possa dobrar de novo e ligar-se na orientação da fita beta normalmente fornecida pela subunidade seguinte na estrutura. Tentou-se ampliar essa estratégia para subunidade MrkA de pelo tipo 3 de K. pneumoniae, removendo primeiramente a sequência sinal de secreção, já que o foco planejado era sobre a expressão citoplasmática das fusões com Rizavidina. O suposto sinal de secreção é modelado em Chan et al. 2012, Langmuir com base no alinhamento dos aminoácidos 1-24 de FimA de E. coli. Em seguida, um /inker de seis glicinas foi adicionado à terminação carboxila, seguido por uma repetição dos 20 primeiros aminoácidos desde o N-terminal de MrkA (sem a sequência sinal) para permitir a complementação com a fita doadora. A sequência foi sintetizada e clonada em um plasmídeo para direcionar a expressão em E. coli de uma fusão amino-terminal de rizavidina com um tag (etiqueta) de seis histidinas para purificação inicial por afinidade (Figura 12A).
Tabela 4: Alinhamento de múltiplas sequências de MrkA de K. pneumoniae MrkA por Clustal O (1.2.1)
iMrkA de K. pneumoniae .«CLUSTAL 0(1.2.1) — Alinhamento de múltiplas sequências g11148236gbIaaR2S0SS.1 -MGVLLSANMATAFFOMIAMMAA DTNVOSGQUNFRGIVIDVSCIVSVIGOSSDANVYL | S8 GLI6SOSSLTIO IgbIATEDOAIS..1) O MGVILSMAMATAFFGMTARERA DINVGGOQUNERGIVIIVSCIVSVIGOGSDANTIL S8 GiIANG6TAGIS[FefINP O00TÁGASS. 11 — MMGVLLSARIATAFRGWIAREADTIVOGQUNFRORVIDVSCIVSVIGOSSDANVIL Sé Gi L9TLIOLIOIgbIaCKTa7AS..11 MAMGNVLLSARIATA FFGMTARFARDINVSGOQUNEFGHVIDVSCIVSVIGOGSDANVIL 60 Gi 34642586 3IGbIABCA 1452 (1 “MEEVLLSMAMATAFTCHTAAEAADTIVOGODMIEGIVTOVSCIVSVIGOGSDANVTL - 58 1283520840 gb |ADB25182.1 menteana att etttÀ tes are ce—e == EVIDVSCIVSVIGQGSDANVYL 22 ou Ress202d8 gb /aDBZSAAA | meneenenam terem aerD emana mem>= —=-=RVIIVSCIVSVIGOGSDANVYL 22 Qi/150956647 gbIABRTE677.1| enem ===> =-MATAFFGMIAAEAADITVGGGQUNFFGKVIDVSCIVSVIGOGSDANVYL 49 Gil4oTROSIIOIghIEKETT36L 1 IAMGOLLSARAATAFTGNTARAARDTVGG(UNEEGKVIDVSCIVSVIGOGSDANVIL - 60 11149236 gbIRNR2S093.1 SEVILTEVEAARADI YLKPRSFIIDVSDCORADGTKODIVSHLGVITOGNLIAGNTARO = 128 Gi I66OSSLTTO IgbIATEDOAAS..1| SEVILTEVEAARADI YLKGRSE TIDVSNCORADGTHQUINTHLGVNNTGGNLIAGRTSKO - 118 GLIAA66T9GASIFefINR 000TÓGASA.11 — SEVILTEVRAMADIYIMPASFTIDVRICOAADSTKQDOVSHLGVITGONLIAGATSHQ | 1218 GUILTIIOLIOIgbIACKÃA7AS..11 SEVILTEVEAARADTYLKPSE TIDVSNCORADGTHQOIVSKIGVINTOGNLIAGATSKO 120 G1346425863 IgbIBÇ2 7482. 11 SEVILTEVEAARADTYLKARSFTIDVSNCORADGTKODIVSHLGVINTOGULIAGNTSKO | 118 Gi 283520840 gb /ADB2S182..1| SEVILTEVMAARADTYLKPRSETIDVSNCORADGTHQDIVSKLGVINTOGNLIAGATSKO * Ez GiI203520836 gbIADBZSE 11 SEVILTEVKAAMADTYLKPRSF TIDVENCORADOTKQDIVSKIOVINTONLIAGATSQ 62 Gi 150956647 IQbIABRTET7 11 SEVILTEVLAARADTYLKPNSETIDVSNCORADGTHQDIVSKLGVINTOGNLIAGRTSKO 109 GiI4oTeOSAOIGbIERETT36A 11 SEVILTEVERARADI YLKPSETIDVSNCORADGINQOIVSKIGVNNTOGNLIAGRTSKO 120 11109236 gDIAAR2S093.1 QSYLANTEAGAQNIQUVSTONATALTNKI IPGDSTORIAAGOASAVODGARETITVOY 178 GLISGOSSITTOIgbIAIEDOAAS..1) QGYIANTEA SGAQNIQUVLSTONATALTNKI TRGDSTORIRNGOAANVADGARETITVGY 178 1144667961 3 ref |NP 000756959.1| QGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKI IPGDSTQPNANGDASAVADGARFIVIVGY 178 GLILTILOIIOIgbIACKÃA7AS..11 QGYIANTEA SGAQNIQUVLSTONATALTNKT IPGDSTORRANGOASAVADGAREIYIVOY - 180 Gi 346425863 [gbIAED27482.11 QGYIANTERSGAQNIQUVISTONATALTNEI PGDSTQRIANGOASAVADGARETITVOY 178 GL 283520840 gb/ADB2S182 11 QGYIANTEA SGAQNIQUVLSTONATALTNKI TRGDSTORIANGOASAVADGARETE---- 138 GLI283S2083E IgbIADBaS1E1 11 QGYIANTEASGAQNIQIVSTNATALTNKI IRGDSTORHAMGOASAVADGARETECnos 138 Gi 180956647 IQRIABRTEST7 11 QGYIANTEA SGAQNIQUVSTONATALTNAI IPGDSTOPRANGOASAVADGARETYYVOY 169 GLI4OTROSIAOIGhIEKAT13EL 1 QSTIANTER SSAQUIQUVLSTONATALTNAT PGDSTORMAGIASAVADGARETIIVOE | 180 11109236 gb/ARR2S093.1 aISTEITITGVANSAADIEITO — 202 Gi I660SS1TTO IgbIATEDOAAS..11 NSMNIMTIOMASADEITO — 262 Gil4a66 TOR SIFef INE 000TÁGASA.11 — ATSAETIVITOVASIATVEITO — 202 Gil19TIIOIIOIgbIacEd2748.11 ASMTIIIIOMASAADEITO — 294 Gi 246425863 [gb IAEO27482.11 MSETIVISTASIATEITO — 202 Gi 283620840 gb /ADBAS182.11 pubunbidiiiiiaiia Gi/283520838IghIADB25181.11 A 1 Gi 250966647 ga IABRTEST7 1 MONTTTIOABADEIR | 13 Gi I40TRO6IAOIQRIEXET7361.11 MSETIVISAASATEITO — 2
[00489] Para a proteína MrkA de K. pneumoniae que é altamente conservada, a sequência AEO27492 (em negrito) na Tabela 4 foi usada como a sequência-fonte para gerar o gene sintético.
[00490] A Rizavidina recombinante (rRavi) usada nesses estudos abrange os aminoácidos 45 a 179 da proteína codificada a partir do genoma, pois as sequências sinal previstas (aminoácidos 1-44) não foram incorporadas. Para otimizar o nível de expressão de rRavi em E. coli, a sequência do gene que codifica o polipeptídeo Rizavidina (45- 179; SEQ ID NO:14) foi redesenhada utilizando e sintetizando códons de expressão preferidos para E. coli. O gene com códons otimizados foi clonado no vetor pET21b para direcionar a expressão proteica. Para facilitar o dobramento correto e a formação de ligações dissulfeto na Rizavidina, selecionou-se uma cepa de E. coli para expressão que facilitava a formação de ligações dissulfeto no citoplasma, T7 shuffle express (NEB).
[00491] Para construir as proteínas de fusão rizavidina-antígeno, uma sequência de DNA que codifica uma região de ligação (linker) flexível, constituída por sete aminoácidos (GGGGSSS; SEQ ID NO:15), foi inserida diretamente na extremidade 3' do gene rRavi sintético para permitir a separação de rRavi e promover o dobramento certo da proteína de fusão subsequente. Os genes codificadores dos antígenos candidatos (completo ou o fragmento desejado) foram sintetizados e inseridos no vetor de expressão de rRavi um pouco além da região do ligante. Para facilitar a purificação, um tag de seis histidinas foi adicionado ao final da construção.
[00492] Os plasmídeos contendo o DNA para direcionar a expressão das proteínas de fusão de rRavi foram transformados na cepa T7 shuffle express de E. coli seguindo o protocolo do fabricante. Uma cultura foi iniciada a partir de uma única colônia e inoculada em 30 mL de meio Luria-Bertani (LB) contendo ampicilina (Amp+) para uma cultura durante a noite a 30 ºC. No 2º dia 2, 5 mL da cultura inicial foram inoculados em 1 litro de meio LB/Amp+ e cultivada a 30ºC até que atingida ODgoo 1,2 a 1,6. Após resfriamento da cultura para 16ºC, IPTG foi adicionado a uma concentração final de 0,1 mM. A cultura induzida foi incubada a 16ºC com agitação por 16 a 20 horas. As bactérias foram coletadas por centrifugação a 5000 x g por 20 minutos e o pélete foi congelado a - 20ºC. Proteínas de fusão exemplares
[00493] Proteínas de fusão de rizavidina exemplares da presente invenção são apresentadas na listagem de sequências a seguir. Para facilidade de referência, as sequências de aminoácidos de uma letra das proteínas de fusão são fornecidas a seguir:
[00494] —“Ravi-PcrV-His, SEQ ID NO:16
[00495] —Ravi-MrkA-complementação-fita-doadora-Hisó, SEQ ID NO:17
[00496] Ravi-FlaA1-His, SEQ ID NO:18
[00497] —Ravi-FlaA2-His, SEQ ID NO:19
[00498] Ravi-FlaB-His, SEQIDNO:20
[00499] —Ravi-FlaB-Domínio2-His, SEQ ID NO:21
[00500] — Ravi-FlaA2-Domínio2-His, SEQ ID NO:22
[00501] —Ravi-FlaB-PcrV-His, SEQ ID NO:23
[00502] — Ravi-FlaB-Domínio2-MrkA-complementação-fita-doadora- His, SEQ ID NO:24
[00503] — Ravi-MrkA-complementação-fita-doadora-PcrV-His, SEQ ID NO:25
[00504] Ravi-FlaB-Domínio2-PcrV-His, SEQ ID NO:26
LSAIGSGHHHHHH Purificação das proteínas de fusão
[00505] Para iniciar a purificação, péletes bacterianos foram ressuspensas em 4 mL de Tris 20 mM resfriado, pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM, MgCl2 10 MM e 2X Halt Protease Inhibitor (Thermo Fisher) por grama de pélete celular. As bactérias foram rompidas com sonicação, seguida pela adição de DNase | até uma concentração final de 25 ug/mL. Resíduos insolúveis foram removidos por centrifugação a 5000x g por 20 minutos. O lisado clarificado foi diluído com um volume equivalente de Tris 20 mM, pH 8,0, com NaCl 500 mM para levar a concentração final do tampão para Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol mM e MgCl2 5 MM 1x Halt Protease Inhibitor. As proteínas foram purificadas por ligação a uma resina de afinidade com níquel, lavagem com Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM e eluindo a proteína ligada com Tris 20 MM, NaCl 500 MM, imidazol 500 mM. As frações de pico na eluição esperada para um dímero da proteína alvo foram agrupadas e concentradas. As proteínas eluídas dessas colunas foram purificadas mais por filtração em gel e/ou SEC. Essas proteínas foram então analisadas por SDS-PAGE, Western blotting e SEC. Todas as proteínas de fusão migraram em SDS-PAGE na MW prevista. À concentração das proteínas de cada amostra foi medida com um kit de ensaio de proteínas BCA (BioRad). As proteínas purificadas foram divididas em alíquotas, instantaneamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenados a -80ºC para uso futuro.
[00506] Um resumo dos atributos físicos de proteínas de fusão de rizavidina exemplares e variantes da invenção é mostrado na Tabela 5. Todas as proteínas de fusão de rizavidina da invenção foram expressas e determinadas serem proteínas diméricas, conforme demonstrado por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) (Tabela 5). Tabela 5: Atributos físicos das proteínas de fusão de rizavidina expressas em E. coli da invenção
ESEIISETES Proteína Bactéria monômero presente por; TLR5 (KDa) SEC presente
[mem | seem [tio pesto E, Proteína Bactéria monômero presente por TLR5 (kDa) SEC presente [RaviFaBD2his | Paemuwnosa | 3 | sm | não | [RaviFlan2D2-nis | P.aemainosa | 27 | sm | não | A fegmen) + | em [e | mm amam e | ee | e | EE (name | o) sm | ve | Avaliação da atividade de TLR5 em proteínas de fusão com flagelina
[00507] Para avaliar se as proteínas de fusão são devidamente dobradas, células HEK293-NFKkB:Luc foram estimuladas pela incubação por 4 horas com uma titulação de cada proteína ou complexo em teste, conforme mostrado na Figura 12B. Foi documentado anteriormente que células HEK293-NFKkB:Luc respondem à flagelinas, mas não a LPS ou Salmonella não flagelada (Simon and Samuel, 2007). Após lise das células, a atividade de luciferase foi determinada com Firefly Luciferase da Promega. O ensaio mede a ativação de NF-KkB. (Simon and Samuel, 2007).
[00508] A bioatividade de TLR5 em um ensaio utilizando células HEK293-NFKB:Luc e flagelinas nativas de Pseudomonas e proteínas de fusão com Ravi, isoladamente ou em complexo de MAPS com PnPS 6B, é mostrada na Figura 12B. Esses resultados indicam claramente que as construções de rizavidina-flagelihna FlaB, FIaA1l, FIlaA2 promoveram a atividade de TLR5 por si mesmas ou como um complexo de MAPS com o PnPS 6B e, portanto, estavam dobradas devidamente. Imunogenicidade de proteínas de fusão exemplares
[00509] Soros com título elevado para variantes das proteínas de fusão foram gerados para avaliar a atividade in vitro atividade de anticorpos específicos contra as proteínas. Os títulos de IgG por ELISA contra o imunógeno correspondente para cada uma das seguintes proteínas de fusão (FP): Ravi-FlaB-D2; Ravi-FlaA2-D2; Ravi-FlaB-PcerV; Ravi-FlaB-D2-MrkA e Ravi-PcrV-MrkA são mostrados na Figura 14. Todas as FPs são muito imunogênicas e provocam título elevado de anticorpo IgG específico contra as FPs.
[00510] Areatividade cruzada entre FlaB e FlIaA1 com soro de coelho contra proteínas de fusão de rizavidina contendo FlaB é resumida na Tabela 6. Tabela 6: Reatividade cruzada de soros de coelhos imunizados com proteínas de fusão de rizavidina contendo FIlaB para FlaB nativa purificada de PA PAO1 ou FIaA1 purificada de PA PAK o fem TRA ao Ravi-FlaB-D2-
[00511] Tanto o soro anti-Ravi-FlaB-D2 e como o anti-Ravi-FlaB- PcrV de Coelho apresentam títulos altos de anticorpo específico contra FlaB, mas os soros anti-Ravi-FlaB-D2-MrkA exibem títulos baixos de anticorpo específico contra FlaB em comparação. Os soros anti-Ravi- FlaB-PcrV apresentaram reatividade cruzada significativa com o anticorpo específico contra FIaA1, sugerindo, assim, que o componente FlaB da proteína de fusão está devidamente dobrado e que os epítopos FIaA1 com reatividade cruzada provavelmente situam-se fora do domínio 2 da flagelina, nos domínios DO e D1 comuns conservados (Song and Yoon, 2014) que não são expressos em Ravi-FlaB-D2 ou FIlaB-D2-MrkA. Consequentemente, por causa de sua reatividade cruzada significativa com FIaA1, Ravi-FlaB-PcrV é uma excelente proteína de fusão candidata que pode fornecer imunidade ampla baseada em flagelina contra infecções por Pseudomonas.
Exemplo 5: Preparação de complexos imunogênicos Preparação de estruturas poliméricos de OPS nativo OPSs nativos
[00512] Os sorotipos O1, O2, O3 e O5 de polissacarídeos-O (OPS) de K. pneumoniae (KP OPS) e os sorotipos O1, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011 do OPS do core de P. aeruginosa (PA OPS) foram isolados da biomassa da fermentação dos organismos cultivados em CDM após tratamento com fervura a 100 ºC em ácido acético um por cento, para o PA OPS, ou com ácido acético e nitrito de sódio (NaNO>) para o KP OPS. Para o PA LPS, o tratamento com ácido acético clivou a ligação de KDO do inner core do LPS e do lipídio A (Figura 1A) e gerou uma porção KDO na extremidade redutora do COPS. Para o KP LPS, a desaminação com ácido nitroso clivou a ligação entre o resíduo de glicosamina do inner core e o resto da porção de lipídio A do inner core do LPS e gerou um resíduo redutor de 2,5-anidromanose com um aldeído no Carbono-1 (Figura 1C). As estruturas do PA OPS (Knirel et al., 2006) e do KP OPS (Vinogradov et a/., 2002) são mostradas nas Figuras 1B e 1D, respectivamente. O processo de purificação a jusante dos PA e KP OPS é mostrado na Figura 8A. Esses processos de purificação renderam quantidades elevadas (>50-100 mg/L de material purificado) de OPS altamente puro com níveis baixos de proteína residual, ácidos nucleicos e endotoxina. A identidade química e imunoquímica do OPS foi averiguada por despolimerização com TFA e Dionex HPAEC-PAD, RMN-1H de alta resolução, comparando dados espectrais de RMN (deslocamentos químicos e constantes de acoplamento) com a literatura publicada, e imunorreatividade por ELISA com anticorpos monoclonais específicos para tipos de OPS de KP e OPS de PA ou antissoro desenvolvido com bactérias inteiras mortas pelo calor (Figura 6C). A MW média do OPS, conforme medida por SEC e SEC-MALLS, variou entre cerca de 10 kDa e 30 kDa, dependendo do tipo, com o OPS de PA OPS tipicamente maior que o OPS de KP. Um resumo das análises da composição de monossacarídeos por HPAEC- PAD (Dionex) dos OPS purificados de KP e de PA é mostrado na Tabela
7. Tabela 7. Análises da composição de monossacarídeos por HPAEC- PAD do OPS purificado de KP e do COPS de PA Bactéri Polissacarídeo Análise de Composição esperada do actérias o monossacarídeos por OPS” HPAEC-PAD*? K. pneumoniae
POC pneumoniae
PEC pneumoniae NAc-fucosamina, NAc- P. Fucosamina, galactosamina, NAc- aeru inosa IATS O1 Quinovosamina, quinovosamina, ácido 9 Galactosamina 2,3-diamino-2,3-didesoxi- NAc-glucurônico Ácido 2,3-diamino-2,3- didesoxi-NAc- P. IATS O2 Fucosamina mManurônico, ácido 2,3 aeruginosa diamino-2,3-didesoxi- NAc-guclurônico, NAc- fucosamina P. R Ramnose, NAc- : IATS O3 amnose, glucosamina, ácido NAc- aeruginosa Glucosamina A galacturônico, P. Fucosamina, NAc-fucosamina, aeru inosa IATS O4 Quinovosamina, Rhmnose, NAc- 9 Ramnose quinovosamina
Polissacarídeo Análise de Composição esperada do Bactérias Oo monossacarídeos por OPS? HPAEC-PAD*? Ácido NAC-NAc- P. ; manurônico, ácido NAc- aeruginosa IATS OS Fucosamina NAm-Manurônico, NAc- fucosamina Ramnose, ácido NAc-Ac- P. Quinovosamina, galacturônico, ácido Nfo- : IATS O6 a aeruginosa Ramnose* galacturônico ,NAc- quinovosamina : ; Ac-Ramnose, ácido NAc- som A quinovosamina aeruginosa Ramnose 5 5 quinovosamina aeruginosa ºO instrumento detecta somente sacarídeos neutros, não ácido urônico; polissacarídeos despolimerizados em TFA 2M/100 ºC/4 horas a menos que informado de outra forma ? Knirel et al. 2006 “determinado depois de TFA 4M/100 ºC/18 horas Estrutura polimérica OPS
[00513] A Figura IE descreve a estrutura química da unidade repetida do polissacarídeo capsular (CPS) K19 de K. oxytoca (KO) que é idêntico ao CPS K19 de K. pneumoniae. A Figura 1F apresenta um espectro por RMN-H a 950 MHz de CPS K19 de KP. Os OPSs nativos de KP e de PA de MW média de 10-30 kDa foram ligados no CPS K19 maior (avMW 218 kDa) para aumentar o tamanho efetivo da MW deles e a valência de seus epítopos. O OPS e estrutura polimérica foram biotinilados subsequentemente ou durante o processo de alargamento seja seletivamente na estrutura polimérica do CPS K19 para produzir BP-1, BP-1.2 ou BP-1.3 (Figuras 2A-2C), ou aleatoriamente no OPS e no CPS para produzir BP-2a (Figura 3) ou seletivamente no OPS para produzir BP-2b (Figura 4).
[00514] Asestruturas poliméricas eluem notavelmente mais cedo em uma coluna de exclusão por tamanho do que o CPS K19 ou OPSs sozinhos, sugerindo que eles aumentaram significativamente de tamanho em comparação aos componentes isoladamente, e demonstraram reduzido o nível de OPS livre em relação à quantidade no material inicial indicando incorporação na estrutura polimérica.
[00515] Esse processo de alargamento usando CPS, como o CPS K19 em uma estrutura polimérica, é um processo universal que pode ser aplicado a qualquer CPS/OPS ou polissacarídeos bacterianos de pequena MW, pode levar a um produto bem definido e consistente e gera alterações mínimas a nenhuma dos epítopos de OPS/CPS. Como mostrado na Figura 6C, isso foi claramente demonstrado após análises de antigenicidade por ELISA com OPS O1, O2, O3, O6, 010 e 011 nativos de PA e as construções correspondentes PA OPS:K19 BP-1, usando soro hiper-imune de coelho da imunização HK-PA (Figura 6C). Nesses experimentos, não foi observada diferença na antigenicidade entre o OPS nativo de PA e o correspondente OPS-estrutura polimérica indicando que os epítopos de OPS se mantiveram durante o processo de alargamento. Biotinilação de estruturas poliméricas (BP) BP-1
[00516] O OPS foi primeiramente equipado em sua extremidade redutora com um espaçador curto contendo uma amina primária em cada extremidade (p. ex., ADH) por aminação redutiva com NaBH3CN. Os aldeídos reativos no OPS de KP estavam localizados no resíduos terminais de 2,5-anidromanose (2,5-anMan) gerados durante o procedimento de extração pelo tratamento do LPS inteiro com nitrito de sódio (Figura 8A), enquanto as cetonas reativas no OPS de PA estavam localizadas nos resíduos terminais redutores de KDO do inner core do OPS de PA gerado pelo tratamento do LPS com ácido acético como representado na Figura 8A. O OPS derivado com ADH foi subsequentemente misturado com a estrutura CPS KP19 parcialmente oxidado com periodato (traçados exemplares por SEC-HPLC desses derivados representados na Figura 6A e 6B) e uma amina primária contendo biotina (como amina-PEG3-biotina) e a mistura aminada por reduzida para formar uma estrutura polimérica de OPS unicamente biotinilado na estrutura polissacarídico que foi denominado estrutura polimérica-1 (BP-1) (Figura 2A). BP-1.2
[00517] —Alternativamente, os grupos carboxilato reativos da estrutura CPS KP19 podem ser primeiramente biotinilados com 1-Etil-3-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida N-hidroxissuccinimida (EDC) e N- Hidroxissuccinimida (NHS) e uma amina primária contendo biotina (como amina-PEG-biotina), depois oxidados com periodato, misturados com o OPS derivado com ADH e a mistura aminada por reduzida para formar uma estrutura polimérica de OPS unicamente biotinilado na estrutura polissacarídica que foi denominado BP-1.2 (Figura 2B). Alternativamente, a etapa com ADH pode ser eliminada para o OPS de PA, pois ele contém um aminoácido substituinte de alanina com um grupo a-amino livre no carbono 2 de seus resíduos de galactosamina do outer core (Figura 1A). Consequentemente, esses grupos amino disponíveis podem ser usados prontamente para acoplamento direto por aminação redutiva ao polímero de CPS K19 oxidado com periodato junto com a amina contendo biotina para formar BP-1 (Figura 2A) ou BP-1.2 biotinilado (Figura 2B).
[00518] —Alternativamente, o OPS contendo aldeído ou cetona na sua extremidade redutora são derivados com um composto amino-azida na presença de um agente redutor para produzir um OPS com um grupo azido na sua extremidade terminal. Uma estrutura polissacarídico é então equipado com grupos alcino através dos grupos carboxilato do polissacarídeo e EDC. A estrutura polissacarídica é ainda biotinilada com CDAP e um composto biotina-hidrazida para gerar um polissacarídeo biotinilado contendo alquinilas. O azido-OPS derivado e o alcino-CPS biotinilado são ligados por química click com um catalisador de cobre para formar o (OPS),--CPS BP-1, no qual a estrutura polimérica é biotinilada e o OPS não é biotinilado (Figura 5B; esquema 1). Com essa ligação por química click, pode-se obter também OPS BP-1 introduzindo primeiramente os grupo alcinos no CPS, por meio dos grupos carboxilados e EDC, seguido por aminação utilizando amino-PEG-azida e um catalisador de sulfato de cobre, biotinilação do CPS com CDAP e biotina-hidrazida; o CPS biotinilado contendo grupos amino primários é misturado com o OPS nativo (contendo grupos aldeído ou cetona em suas extremidades redutoras terminais) e aminado por redução com um agente redutor para produzir um OPS/CPS BP-1 (Figura 5B; esquema 2). BP-2b pode ser obtido por essa química click, em primeiro lugar, introduzindo seletivamente resíduos de biotina no OPS derivado com grupos azido na sua extremidade terminal e, então, biotinilado utilizando a química com CDAP e biotina-hidrazida; e, em segundo lugar, ligando por química click o OPS-azido biotinilado derivado com o CPS alquinilado como mostrados na Figura 5B; esquema 3). BP-2a
[00519] —Alternativamente, o OPS derivado com ADH ou OPS não derivado são misturados com a estrutura CPS da cepa KP 19 parcialmente oxidado com periodato e aminado por redução para formar um estrutura polimérica de OPS; a estrutura polimérica é ainda derivada com CDAP e biotina-PEG-amina para obter uma estrutura polimérica aleatoriamente biotinilado com biotina na estrutura polissacarídica e no OPS que foi denominado BP-2a (BP-2a) (Figura 3). BP-2b
[00520] —Alternativamente, o OPS é primeiramente biotinilado com CDAP e amina-PEG-biotina; o OPS biotinilado resultante é parcialmente oxidado com periodato para introduzir aldeídos em seus KDOs do inner core ou porções de heptose e aminado por redução com ADH; o OPS biotinilado e aminado é então misturado com a estrutura CPS KP 19 parcialmente oxidada com periodato para formar um estrutura polimérica de OPS seletivamente biotinilada em seu OPS que foi denominado BP-2b (Figura 4 e Figura 5B, esquema 3). BP-3
[00521] —Alternativamente, o OPS derivado com ADH é primeiramente aminado por redução com os grupos e-NH2 de uma estrutura de PLL para produzir uma estrutura polimérica OPS-PLL. O OPS-PLL resultante é tratado com um reagente de acilação, como anidrido acético, para capeamento dos grupos amino (e-NH2) não reagidos da estrutura de PLL e formar uma estrutura polimérica OPS-Poli-N-acetil- Lisina (OPS-PNAcLL). Essa estrutura polimérica OPS-PNAcLL é então biotinilada em seu OPS, primeiramente, pelo tratamento CDAP e, a seguir, com amina-PEG-biotihan Essa estrutura polimérica seletivamente biotinilada em seu OPS é denominado BP-3 (Figura 5A).
[00522] OPS não reagido, biotina, CPS e substâncias químicas residuais da conjugação foram removidos por FPLC-SEC com Superdex 200 ou por TFF UF-DF 50-300 kDa. Geração e purificação de complexos imunogênicos exemplares
[00523] “Complexos de MAPS ou complexos de MAPS variante foram gerados adicionando a proteína de fusão rRavi-antígeno candidata ao polissacarídeo biotinilado, em Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, na razão selecionada (tipicamente 3:1, proteína:PS m:m) com timerosal 0,01% adicionado para inibir o crescimento microbiano. A amostra foi incubada com rotação extremo a extremo (end over end) a 25 ºC durante a noite seguida por centrifugação a 10.000x g por 5 minutos para remover qualquer material insolúvel (Zhang et a/., 2013). O material solúvel foi coletado e os complexos de MAPS ou complexos de MAPS variante foram purificados com cromatografia de exclusão por tamanho em uma coluna Superdex 75 (MAPS de OPS nativo de PS) ou coluna Superdex 200 (MAPS de CPS e MAPS com estrutura polimérica variante de PS) com Tris 2 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM (Zhang et al., 2013). As frações de pico foram analisadas quanto ao teor proteico com SDS-PAGE de amostras reduzidas sem aquecimento e visualizadas com corante para proteína total. As frações contendo complexos de MAPS ou MAPS variante foram identificadas, observando o gel, pelo corante retido pela proteína em complexos de grande massa molecular no gel em vez da migração esperada no tamanho do dímero proteico (Zhang et al., 2013). As frações contendo os complexos de MAPS foram agrupadas, e a razão proteína/polissacarídeo do MAPS ou MAPS variante foi determinada utilizando o kit de ensaio com BCA para proteína e o ensaio com antrona para polissacarídeo (Zhang et al, 2013). A integridade dos complexos de MAPS ou MAPS variante foi avaliada com SDS-PAGE de amostras reduzidas sem aquecimento e visualizadas com coloração para proteína total (Zhang et a/., 2013). O teor de proteína livre dos complexos de MAPS ou MAPS variante foi quantificado por densitometria do teor de dímero proteico no complexo de MAPS ou MAPS variante por SDS-PAGE sem aquecimento em comparação a uma quantidade padrão de dímero proteico controle (Zhang et a/., 2013). A massa molecular da proteína incorporada nos complexos de MAPS ou MAPS variante foi analisada com SDS-PAGE de amostras reduzidas fervidas visualizadas com corante para proteína total e um padrão da massa molecular.
[00524] OPS de KP/PA foram produzidos em várias formas de OPS- estrutura polimérica (1, 2a, 2b), utilizando CPS K19 como a estrutura polimérica, e foram complexados em MAPS variante com as seguintes proteínas de fusão de rizavidina recombinantes de E. coli, derivadas do genoma de KP e PA: Ravi-PcrV; Ravi-MrkA; Ravi-FlaA1; Ravi-FIaA2; Ravi-FlaB; Ravi-FlaB-Domínio2; Ravi-FlaA2-Domínio2; Ravi-FlaB-PcrV;
Ravi-FlaB-Domínio2-MrkA; Ravi-MrkA-PcrV; Ravi-FlaB-Domínio2-PcrV, com cada uma das SEQ ID NOs: 16-26 e utilizando PRO-CN como proteína controle.
[00525] — Atributos exemplares de alguns lotes de MAPS gerados com a proteína de fusão de rizavidina da invenção e complexado com polissacarídeos biotinilados pneumocócicos de PS tipos 6B, 7F e 19A são mostrados na Tabela 8. Purificações exemplares de complexos de MAPS variante são mostradas nas Figuras 10 e 11. Os complexos de MAPS variante foram purificados da proteína não reagida por SEC e as frações eluindo o gel, analisadas por SDS-PAGE; uma análise típica é mostrada na Figura 10, em que foi demonstrado que a proteína livre eluía nas frações tardias do gel e que pode ser separada do MAPS variante como originalmente observado para complexos de MAPS em Zhang et al., 2013. As Figuras 11A-11C apresentam análises por SDS- PAGE de complexos de MAPS K19-PA O1 OPS BP-1 purificados, complexos de MAPS K19-PA O2 OPS BP-1 e complexos de MAPS K19- PA O10 OPS BP-1 com PRO-CN (Figura 11A); Ravi-FlaB-PcrV (Figura 11B); Ravi-FlaB-D2-MrkA (Figura 11C). Cada uma das amostras de MAPS variante purificado foi processada separadamente com fervura e sem calor. Os complexos de MAPS variante não se romperam sem calor, e a proteína nos complexos de MAPS variante ficou retida na parte superior do gel (Zhang et a/., 2013). Com a fervura, os complexos de MAPS variante foram rompidos, a proteína foi liberada e o dímero da proteína formado através de interação intermolecular de rizavidina foi também desassociado (Zhang et a/., 2013). O teor de proteína do MAPS variante foi então determinado com o ensaio de BCA e o teor de polissacarídeo, determinado com o ensaio de antrona. A razão proteína/polissacarídeo foi calculada como razão massa/massa e como razão molar.
[00526] Todos osMAPS e MaAPS variantes finais purificados foram passíveis de filtração estéril com um filtro de 0,2 um (Tabela 8 e dados não mostrados).
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Exemplo 6: Estudos de imunização Imunização de animais
[00527] Antes da imunização de coelhos, os complexos MAPS ou MAPS variante ou PS sozinho foram formulados com adjuvante aproximadamente 48 horas antes da injeção. MAPS ou MAPS variante foram adsorvidos no adjuvante a uma concentração final de 10 ug/mL de cada sorotipo de PS, quer em mistura única ou mistura multivalente com histidina 40 MM, pH 5,5, NaCl 150 mM e gel de fosfato de alumínio 0,25 mg/mL com mistura end over end durante a noite a 4 ºC. Essa mistura formulada foi usada diretamente para as imunizações em um volume de 0,5 mL para uma dose de 5 ug de PS. Para doses menores de PS, foi realizada a diluição adequada com histidina 40 mM, pH 5,5, NaCl 150 mM. Duas imunizações IM (0,5 mL) foram administradas com intervalo de 2 ou 4 semanas a coelhos New Zealand White de 4 meses de idade (Cocalico Biologicals, n = 8 a 10 por grupo). Foram obtidas amostras de sangue 2 semanas depois da primeira e da segunda imunização com um intervalo de 2 semanas entre as doses. As amostras foram coletadas 2 e 4 semanas depois da primeira imunização e 2 semanas depois da segunda imunização para o intervalo de 4 semanas entre as doses.
[00528] Para obter título alto de anticorpos contra as proteínas de fusão candidatas de transporte, usou-se o adjuvante completo de Freund, para a primeira, e o incompleto de Freund para a segunda e a terceira imunização, respectivamente. Cada proteína de transporte (0,1 mg) foi misturada separadamente com o adjuvante de Freund para um volume final de 1 mL, com 0,2 mL injetados por via subcutânea em 4 locais 4 diferentes e 0,2 mL injetados IM por coelho por imunização. As imunizações foram administradas a coelhos New Zealand White de 4 meses de idade (Cocalico Biologicals), (n = 3 por grupo) no Dia 0, Dia 14 e Dia 21, e amostras de sangue foram coletadas 2 semanas depois da segunda e da terceira imunização. Medição de anticorpos
[00529] Os ensaios para anticorpos de coelhos contra polissacarídeos capsulares (CPS) ou OPS ou antígenos proteicos diferentes foram realizados no meio Immulon 2 HB ou Greneir Bio-one para ligação em placas de 96 microcavidades (Thermo Scientific Waltham Mass) revestidas com (1 ug CPS ou OPS ou PS conjugados a HSA/mL de PBS) ou com antígenos proteicos (1 ug de proteína/mL de PBS). As placas foram bloqueadas com BSA 1% em PBS. O anticorpo diluído em PBS-T foi adicionado e incubado à temperatura ambiente por 2 horas. As placas foram lavadas com PBS-T e o anticorpo secundário conjugado com HRP contra imunoglobulina G de coelho (da Sigma) foi adicionado e incubado à temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas e reveladas com o substrato SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL, Gaithersburg, MD).
[00530] O título de IgG de coelho em amostras de soro específico para os diferentes antígenos proteicos foi determinado com ELISA e uma curva padrão de unidades arbitrárias designadas a soro policlonal. Os antígenos proteicos foram revestidos durante a noite à temperatura ambiente em placas de 96 microcavidades Immulon 2 HB (Thermo Scientific) a 0,5-1 ug de proteína/mL de PBS com 100 yuL por cavidade. A solução com as proteínas foi removida, e as placas foram bloqueadas com PBS + BSA 1,0% por 1 hora à temperatura ambiente e lavadas com solução salina com tampão fosfato de Dulbeco com Tween-20 0,05% (PBS-T). O soro dos coelhos foi diluído em PBS-T, adicionado à placa e incubado à temperatura ambiente por 2 horas. As placas foram lavadas com PBS-T e IgG secundária de burro anti-lgG de coelho conjugado a HRP (Santa Cruz Biotechnology), diluído 1 para 20.000 em PBS-T, foi adicionada, 100 uL por cavidade, e incubada à temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas e reveladas com o substrato SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL, Gaithersburg, MD). A reação foi interrompida com um volume igual de HCI IN, e a absorbância foi lida a 450 nm em um leitor de placas Spectramax (Molecular Devices). Um valor de AU de 12.500 AU/mL foi atribuído ao soro policlonal padrão incluído em cada placa, e uma equação de um ajuste da curva de 4 parâmetros foi utilizada para atribuir o valor de AU para cada amostra diluída de soro com base na absorbância a 450 nm e corrigido para o fator de diluição. Os critérios de aceitação da curva padrão do soro policlonal (AFV160, específico para PRO-CN, rizavidina e tag de 6 histidinas) foi Rº para o ajuste da curva de 4 parâmetros de 0,99 ou maior e menos de 10% de CV entre duplicatas. Um soro de controle interno (AFV151, específico para PRO- CN, rizavidina e tag de 6 histidinas) foi também incluído em cada placa, e o CV para o valor atribuído tinha que ser igual ou inferior a 20% entre as placas para aceitação dos dados. Avaliação da função de transporte
[00531] A capacidade para função de transporte das proteínas de fusão de rizavidina para gerar uma resposta imune aumentada aos polissacarídeos nos complexos MAPS foi avaliada e comparada à de rizavidina sozinha e uma proteína de transporte controle (PRO-CN) que havia gerado anteriormente respostas imunes robustas a polissacarídeos complexados. As várias proteínas de fusão geradas foram complexadas com polissacarídeos de imunogenicidade conhecida (S. pneumoniae 6B, 7F e 19A) (Zhang et al., 2013) e comparadas a uma proteína de transporte controle de função robusta (PRO-CN). Todas as proteínas de fusão foram capazes de complexar com o PS biotinilado e formar complexos de alta massa molecular que foram passíveis de purificação e uso subsequente para imunização de coelhos e avaliação da função de transporte.
[00532] Os coelhos foram imunizados com complexos MAPS gerados com polissacarídeos pneumocócicos (PnPS) 6B e 19A, gerados com várias proteínas de fusão de rizavidina. O soro foi coletado 2 semanas depois da primeira imunização (P1) e da segunda imunização (P2). Os níveis de IgG dos coelhos contra o PNPS 19A e 6B de cada amostra foram medidos por ELISA e relatados em AU que foram determinadas a partir de uma curva padrão com soro policlonal atribuído com AU de 12.500 AU/mL. Como mostrado nas Figuras 13A e 13B, Flagelina B (FlaB) de Pseudomonas, como proteína de fusão de rizavidina (Ravi-FlaB), e FlaB de Pseudomonas fundida a PcrV de Pseudomonas PcrV, como proteína de fusão de rizavidina (Ravi-FlaB- PcrV), foram capazes de gerar títulos de IgG contra polissacarídeos pneumocócicos (PnPS) 6B e 19A semelhantes aos da proteína de transporte anteriormente identificada, PRO-CN. FIaA1 e FIaA2 de Pseudomonas, como proteínas de fusão de rizavidina (Ravi-FlaA1 e Ravi-FlaA2), e Domínio 2 de FlaB de Pseudomonas fundido a MrkA de Klebsiella como proteína de fusão de rizavidina (Ravi-FlaBD2-MrkA) demonstram títulos que foram semelhantes ou dentro de 2 vezes os títulos de Ravi-FlaB e PRO-CN. MrkA de Klebsiella e PcrV de Pseudomonas demonstraram títulos de IgG muito baixos a não detectáveis contra 19A PS do desafio e títulos baixos para 6B e 7F na dose de 0,044 ug. Para superar a baixa função de transporte de MrkA enquanto ao mesmo tempo gerando anticorpos direcionados contra MFrkA, este foi fundido com a forte proteína carreadora Domínio 2 de FlaB para reter a função de transporte (Ravi-FlaBD2-MrkA).
[00533] A Tabela 9 resume os atributos de transporte de proteínas de fusão de rizavidina exemplares da invenção. A função de transporte de cada proteína de fusão é expressa em percentual daquele demonstrado pela proteína de transporte, PRO-CN, e comparado ao da proteína rizavidina sozinha que obteve somente 4% da resposta imune a 6B e 5% da resposta imune a 19A quando comparada àquela de PRO-
CN. Ravi-FlaB-PcrV, uma proteína duplamente patogênica (uma proteína quimérica com dois antígenos derivados de FlaB e PcrV de Pseudomonas fundidos com rizavidina), emergiu como uma forte transportadora em termos de desenvolver uma resposta imune robusta específica a PNPS em coelhos ao tipo 6B (62%) e 19A (102%) em relação a PRO-CN (100%). Ravi-FlaB também demonstrou forte função de transporte com respostas robustas a 6B (66%) e a 19A (49%) em relação a PRO-CN. Ravi-MrkA apresentou menor função como proteína de transporte para 6B (27%) e 19A (2%) em relação a PRO-CN, respectivamente. Ravi-FlaBD2 exibiu uma função de transporte robusta para 6B (66%) e menor função transportadora para 19A (20%). O Ravi- FlaBD2-MrkA quimérico contendo antígenos de Pseudomonas (FlaBD2) e de Klebsiella (MrkA) proporcionou uma função de transporte para 6B (34%) e 19A (45%), que é aproximadamente 2 vezes menor do que a proteína de transporte, PRO-CN, e aumentada em relação à rizavidina isoladamente. Por terem gerado uma resposta imune contra PnPS superior a 30% à de PRO-CN e por que um número maior de proteínas patogênicas específicas estar representado, ambas as variantes Ravi- FlaB-PcrV e Ravi-FlaBD2-MrkA foram selecionadas como proteínas de transporte candidatas para complexar no MAPS variante com o OPS- estrutura polimérica da invenção. Além da função de transporte demonstrada, uma proteína de transporte IgG-específica contra o PcrV altamente conservado de Pseudomonas e, em alguma medida contra FlaB (ou seja, aproximadamente 45 por cento das cepas de Pseudomonas expressavam FlaB) e contra MrkA conservado de Klebsiella gerado contra essas FPs pode conferir ampla cobertura protetora adicional significativa contra doença causada por esses dois patógenos.
Tabela 9: Atributos da proteína de transporte de proteínas de fusão de rizavidina exemplares e variantes
% da média | % da média Domínio . Função de| geométrica | geométrica Proteína Bactéria TLR5 BR transporte] de PRO-CN [de PRO-CN presente 6B 19A Ravi-FlaA2D2- , P. aeruginosa Não + n 5 his Ravi-FlaBD2- | P. aeruginosa Não +++ 34 45 MrkA-his K. pneumoniae Ravi-FlaB-PcrV- . hi P. aeruginosa Sim ++++ 62 102 is Ravi-PcrV-MrkA-| P. aeruginosa NA ++ 30 23 his K. pneumoniae *Capacidade da proteína de fusão para desenvolver uma resposta de anticorpo contra PS pneumocócico do tipo 19A e 6B (PnPS), em relação à proteína de fusão Icom PRO-CN considerada como a referência de 100 por cento (++++). Avaliação da imunogenicidade
[00534] “Um estudo comparativo da imunogenicidade em coelhos de várias formulações de OPS O6 e 010 nativos de PA em complexos de MAPS com a proteína de fusão de rizavidina PRO-CN, ou rizavidina é mostrado na Figura 15. Os títulos de IgG específicos para os OPS por ELISA são relatados em unidades ELISA. Títulos de anticorpos IgG OPS-específicos mais de 100 vezes acima de PO não puderam ser gerados com qualquer uma dessas formulações após 2 imunizações (P2). Isso sugere que o tamanho molecular dos OPSs nativos de PA
(10-30 kDa) era pequeno demais, a valência dos epítopos era baixa demais ou que a estrutura molecular não era adequada para induzir uma resposta mesmo em um complexo de MAPS com a proteína de transporte, PRO-CN.
[00535] Um estudo de imunogenicidade comparando várias variantes da estrutura polimérica de KP-O1 OPS complexado para MAPS foi realizado em coelhos. As variantes BP-1, BP-2a e BP-2b de KP O1 OPS ligadas ao polissacarídeo capsular (CPS) K19 de Klebsiella foram avaliadas quanto à imunogenicidade. Uma variante BP-1 de KP OS5 ligada a K19 foi também avaliada. Quatro misturas de compostos de MAPS foram comparadas quanto à imunogenicidade; 2-valente KP-O1 e -O5 OPS BP-1 (cujo desenho esquemático é mostrado na Figura 2A); KP-O1 BP-2a (Figura 3), e KP-O1 BP-2b (Figura 4). Esses polissacarídeos foram todos complexados no MAPS variante com a proteína de transporte PRO-CN e formulados com alúmen antes da injeção. Os títulos de IgG anti-KP-O1 OPS são expressos em unidades ELISA para o soro pré-imune (PO), depois de uma (P1) ou 2 imunizações (P2) e mostrados na Figura 16. BP-2a OPS (12.000 unidades EIA) exibiu títulos de IgG específicos para O1 OPS mais de 100 vezes acima de PO. O1 OPS BP-1 e O5 OPS BP-1 exibiram títulos que foram 10 vezes acima de PO.
[00536] Do mesmo modo, um estudo de imunogenicidade em coelhos comparou várias formulações de PA-O6 e -O010 OPS BP-1: MAPS 2-valente PA-O6,-010 OPS BP-1 PRO-CN com alúmen; MAPS 2-valente PA-O6,-010 OPS BP-1 PRO-CN sem adjuvante (sem alumínio); um polissacarídeo 2-valente PA-O6,-010 OPS BP-1 somente (alúmen, sem proteína); uma mistura 2-valente PA-O6,-010 OPS BP-1 com PRO-CN não complexada (não biotinilado; alúmen; sem formação de MAPS variante); e MAPS monovalente PA-IATS O6 OPS BP-1 PRO- CN com alúmen (fonte adicional de OPS da cepa 06 de PA). Os títulos de IgG anti-PA-O6 e PA-O10 OPS são fornecidos em unidades ELISA para o soro pré-imune (PO), depois de uma (P1) ou 2 imunizações (P2) e mostrados na Figura 17. Títulos de IgG PA-O6 e PA-O10 OPS- específica superiores a 100 vezes acima de PO puderam ser alcançados (variação 5.000-11.000 em unidades ELISA) somente quando o OPS- estrutura polimérica estava presente em um complexo de MAPS variante com alúmen.
[00537] —Otamanho do OPS de KP produzido utilizando as condições padronizadas de crescimento no laboratório com um meio quimicamente definido está na faixa de 10-15 kDa, comparativamente menor do que aquele do OPS de PA (20-30 kDa) obtido sob condições semelhantes; essas diferenças no tamanho poderiam ser explicadas em parte o motivo por que, nesses estudos comparativos de imunogenicidade, PA OPS BP-1 era mais imunogênico do que KP OPS BP-1. As construções KP OPS BP-2b, por outro lado, foram significativamente imunogênicas (Figura 16) Outras diferenças estruturais na unidade repetida do OPS poderiam ser um fator também, tais como as cargas, ambas as unidades repetidas de PA-O6 e -O10 têm carga negativa enquanto que KP-O1 OPS é neutro. Exemplo 7: Ensaios de anticorpos funcionais Ensaio de morte por opsonofagocitose
[00538] Ensaios de morte por opsonofagocitose (OPK) com HL-60: os ensaios foram realizados como descritos anteriormente, com modificações (Ramachandran et a/., 2016). Resumidamente, os ensaios foram realizados em placas de fundo redondo de 96 cavidades com cepas de P. aeruginosa e K. pneumoniae de culturas em fase log diluídas para 3x 10º células/ml; Complemento de coelho lactente (BRC); células HL-60 PMA-diferenciadas (2x 107 células/mL) como a fonte de leucócitos polimorfonucleares; e soro de coelho pré-imune / imune em diversas diluições. Após 45 minutos de incubação a 37ºC,
uma alíquota foi removida da cavidade e colocada em placas de ágar bacteriológico (extrato de levedura-Hy 5% [Kerry Bio-Science], Peptona de soja livre de animal 10% [Teknova], NaCl 5% [Americanbio] e ágar 1,4% Agar [Americanbio], a seguir, referido como HySoy Ágar ou HSA). Após incubação durante a noite em HAS, as CFU foram contadas. Uma resposta positiva de OPK é obtida quando as CFU para bactéria tratada com soro imune são reduzidas daquela com diluição semelhante do soro pré-imune.
[00539] A Figura 18A compara a OPK da cepa KP 12-0581 (01: K62) de Klebsiella com células HL-60 e antissoro de coelho a: MAPS KP-O1 OPS BP-1 PRO-CN antes e após a segunda imunização (esquerda) e MAPS KP-O1 OPS BP-2a /Rizavidina PRO-CN antes e após a segunda imunização (direita). Foi observada morte significativa de KP para o soro imune BP-2a (P2) em comparação com soro pré-imune (PO) do mesmo coelho. Não foi observada morte significativa com soro imune BP-1, em concordância com os títulos de IgG O1-OPS-específica, obtidos com essas construções, ou seja, BP-2a > BP-1 em termos de títulos relativos.
[00540] A OPK da cepa PA IATS O6 de Pseudomonas com células HL-60 e antissoro de coelho para MAPS bivalente PA O6, 010-OPS BP- 1 PRO-CN e MAPS monovalente PA IATSO6 -OPS BP-1 PRO-CN é mostrada na Figura 18B. O soro P2 individual de 2 coelhos (AFV 624; AFV 625) para MAPS PA O6, O010-BP-1 gerou OPK significativa de PA IATSOG6 (painel esquerdo), o soro de coelho pós-imune (P2) contra MAPS PA IATSO6-BP-1 produziu OPK significativa de PA IATS O6 também, embora o soro de AFV643 (P2) tenha produzido um efeito prozona sugestivo de título forte de anticorpos contra OPS.
[00541] Os soros imunes (P2) de quatro coelhos individuais, gerados com uma vacina 2-valente PA-O6, -O010 OPS BP-1-PRO-CN-MAPS, induziram OPK robusta de bactérias Pseudomonas O10 com células HL-60 (Figura 18C).
[00542] “Uma OPK da cepa alvo PAO1 (O5: expressando FlaB) de P. com um pool de antissoro de coelho anti-Ravi-FlaB-His e células e HL- 60 é mostrada na Figura 22. Nesse experimento, houve alguma OPK (até diluição 1/100) provocada pelo antissoro anti-Ravi-FlaB-His. Fortes OPKs foram registradas com uma IVIG humana desenvolvida com uma vacina contra Pseudomonas e soro anti-FlaB de Pseudomonas. O soro de controle (-) não induziu OPK.
Ensaios de OPK com PMNs humanos
[00543] Ensaios foram realizados como descritos anteriormente com modificações (Cross et al., 1986). Resumidamente, os ensaios foram realizados em placas de 96 cavidades utilizando leucócitos polimorfonucleares (PMN) recentemente isolados de doadores humanos sadios por sedimentação com dextrano e centrifugação com gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. A solução estoque de PMN foi ajustada para 23 x 10º células/ml. em HBSS com cálcio/magnésio. Sessenta ul de estoque de PMN são adicionados à cavidade de microtitulação junto com 10-20 ul de complemento de coelho lactente ou soro humano normal (NHS) fresco, 10 ul de bactérias (-10º CFUs para MOI —-1:1) na presença ou ausência de 10 uL de soro pré ou pós- imune inativado pelo calor em várias diluições. Uma amostra do tempo O é obtida, diluída e colocada em placas HySoy e a placa de 96 cavidades é então incubada por 2 horas a 37 ºC com agitação. Em 2 horas, amostras são novamente obtidas, diluídas e colocadas em placas. Após incubação durante a noite a 37 º C, as placas são contadas. As contagens de 2 horas de cada cavidade são divididas pelas contagens do tempo O, e % de eliminação é calculado por 1,0-T » CFU/To cru. Alternativamente, as CFUs de cada cavidade serão convertidas em log CFU e a contagem de log CFU da amostra de 2 horas será subtraída da contagem de log CFU do tempo O e expressarão a diferença em eliminação como "delta log CFU". À eliminação nas cavidades com soro pré e pós-imune é então comparada ao controle sem anticorpo. Ensaios de ligação baseados em citometria de fluxo
[00544] Cepas na fase Mid-log de P. aeruginosa e K. pneumoniae foram concentradas em PBS até ODçsoo de 0,8. Para antígenos polissacarídicos, as bactérias foram fixadas com formaldeído 1% antes de adicionar o anticorpo. Para antígenos proteicos, as bactérias não foram fixadas com formaldeído antes de adicionar o anticorpo para preservar os antígenos na superfície celular. As bactérias foram incubadas com várias diluições de soro pré-imune/imune de coelho por 1 hora à temperatura ambiente. O anticorpo não ligado foi removido por centrifugação e formação de pélete das bactérias e lavagem com PBS, as células lavadas foram incubadas com um anticorpo de cabra com Alexa Fluor 488 anti-lgG de coelho (Invitrogen) por 1 hora à temperatura ambiente. O anticorpo secundário não ligado foi removido por centrifugação e formação de pélete das bactérias e lavagem com PBS. As bactérias imunocoradas foram fixadas em formaldeído 1% para eliminar quaisquer organismos viáveis. Amostras foram injetadas em um citômetro de fluxo LSR II (BD) e analisadas utilizando FACS Diva (v.
6.1.3; BD) e FlowJo (v. 9.2; Tree Star).
[00545] A ligação FC à cepa B5055 (01: K2) de Klebsiella com antissoro de coelho contra MAPS K-19: O1- e O5-OPS BP-1 e BP-2a PRO-CN é mostrada na Figura 19A. Ligação FC à cepa B5055 da bactéria inteira Klebsiella com soros individuais de coelhos contra 2- valente KP O1, O5 OPS BP-1 (nº 651-655) (esquerda) e KP O1 OPS BP-2a (nº 666-670) (direita).
[00546] Esses resultados de ligação FC com a bactérias inteira correlacionam-se bem com os títulos correspondentes de IgG por ELISA contra KP O1 OPS purificado como mostrados na Tabela 10, ou seja, título baixo corresponde à baixa ligação FC, um número pequeno de eventos duplo-positivos indica ligação fraca do anticorpo ou acesso limitado do anticorpo contra OPS na superfície de KP B5055. Tabela 10: Títulos de IgG KP O1-OPS por ELISA contra as construções das estrutura polimérica MAPS BP-1 O1-OPS e BP-2a ; | Antssaadecaaro EA
[00547] A Figura 19B compara gráficos de dispersão da ligação FC para três cepas O1 de Klebsiella O1 com um antissoro de coelho (AFV667) gerado com um complexo de MAPS OPS KP O1 BP-2a PRO- CN; nos painéis superiores, são observadas ligação FC fraca a KP B5055 (esquerda), ligação fraca a K. caroli (meio) e ligação forte a KP CVD 3001 não encapsulado (direita). No painel inferior (Figura 19B), uma comparação dos eventos de ligação FC às mesmas 3 cepas 01 de Klebsiella O1 entre um soro de um coelho vacinado com um MAPS 2- valente KP O1, OS OPS BP-1 (AFV651) PRO-CN e um soro de coelho (AFV667) desenvolvido com um MAPS monovalente KP O1 OPS BP- 2a PRO-CN. De nota, há significativamente mais ligação FC do anticorpo com a construção O1 OPS BP-2a do que com o BP-1 OPS correspondente, e esses dados parecem correlacionar-se com os títulos de IgG contra O1 OPS, ou seja, KP O1 OPS BP-2a são mais imunogênicos do que seus equivalentes BP-1. Esses dados de ligação também sugerem que a quantidade de CPS afeta a exposição do OPS ao anticorpo, possivelmente influenciado por condições do crescimento.
[00548] “Uma comparação da ligação FC do anticorpo à cepa PAK (O6:FIaA1) da bactéria Pseudomonas inteira é mostrada na Figura 20: com soros de coelho (soros agrupados de 3 coelhos, após a segunda imunização) para MAPS 2-valente PA-O6, -O010 OPS nativo-PRO-CN-
(esquerda); soros de coelho (soros agrupados de 3 coelhos, após a segunda imunização) para MAPS 2-valente PA O6, 010-OPS BP-1- PRO-CN (meio); soros de coelho (soros agrupados de 3 coelhos, após a segunda imunização) para MAPS monovalente PAO6-IATS -OPS BP- 1-PRO-CN; Ligação FC mais forte do anticorpo à cepa PAK é observada para MAPS PAO6 OPS BP-1 PRO-CN em comparação à forma nativa de MAPS PA O6 OPS, indicando que há um tamanho mínimo do OPS crítico para sua imunogenicidade, ou seja, o tamanho do OPS nativo de PA é pequeno demais e precisa ser alargado por ligação química a um estrutura polissacarídico para aumentar a valência de seus epítopos bem como seu tamanho.
[00549] A ligação à cepa PAO1 (O5 expressando FlaB) de Pseudomonas de anticorpos individuais de coelhos anti-FlaB, desenvolvidos com várias variantes de FPs de rizavidina contendo os epítopos FlaB, foi examinada por FC e está resumida na Tabela 11. À porcentagem de ligação acima do limite e alta ligação do soro pré-imune (PO) versus soro após a terceira imunização (P3) aos antígenos das proteínas de fusão são indicadas para 3 soros individuais de coelho. Esses dados de ligação demonstram que as proteínas de fusão rizavidina FlaB-D2 e FlaB-PcrV podem induzir forte ligação do anticorpo e reconhecem a cepa PAO1 de Pseudomonas inteira expressando FlaB flagelar, sugerindo que essas duas proteínas foram produzidas com dobramento correto e foram capazes de induzir anticorpos contra FlaB com especificidade para os epítopos B nativos dos flagelos nas bactérias Pseudomonas inteiras. O soro com a proteína de fusão anti- RhaviFlaB-D2-MrkA — proteina de fusão não reconheceu significativamente (ou fracamente, no máximo) flagelos na cepa PAO1 de Pseudomonas inteira, indicando que a porção FlaB da construção de rizavidina não estava devidamente dobrada ou não era suficientemente imunogênica no contexto da proteína de fusão com MrkA quando avaliada em uma imunização com a proteína sozinha com adjuvante de Freund.
[00550] Os gráficos de dispersão de FC para alguns dos soros de coelhos individuais (nº 792, nº 798 e nº 800) listados na Tabela 11 são também mostrados na Figura 21B (painel superior) e revelam forte ligação FC para o soro do coelho nº 792 (sangria P3) à rizavidina FlaB- D2; (painel do meio), ligação FC intermediária do soro do coelho nº 798 (sangria P3) à rizavidina FlaB-PcrV; e (inferior) baixa ligação FC do soro do coelho nº 800 (sangria P3) à rizavidina FlaB-D2-MrkA. Na Figura 21A, um pool de soro de coelho dos coelhos imunizados a proteína de fusão rizavidina-FlaB-Domínio2 (sem a região de ligação a TL5) (P3) mostra alta porcentagem da população marcada da cepa PAO1 de Pseudomonas (gráfico de dispersão no painel à direita) em comparação ao pré-imune (PO). Tabela 11: Ligação FC de anticorpos de coelho anti-FlaB à cepa PAO1 de Pseudomonas (O5 expressando FlaB) Percentual acima do Percentual de ligação Proteínas de | Coelho o fusão Ri o limite elevada usao KiZ n | Pe Ps | Po Ps tas aa aa FaBD2 | 72 | 23 | 442 | o1 | 148 | as aa a ta | 7 | as ass | oro | 7 | FlaBPOV | 7 | ae | so | oo) 22 [o os ar | a e a a O
[00551] Esses dados de ELISA e ligação FC respaldam a noção de que proteínas de fusão de rizavidina contendo FlaB, tais como Rizavidina FlaB-Domínio2 e Rizavidina FlaB-PcrV, podem ser produzidas com o dobramento correto para induzir anticorpos funcionais capazes de reconhecer flagelos B nativos em organismos inteiros de Pseudomonas. Ensaios de motilidade e inibição da motilidade
[00552] A cepaPAO1 de P. aeruginosa (O5: expressando FlaB) foi cultivada até a fase mid-log em caldo HySoy. As bactérias foram sedimentadas em péletes por centrifugação e suspensas em PBS até uma leitura de ODgeoo de 0,3, então diluídas 100 vezes em PBS. Ágar mole foi despejado em placas de 24 cavidades na presença ou ausência de várias diluições de antissoro desenvolvido contra flagelina. As diluições do antissoro foram realizadas em cavidades em triplicata. Uma agulha flamejante foi imersa na suspensão bacteriana, a seguir, usada para inocular o centro do tampão de ágar. As placas foram incubadas a ºC por 14 horas ou mais até que as bactérias tivessem se despalhado desde o local de inoculação através da superfície do ágar. Imagens das placas foram capturadas por câmera digital para registrar o diâmetro da colônia bacteriana. O resultado do teste inibição da motilidade é positivo quando o tamanho da colônia no ágar com soro anti-flagelina é reduzido significativamente em relação ao soro pré-imune.
[00553] Os títulos por ELISA e correspondentes de inibição da motilidade do soro de coelhos vacinados com as construções Rizavidina FlaB: Ravi-FlaB-D2; Ravi-FlaB-PcrV; e Ravi-FlaB-D2-MrkA estão resumidos na Tabela 12. Nessa tabela, os títulos ELISA contra FIaA1 e FlaB são mostrados para antissoro após a terceira imunização (P3), e os títulos de inibição da motilidade para os respectivos antissoros P3 utilizando a cepa PAO1 de P. aeruginosa (O5: expressando FlaB) são também mostrados. Há uma boa correlação entre os níveis de anticorpo anti-FlaB (títulos ELISA) e os títulos correspondentes de inibição da motilidade, ou seja, os dois antissoro de Ravi-FlaB-D2 e Ravi-FlaB-PecrV com títulos elevados de anticorpo específico contra FlaB induziram altos níveis de inibição da motilidade de PAO1, enquanto que a construção da proteína de fusão Ravi-FlaB-D2-MrkA não o fez, supostamente devido aos baixos níveis de anticorpo contra FlaB, provavelmente pelo dobramento indevido do componente proteico FlaB na construção ou a falta de uma resposta imune no contexto da proteína de fusão com MrkA quando avaliada como uma imunização com a proteína sozinha com adjuvante de Freund. Tabela 12: Títulos ELISA e de inibição para várias construções de rizavidina contendo FlaB E o ETE TE proteína de fusão | Coelho nº de rizavidina ELISA ELISA inibição da motilidade [es ER ie A Ensaios de citotoxicidade (para construções com PecrV de Pseudomonas)
[00554] Os ensaios foram realizados como segue. Resumidamente, antissoro de coelho desenvolvido contra a proteína PcrV do sistema de secreção bacteriana foi adicionado a células AS49 semeadas em placas de fundo redondo de 96 cavidades (Corning Costar). Todas as diluições do antissoro e bacterianas foram realizadas em meio RPMI sem antibiótico. A cepa PAK em fase log de P. aeruginosa, capaz de expressar ExoU, foi adicionada em MOI aproximada de 10 e incubada por 2 horas a 37ºC/CO>, 5% e, durante esse período, as células A549 tornam-se intoxicadas e não são mais viáveis. O número de células viáveis em cada cavidade é estimado pela internalização celular do corante vital Neutral Red (Pseudomonas também metaboliza Alamar Blue e não pode ser utilizada). A porcentagem de células viáveis em cada cavidade é estimada medindo a absorbância de Neutral Red e comparando esses valores a células que não foram expostas às bactérias. O resultado desse teste é positivo quando o antissoro anti- PcrV aumenta o número de células viáveis (ou seja, células capazes de internalizar o Neutral Red) em comparação com uma diluição equivalente do soro pré-imune.
[00555] Um modelo de prevenção de citoxicidade celular por bactérias Pseudomonas (Warrener et al., 2014) foi utilizado para testar a potência de um anticorpo de coelho anti-Ravi-FlaB-PcrV FT é mostrado na Figura 24A. A proteção pelo anticorpo anti-PcrV de células AB49 (Carcinoma pulmonar) da intoxicação pela cepa PAK (O6:FIaA1) de Pseudomonas foi obtida como segue. Monocamadas de A549 foram infectadas com a cepa PAK (O6:FIlaA1) de Pseudomonas por 4 horas na presença de um soro 10% de coelhos (pool de 3, após a terceira imunização, P3) vacinados com uma proteína de fusão Ravi-FlaB-PcrV. O soro anti-Ravi-FlaB-PcrV protegeu as células da intoxicação pela cepa PAK de Pseudomonas, quando comparado ao soro pré-imune, conforme visto por menos células arredondadas e destacadas. Em um experimento seguinte (Figura 24B), células A5S49 em monocamada foram infectadas com a cepa PAK de Pseudomonas por 4 horas na presença do soro anti Ravi-FlaB-PcrV (pool de 3, P3) em várias diluições. As células foram lavadas com PBS e incubadas por 1 ora com Neutral-Red. As células foram lisadas e a absorbância do corante foi registrada em cada cavidade. O soro anti-Ravi-FlaB-PcrV (P3) protegeu as células da intoxicação por PAK em comparação ao soro pré-imune até uma diluição de 1 a 40.
[00556] Sema intenção de vincular-se a qualquer teoria, a natureza policlonal da resposta a Ravi-FlaB-PcrV, bem como sua configuração dentro da proteína de fusão pode ser o motivo para o aumento na afinidade do anticorpo pelo componente PcrV da proteína de fusão. Diversas cepas de Pseudomonas foram testadas nesse ensaio de citotoxicidade, utilizando células A549 e soro anti-FlaB-PcrV de coelho (após a terceira imunização; P3) (Figura 25): com a cepa PA IATS O1 altamente tóxica (losango fechado), não foi observada proteção do soro contra a citotoxicidade; com a cepa PA M-2 O5 citotóxica (círculo fechado) não houve proteção pelo soro também; com a cepa PA IATS OG6 não citotóxica (triângulo fechado) não foi verificada toxicidade com a cepa PA 17002 citotóxica (010) (retângulo fechado) houve uma nítida proteção pelo soro; Essas variações na proteção pelo soro dependente da cepa poderia refletir a expressão e o nível do PcrV alvo nas cepas de Pseudomonas. Ensaio de fixação celular
[00557] A fixação de Klebsiella às células AS49 foi analisada como descrito (Clements et a/., 2008) com algumas modificações. Antissoro de coelho desenvolvido contra a proteína da fímbria MrkA foi diluído em tampão RPM! (sem suplementos) e adicionado a células A549 semeadas em placas de 96 cavidades. Um volume igual da cepa 6997 de K. pneumoniae O5 (10º CFU/mL) foi misturado com as diluições do antissoro. As células infectadas foram incubadas por 1 hora a 37ºC e CO» 5% e, depois desse período, as cavidades foram lavadas 6 vezes com PBS estéril para remover as bactérias não ligadas. As células foram lisados com Triton X-100 0,1% em PBS e uma alíquota da solução foi espalhada sobre HSA. As placas foram incubadas durante a noite e o número de CFU, contado. O resultado do ensaio é positivo quando o número de Klebsiella aderente é reduzido com antissoro anti-MrkA quando comparado com uma diluição igual do soro pré-imune.
[00558] O bloqueio da aderência de Klebsiella KP O5 6997 (origem: África do Sul) a células A549 por um soro de coelho anti-Ravi-FlaBD2- MFrkA é mostrado na Figura 23. Soro específico para Ravi-FlaBD2-MrkA (após a terceira imunização, P3) com título alto inibiu significativamente a ligação da cepa KP 6997 a células A549 até uma diluição de 1/1000 enquanto um soro pré-imune (PO) não o fez. Isso indicou que o componente proteico MrkA da Ravi-FlabBD2-MrkA FP estava devidamente dobrado e capaz de gerar anticorpos funcionais bloqueadores específicos para o MrkA nativo na superfície de bactérias KP. Um segundo experimento foi conduzido utilizando antissoro individual anti-MrkA de coelho, obtido pela imunização com as duas proteínas de fusão de rizavidina com MrkA, Ravi-FlaB-D2-MrkA e Ravi- PcrV-MFrkA, cujos resultados estão resumidos na Tabela 13. Todos os soros com FPs de MrkA (exceto para um, nº 804) foram capazes de reduzir a aderência da cepa 6997 de Klebsiella O5 a células A549 indicando que essas duas FPs de rizavidina exibiam o potencial para gerar anticorpos funcionais MrkA-específicos. Tabela 13: Inibição pelo soro anti-MrkA da ligação da cepa 6997 de Klebsiella O5 a células A549 reduziu com P3
Ensaio de resposta de anticorpo contra MrkA
[00559] Klebsiela que expressam MrkA/fímbria tipo-3l são aglutinadas por anticorpo anti-MrkA, fazendo com que as bactérias se agrupem e se desprendam da solução. Avaliou-se o soro pré-imune ou soro imune de coelhos que haviam sido inoculados com as proteínas de transporte Ravi-MrkA-his, Ravi-FlaB-D2-MrkA-his ou Ravi-PcrV-MrkA- his. A cepa4425 (O5: K57) de Klebsiella foi incubada com diluições dos soros em PBS a 25 ºC por 1 hora em placas de microtitulação de fundo redondo e 96 cavidades. As placas foram gentilmente agitadas para suspender as bactérias não aglutinadas. O sobrenadante de cada cavidade fui cuidadosamente removido e transferido para uma placa de microtitulação fresca, e mediu-se o espalhamento de luz a 600 nm para avaliar a turbidez da solução. O resultado obtido é positivo quando a absorbância é reduzida daquela de uma cavidade controle sem anticorpo, indicando número diminuído de bactérias no sobrenadante devido à aglutinação induzida pelo anticorpo. O resultado do ensaio é registrado como a diluição mais alta do anticorpo (a concentração mais baixa) na qual K. pneumoniae foi aglutinada pelo soro imune mais do que pelo soro pré-imune conforme medido pela diferença em absorbância a 600 nm.
[00560] A avaliação da aglutinação das cepas O5K57, cepa 4425 e O1 K22, cepa170381 de Klebsiella pneumoniae, com antissoro de coelho para várias construções de proteína de fusão de rizavidina com MrkA: Ravi-FlaB-D2-MrkA e Ravi-PcrV-MrkA é resumida na Tabela 14. Os títulos para antissoro específico de 3 coelhos individuais para cada construção após a segunda (P2) e a terceira (P3) imunização são a maior diluição do soro com aglutinação detectável. Nesse experimento, tufos aglutinados são deixados depositar, e as quantidades restantes de bactérias (não aglutinadas) foram medidas na densidade óptica (OD) de 600 nm. Anticorpos MrkA-especiíficos, induzidos pelas 2 construções
Ravi-FlaB-D2-MrkA e Ravi-PcrV-MrkA, reconheceram MrkA expresso em ambas as cepas de Klebsiella indicando que o componente MrkA nessas 2 proteínas de fusão está devidamente dobrado e gera uma resposta de anticorpos funcionais. Tabela 14: de bactérias Klebsiella por anticorpos rizavidina FP MrkA- específicos Solução mais alta do soro com aglutinação Exemplo 8: Modelos de lesão térmica e bacteremia em camundongos por P. aeruginosa
[00561] Os modelos de lesão térmica e bacteremia foram realizados como descrito com modificações (Neely et a/., 2002). For lesão térmica, camundongos CD-1 não consanguíneos de 11 semanas de idade tiveram o dorso raspado e foram anestesiados com cetamina e xilazinantes da exposição a um modelo de cartão polímeros resistente ao calor com uma abertura de 3,8 cm (1,5 polegadas). Essa plataforma foi projetada para induzir uma lesão térmica com 12-15% de área de superfície corporal total. Etanol (0,5 mL, 100%) é espalhado uniformemente sobre a área das costas delineada pela janela, inflamado e deixado queimar por precisamente 10 segundos então apagado. Imediatamente depois da queimadura, os camundongos recebem 0,5 mL de solução salina normal estéril para hidratação. P. aeruginosa é, a seguir, injetada SC abaixo da ferida térmica. A ferida é deixada descoberta. Os animais são monitorados cuidadosamente por 14 dias após a infecção quanto à mortalidade e carga em órgãos (ou seja, disseminação à distância).
[00562] Afimde avaliar a potência de anticorpos de coelho anti-FlaB de Pseudomonas, usou-se um modelo de sepse por ferida resultante de queimadura em camundongos (Cryz et al. 1984). Nesse modelo, camundongos CD1 foram queimados como descrito acima, e 28 CFU da cepa M2 (O5:FlaB) de P. aeruginosa (infecção de ferida por queimadura LDso < 1 x 10º) foram injetadas na ferida da queimadura. Os camundongos CD-1 foram injetados IP com PBS, soro pré-imune ou anti-FlaB antes do desafio de ferida por queimadura. Como mostrado nos gráficos de sobrevivência de Kaplan-Meier na Figura 26, os camundongos foram protegidos por anti-FlaB por 10 dias ou mais desde o desafio da ferida com a cepa M-2 expressando FlaB de Pseudomonas enquanto que todos os camundongos dos outros grupos morreram do desafio da ferida.
[00563] No modelo de bacteremia, camundongos BALB/c de 7 semanas de idade são tratados com IgG controle ou com anticorpo induzido pela vacina pela administração IP, 24 horas, antes do desafio IV com K. pneumoniae ou P. aeruginosa. Dependendo do organismo, os animais são sangrados em intervalos ao longo de 1-4 horas para monitorar a eliminação do sangue e, em seguida, os camundongos são sacrificados e o fígado e o baço são coletados 1-24 horas depois da infecção. Exemplo 9: Ensaios de proteção em camundongos Modelo em camundongos de eliminação e carga em órgãos
[00564] A capacidade do anticorpo KP OPS-especiífico para prevenir infecção por Klebsiella foi testada em um modelo em camundongos de eliminação e carga em órgãos. Camundongos CD1 (grupos de 3)
receberam por IP um soro de coelho contra MAPS KPO1 BP-2a OPS- PRO-CN MAPS e, a seguir, foram desafiados (IV) com Klebsiella KP B5055 O1 (9x10º CFU). Números de KP viáveis no baço foram medidos 14 horas após o desafio. Foi observada uma redução significativa em números de KP viáveis no baço de camundongos que receberam o soro imune (P2) quando comparado ao baço de camundongos que receberam o soro pré-imune (PO) (Figura 27). Esses dados indicam que o anticorpo O1 OPS-específico, induzido pela vacina de MAPS OPS BP- 2a MAPS, é capaz de eliminar organismos do baço dos camundongos e, consequentemente, protege contra infecção por Klebsiella.
KP (01: K2) cultivada em salicilato de sódio
[00565] A cepa B5055 (01: K2) de Klebsiella pneumoniae foi cultivada durante a noite em caldo HySoy contendo salicilato de sódio 2,5 mM (Sigma) para diminuir a expressão de CPS (Domenico, 1989). 12 mL de caldo HySoy com salicilato de sódio 2,5 mM foram inoculados com 5% de uma cultura durante a noite e, a seguir, cresceram até a fase mid-log (37 ºC com agitação). As bactérias foram centrifugadas com formação de pélete, então, ressuspensas em PBS estéril até uma concentração de aproximadamente 1x 10º CFU/mL. As bactérias concentradas foram diluídas em PBS para 2x 10º CFU/mL. Uma hora depois da administração IP de 0,1 mL de soro de coelho, camundongos CD-1 fêmeas de 8-12 semanas de idade foram infectadas IP com 2x 10º CFU de B5055 e, 0,1 mL. Os camundongos foram monitorados quanto à mortalidade durante um período de 7 dias.
[00566] No experimento 1, camundongos CD1 receberam 0,1 mL de MAPS KP O1 OPS BP-1; BP-2a PRO-CN de coelho ou antissoro de coelho HK KP 01: K2 (diluído 1/10) IP 1 hora antes de serem desafiados IP com 2x10º* de organismos KP O1 B5055. Os resultados do experimento estão resumidos na Tabela 15.
Tabela 15: Proteção passive de camundongos com organismos KP O1:
K2 cultivados em salicilato de sódio [PS | oes | os | a *Antissoro de coelho de organismos HK KP O1 controle, fornecido em
[00567] No experimento 1, o controle positivo com bactérias HK KP O1 e antissoro MAPS KP O1 OPS BP-2 PRO-CN proporcionaram proteção completa contra o desafio com KP O1: K2 (B5055) enquanto o controle com PBS e o antissoro MAPS KP O1 OPS BP-1 PRO-CN não protegeram os camundongos.
[00568] No experimento 2, camundongos CD1 (5/grupo) receberam IP 0,1mL de um pool de soro imune ou pré-imune de coelho antes do desafio bacteriano IP com 2x10º de bactérias KP O1 B5055. Os camundongos receberam PBS e um soro KPO1 HK (diluído 1/10) como controle negativo e controle positivo, respectivamente. Todos os soros KP O1 OPS PRO-CN foram capazes de conferir proteção no modelo, embora os camundongos que receberam BP-2a (4 out of 5) sobrevivem significativamente melhor o desafio. Os soros KP O1 OPS BP-1 PRO- CN proporcionaram alguma proteção com 2 em 5 camundongos sobrevivendo. Nenhum dos camundongos que receberam PBS sobreviveu ao desafio. Esses resultados de sobrevivência concordam bem e se correlacionam bastante com os níveis de títulos de IgG anti- KP O1 OPS-específico por ELISA (ou seja, os níveis melhores de proteção foram observados com níveis mais altos de anticorpos). Proteção passive contra organismos Pseudomonas em um modelo em camundongos
[00569] A capacidade do anticorpo específico contra OPS de PA para prevenir infecção por Pseudomonas foi testado em um modelo de sobrevivência por proteção passiva em camundongos, utilizando camundongos CD1 desafiados IP pela cepa 17002 (010) de PA juntamente com D-galactosamina para sensibilizar os animais para os efeitos letais de endotoxinas (Galanos et a/., 1979) e para torná-los mais suscetíveis à infecção. Os camundongos receberam anti-MAPS 2- valente PA O6/010 BP-1 PRO-CN de coelho (coelho AFV624 ou AFV629, fornecido por IP) 1 hora antes de serem desafiados com (1x10º CFU) e D-galactosamina. Os resultados estão resumidos na Tabela 16. Nesse estudo de proteção, o soro imune de MAPS PA O6/010 2v BP-1 PRO-CN (AFV624; P2) protegeu 40% mais camundongos contra a cepa 17002 de PA O10 em comparação ao soro pré-imune (AFV624 PO). Do mesmo modo, o soro imune de MAPS PA O6/010 2y BP-1 PRO-CN MAPS (AFV629; P2) protegeu 40% mais camundongos contra a cepa 17002 de PA O10 em comparação ao soro pré-imune (AFV629 PO). Um antissoro de coelho com título alto de controle positivo, desenvolvido com bactérias PA 010 mortas pelo calor, forneceu proteção significativa versus o PBS controle. O soro pré-imune de alguns coelhos pode ter proporcionada alguma proteção em comparação com PBS (AFV624 PO). Parece haver alguma correlação entre os níveis de proteção (sobrevivência) e os níveis de anticorpo IgG PA 010 OPS-específico induzido pela vacina, conforme medidos por ELISA (Tabela 16). Tabela 16: Proteção passiva em camundongos desafiados com a cepa 17002 de PA O10 e D-galactosamina pelo grupo de MAPS 2-valente PA O6/010 BP-1 PRO-CN | Pescanae os
[00570] A Figura 28 apresenta curvas de sobrevivência de Kaplan- Meier para proteção passiva de camundongos que receberam soro de coelho contra MAPS KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN antes da infecção com a cepa B5055 (01: K2) de Klebsiella cultivada em salicilato para reduzir a expressão da cápsula. Camundongos CD1 (5/grupo) receberam IP 0,1 mL de um pool de soro imune (P2) ou pré-imune (PO) de coelho antes do desafio bacteriano IP com 2x 10º CFU da cepa B5055 (O1: K2) de Klebsiella. São mostrados os gráficos de sobrevivência de Kaplan-Meier para camundongos que receberam soro PO ou P2 de MAPS KPO1 BP- 1 OPS-PRO-CN. O soro P2 protegeu no modelo, com uma proporção maior de camundongos que haviam recebido antissoro MAPS KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN sobrevivendo e por um período de tempo prolongado em relação aos camundongos que receberam o soro PO. Exemplo 10: Composições imunogênicas multivalentes exemplares Vacina 4-valente contra KP exemplar
[00571] Quatro complexos imunogênicos diferentes foram preparados separadamente e, a seguir, formulados junto para preparar uma vacina 4-valente contra KP exemplar.
[00572] Cada complexo incluía um polímero BP-1, preparado por conjugação do OPS de um único sorotipo bacteriano de KP ao polissacarídeo K19 oxidado, com biotinilação subsequente do polissacarídeo K19. Esses foram, então, complexados com uma proteína fusão de transporte de rizavidina. Os componentes de cada um desses complexos são detalhados na Tabela 17. Tabela 17: Componentes de complexos incluídos na vacina 4-valente contra KP exemplar
[00573] Esses quatro complexos foram formulados junto com um adjuvante como detalhado abaixo na Tabela 21. Vacina 8-valente contra PA exemplar
[00574] 8 complexos imunogênicos diferentes foram preparados separadamente e, a seguir, formulados juntos para preparar uma vacina 8-valente contra PA exemplar.
[00575] Cada complexo incluía um polímero BP-1, preparado por conjugação do OPS de um único sorotipo bacteriano de PA ao polissacarídeo K19 oxidado com biotinilação subsequente do polissacarídeo K19. Esses foram então complexados com uma proteína de fusão de transporte com rivazividina. Os componentes de cada um desses complexos são detalhados na Tabela 18. Tabela 18: Componentes de complexos incluídos na vacina 8-valente contra PA exemplar cPS rivavidina [e es TA] rarmesoaA [a [RS PAT] RenrenaaHA —
[00576] Esses oito complexos foram formulados junto com um adjuvante conforme detalhado abaixo na Tabela 21. Vacina-1 12-valente contra KP/PA exemplar
[00577] 12 complexos imunogênicos diferentes foram preparados separadamente e, a seguir, formulados juntos para preparar uma vacina-1 12-valente contra KP/PA exemplar.
[00578] Cada complexo incluía um polímero BP-1, preparado por conjugação de um OPS ao polissacarídeo K19 oxidado com biotinilação subsequente do polissacarídeo K19. Esses foram então complexados com uma proteína de fusão de transporte com rivazividina. Os componentes de cada um desses complexos são detalhados na Tabela
19. Tabela 19: Componentes de complexos incluídos na vacina vacina-1 12-valente contra KP/PA exemplar CPS rivazividina pera] sea [E es e rareanaPa [IE RE] eeEsAA
[00579] Esses doze complexos foram formulados junto com um adjuvante como detalhado abaixo na Tabela 21. Vacina-2 12-valente contra KP/PA exemplar
[00580] 12 complexos imunogênicos diferentes foram preparados separadamente e, a seguir, formulados juntos para preparar uma vacina-2 12-valente contra KP/PA exemplar.
[00581] Cada complexo incluía um polímero BP-1, preparado por conjugação de um OPS ao polissacarídeo K19 oxidado com biotinilação subsequente do polissacarídeo K19. Esses foram então complexados com uma proteína de fusão de transporte com rivazividina. Os componentes de cada um desses complexos são detalhados na Tabela
20. Tabela 20: Componentes de complexos incluídos na vacina-2 12- valente contra KP/PA exemplar CPS rivazividina E Ra] era — EFE] A [pre] serena
[00582] Esses doze complexos foram formulados junto com um adjuvante conforme detalhado abaixo na Tabela 21. Exemplo 11: Estudo de imunização em coelhos da vacina 12-valente contra P. aeruginosa/K. pneumoniae Imunização de animais
[00583] Antes da imunização de coelhos, a vacina 4-valente contra KP exemplar, a vacina 8-valente contra PA exemplar, a vacina-1 12- valente contra KP/PA exemplar e a vacina-2 12-valente contra KP/PA exemplar foram formuladas com adjuvante aproximadamente 48 horas antes da injeção.
Os complexos foram adsorvidos ao adjuvante a uma concentração final de 10 ug/mL para a dose de 5 ug de PS e 2 ug/mL para a dose de 1 ug de PS de cada sorotipo BP-1, em mistura única ou multivalente com histidina 40 mM, pH 5,5, NaCl 150 mM e gel de fosfato de alumínio 1,25 mg/mL, com mistura end over end durante a noite a 4ºC.
Essas misturas formuladas foram usadas diretamente para as imunizações em um volume de 0,5 mL por dose.
Um resumo das composições da vacina 4-valente contra KP exemplar, vacina 8-valente contra PA exemplar, vacina-1 12-valente contra KP/PA exemplar e vacina-2 12-valente contra KP/PA exemplar é fornecido na Tabela 21.
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[00584] A vacina-1 12-valente contra KP/PA foi administrada ao grupo de tratamento 5 e 6 (com FlaBD2-MrkA e FlaBD2-PcrV como proteínas de transporte) e a vacina-2 12-valente contra KP/PA foi administrada ao grupo de tratamento 1 e 2 (com FlaBD2-MrkA como proteína de transporte). Para comparação, dois grupos de tratamento adicionais que receberam uma vacina 8-valente contra PA ou uma vacina 4-valente contra KP foram incluídos nesse estudo. O grupo de tratamento 3 recebeu uma vacina 8-valente contra PA e o grupo de tratamento 4 recebeu uma vacina 4-valente contra KP. Os grupos 1,3, 4 e 5 receberam 5 ug de cada polissacarídeo (PS) na vacina e os grupos de tratamento 2 e 6 receberam uma dose menor de 1 ug de cada PS na vacina. Todas as vacinas continham a mesma quantidade de fosfato de alumínio como adjuvante (625 ug).
[00585] “Foram administradas duas imunizações IM (0,5 mL) com intervalo de 4 semanas a coelhos New Zealand White de 4 meses (Cocalico Biologicals, n = 10 por grupo). Amostras de sangue foram coletadas 4 semanas depois da primeira imunização e 2 semanas depois da segunda imunização. Respostas imunes ao OPS Respostas imunes ao KP OPS na vacina-1 12-valente contra KP/PA em comparação a uma vacina 4-valente contra KP
[00586] A Figura 29 apresenta os resultados dos títulos finais de IgG por ELISA contra OPS de KP para soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA (dose de 5 ug, grupo de tratamento 5) em comparação com uma vacina 4-valente contra KP (dose de 5 ug, grupo de tratamento 4).
[00587] Uma resposta robusta de IgG a todos os sorotipos de OPS de KP na vacina (bem como ao CPS KP19 CPS) foi demonstrada sem diferenças significativas nos títulos entre cada tipo de OPS de KP na vacina 4-valente contra KP e cada um dos títulos de IgG correspondentes contra OPS de KP da vacina-1 12-valente contra KP/PA. Houve uma tendência para uma resposta ligeiramente melhor a OPS de KP induzida com a vacina-1 12-valente contra KP/PA. Esses resultados também indicam que não há interferência negativa na resposta imune a cada um dos OPS de KP da vacina 4-valente contra KP quando este é combinado com os 8 OPS adicionais de PA que estão incluídos na vacina-1 12-valente contra KP/PA (todos preparados como MAPS BP-1). Respostas imunes ao OPS de PA na vacina-1 12-valente contra KP/PA em comparação a uma vacina 8-valente contra PA
[00588] A Figura 30 apresenta os resultados dos títulos finais de IgG contra OPS PA por ELISA para soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA (dose de 5 ug, grupo de tratamento 5) em comparação com uma vacina 8-valente contra PA (dose de 5 ug, grupo de tratamento 3).
[00589] “Como observado para a resposta ao OPS de KP, respostas robustas de IgG contra todos os sorotipos de OPS de PA na vacina foram demonstradas sem diferenças significativas nos títulos entre cada tipo de OPS de PA na vacina 8-valente PA e cada um dos títulos de IgG correspondentes contra OPS de PA da vacina-1 12-valente contra KP/PA. Esses resultados indicam que não há interferência negativa na resposta imune a cada um dos OPS de PA da vacina 8-valente quando este é combinado com os 4 OPS adicionais de KP na vacina-1 12- valente contra KP/PA (todos preparados como MAPS BP-1). Respostas robustas de IgG são também demonstradas a cada um dos OPS de PA depois de uma imunização (P1) sem aumentos significativos depois da segunda imunização (P2). Respostas imunes à vacina-1 12-valente contra KP/PA em dois níveis diferentes de dose
[00590] A Figura 31 apresenta os resultados dos títulos finais de IgG contra OPS PA por ELISA para soros agrupados de coelhos imunizados com 5 ug de PS da vacina-1 12-valente contra KP/PA, contribuídos por cada tipo de BP na vacina dose (grupo de tratamento 5) em comparação com a vacina-1 12-valente contra KP/PA com 1 ug de PS contribuído por cada tipo de BP na vacina (grupo de tratamento 6)
[00591] Não foram observadas diferenças significativas em títulos de IgG contra OPS de PA e KP para a vacina-1 12-valente contra KP/PA quando os grupos de tratamento com a dose de 5 ug e a dose de 1 ug foram comparados depois de uma (P1) ou depois de duas imunizações (P2), exceto para KP O3 em que a segunda imunização mostrou uma resposta de IgG melhorada.
[00592] Os títulos individuais de IgG OPS-específica por ELISA para a vacina-1 12-valente contra KP/PA 28 dias após a primeira imunização (P1) e 14 dias após a segunda imunização (P2) são mostrados na Figura 32 e Figura 33. Respostas robustas de IgG a todos os12 sorotipos de OPS na vacina, bem como ao CPS K19 de KP são demonstradas para a vacina-1 12-valente contra KP/PA na dose de 5 ug (Figura 32) e na dose de 1 ug (Figura 33). No entanto, embora robusta, a magnitude da resposta de IgG ao OPS KPO2 e KPO3 não é tão grande quanto à da resposta ao KPO1 e KPOS5, especialmente depois da primeira imunização. A resposta mais alta foi observada para KO K19.
[00593] “Uma comparação do fator de indução x individual de IgG anti-OPS para vacina-1 12-valente contra KP/PA foi realizada para o grupo de tratamento com a dose de 5 ug. Os resultados são mostrados na Figura 34. Exceto por dois outliers, todos os animais mostraram uma indução dos títulos por ELISA pelo menos 4 vezes acima do basal (P2/PO) para cada um dos sorotipos de OPS. Em média, uma indução vezes maior foi ultrapassada para todos os sorotipos de OPS pela vacina-1 12-valente contra KP/PA. A indução maior foi observada para
KO 19.
[00594] A Figura 35 fornece resultados da comparação do fator de indução x individual de títulos de IgG anti-OPS por ELISA acima do basal (P2/PO) para vacina-1 12-valente contra KP/PA na dose de 5 ug e 1 ug. Curiosamente, todos os animais do grupo de tratamento com a dose de 1 ug mostraram 4 vezes de aumento acima do basal como já descrito para o grupo de tratamento com a dose de 5 ug. O aumento médio relativo nos títulos de IgG para todos os sorotipos de OPS incluídos na vacina-1 12-valente contra KP/PA ultrapassa 20 vezes de aumento sobre o basal para todos os sorotipos de OPS em 5 ug, bem como na dose de 1 ug administrada aos animais. O fator de indução mais alto foi observado para KO K19 nos dois níveis de dose e os menores fatores de indução foram observados para KP O2 e KP O3. Respostas imunes à vacina-2 12-valente contra KP/PA em dois níveis diferentes de dose
[00595] A Figura 36 mostra os resultados da comparação das respostas a OPS de KP/PA em soros agrupados 28 dias após a primeira vacinação (P1) e 14 dias após a segunda vacinação (P2) de coelhos imunizados com a vacina-2 12-valente contra KP/PA. Notavelmente, no grupo de tratamento com a dose de 5 ug, a vacina induziu uma resposta robusta de IgG contra todos os sorotipos de OPS depois da primeira imunização sem aumento significativo nos títulos após a segunda imunização, exceto para KP O2 e KP O3 OPS. Para aqueles sorotipos de OPS, a segunda imunização produziu um aumento significativo dos títulos. As respostas de IgG contra OPS são equivalentes para os grupos de tratamento com a dose de 5 ug e de 1 ug, exceto para KP O3 OPS mostrando uma resposta menos imunogênica na dose menor.
[00596] Os títulos individuais de IgG OPS-específico por ELISA para a vacina-2 12-valente contra KP/PA 28 dias após a primeira imunização (P1) e 14 dias após a segunda imunização (P2) são mostrados na
Figura 37 e Figura 38. Respostas robustas de IgG contra todos os 12 sorotipos de OPS na vacina, bem como contra o COPS K19 de KP são demonstradas para a vacina-2 12-valente contra KP/PA na dose de 5 ug (Figura 37) e na dose de 1 ug (Figura 38). Os títulos para cada um dos sorotipos de OPS aumentaram ainda mais 14 dias após a segunda vacinação. No entanto, a magnitude desse aumento não foi notável, exceto para KP O3. Como observado para a vacina-1 12-valente contra KP/PA, a diferença na resposta imune entre os grupos de tratamento com a dose de 5 ug e a dose de 1 ug foi mínima. Os títulos mais altos foram observados para o sorotipo KO K19 de OPS e as respostas menores foram observadas para KP O2 e KP O3. Resumo dos resultados de respostas imunes ao OPS para a vacina-1 12-valente contra KP/PA e a vacina-2 12-valente contra KP/PA
[00597] As respostas imunes anti-OPS a todos os OPS de PA na vacina-1 12-valente contra KP/PA em soros agrupados de coelhos foram equivalentes àquelas para a vacina MAPS 8-valente contra PA.
[00598] As respostas imunes anti-OPS a todos os OPS de KP na vacina-1 12-valente contra KP/PA em soros agrupados de coelhos foram equivalentes ou ligeiramente melhores do que aquelas para a vacina MAPS 4-valente contra KP.
[00599] —Aumentos de aproximadamente 200 vezes sobre o basal foram observados para anticorpos contra OPS de PA e de aproximadamente 50 vezes sobre o basal foram observados para anticorpos contra OPS de KP.
[00600] Os anticorpos para os grupos de tratamento com a dose de ug de PS por BP e a dose de 1 ug de PS por BP em soros agrupados são semelhantes entre a vacina-1 12-valente contra KP/PA e a vacina- 2 12-valente contra KP/PA, exceto por KP O3.
[00601] As análises de soros individuais dos grupos de tratamento com a dose de 5 ug de PS por BP e a dose de 1 ug de PS por BP para a vacina-1 12-valente contra KP/PA demonstram uma resposta robusta a todos os OPS de KP e PA após uma única imunização com aumento muito pequeno depois da segunda imunização, exceto para a resposta ao OPS de KP O2 e KP O3, em que a segunda imunização produziu um aumento significativo nos títulos de anticorpos IgG.
[00602] As análises de soros individuais dos grupos de tratamento com a dose de 5 ug de PS por BP e a dose de 1 ug de PS por BP para a vacina-2 12-valente contra KP/PA também demonstraram uma resposta robusta a todos os OPS de KP e PA após uma única imunização com aumento muito pequeno depois da segunda imunização, exceto para a resposta ao OPS de KP O3, em que a segunda imunização produziu um aumento significativo nos títulos de IgG. Desempenho de proteínas de transporte Resposta de anticorpos às proteínas de transporte
[00603] Foram avaliadas as respostas de anticorpos contra proteína de transporte, induzidas pela vacina-1 12-valente contra KP/PA com FIaBD2-MrkA e FlaBD2-PcrV como proteínas de transporte, pela vacina-2 12-valente contra KP/PA com FlaBD2-MrkA como a única proteína de transporte. As respostas às proteínas de transporte de coelhos individuais são expressas em unidades de IgG por ELISA dos níveis pré-imune (PO) e obtidos depois de uma (P1) e duas imunizações (P2). A análise por ELISA de IgG de coelhos individuais para as proteínas de transporte foi determinada utilizando os componentes proteicos recombinantes individuais como antígenos de revestimento (ou seja, FlaBD2, MrkA e PcrV). Para cada análise, as respostas aos componentes das proteínas de transporte foram comparadas para a vacina 1 e 2 com as respostas à vacina 8-valente PA FlaBD2-MrkA à vacina 4-valente KP FIaBD2-MrkA. Detalhes sobre as doses das vacinas e dos grupos de tratamento são fornecidos na Tabela 21.
(a) Resultados por ELISA para as diferentes proteínas de transporte
[00604] —Osresultados dos títulos de IgG por ELISA para FlaB-D2 são fornecidos na Figura 39. Um aumento robusto dos títulos de IgG foi observado depois da primeira imunização, seguido por um segundo aumento dos títulos depois da segunda imunização em todos os grupos que foram comparados. O nível de anticorpos após cada vacinação foi semelhante entre todos os grupos, os dois grupos de doses diferentes (1 ug ou 5 ug de PS total, contribuídos por cada tipo de complexo presente na composição vacinal, p. ex., total de 12 ug ou 60 ug de PS presentes nas composições da vacina-1 e vacina-2 12-valente contra KP/PA) da vacina-1 12-valente contra KP/PA e vacina-2 12-valente contra KP/PA e a vacina 8-valente contra PA e a vacina 4-valente contra KP (as duas com 5 ug de cada PS na vacina, p. ex., total de 40 ug ou ug de PS presentes na vacina, respectivamente).
[00605] Os resultados dos títulos de IgG por ELISA para MrkA são fornecidos na Figura 40. Como observado para FlaBD2, um aumento robusto dos títulos de IgG foi observado depois da primeira imunização uma elevação adicional depois da segunda imunização em todos os grupos com aumentos semelhantes para cada grupo, os dois de doses diferentes (1 ug ou 5 ug de PS contribuídos por cada tipo de complexo na vacina) da vacina-1 12-valente contra KP/PA e vacina-2 12-valente contra KP/PA e a vacina 8-valente contra PA e a vacina 4-valente contra KP (as duas com 5 ug de PS contribuídos por cada tipo de complexo na vacina).
[00606] A Figura 41 mostra os resultados para a resposta de anticorpos contra PcrV depois da imunização com a vacina-1 12-valente contra KP/PA com 1 ug e com 5 ug de cada PS na vacina. A resposta de IgG foi robusta depois da primeira imunização com mais um aumento dos títulos depois da segunda vacinação. No entanto, as respostas foram semelhantes entre os dois grupos de dose.
[00607] As respostas às proteínas de transporte induzidas pela vacina-1 12-valente contra KP/PA com FlaBD2-MrkA e FlaBD2-PcrV como proteínas de transporte, pela vacina-2 12-valente contra KP/PA com FlaBD2-MrkA como proteína de transporte, pela vacina 8-valente contra PA (FlaBD2-MrkA) e pela vacina 4-valente contra KP (FlaBD2- MFrkA), expressas como variação relativa por ELISA (fold change) em títulos sobre os níveis pré-imune (PO) depois de uma (P1) e duas imunizações (P2) são mostradas na Figura 42.
[00608] Respostas robustas foram demonstradas contra cada uma das três proteínas de transporte FlaBD2, MrkA e PcrV na vacina-1 12- valente contra KP/PA com variações de 30 vezes depois da primeira imunização e variações de 500 vezes depois da segunda imunização. Não foram observadas diferenças significativas em imunogenicidade para as três proteínas entre os grupos com a dose de 5 ug e a de 1 po.
[00609] Uma resposta robusta de IgG contra cada um dos dois componentes proteicos foi observada já depois de uma imunização com aumento acima de 30 vezes para os dois componentes da proteína de fusão FlaBD2 e MrkA na vacina-2 12-valente contra KP/PA. Aumentos significativos adicionais foram observados após a segunda imunização atingindo aumentos acima de 1000 vezes. Não foram observadas diferenças significativas em variações relativas para FlIaABD2 e MrkA entre os grupos da dose de 5 ug e de 1 ug.
[00610] Não foram observadas diferenças significativas em imunogenicidade para os dois componentes FIlaBD2 e MrkA entre os grupos que receberam a vacina 8-valente contra PA ou a vacina 4- valente contra KP. No entanto, essas respostas foram ligeiramente menores no grupo da vacina 4-valente quando comparadas àquelas do grupo da vacina-2 12-valente contra KP/PA e do grupo da vacina 8- valente contra PA.
(b) Comparação da variação relativa das respostas de IgG às diferentes proteínas de transporte nos três estudos
[00611] A comparação entre a variação relativa da resposta de IgG a FlaB foi examinada nos três estudos de imunogenicidade em coelhos: NCBO007, NCBOO8 e NCBO12. No NCBOO7, a dose de 5 ug da vacina 6- valente PA FlaBD2-MrkA (contendo PA O1, 02, O3, O6, 010 e 011 OPS) foi comparada com a equivalente 6-valente PA FlaB-PcrV, no NCBO008, a dose de 5 ug da vacina 4-valente (O1, O2, 03, O5) KP FlaBD2-MrkA foi comparada à 4-valente KP FlaB-PcrV e, no NOB012, a dose de 5 ug da vacina-2 12-valente contra KP/PA com FlaBD2-MrkA foi comparada com a vacina-1 12-valente contra KP/PA FlaBD2-MrkA e FIlaBD2-PcrV. Todas as vacinas eram do tipo BP-1 de estrutura. Os resultados da variação relativa são fornecidos na Figura 43, Figura 44 e Figura 45.
[00612] A Figura 43 mostra a variação relativa das respostas de IgG a FlaB com o maior aumento em resposta para a vacina-1 12-valente contra KP/PA e vacina-2 12-valente contra KP/PA. Uma boa resposta já foi observada depois da primeira imunização com mais aumento depois da segunda imunização. As respostas aos complexos 4-valente KP FIlaBD2-MrkA e o 4-valente FlaB-PcrV no NCBO0O08 revelaram uma boa resposta depois da primeira imunização, com aumento pequeno depois da segunda imunização para FIaBD-2-MrkA e basicamente sem resposta depois de qualquer imunização para FlaB-PcrV. Uma resposta ruim a FlaB foi também observada para o 6-valente PA FlaBD2-MrkA, no NCBO0O07, depois da primeira imunização, mas um aumento significativo foi provocado depois da segunda vacinação. A resposta a FlaB-PcrV no NCBO007 foi robusta depois da primeira imunização sem aumento adicional depois da segunda imunização.
[00613] A Figura 44 mostra as respostas a MrkA com as respostas mais alta em variações desde o basal para a vacina-2 12-valente contra
KP/PA e a vacina-1 12-valente contra KP/PA, no NCB012, quando comparadas com as respostas à vacina 4-valente KP FlaBD2-MrkA, no NCBO008, e a 6-valente PA FlaBD2-MrkA no NCB007. Quase não houve resposta observada para MrkA no NCBO0O08 depois da primeira e da segunda vacinação, enquanto uma resposta robusta a MrkA foi observada com a 6-valente PA FIaBD2-MrkA depois da primeira imunização e mais aumento depois da segunda imunização.
[00614] A Figura45 mostra a variação relativa na resposta de IgG a PcrV com o aumento mais alto para a vacina-1 12-valente contra KP/PA no estudo NCB012 depois da primeira e da segunda imunização. Quase não foi observada resposta a PcrV no estudo da vacina 4-valente KP FlaB-PcrV no NCBOO08. Uma resposta robusta a PcrV foi observada depois da primeira e da segunda imunização no estudo NCB007.
(c) Resumo dos resultados .º Uma resposta robusta de anticorpo IgG a todas as três proteínas de transporte foi demonstrada para a vacina-1 12-valente contra KP/PA e a vacina-2 12-valente contra KP/PA. º As respostas às proteínas de transporte foram semelhantes para os grupos de dose de 1 ug e 5 pg. º O aumento relativo gerado para cada uma das três proteínas de transporte foi aproximadamente 500 a 1000 vezes para a vacina-1 12-valente contra KP/PA. .º Houve reforço consistente entre a primeira e a segunda dose em animais naive. Sem a intenção de ficar preso a qualquer teoria, em adultos que não são naive, esperam-se respostas próximas da máxima depois de uma dose e dentro de 7-10 dias. º A questão anterior encontrada com respostas menores a MFrkA e PcrV em animais imunizados com a vacina 4-valente contra KP não foi observada em animais imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA ou a vacina-2 12-valente contra KP/PA.
Falta de bioatividade agonista de TLR5 nas proteínas de transporte contendo somente FlaB2
[00615] A Figura 12B descreve a bioatividade de TLR5 de proteínas de fusão e complexos MAPS contendo as proteínas FIaA e FlaB utilizando células HEK293 que expressam luciferase repórter direcionado por NF-kB. A ativação de Flagelina TLR5 provoca regulação positiva da expressão do repórter.
[00616] Foi verificado que MAPS KP/PA-proteínas de transporte contendo somente o domínio 2 de FlaB (FlaBD2) eram desprovidos de bioatividade agonista de TLR5, conforme é demonstrado pelos dados do ensaio com luciferase para FlaBD2-MrkA e FlaBD2-PcrV, mostrado na Figura 46. FlaBD2-MrkA e FlaBD2-PcrV são as duas proteínas de transporte na vacina-1 12-valente contra KP/PA.
[00617] FlaB controle e a proteína de fusão Ravi-FlaB-his revelaram forte bioatividade agonista de TLR5 enquanto FIlaBD2, FlaBD2-MrkA e FIlaBD2-PcrV, todas contendo somente o domínio 2 de FlaB (FlaBD2), não mostraram atividade nesse ensaio. Amplitude de ligação por FACS e aglutinação para cepas vacinais sem
[00618] As cepasdeKPePA sem OPS de sorotipos vacinais foram testadas por citometria de fluxo e em ensaios de aglutinação para estudar a amplitude da cobertura por anticorpos para a vacina-1 12- valente contra KP/PA.
[00619] A Tabela22 mostra os resultados de ligação por FACS e aglutinação bacteriana cepas de KP não OPS, obtidos com soros agrupados (AFV1502-1511) de coelhos que foram imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA a uma dose de 5 ug de cada BP-1. Doze de 14 cepas testadas mostraram não haver uma diferença óbvia em reconhecimento por soros PO e P2 na aglutinação e um aumento na ligação bacteriana, medido por citometria de fluxo em uma diluição do soro de 1:100. Tabela 22: Resposta para a vacina-1 12-valente contra KP/PA - ligação e aglutinação de cepas de KP sem OPS vacinais Ligação | Presença País de Aglutinação|bacteriana| do gene ID da cepa . Tipo de O . . . origem bacteriana | citometria MrkA de fluxo (PCR) África x 5205 NÃO (01,02,03,05) Sim Sim Sim do Sul África 7 7075 NÃO (01,02,03,05) Sim Sim Sim do Sul África . 7069 NÃO (01,02,03,05) Sim Sim Sim do Sul Dinamar [es ET e sn | sn se | ca Singapu . . . EC1793 Sim Sim Sim ra
[00620] A Tabela 23 mostra os resultados de ligação por FACS e aglutinação bacteriana de cepas não OPS de PA com soros agrupados (AFV1502-1511) de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA a uma dose de 5 ug de cada sorotipo BP-1. Para flagelina
B, 6 de 7 cepas aglutinaram, e 7 de 7 mostraram ligação ao anticorpo por citometria de fluxo. Para flagelina A1, 3 de 4 cepas mostraram ligação ao anticorpo por citometria de fluxo. Para flagelina A2, não foi observada evidência de reconhecido por anticorpo em 4 cepas. Tabela 23: Resposta para a vacina-1 12-valente contra KP/PA - ligação e aglutinação de cepas PA sem OPS vacinais Sorotipo de . . Ligação origem (Medimabs) flagelina | bacteriana citometria de fluxo see | e [e | e sa se [a [e Ds | se me [a Ds e | e sas ss [a De e e [Pe es a Ds e | so es] se [a De e ass se [a De ss so ee ss Do [6 ss so ms e [os | e De | se pe Des [6 ss so me e [e ss so E e De 6 ss so
[00621] “Quatorze cepas de KP e 15 de PA que são sorotipos sem OPS vacinais foram testadas para determinar a amplitude da cobertura por anticorpos gerados em coelhos pela vacina-1 12-valente contra KP/PA. Em suma:
U Os anticorpos gerados ligaram-se e aglutinam 12 de 14 cepas de KP com sorotipo não OPS; . Os sorotipos que não contêm o gene MrkA não ligaram anticorpos .º A ligação a essas cepas provavelmente deve-se a anticorpos direcionados contra MrkA; º Os anticorpos gerados ligam-se a 10 de 15 sorotipos de PA sem OPS vacinais; º A ligação ocorreu para cepas com FlaB e algumas com FIaA1 .º A ligação deve-se mais provavelmente aos anticorpos direcionados contra FlaB e à reatividade cruzada com FIaA1 U Os anticorpos direcionados contra as proteínas de transporte (FlIaBD2 e MrkA) expandem a amplitude da cobertura para sorotipos sem OPS vacinais. Proteção passiva em animais induzida por anticorpos contra proteínas de transporte
[00622] O potencialdas proteínas de transporte para induzir proteção passiva em camundongos foi avaliado em um modelo de infecção em ferida por queimadura com Klebsiella KP B5055 (O1: K2) utilizando soro anti-O1 e soro anti-MrkA conforme detalhado na Tabela 24.
[00623] Os resultados indicam que há uma tendência para um papel protetor de MrkA (FlaBD2-MrkA) em prevenir a morte de animais infectados com uma cepa encapsulada de KP. No Dia 6 após o desafio, 60% (3/5) dos animais estavam ainda vivos. Os anticorpos OPS O1 não protegeram contra infecção nesse experimento. Tabela 24: Proteção contra infecção por KP B5055 (01: K2) de ferida por queimadura utilizando soro anti-O1 e anti-MrkA te CFU/camundongos) | Soro anti-KP O1 + MrkA
E Ea o P2 *Camundongos receberam passivamente duas transferências de 200 ul de soro, SC infectado depois de ferida por queimadura com 12 CFU de B5055. Anticorpo KPO1: Pool de 3 soros de títulos maiores de MAPS FlaB-PcrV 4-valente KP do NCBO008 Anticorpo Mrk: Pool de 10 soros com MAPS FlaBD2-MrkA 1v PA do NCBO10
[00624] “Resumo do desempenho de duas proteínas de transporte em uma formulação vacinal: U As proteínas de transporte FlaBD2-MrkA e FlaBD2-PcrV na vacina-1 12-valente contra KP/PA e vacina-2 12-valente contra KP/PA demonstraram ser transportadoras robustas do OPS de KP/PA. U Uma forte resposta anti-proteína foi vista para FlaBD2-MrkA e FlaBD2-PcrV na vacina-1 12-valente contra KP/PA, bem como para a FIlaBD2-MrkA na vacina-2 12-valente contra KP/PA. º Os anticorpos direcionados para as proteínas de transporte na vacina-1 12-valente contra KP/PA expandem a amplitude da cobertura para sorotipos de OPS não vacinais. º Coerente com o desenho experimental para FlaB contendo somente o domínio 2 de FlaB (FlaBD2), uma ablação completa da atividade agonista de TLR5 foi demonstrada para as proteínas de fusão de transporte com FlaBD2. .º Os resultados do primeiro desafio em um modelo de infecção por Klebsiella de ferida por queimadura mostram uma tendência de proteção por anticorpos contra MrkA. Exemplo 12: Ensaios funcionais da vacina 12-valente contra P. aeruginosa/K. pneumoniae Ensaios de morte por opsonofagocitose (OPK) Ensaios OPK de neutrófilos humanos
[00625] Um ensaio de morte por opsonofagocitose (OPK) de neutrófilos humanos foi usado para avaliar a resposta funcional de soros agrupados de coelho (P2) desenvolvido com a vacina-1 12-valente contra KP/PA com dose de 5 ug (NCB012, Tabela 21), utilizando a cepa acapsular 7380 do sorotipo O2 (KP O2 K-) de KP. Os resultados do ensaio OPK são mostrados in Figura 47.
[00626] O soro imune levou a 100% de morte das bactérias KP O2 em diluição 1/10 depois de 24 horas de incubação, enquanto a diluição 1/100 não teve atividade de morte das bactérias. A atividade de morte do soro pode ser atribuída ao OPS de KP O2 ou MrkA, ou a combinação dos dois componentes da vacina. Ensaios OPK com linhagem celular J774 de macrófagos
[00627] Esse ensaio OPK usa a linhagem celular J774 de macrófagos na presença ou ausência do antibiótico gentamicina para avaliar a atividade funcional. Diversos antibióticos não conseguem penetrar as células eucarióticas. Portanto, esses antibióticos não podem prejudicar bactérias que já estão internalizadas. O uso de tais antibióticos permite diferenciar bactérias que conseguem penetrar células eucarióticas e aqueles que não o fazem. A aplicação de tal antibiótico a uma cultura de células eucarióticas infectadas com bactérias mataria as bactérias que restassem fora das células enquanto poupando aquelas que penetraram. O antibiótico de escolha para esse ensaio é o aminoglicosídeo gentamicina.
[00628] Soros agrupados de coelhos no grupo de tratamento 5, que receberam a dose de 5 ug da vacina-1 12-valente contra KP/PA no
NCB012 e que mostraram os títulos mais altos de OPS (1502, 1506, 1508, 1511) foram utilizados em um ensaio OPK com uma linhagem celular J774 de macrófagos para avaliar o efeito do soro sobre a internalização fagocitária das cepas KP O1, KP O2, KP O3 e KP O5 de Klebsiella.
[00629] Células uJ774 de macrófagos foram semeados em placas de 96 cavidades 24 horas antes do experimento. Cepas de Klebsiella de vários tipos de O foram cultivadas até a fase mid-log em caldo e soros agrupados foram utilizados no ensaio de morte. Aproximadamente 1x10º CFU de bactérias foram incubadas com soros agrupados pré- imune (PO) ou imune (P2) por 30 minutos. As bactérias opsonizadas foram incubadas com células J774 por 15 minutos à temperatura ambiente, um tempo suficiente para permitir a fagocitose mediada por anticorpos. As bactérias não ligadas foram removidas das células, e tampão fresco com gentamina +50 pg/mL foi adicionado por 20 minutos adicionais. As células foram lavadas duas vezes com PBS, então lisados pela adição de água pura. Dez mL de cada cavidade foram espalhados em placas em duplicata e as unidades formadoras de colônias (CFU) foram contadas no dia seguinte.
[00630] Os resultados desse ensaio são mostrados na Figura 48A e 48B. A internalização fagocitária por células J774 de Klebsiella opsonizadas com soro imune ou pré-imune em diluição 1/20, 1/100 e 1/500 demonstram uma internalização aumentada de KP O1, KP O?2, KP O3 e KP O5 na presença de soro imune e presença de gentamicina (Figura 48A). A maior internalização foi observada na diluição 1/100 para KP O1, KP 02 e KP O3. Para KP O5, a internalização foi semelhante a uma diluição de 1/20 e 1/100.
[00631] Na ausência de gentamicina, foi também observada internalização significativa pelas células J774 de KP O1, KP 03 e KP O5 com soro P2, quando comparado ao soro pré-imune, em que há menos internalização bacteriana. Para KP O2, não são apresentados resultados por que as contagens de CFU eram altas demais para contagem (Figura 48B). Para KP O1 e KP O3, a internalização diminuiu com diluição mais alta e, para KP O5, a maior internalização foi observada para a diluição 1/100, uma internalização ligeiramente menor para a diluição 1/20 e a menor internalização para a diluição 1/500.
[00632] Soros agrupados de coelhos que receberam a dose de 5 ug da vacina-1 12-valente contra KP/PA in NCB012 e mostraram os maiores títulos de OPS (1502, 1506, 1508, 1511) foram também usados em um ensaio OPK com uma linhagem celular J774 de macrófagos para avaliar o efeito do soro sobre internalização por fagocitose de Pseudomonas PA (O5:FlaB e O6:FIlaA1) e de Klebsiella cepa KP O5 (cepa 6997). O ensaio foi realizado como descrito acima a respeito dos testes de OPK com J774 OPK das cepas KP O1, KP O2, KP 03, e KP O5 de Klebsiella.
[00633] Os resultados desse ensaio são mostrados in Figuras 49, 50 e 51. Soro imune (PO) mediou a internalização de cada uma dessas cepas bacterianas pelos fagócitos como demonstrado na Figura 49. À internalização de bactérias pelas células J/774 semelhantes a macrófagos é mostrada mais por microscopia utilizando PA marcada com GFP (PA O1, PA O5 FlaB) como ilustrado na Figura 50. PA exposta ao soro imune foram internalizadas avidamente pelas células. Múltiplos isolados de PA tratados com P2 em cada célula J774 são mostrados na vista aumentada na Figura 50. A Figura 51 mostra que uma proporção maior de células (painel esquerdo) e número maior de bactérias por célula (painel à direita) foram observados para aquelas células tratadas com soro imune quando comparadas àquelas tratadas com soro pré- imune. Ensaios de OPK com HL-60
[00634] Nesse tipo de ensaio, bactérias da cepa 7380 KP O2 foram primeiramente opsonizadas com soro e, a seguir, células HL-60 diferenciadas foram adicionadas à mistura. Depois de incubação da mistura por 45 minutos, as bactérias viáveis foram contadas. O título de OPK foi definido como o título no qual menos de 50% das bactérias sobrevivem em relação ao controle negativo (bactérias + células HL-60 somente).
[00635] A Figura52eaTabela25 mostram os resultados do ensaio OPK por HL60 OPK com a cepa 7380 de KP O2 e soros agrupados de coelhos imunizados com a dose de 5 ug da vacina-1 12-valente contra KP/PA. Os soros de coelho anti-KP O2 morta pelo calor (HK) pré e pós- imunização serviu como controles positivos. O ensaio foi realizado com diluições 1/200 a 1/204.800 do soro.
[00636] Os soros de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA mostram uma atividade OPK significativa contra cepa 7380 de KP O2 enquanto que o soro pré-imune correspondente mostrou um efeito muito menor na morte das bactérias. A atividade de morte pode ser atribuída aos anticorpos contra OPS de KP O2 ou MrkA ou a ambos. Detalhes sobre os títulos de OPK para os soros pré e pós- imunização, bem como para os controles positivos são fornecidos na Tabela 25. Houve uma diferença significativa (aumento >15 vezes) na atividade de morte entre o soro pré (1/800) e o pós-imune (1/12.800). Tabela 25: Título de OPK para a cepa 7380 de KP O2 no ensaio com HL-60 | esa OR Bactérias mortas pelo | Pé 1200 | | caem BR rama
[00637] Um ensaio semelhante foi realizado com a cepa 6997 de KP OB. As bactérias foram misturadas com pools de soro pré-imune (PO)
ou pools de soro imune (P2) do NCB012 e adicionadas a células HL-60 na presença de complemento (Tabela 26). Foi observada 50 por cento de redução da sobrevivência com o soro imune até um título de 1:1.280 enquanto o pool de soro pré-imune exibiu uma redução modesta em diluição 1:40 do soro. Tabela 26: Percentual de sobrevivência da cepa 6997 de KP O5 em células HL-60 utilizando soros agrupados o e am e Conclusões para os diferentes ensaios de OPK
[00638] Três ensaios diferentes de OPK foram utilizados para avaliar a eficácia dos anticorpos induzidos em coelhos após duas administrações da vacina-1 12-valente contra KP/PA. Atividade OPK significativa pôde ser demonstrada contra os sorotipos 01, 02, 03 e O5 de PK nos ensaios utilizando PMNs humanos, células J774 de macrófagos ou células HL-60 diferenciadas. A atividade OPK poderia ser atribuída aos anticorpos OPS-especiíficos e/ou os anticorpos contra a proteína de transporte MrkA. A internalização de KP e PA por células fagocitárrias promovida pelo soro imune 12-valente deve-se provavelmente ao anticorpo contra OPS. Proteção contra toxicidade celular
[00639] De acordo com o protocolo descrito no Exemplo 7, (Ensaios de citotoxicidade para construções com a proteína PcrV de Pseudomonas), a PAK (O6 FIaA1) de Pseudomonas foi cultivada durante a noite e usada para infectar monocamadas de células A549 derivadas do epitélio pulmonar humano na presença de várias concentrações (10%, 5%, 2,5% ou zero) de soro de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA, o qual contém anticorpo anti-
PcrV gerado a partir da resposta imune contra MAPS-proteína de transporte ou com soro pré-imune desses mesmos coelhos na mesma faixa de concentrações do soro. A citotoxicidade em A549 induzida por Pseudomonas é caracterizada pelo arredondamento celular à medida que as células se tornam apoptóticas e se destacam da superfície da placa de cultura celular. A proteção mediada pelo anticorpo anti-PerV contra citotoxicidade é indicada pela redução no número de células arredondadas (apoptóticas) em um dado campo do microscópio em comparação a células tratadas com uma concentração semelhante de soro pré-imune. A diferença máxima em células arredondadas (apoptóticas) entre tratamento com soro imune e pré-imune foi observada a uma concentração do soro de 2,5% (Figura 53, gráfico esquerdo). Fotomicrografias de células A549 representativas infectadas por PAK e tratadas com soro 2,5% demonstram essa diferença como uma diminuição no número de células arredondadas altamente refrativas na amostra tratada com soro imune (Figura 53, painel direito). Imagens semelhantes foram utilizadas para estimar o número de células afetadas em cada concentração do soro (Figura 53, gráfico esquerdo). Redução da motilidade de P. aeruginosa através de anticorpos contra FlaB
[00640] “Como mostrado na Figura 54, células tratadas com soros agrupados de coelhos imunizados com a dose de 5 ug por PS (p. ex., 60 ug de PS total na vacina; 5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina) da vacina-1 12-valente contra KP/PA mostraram mortalidade reduzida da cepa PA O5 FlaB através do anticorpo contra FlaB em comparação ao tratamento com soro pré-imune. Agregação de P. aeruginosa via anticorpos contra FlaB
[00641] A cepa PAO1 (O5 FlaB) de P. aeruginosa foi cultivada durante a noite e suspensa em PBS até uma concentração de 107 CFU/mL, então, incubada com soro 1% de coelhos vacinados com a vacina 4-valente contra KP ou com soro pré-imune dos mesmos coelhos por 1 hora à temperatura ambiente. Anticorpo anti-FlaB no soro gerado da resposta imune à proteína de transporte Ravi-FlaBD2-MrkA-His foi capaz de aglutihar Pseudomonas expressando FlaB, como demonstrado pelos clusters de bactérias vistos em fotomicrografias como bastões pretos (Figura 55, painel direito) e agregação marcada, enquanto nenhum de tais agregados foi observado com bactérias tratadas com o soro pré-imune (Figura 55, painel esquerdo). FlIaBD2 era o único antígeno de Pseudomonas nesse preparado vacinal, e a observação de bactérias reticuladas indica que a proteína de transporte induz a produção de anticorpos funcionais capazes de reconhecer o epítopo nativo produzido na flagelinas bacteriana. O soro de coelhos imunizados com a vacina-1 MAPS 12-valente contra KP/PA foi capaz de aglutinar Pseudomonas expressando FlaB com o tipo O não presente na vacina (dados não mostrados), o que sugere fortemente que a proteína de transporte contendo FIlaBD2 gerou anticorpos funcionais anti-FlaB na formulação 12-valente, embora a reatividade cruzada entre os tipos O de Pseudomonas como contribuintes para a aglutinação observada não possa ser descartada.
Ensaios de inibição da aderência
[00642] Nesse ensaio, foram utilizados soros agrupados do NCBO012 para avaliar a inibição da aderência da resposta de anticorpos gerada para diferentes vacinas exemplares. Celas bacterianas da cepa 6997 de KP 05 expressando fímbria Tipo 3 foram misturadas com soro pré-imune e soro imune (10%) e incubadas com células A549 da linhagem celular epitelial. Bactérias não aderentes foram lavadas das células antes da lise das células e determinação do número de bactérias aderentes. À inibição da aderência resulta em menos CFU na placa. A Figura 56 mostra que os soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA, os soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina 8-valente contra PA (MrkA é o único antígeno de KP na vacina 8-valente contra PA) e os soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina 4-valente contra KP bloquearam a aderência da cepa 6997 de KP O5 a células A549. Sem a intenção de ficar preso a qualquer teoria, como os soros agrupados de coelhos imunizados com a única vacina 8-valente com OPS de PA também inibisse a aderência, sugere-se que o anticorpo contra MrkA, induzido pela proteína de transporte, oferece proteção. Exemplo 13: Ensaios de proteção de camundongos
[00643] Estudos de imunização passiva foram realizados em camundongos com antissoro obtido de coelhos imunizados com as vacinas contra KP/PA. A Tabela 21 fornece informações sobre as formulações vacinais que foram utilizadas para a imunização de coelhos. Os soros pré e pós-imunização dos coelhos (em soros agrupados) foram usados para imunização passiva dos camundongos como descrito para os diferentes modelos. Detalhes sobre as diferentes cepas de desafio são também descritas por estudo. Estudo de proteção passiva em camundongos contra infecção letal por PA utilizando soros de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA
[00644] Um estudo de proteção passiva em camundongos foi realizado utilizando soros agrupados de coelhos imunizados com a dose de 5 ug por PS (p. ex., 60 ug de PS total na vacina; 5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina) da vacina-1 12-valente contra KP/PA (Tabela 21, grupo 5) no estudo NCBO012. Os camundongos foram pré-tratados com soro pré-imune ou soro imune (soros agrupados de coelho) e desafiados IP com cepas diferentes de
[00645] Em doses letais do desafio com PA, o soro imune protegeu os camundongos da infecção com PA O5 e PA O6. Houve uma tendência para proteção nos desafios com PA 010 e O11, mas a diferença acentuada na sobrevivência de camundongos tratados com soro pré-imune e desafiados com 1x 10º CFU e uma dose apenas 3 vezes menor ilustra quão íngreme é a curva de dose-resposta para muitas bactérias Gram-negativas. Isso frequentemente representa desafios na realização desses ensaios. Detalhes sobre as taxas de sobrevivência são apresentados na Tabela 27. Tabela 27: Taxas de sobrevivência de camundongos em um estudo de desafio letal com PA o e an Tras, Estudo de proteção passiva em camundongos contra Klebsiella KP O3 utilizando soros de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA
[00646] Os soros dos 4 coelhos com as maiores respostas anti-KP- O3 (coelhos 1502, 1506, 1508 e 1511; Tabela 28), imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA em uma dose de 5 ug por PS (p. ex., 60 ug de PS total na vacina; 5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina) (Grupo 5) no NCB012, foram agrupados e injetados (soro pré-imune ou imune) IP 20 horas e 2 horas antes do desafio IV com a cepa 700603 de KP O3 a 50.000 CFU em 0,1 mL. Tabela 28: Títulos pré-imune e imune de soros de coelhos incluídos nas amostras agrupadas
Número do coelho/ Amostra de Título pré-imune de .
[00647] Quatro horas após o desafio, os camundongos foram sacrificados e sangue, fígado e baço foram coletados e as contagens de colônias determinadas. Os resultados são fornecidos na Tabela 29. Camundongos que receberam soro imune agrupado mostraram eliminação do sangue e número reduzidos de bactérias viáveis no fígado e baço quando comparados a camundongos tratados com o soro pré-imune dos mesmos coelhos. Esses resultados foram semelhantes para eliminação bacteriana utilizando soros de título equivalente de coelhos imunizados com o MPAS 4-valente KP no estudo NCB008. Tabela 29: Média geométrica de CFU para eliminação do sangue de bactérias viáveis em órgãos após o desafio com Klebsiella KP O3 Estudo de proteção passiva em camundongos contra cepa B5055 de Klebsiella utilizando soros de coelhos imunizados com a vacina-1 12- valente contra KP/PA
[00648] Nesse estudo, três camundongos por grupo foram injetados com soros agrupados de coelhos que foram imunizados com a vacina- 1 12-valente contra KP/PA em uma dose de 5 ug por PS (p. ex., 60 ug de PS total na vacina; 5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina) (Tabela 21, grupo 5) no estudo NCBO012 (soro pré-imune e imune) seguido por um desafio intravenoso (IV) com a cepa B5055 de KP O1 a 5x 10º. Os resultados para o ensaio de eliminação do sangue em 1 e 4 horas após o desafio são listados na Tabela 30 como a média geométrica de CFU/ml de sangue e ilustrados na Figura 57, individualmente por camundongos.
[00649] “Quatro horas após o desafio, o sangue de camundongos no grupo do soro imune apresentava uma redução significativa em CFU/mL, enquanto a CFU/mL em camundongos que receberam o soro pré-imune permaneceu elevado. Tabela 30: Resultados do ensaio de eliminação do sangue em média geométrica de CFU/mL em camundongos após o desafio com a cepa B5055 de KP O1 mess [mo mes am
[00650] Os resultados para a carga em órgão do baço e fígado nesses camundongos estão listados na Tabela 31 em média geométrica de CFU/g de tecido para os três camundongos. A Figura 58 mostra os resultados da carga em órgãos para baço e fígado dos três camundongos 20 horas após o desafio.
[00651] Dois dos três camundongos que receberam o soro imune revelaram diminuição da média geométrica de contagens de CFU no fígado quando comparados aos camundongos que receberam o soro pré-imune. Os resultados para o baço mostram um padrão semelhante para camundongos pré-tratados com o soro imune que mostravam diminuição significativa 20 horas após o desafio em comparação aos camundongos que receberam o soro pré-imune que exibiram uma contagem de bactérias significativamente maior.
Tabela 31: Carga em órgãos de camundongos em média geométrica de CFU/g de tecido após o desafio com a cepa B5055 de KP O1
EFTEFIEFIIE Estudo de proteção passiva em camundongos contra a cepa 6997 de Klebsiella KP OB5 utilizando soros de coelhos imunizados com a vacina- 1 12-valente contra KP/PA
[00652] Nesse estudo, três camundongos por grupo foram injetados com soros agrupados de coelhos que foram imunizados com a vacina- 1 12-valente contra KP/PA em uma dose de 5 ug por PS (p. ex., 60 ug de PS total na vacina; 5 ug de PS contribuídos por cada tipo de BP na vacina) no estudo NCB012 (Tabela 21, grupo 5, soro pré-imune e imune), seguido por um desafio IV com a cepa 6997 de KP O5 a 5x 10º. Os resultados para o ensaio de eliminação do sangue em 1 e 4 horas após o desafio estão listados na Tabela 32 em média de CFU/mL de sangue e ilustrados individualmente na Figura 59 por camundongo.
[00653] Quatro horas após o desafio, o sangue de 2 dos 3 camundongos no grupo do soro imune mostrava eliminação das bactérias com uma diminuição significativa em carga de CFU no terceiro camundongo, enquanto a CFU em camundongos que receberam o soro pré-imune permanecia elevada (2 de 3 camundongos) quatro horas após o desafio. Tabela 32: Resultados do ensaio de eliminação do sangue em média geométrica de CFU/mL em camundongos após o desafio com a cepa 6997 de KP O5 om e
[00654] Os resultados para a carga em órgãos do baço nesses camundongos estão listados na Tabela 33 em média geométrica de CFU/g de tecido para os três camundongos, e a Figura 60 mostra os resultados da carga em órgãos para o baço dos três camundongos 20 horas após o desafio.
[00655] Emrelação ao baço, foi observado que os camundongos que receberam o soro imune apresentavam contagens de bactérias muito menores 20 horas após o desafio do que aqueles camundongos que receberam o soro pré-imune. Tabela 33: Carga em órgãos de camundongos em média geométrica de CFU/g de tecido após o desafio com a cepa 6997 de KP O5
EEE Estudo de proteção passiva em camundongos contra Klebsiella KP O2 (cepa KPN 12) de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA
[00656] Nesse estudo, camundongos CD-1 (3/grupo) receberam 0,2 mL de pools de soro pré- ou imune (10 coelhos por pool, estudo NCB012) 24 horas e 2 horas antes da administração IV de of 2x 105 CFU da cepa KPN-12 de KP O2. Os baços foram coletados 72 horas após a infecção e a carga bacteriana por grama de tecido foi determinada. Os camundongos que receberam o soro imune mostraram números reduzidos de bactérias viáveis em comparação com camundongos tratados com soro pré-imune (7.978 versus 114.687 CFU, média; Figura 61). Os soros imunes agrupados promoveram a eliminação de KP O2 (cepa KPN-12) da circulação.
[00657] Diversos experimentos com soro pré-imune e soro imune do NCB012 foram realizados para desenvolver e otimizar um protocolo de proteção passiva em um modelo de desafio letal com Klebsiella KP O2.
Experimentos semelhantes podem ser realizados para desenvolver e otimizar um protocolo de proteção passiva para outros organismos, outras vacinas ou composições imunogênicas e/ou outros patógenos/cepas. Foram examinadas variáveis como a dose do desafio de bactérias, a entrega do inóculo (p. ex., opsonização das bactérias antes da injeção) e o número, momento e concentração dos soros para proteção passiva (p. ex., soros gerados com a dose de 5 ug ou 1 ug de polissacarídeo). Parâmetros testados exemplares e resultados são apresentados na Figura 62. Resposta de Th17 e colonização de camundongos CD-1- com desafio
[00658] Esse experimento foi projetado para determinar a capacidade de três doses da vacina de MAPS KP O1 com FIaBD2 e MrkA administrada a camundongos, cada dose administrada quatorze dias depois da dose anterior, para reduzir a colonização bacteriana após desafio bacteriano duas semanas depois da última imunização. Dois grupos de camundongos CD-1 deveriam se submeter ao desafio bacteriano; um grupo foi imunizado com a vacina MAPS KPO1/FIaBD2- MFrkA e o outro foi imunizado com tampão (PBS) apenas.
[00659] Cinco camundongos por grupo foram desafiados com 3- 5x10º CFU de KP B5055 (01:K2) via intratraqueal (IT). Quarenta e oito horas após o desafio bacteriano, os pulmões foram coletados e pesados, homogenados foram colocados em placas para contagens bacterianas e, então, centrifugados. Os sobrenadantes tiveram os níveis de IL-17a avaliados. Simultaneamente, os baços foram cocultivados com PBS, FIlaBD2 e MrkA, como descrito acima e, depois de três dias, os sobrenadantes tiveram os níveis de IL-17a avaliados.
[00660] A Figura 63 mostra a indução de IL-17a por células esplênicas estimuladas após o desafio bacteriano. Foi observada uma indução significativa em células esplênicas estimuladas com FlaBD2 (p =0,02).
Efeito da imunização sobre a colonização do trato GI por P. aeruginosa
[00661] O protocolo experimental seguinte foi projetado para examinar o efeito da imunização com uma vacina MAPS monovalente contra PA O6 sobre a colonização gastrointestinal (GI) por P. aeruginosa.
[00662] Oito ratos Sprague-Dawley foram imunizados duas vezes com 0,5 mL SC, em intervalos de duas semanas, com uma vacina MAPS monovalente, MAG6-93-PAO6 (Klebsiella pneumoniae K19: Pseudomonas aeruginosa O6 /Ravi-FlaBD2-MrkA-his BP-1). Sete ratos foram imunizados com tampão apenas. Quatorze dias depois da segunda imunização, os ratos foram tratados com ceftriaxona (50 mg/Kkg IM) e continuaram a receber doses uma vez ao dia do antibiótico por nove dias. Os ratos receberam antibióticos para superar a resistência à colonização no trato Gl por bactérias oportunistas, como PA, e para simular a situação clínica. Depois de quatro dias de antibiótico apenas, os ratos receberam P. aeruginosa (PA, IATS O6) a 10º CFU por gavagem durante, no total, cinco dias. Depois de cinco doses diárias de PA e nove doses diárias de ceftriaxona, os ratos foram sacrificados e o ceco foi removido, pesado e, a seguir, cultivado. Sangue foi obtido para os níveis de anticorpos antes dos antibióticos e da administração das bactérias, e amostras de fezes foram obtidas para cultura de PA no dia antes e dois dias depois da primeira dose de PA. Detalhes podem também ser encontrados na metade superior da Figura 64.
[00663] Os resultados do estudo de colonização em ratos com as duas doses da vacina MAPS PA O6 FlaBD2-MrkA são mostrados na parte inferior da Figura 64. Ratos que receberam a vacina contra PA O6 apresentaram um título elevado de IgG por ELISA acima dos ratos que receberam PBS (parte inferior esquerda da figura). Os ratos vacinados também mostraram uma mediana inferior a 10º CFU/g de bactérias em comparação com os ratos controle que apresentaram uma mediana
>10º CFU/g (parte inferior direita da figura). Os resultados do estudo indicam uma redução da colonização por PA O6 no ceco depois de aduas imunizações com uma vacina MAPS monovalente contra PA O6. Exemplo 14: Anticorpo anti-OPS contra cepas de PK resistentes a carbapenem (CRKP) expressando o epítopo Gal-ll|
[00664] Em contraste a outras classes of carbapenemase bacteriana (p. ex., oxa-48 ou metalo-beta-lactamases), a disseminação de KPC (K. pneumoniae carbapenemase) parece ser pelo menos parcialmente um fenômeno clonal. Uma linhagem específica denominada sequência tipo (ST) 258 demonstrou ser responsável pela maioria das infecções por Klebsiella produtora de KPC que são endêmicas em diversas regiões geográficas. Atualmente, nos estados do Nordeste dos Estados Unidos, >30% de todas as infecções nosocomiais por K. pneumoniae causadas por CRKP, e cerca de 70% dessas pertencem ao clone ST258 produtor de KPC. Do mesmo modo, esse clone (incluindo variantes ST de lócus único) é epidêmico em outras partes do mundo, incluindo Israel, Polônia, Itália, Grécia, América do Sul e China. Recentemente, uma investigação da evolução molecular de ST258 identificou dois clados que estão relacionados com a expressão de diferentes polissacarídeos capsulares (Chen 2014a, Chen 2014b, DeLeo 2014). Klebsiella pneumoniae ST258 é um clone nosocomial mundialmente disseminado, extremamente resistente a fármacos com opções terapêuticas limitadas.
[00665] Os antígenos KP O1 e KP O2 são construídos com homopolímeros de galactose, ou seja, galactanos. O antígeno KP O?2, denominado d-galactano-l (gal-|), é composto por unidades repetidas de dissacarídeos de galactose. No caso de KP O1, gal-l é capeado por repetições de um dissacarídeo de galactose antigenicamente diferente denominado d-galactano-ll (gal-ll), que determina a especificidade do sorotipo. O sorotipo raro KP O2ac possui uma estrutura análoga, ou seja, repetições de subunidades de gal-| são capeadas por um polímero de uma unidade repetida distinta, neste caso, não galactano. Assim, todas as cepas KP O1, KP O2 e KP O2ac compartilham o antígeno gal- |, no entanto, enquanto em KP O?2, este é o único determinante antigênico O, no caso de KP O1 e KP O2ac, gal-| é resguardado por unidades repetidas mais externas. Além disso, as unidades repetidas do dissacarídeo gal-l podem ser ornamentadas pela adição estequiométrica e não estequiométrica de grupos O-acetila ou galactosila gerando subtipos dentro do sorogrupo KP O2 (Figura 65). À grande maioria de isolados ST258 expressa o antígeno O do lipopolissacarídeo d-galactano-l modificado, com o Gal-l ornamentado com os grupos galactosila denominado a seguir como d-galactano-lll (Szijártó V. et al., 2016).
[00666] OKP O1 OPS é composto por um trecho curto de iniciador de D-Gal-| ou D-Gal-Ill, seguido por um trecho longo de D-Gal-ll. KP O2 OPS é composto somente por D-Gal-l ou D-Gal-lll (Figura 65). O epítopo Gal-ll é o único específico para o sorotipo KP O1.
[00667] OOPS de BB5055, que é a fonte do antígeno KP O1 na vacina MAPS, possui o trecho curto de D-Gal-Ill, seguido por um polímero longo de D-Gal-ll. KP 7380 (fonte do antígeno vacinal de KP O2) possui apenas D-Gal-l.
[00668] Para investigar se a vacina MPAS contra KP/PA tem o potencial para gerar anticorpos contra o epítopo Gal-lll e, assim, foi investigado se teria o potencial para prevenir infecções que se devem às cepas clonais KPCR ST 258. Soros agrupados (P2) de coelhos imunizados com a vacina MAPS 4-valente KP PRO-CN na dose de 5 ug foram utilizados em um ensaio por citometria de fluxo para demonstrar a capacidade de ligação a epítopos expressando KP D-Gal-lll e KP D- Gal-l. Nesse caso, a única resposta relevante seria contra o OPS reconhecido de D-Gal-| O2 e D-Gal-lll O2 OPS, D-Gal-ll 01 OPS. Os resultados demonstraram um aumento em ligação acima do soro pré-
imune correspondente (PO) para ambos, KP O1 e KP O2 de D-Gal Ill e D-Gal | OPS (Figura 66). É, portanto, provável que anticorpos foram gerados contra todos os três tipos de D-Gal de KP.
[00669] A análise por citometria de fluxo, fornecida na Tabela 34 e Figura 67, mostra que os anticorpos em soros agrupados de coelhos imunizados com a vacina-1 12-valente contra KP/PA ligou-se a duas das três cepas ST258 de isolados de bacteremia. Antissoros da vacina- 1 12-valente contra KP/PA ligou-se a três de quatro cepas de sorotipos não incluídos na vacina, entre estas, cepas com alelos de MrkA com variantes mínimos da sequência (Figura 67). Sem a intenção de ficar preso a qualquer teoria, esses dados sugerem que a maioria das cepas KP, não apenas aquelas com os sorotipos dos componentes OPS da vacina-1 12-valente contra KP/PA, será reconhecida pelos anticorpos desenvolvidos pela vacina via a componente proteína de fusão MrkA. Tabela 34: Resultados da citometria de fluxo de soros 12-valente da vacina-1 contra cepas de Klebsiella de sorotipos não incluídos na vacina e que possuem alelos mutantes de MrkA a vs ao grmo MrkA por fluxo 1405472 EUA o 258 Wzi154 | Desco- Sim ns asas 1105463 EUA o2 258 Wzi154 Desco- sas 1103113 EUA o2 258 Wzi154 Conser- Sim su e NUH5575 | Japão Não O1, Desco- Wzi41 T23N Sim 02, O3 ou | nhecido So 7075 África Não O1, Desco- Wzi212 AV, Sim do sul | 02, O3ou | nhecido T12S | eles] je]
02, O3 ou | nhecido vados Os dae 02, O3 ou | nhecido MrkA Os
[00670] Osresultados para a capacidade de ligação da vacina MPAS 4-valente contra KP aos epítopos expressando KP D-Gal-|l e D-Gal-lll indicam que uma vacina 12-valente contra KP/PA tem o potencial para gerar anticorpos contra o epítopo Gal-lll e para prevenir infecções que se devem às cepas clonais KPCR ST 258. Exemplo 15: Preparação de BP-1.2
[00671] BP-1 beneficia-se por ter resíduos de biotina localizados no aspecto CPS do BP, o que pode ser vantajoso em termos de caracterização do produto e perturbação mínima de epítopos do OPS. Uma variante desse processo para produzir tal estrutura foi desenvolvida e baseia-se na ligação dos resíduos de biotina com o CPS em um sítio ortogonal, utilizando os carboxilatos dos resíduos de ácido urônico do polissacarídeo ao contrário de um aldeído. Essa reação, que envolve o uso da carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS), é altamente controlável e permite um nível constante de biotinilação no CPS e do BP resultante. O BP preparado por tal método é referido como BP-1.2. Um desenho esquemático de um processo exemplar para preparar BP-1.2 é representado na Figura 2B.
[00672] Algumas vantagens desse processo inclui prover um processo consistente de biotinilação com controle melhor sobre o nível de derivação com biotina, e consistência melhor do produto, pois todos os BPs derivam do mesmo lote de CPS biotinilado, fornecendo um intermediário biotinilado estável que pode ser armazenado em grandes lotes, e o potencial para alcançar uma razão maior OPS/CPS no BP por que mais grupos aldeído estão disponíveis no CPS levando a menos competição pelos mesmos sítios de ligação. Exemplo 16: Estudos de imunização de complexos imunogênicos BP-1 e BP-1.2
[00673] Vacinas 4-valentes foram preparadas como MAPS BP-1 ou MAPS BP-1.2, e formuladas de acordo com a Tabela 35. Essas composições foram administradas a coelhos usando os protocolos descritos acima, p. ex., Exemplos 6 e 11.
o o s o o 8 = =
O 2 cs o? + ox S 2 O 2 O o o = QN & «Ss Z2 o << o << qo FS É s Tv] gs E s|>2 a UNA, Tio o no |N E 28 m ge ee|S S o Sm SW = = a o o &
ND | o o o | à E SO 8 vv o 82 so sos e 8 2º 2? > Ss On o o ã o E|ê 8 8 8 SE o O Oo 8 O |O - o - o |o o Õ o o vo O O O => 3 on o q q q o 2152 O 0 A e2|/A<|4À na | o m e [EST Mm E In & E o IS XX SS << SS <q< mo o TFT o Lt SS EL SS LS wo S/S 2 E 2 E 2 E LE n | 2 a = a = a = E 3 /&* XX “ o“ a = o ú =
É = a o S o o e 8 E | ns E 2 E o | o S o S E o |O SS <Q VS o & | NS 2 N o So 3 x 2 S E a E x o 2 2 > 2 2 o cs - & - Sl tax , Taxa Z o : g 2 1E 7& om 7 T o ã 3/6 TERAsSsS Too 2 S 2 |> aviao tmo 2 Ss ' Ss o : o O ç & & S 8 $ e) > > O ã o E Ss 8 3 o |3 - qa z EO z eg É z ã se & ê
[00674] Uma resposta robusta de anticorpo IgG contra OPS de KP e PA foi observado para os dois grupos, BP-1 e BP-1.2. Os títulos individuais de IgG contra OPS e CPS K19, para o grupo 1 e grupo 2, são mostrados na Figura 68. As respostas imunes anti-OPS para OPS de PA O6 e PA 011 foram equivalentes para as construções de MAPS BP-1 e BP-1.2. Do mesmo modo, respostas equivalentes foram observadas para o OPS de KP O3 e KP O5, embora os títulos fossem significativamente melhores para KP O3 com a construção de MAPS BP-1.2 (Média geométrica do título aproximadamente 5 a 6 vezes maior). Os títulos de IgG contra o CPS K19 foram equivalentes para as duas construções de MAPS BP-1 e BP-1.2. Uma resposta robusta de anticorpo IgG contra as proteínas de transporte FIlaB-D2 e MrkA foi obtida também pelos grupos BP-1 e 1.2. A resposta de anticorpo (soros agrupados) contra as proteínas de transporte foi comparável para os dois grupos BP-1 e BP-1.2 (Figura 69). Um resumo dos resultados é mostrado na Tabela 36. Tabela 36: Comparação da imunogenicidade de MAPS BP-1 (Grupo 1) com MAPS BP-1.2 (Grupo 2): Resposta de IgG ao OPS
[em TR [A
CC A a O
CC a a O
[eo Ro o go [es Tm Tm eg
[00675] Os títulos individuais de IgG contra OPS e CPS K19 para o grupo 1 e grupo 2 são mostrados na Figura 68. As respostas imunes anti-OPS ao OPS de PA O6 e PA O11 OPS foram equivalentes para as construções de MAPS BP-1 e BP-1.2. Do mesmo modo, respostas equivalentes foram observadas para o OPS de KP O3 e KP O5, embora os títulos fossem significativamente melhores para KP O3 com a construção MAPS BP-1.2 (Média geométrica do título aproximadamente a 6 vezes maior). Os títulos de IgG contra o CPS K19 foram equivalentes para as duas construções de MAPS BP-1 e BP-1.2.
[00676] NoestudoNCBO013, uma comparação de vacinas 2-valentes com a BP-1 (estrutura-1) e BP-1.2 (estrutura-1.2) contra KP/PA foi realizado em coelhos (ver também a Tabela 35 para descrição das formulações vacinais). A Figura 70 e a Figura 71 demonstram as respostas individuais de anticorpos contra as duas proteínas de transporte FlaBD2 e MrkA para BP-1 e BP-1.2 (4-valente contra KP/PA) respectivamente. Um aumento significativo dos títulos de anticorpos foi observado depois da primeira imunização para as duas proteínas de transporte para ambos as estruturas. Os títulos de anticorpos títulos aumentaram mais depois da segunda imunização. Uma resposta robusta de anticorpos contra FlaBD2 e MrkA para os dois grupos, BP-1 e BP-1.2, foi observada, e a resposta de anticorpos contra ambas as proteínas foi comparável para os grupos BP-1 e BP-1.2. Sequências
MKIKTLAMIVVSALSLSSTAALADTTTVNGGTVHFK Proteína d. GEVVNAACAVDAGSIDQTVAQLGQVRSAKLATAGS roteina da
SEQ ID TSSAVGFNIQLDDCDTTVATKASVAFAGTAIDSSNT fímbria Tipo | de NO:1 , TVLALQNSAAGSATNVGVQILDNTGTPLALDGATF K. pneumoniae
MKKVLLSAAMATAFFGMTAAHAADTTVGGGQVNF Proteína MrkA
FGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKA conservada da SEQ |D fimbria Tipo Il AAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGV Imbria lipo NO:2 d k NWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVL e KA. . STDNATALTNKIIPGDSTAPKAKGDASAVADGARF pneumoniae
ADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDAN Proteína MrkA
VYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCOQAAD estabilizada da SEQ |D fimbria Tipo HI GTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLAN imbria lipo NO:3 d TEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQAPKAK e KA. . GDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSY pneumoniae
ATYEITYAQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVS Sequência em | QVRLQQOSGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSTSPYFW SEQ ID | PsL de ligação | SIWVLRQOPPGKGLEWIGYIHSNGGTNYNPSLKSRLTI NO:4 ao mAb Cam- | SGDTSKNQFSLNLSFVTAADTALYYCARTDYDVYG 003 PAFDIWGQAGTMVTV Sequência em | SSELTQDPAVSVALGOTVRITCAGDSLRSYYASW SEQ ID | PsL de ligação | YAQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGN NO:5 ao mAb Cam- | TASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGG 003 TKLTVL SEQ ID Flagelina FIC | MALTVNTNIASLNTORNLNNSSASLNTSLORLSTG NO:6 subtipo A1 de P. | SRINSAKDDAAGLQIANRLTSQVNGLNVATKNAND aeruginosa GISLAQTAEGALQQSTNILORMRDLSLASANGSNS
FGTTSFQVGSNAYETIDISLONASASAIGSYQVGSN Flagelina FliC GAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAI SEQ ID subtipo B de P. AAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGV NO:7 . TGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSN aeruginosa SSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTAT
MEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLAL Sistema de LRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAP secreção tipo | PGEQGLEVLREVLOARRQPGAQWDLREFLVSAYFS SEG |!D três (TTSS) LHGRLDEDVIGVYKDVLATADGKRKALLDELKALT . Fator de AELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTL no virulência PerV | YeYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFL de P. SGSPKOSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVS aeruginosa DRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNREFI
QKYDSVLRDILSAI FIaA2 flagelina | MALTVNTNIASLNTORNLNNSSASLNTSLORLSTG No Pp de P. SRINSAKDDAAGLQIANRLTSQVNGLNVATKNAND No? aeruginosa GISLAQTAEGALQQSTNILORMRDLSLASANGSNS
ANLTKNQVLOQAGTAILAQANQLPQSVLSLLR Domínio D2 GSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVG omínio
GGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTV sem o motivo de
FTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDL SEQ ID | ligação a TLR5
ADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFG NO:10 da flagelina FlaB de P AQTGTATAGQVAVKVOQGSDGKFEAAAKNVVAAGT aB de P. . AATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNA aeruginosa
SAAQKSS Domínio D2
NGTYFKADGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVN sem o motivo de
VKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFSDG SEQ ID | ligação a TLR5
DTISYVSKAGKDGSGAITSAVSGVVIADTGSTGVGT NO:11 da flagelina
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[00677] Os técnicos no assunto reconhecerão ou serão capazes de averiguar, utilizando não mais do que experimentação rotineira, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas.
O âmbito da presente invenção não se destina a ser limitado pela Descrição acima, mas sim conforme apresentado nas reivindicações a seguir.
Claims (135)
1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende (i) uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero e um ou mais polissacarídeos antigênicos conjugados ao polímero; e (ii) um ou mais antígenos polipeptídicos complexados não covalentemente com o polímero ou o polissacarídeo antigênico.
2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos polissacarídeos antigênicos são conjugados ao polímero com ou sem um ligante.
3. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos polissacarídeos antigênicos são derivados de bactérias Gram-negativas e/ou bactérias Gram-positivas.
4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos —antigênicos são derivados de polissacarídeos antigênicos de Klebsiella, Pseudomonas, e/ou E. coli.
5. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que um ou mais dentre o potencial de opsonização ou a imunogenicidade de um ou mais dos polissacarídeos antigênicos são aumentados em relação a um nível predeterminado, conforme medido por ELISA e/ou por um ensaio funcional de anticorpos.
6. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que um ou mais dentre o potencial de opsonização ou a imunogenicidade de um ou mais dos polissacarídeos antigênicos são aumentados em relação a uma composição de controle, conforme medido por ELISA e ou por um ensaio funcional de anticorpos.
7. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação ou 6, caracterizada pelo fato de que um ou mais dentre o potencial de opsonização ou a imunogenicidade de um ou mais dos polissacarídeos antigênicos são aumentados pelo menos 1| vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes em relação a um nível predeterminado, conforme medido por ELISA e ou por um ensaio funcional de anticorpos.
8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, caracterizada pelo fato de que o nível predeterminado é um nível pré-imune.
9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, caracterizada pelo fato de que a valência dos epítopos de um ou mais dos polissacarídeos antigênicos é pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes acima daquela do polissacarídeo nativo.
10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos antígenos polipeptídicos são proteínas de transporte de um ou mais polissacarídeos antigênicos.
11. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que, quando da administração a um indivíduo, a composição imunogênica induz a produção de anticorpos contra um ou mais patógenos no indivíduo em nível maior do que uma composição compreendendo um polissacarídeo antigênico e não compreendendo a estrutura principal polimérica, conforme medido por ELISA.
12. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que, quando da administração a um indivíduo, a composição imunogênica induz a produção de anticorpos contra um ou mais patógenos no indivíduo em nível maior do que uma composição compreendendo um antígeno polipeptídico e não compreendendo a estrutura principal polimérica, conforme medido por ELISA.
13. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 11 ou 12 caracterizada pelo fato de que um ou mais dos patógenos são selecionados dentre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli.
14. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que, quando da administração a um indivíduo, a composição imunogênica provoca uma resposta imune contra um ou mais dentre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli.
15. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos antígenos polipeptídicos compreendem um polipeptídeo bacteriano, um polipeptídeo fúngico e/ou um polipeptídeo viral.
16. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos antígenos polipeptídicos compreendem um polipeptídeo derivado de um polipeptídeo de Klebsiella, Pseudomonas e/ou E. coli.
17. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4-16, caracterizada pelo fato de que o polímero é um polissacarídeo, um polipeptídeo ou um dendrímero sintético.
18. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4-17, caracterizada pelo fato de que o polímero tem entre cerca de 50 kDa e 2000 kDa de tamanho.
19. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4-18, caracterizada pelo fato de que o polímero é a polissacarídeo capsular derivado de bactérias Gram-negativas ou Gram-positivas.
20. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo — capsular de Klebsiellar exopolissacarídeo de Pseudomonas e/ou polissacarídeo capsular de Escherichia.
21. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o polímero é um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp.
22. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o polímero é uma poli-L-lisina linear ou um dendrímero de L-lisina.
23. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o polímero é um dendrímero de um monossacarídeo ou oligossacarídeo sintético.
24. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos antígenos polipeptídicos são complexados não covalentemente com o polímero ou um ou mais polissacarídeos antigênicos pela formação de pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreendendo (i) uma primeira molécula de afinidade associada com o polímero ou um ou mais polissacarídeos antigênicos; e (ii) uma molécula de afinidade complementar associada com um ou mais antígenos polipeptídicos.
25. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o par de moléculas de afinidades complementares é selecionado a partir do grupo que consiste em: biotina/protena — de ligação à biotihnaq anticorpo/antígeno, enzima/substrato, receptor/ligante, metal/proteína de ligação ao metal, carboidrato/proteína de ligação ao carboidrato, lipídio/proteína de ligação ao lipídio e etiqueta His/proteína de ligação à etiqueta His.
26. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a primeira molécula de afinidade é biotina ou um derivado da mesma.
27. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação ou 26, caracterizada pelo fato de que a molécula de afinidade complementar é uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina.
28. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação à biotina é rizavidina, avidina, estreptavidina, bradavidina, tamavidina, lentiavidina, zebavidina, NeutrAvidin, CaptAvidin't" ou uma combinação das mesmas.
29. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-28, caracterizada pelo fato de que a primeira molécula de afinidade é reticulada ou ligada covalentemente ao polímero ou a um ou mais dos polissacarídeos antigênicos.
30. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a primeira molécula de afinidade é reticulada ou ligada covalentemente ao polímero da estrutura principal polimérica.
31. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a primeira molécula de afinidade é reticulada ou ligada covalentemente a um ou mais dos polissacarídeos antigênicos.
32. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a primeira molécula de afinidade é reticulada ou ligada covalentemente ao polímero da estrutura principal polimérica e a um ou mais dos polissacarídeos antigênicos.
33. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o polímero é poli-L-lisina.
34. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos polissacarídeos antigênicos compreendem um polissacarídeo de um ou mais dentre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli.
35. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
34, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos polissacarídeos antigênicos compreendem um OPS do tipo O1, O2, O3, O5 de K. pneumoniae, ou uma combinação dos mesmos.
36. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos polissacarídeos antigênicos compreendem um OPS do tipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, 010, 011, 012 de P. aeruginosa, ou uma combinação dos mesmos.
37. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos polissacarídeos antigênicos é o exopolissacarídeo PsL de P. aeruginosa.
38. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o PsL compreende pelo menos um epítopo que se liga a um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:4 e/ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:5.
39. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que pelo menos um antígeno polipeptídico compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:1 (proteína da fímbria Tipo | de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico da mesma.
40. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que pelo menos um antígeno polipeptídico compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 (proteína MFrkA conservada da fímbria Tipo Ill de K. pneumoniae) e/ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:3 ou um fragmento imunogênico da mesma.
41. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que pelo menos um antígeno polipeptídico é uma flagelina FIIC subtipo A de P. aeruginosa, uma flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa ou um fragmento imunogênico das mesmas.
42. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que pelo menos um antígeno polipeptídico compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:6 (Flagelina FIIC subtipo Alde P. aeruginosa), uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:9 (Flagelina FIIC subtipo A2 de P. aeruginosa), uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:7 (Flagelina FIIC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico das mesmas.
43. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que pelo menos um antígeno polipeptídico compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
44. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma estrutura principal polimérica incluindo: (i) um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp.; e (ii) um ou mais polissacarídeos antigênicos compreendendo um polissacarídeo de Klebsiela ou Pseudomonas conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp.; e (b) um ou mais antígenos polipeptídicos complexados não covalentemente com o polímero pela formação de pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreendendo: (i) uma primeira molécula de afinidade associada com o polímero; e (ii) uma molécula de afinidade complementar associada com um ou mais dos antígenos polipeptídicos.
45. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos polissacarídeos antigênicos compreendem um OPS do tipo O1, O2, O3, O5 de K. pneumoniae, ou uma combinação dos mesmos.
46. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 44 ou reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos polissacarídeos antigênicos compreendem um OPS do tipo 01, 02, O3, O4, O5, O6, 010, 011 de P. aeruginosa, ou uma combinação dos mesmos.
47. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 44-46, caracterizada pelo fato de que a primeira molécula de afinidade é biotina ou um derivado da mesma e a molécula de afinidade complementar é uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina.
48. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
47, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação à biotina é rizavidina ou seu domínio de ligação à biotina.
49. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 44-48, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos antígenos polipeptídicos são selecionados dentre domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da Flagelina FIiC subtipo B de P. aeruginosa, PcrV de P. aeruginosa, MrkA de K. pneumoniae, fragmentos antigênicos destes ou uma combinação dos mesmos.
50. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 44-49, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão compreendendo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FlaB) ou um fragmento imunogênico do mesmo e (iii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 (MrkA de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
51. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 44-50, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:24 (Ravi- FlaB-Domínio2-MrkA-His).
52. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 44-51, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão compreendendo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIiC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo e (iii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PerV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico do mesmo.
53. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 44-52, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:26 (Ravi- FlaB-Domínio2-PcrV-His).
54. Composição vacinal, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma primeira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica,y incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada; (b) uma segunda composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica, incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada; (c) uma terceira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada; e (d) uma quarta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp., e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada.
55. Composição vacinal, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma primeira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica, incluindo um polímero compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada; (b) uma segunda composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp., e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada; (c) uma terceira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada; e (d) uma quarta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada.
56. Composição vacinal, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma primeira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada; (b) uma segunda composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada;
(c) uma terceira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada;
(d) uma quarta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada;
(e) uma quinta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada;
(f) uma sexta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaAbBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal poliméricaa biotinilada;
(9) uma sétima composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 Dbiotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O10 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada; e (h) uma oitava composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 Dbiotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O11 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada.
57. Composição vacinal, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma primeira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada; (b) uma segunda composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp., e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente a estrutura principal — polimérica biotinilada; (c) uma terceira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 Dbiotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada;
(d) uma quarta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 Dbiotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada;
(e) uma quinta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada;
(f) uma sexta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp. um OPS PA O6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaAbBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada;
(g9) uma sétima composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA 010 conjugado ao polissacarídeo capsular
K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal — polimérica biotinilada; e (h) uma oitava composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O11 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal — polimérica biotinilada.
58. Composição vacinal, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma primeira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada; (b) uma segunda composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexados não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada; (c) uma terceira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular
K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente ao estrutura principal polimérica biotinilada;
(d) uma quarta composição imunogênica compreendendo um estrutura principal! polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal — polimérica biotinilada;
(e) uma quinta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada;
(f) uma sexta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada;
(g9) uma sétima composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada;
(h) uma oitava composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal — polimérica biotinilada;
(1) uma nona composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada;
(])) uma décima composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada;
(k) uma décima primeira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA 010 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2- MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada; e
() uma décima segunda composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp, um OPS PA O11 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2- MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada.
59. Composição vacinal, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma primeira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 Dbiotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada; (b) uma segunda composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada; (c) uma terceira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS KP O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada; (d) uma quarta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de
Klebsiella spp., um OPS KP O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente a estrutura principal — polimérica biotinilada;
(e) uma quinta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O1 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente a estrutura principal — polimérica biotinilada;
(f) uma sexta composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O2 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteina de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada;
(9) uma sétima composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O3 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PecrV complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada;
(h) uma oitava composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 Dbiotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O4 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PerV complexada não covalentemente a estrutura principal —polimérica biotinilada; (i) uma nona composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O5 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlabBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada; (])) uma décima composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp., um OPS PA O6 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2-MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal — polimérica biotinilada; (k) uma décima primeira composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal —polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp, um OPS PA O10 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2- MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada; e () uma décima segunda composição imunogênica compreendendo uma estrutura principal —polimérica incluindo um polímero, compreendendo um polissacarídeo capsular K19 biotinilado de Klebsiella spp, um OPS PA O11 conjugado ao polissacarídeo capsular K19 de Klebsiella spp. e uma proteína de fusão Ravi-FlaBD2- MrkA complexada não covalentemente a estrutura principal polimérica biotinilada.
60. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-59, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão
Ravi-FlaBD2-MrkA compreende um polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:24 (Ravi-FlaB-Domínio2-MrkA-His).
61. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 55, 57, 59-60, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão Ravi-FlaBD2-PcrV compreende um polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:26 (Ravi-FlaB-Domínio2-PcrV-His).
62. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-61, caracterizada pelo fato de que o OPS de cada composição imunogênica está presente em uma razão m/m de aproximadamente 1:1.
63. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-61, caracterizada pelo fato de que o estrutura principal polimérica de cada composição imunogênica está presente em uma razão m/m de aproximadamente 1:1.
64. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-61, caracterizada pelo fato de que o OPS e o CPS combinados de cada composição imunogênica estão presentes em uma razão m/m de aproximadamente 1:1.
65. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-64, caracterizada pelo fato de que o OPS de cada composição imunogênica está presente com aproximadamente 1 ug.
66. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-64, caracterizada pelo fato de que a estrutura principal polimérica de cada composição imunogênica está presente com aproximadamente 1 ug.
67. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-64, caracterizada pelo fato de que o OPS e o CPS combinados de cada composição imunogênica estão presente com aproximadamente 1 ug.
68. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-64, caracterizada pelo fato de que o OPS de cada composição imunogênica está presente com aproximadamente 5 ug.
69. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-64, caracterizada pelo fato de que a estrutura principal polimérica de cada composição imunogênica está presente com aproximadamente 5 ug.
70. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-64, caracterizada pelo fato de que o OPS e o CPS combinados de cada composição imunogênica estão presente com aproximadamente 5 uno.
71. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-70, caracterizada pelo fato de que a estrutura principal polimérica é uma estrutura principal BP-1.
72. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-70, caracterizada pelo fato de que a estrutura principal polimérica é uma estrutura principal BP-1.2.
73. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que, quando da administração a um indivíduo, a composição imunogênica provoca uma resposta imune contra bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas.
74. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que a resposta imune é uma resposta de anticorpos ou de células B.
75. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com a reivindicação 74, caracterizada pelo fato de que a resposta imune é uma resposta de células T CD4+, incluindo resposta de Th1, Th2 ou Th17, ou uma resposta de células T CD8+ ou resposta de células T CD4+/CD8+.
76. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com a reivindicação 75, caracterizada pelo fato de que a resposta imune é: uma resposta de anticorpos ou de células B; e uma resposta de células T.
77. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 70-76, caracterizada pelo fato de que as bactérias Gram-negativas são selecionadas dentre Klebsiella, Pseudomonas, E. coli e uma combinação das mesmas.
78. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-77, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos antígenos polipeptídicos compreendem uma ou mais proteínas de P. aeruginosa ou variantes, e em que a molécula de afinidade complementar compreende uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina.
79. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-78, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos antígenos polipeptídicos compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:7 (Flagelina FlaB de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico da mesma.
80. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-79, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos antígenos polipeptídicos compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de
SEQ ID NO:6 (Flagelina FIaA1 de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico da mesma.
81. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-80, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão incluindo uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:9 (Flagelina FIaA2) ou um fragmento imunogênico da mesma.
82. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-81, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão incluindo uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FlaB) ou um fragmento imunogênico da mesma ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:11 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIaA1) ou um fragmento imunogênico da mesma ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:12 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FlaA2) ou um fragmento imunogênico das mesmas.
83. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-82, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão incluindo uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FlaB) ou um fragmento imunogênico da mesma.
84. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-83, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão incluindo uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:11 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIaA1) ou um fragmento imunogênico da mesma.
85. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-84, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão incluindo uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:12 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIaA2) ou um fragmento imunogênico da mesma.
86. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-85, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão incluindo proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotihna e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV do sistema de secreção tipo Ill (TTSS) de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico da mesma.
87. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-86, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão incluindo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:7 (Flagelina FIiC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico da mesma e (iii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico da mesma.
88. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-87, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão incluindo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIiC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico da mesma, e (iii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico da mesma.
89. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-88, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão incluindo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:7 (Flagelina FIiC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico da mesma, e (iii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 (MrkA de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico da mesma.
90. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-89, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão incluindo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:10 (domínio D2 sem o motivo de ligação a TLR5 da flagelina FIiC subtipo B de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico da mesma, e (iii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 (MrkA de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico da mesma.
91. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-90, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de moléculas de afinidades complementares compreende uma proteína de fusão incluindo (i) uma proteína de ligação à biotina ou seu domínio de ligação à biotina, (ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:8 (PcrV de P. aeruginosa) ou um fragmento imunogênico da mesma, e (ili) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 (MrkA de K. pneumoniae) ou um fragmento imunogênico da mesma.
92. Composição imunogênica ou composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 83-91, caracterizada pelo fato de que, quando da administração a um indivíduo, a composição dá origem a anticorpos que reconhecem MrkA nativa em K. pneumoniae que expressam MrkA.
93. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais das composições imunogênicas ou composições vacinais como definidas nas reivindicações 1-92 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
94. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 93, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais adjuvantes.
95. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação
94, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado a partir do grupo de fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, hidróxido de alumínio fosfatado, agonistas de TLRs, como a saponina de TLR2 (QS21) ou porinas, e agonistas de TLR4 como, por exemplo, lipídio À monofosforilado (MPL), e TLR5 como flagelinas, etc.
96. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 93-95, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada para injeção.
97. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 93-96, caracterizada pelo fato de que, quando da administração a um indivíduo, a composição farmacêutica provoca uma resposta de células Th1 e/ou Th17.
98. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 93-97, caracterizada pelo fato de que, quando da administração a um indivíduo, a composição farmacêutica provoca uma resposta opsônica/bactericida contra um ou mais dentre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli.
99. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 93-98, caracterizada pelo fato de que, quando da administração a um indivíduo, a composição farmacêutica reduz a taxa de transmissão e/ou de colonização das superfícies das mucosas por um ou mais dentre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli.
100. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 93-99, caracterizada pelo fato de que, quando da administração a um indivíduo, a composição farmacêutica reduz a taxa de transmissão e/ou de colonização do trato GI por um ou mais dentre Klebsiella, Pseudomonas e E. coli.
101. Método de imunização de um indivíduo contra infecção por Klebsiella, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição imunogênica ou composição vacinal como definida em qualquer uma das reivindicações 1-92.
102. Método de imunização de um indivíduo contra infecção por Klebsiella, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 93-100.
103. Método de imunização de um indivíduo contra infecção por P. aeruginosa, caracterizado pelo fato de que compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição imunogênica ou composição vacinal como definida em qualquer uma das reivindicações 1-92.
104. Método de imunização de um indivíduo contra infecção por P. aeruginosa, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 93-
100.
105. Método de imunização de um indivíduo contra infecção por E. coli, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição imunogênica ou composição vacinal como definida em qualquer uma das reivindicações 1-92.
106. Método de imunização de um indivíduo contra infecção por E. coli, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 93-100.
107. Composição de anticorpos, caracterizada pelo fato de que compreende anticorpos desenvolvidos em um mamífero imunizado com uma composição imunogênica ou composição vacinal como definida em qualquer uma das reivindicações 1-92.
108. Composição de anticorpos de acordo com a reivindicação 107, caracterizada pelo fato de que a composição de anticorpos compreende pelo menos um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos monoclionais e anticorpos anti- idiotípicos.
109. Composição de anticorpos de acordo com a reivindicação 107 ou reivindicação 108, caracterizada pelo fato de que a composição de anticorpos compreende uma fração de globulina gama isolada.
110. Método para purificação de um polissacarídeo de antígeno-O de um ou mais componentes celulares de Klebsiella, caracterizado pelo fato de que os componentes celulares incluem proteína e/ou ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de: colocar um ou mais componentes celulares em contato com um reagente oxidante para obter uma mistura, em que o pH da mistura é entre aproximadamente 3 e 5; separar o polissacarídeo de antígeno-O dos componentes celulares; e recuperar o OPS, em que o OPS é substancialmente livre dos outros componentes celulares e contém um aldeído livre em sua extremidade terminal redutora.
111. Método de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pelo fato de que o reagente oxidante é nitrito de sódio, o ácido é ácido acético e em que a extremidade terminal redutora do OPS é um resíduo de 2,5-anidromanose contendo um aldeído livre.
112. Método para purificação de um polissacarídeo de antígeno-O de um ou mais componentes celulares de bactérias Gram- negativas, em que os componentes celulares incluem proteína e/ou ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que o método compreende: colocar um ou mais componentes celulares em contato com um reagente ácido para obter uma mistura, em que o pH da mistura é entre aproximadamente 3 e 5, aquecer a mistura até entre cerca de 80 ºC e 100 ºC; separar o polissacarídeo de antígeno-O dos componentes celulares; e recuperar o OPS, em que o OPS é substancialmente livre dos outros componentes celulares e contém uma cetona em sua extremidade terminal redutora.
113. Método de produção de uma estrutura principal polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno- O não biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno-O compreende um grupo amino primário e pelo menos um polissacarídeo biotinilado, caracterizado pelo fato de que o método compreende: ligar quimicamente o grupo amino primário do polissacarídeo de antígeno-O, misturando o polissacarídeo de antígeno-O com um polissacarídeo parcialmente oxidado contendo grupos aldeído e uma amina primária contendo biotina para obter uma mistura; e submeter a mistura à aminação redutiva com um agente redutor para produzir uma estrutura principal —polimérica BP-1, em que o polissacarídeo é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno-O ligado quimicamente não é biotinilado.
114. Método de produção de uma estrutura principal polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno- O não biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno-O compreende um grupo amino primário e pelo menos um polissacarídeo biotinilado, caracterizado pelo fato de que o método compreende: ligar quimicamente o grupo amino primário do polissacarídeo de antígeno-O, misturando o polissacarídeo de antígeno-O com um polissacarídeo biotinilado e oxidado, obtido tratando primeiramente os grupos — carboxilados do polissacarídmo — com 1-Etil-3-(3-
dimetilaminopropil)-carbodiimida N-hidroxissuccinimida (EDC) e N- Hidroxissuccinimida (NHS) e uma hidrazida de biotina, a seguir, tratando o polissacarídeo com um agente oxidante; e submeter a mistura à aminação redutiva com um agente redutor para produzir a estrutura principal polimérica BP-1.2, em que o polissacarídeo é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno-O ligado quimicamente não é biotinilado.
115. Método de produção de uma estrutura principal polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno- O não biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno-O compreende um grupo amino primário e pelo menos um polissacarídeo biotinilado, caracterizado pelo fato de que o método compreende: ligar quimicamente o grupo amino primário do polissacarídeo de antígeno-O, misturando o polissacarídeo de antígeno-O com um polissacarídeo —biotinilado e CDAP ativado, obtido tratando primeiramente os grupos carboxilados do polissacarídeo com 1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida N-hidroxissuccinimida (EDC) e N- Hidroxissuccinimida (NHS) e uma hidrazida de biotina, a seguir, tratando o polissacarídeo com CDAP para produzir a estrutura principal polimérica BP-1.3, em que o polissacarídeo é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno-O ligado quimicamente não é biotinilado.
116. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 113-115, caracterizado pelo fato de que o grupo primário no polissacarídeo de antígeno-O é o grupo a-amino de L-Alanina do OPS do outer core de P. aeruginosa ou um grupo amino que foi introduzido na extremidade redutora do polissacarídeo de antígeno-O, ligando quimicamente uma molécula espaçadora curta contendo um grupo primário em cada extremidade por aminação redutiva com um agente redutor.
117. Método de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que o agente oxidante para a oxidação do polissacarídeo é periodato de sódio, o espaçador curto contendo diamina é di-hidrazida adípica e o agente redutivo da aminação redutiva é cianoborohidreto de sódio.
118. Método de produção de uma estrutura principal polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno- O biotinilado e pelo menos um polissacarídeo biotinilado, caracterizado pelo fato de que o método compreende: ligar quimicamente o polissacarídeo de antígeno-O contendo uma amina primária em seu core, obtido quer por ligação de um espaçador curto, contendo uma amina primária em cada extremidade, a um polissacarídeo de antígeno-O por aminação redutiva para obter um polissacarídeo de antígeno-O-molécula espaçadora, que utilizando OPS, sem derivação, contendo um grupo a-amino de L-alanina, misturar o polissacarídeo de antígeno-O contendo a amina primária com um polissacarídeo parcialmente oxidado para obter uma mistura; submeter a mistura à aminação redutiva para formar uma estrutura principal de OPS; e derivar OPS com CDAP e uma amina primária contendo biotina, formando, assim, uma estrutura principal polimérica, em que o polissacarídeo e o polissacarídeo de antígeno-O ligado quimicamente são biotinilados.
119. Método de produção de uma estrutura principal polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno- O biotinilado e pelo menos um polissacarídeo não biotinilado, caracterizado pelo fato de que o método compreende: biotinilar um polissacarídeo de antígeno-O, compreendendo um ou mais KDOs do core e/ou porções de heptose, com CDAP e uma amina primária contendo biotina para obter uma mistura de OPS biotinilado; oxidar parcialmente a mistura de OPS biotinilado com periodato de sódio para introduzir aldeídos nos KDOs do core e/ou porções de heptose; submeter a mistura de biotinilação à aminação redutiva di- hidrazida de ácido adípico; misturar o OPS biotinilado e aminado com um polissacarídeo parcialmente oxidado para formar uma mistura; e submeter a mistura à aminação redutiva; formando, assim, uma estrutura principal polimérica, em que o polissacarídeo não é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno-O ligado quimicamente é biotinilado.
120. Método de produção de uma estrutura principal polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno- O biotinilado e um polímero de PLL, caracterizado pelo fato de que o método compreende: submeter um polissacarídeo de antígeno-O contendo aldeídos terminais ou alfa KDOs à aminação redutiva com os grupos e- NH2 de um polímero de PLL para produzir um polímero de OPS-PLL; derivar o OPS com CDAP para formar uma mistura do derivado; reagir a mistura do derivado com uma amina primária contendo biotina; e tratar a mistura ou não com um reagente de acilação para capeamento dos grupos e-NH2 não reagidos do polímero de PLL; produzindo, assim, uma estrutura principal polimérica, em que a estrutura principal de PLL N-acetilado capeado ou de PLL sem capeamento não é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno-O ligado quimicamente é biotinilado.
121. Método de acordo com a reivindicação 120,
caracterizado pelo fato de que o agente de acilação é anidrido acético ou cloreto de acetila.
122. Método de acordo com a reivindicação 120 ou reivindicação 121, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é cianoborohidreto de sódio.
123. Método de produção de um estrutura principal polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno- O não biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno-O compreende um grupo azido em sua extremidade terminal redutora, e pelo menos um polissacarídeo biotinilado contendo grupos alcinos, caracterizado pelo fato de que o método compreende: ligar o polissacarídeo de antígeno-O, contendo grupos azido nas suas extremidades redutoras, por química click e na presença de um catalisador, com polissacarídeo biotinilado contendo alcinos, formando, assim, uma estrutura principal polimérica de OPS, em que o polissacarídeo é biotinilado, mas o polissacarídeo de antígeno-O ligado por química click não é biotinilado.
124. Método de produção de uma estrutura principal polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno- O não biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno-O compreende um grupo aldeído ou cetona em sua extremidade terminal redutora, e pelo menos um polissacarídeo biotinilado contendo grupos amino primários por ligações de química click, na presença de um catalisador, o polissacarídeo biotinilado contendo grupos alcinos com um composto de MW pequena contendo um grupo azido em uma extremidade e um amino livre na outra, caracterizado pelo fato de que o método compreende: ligar quimicamente o polissacarídeo de antígeno-O contendo grupos aldeído ou cetona, misturando o polissacarídeo de antígeno-O com um polissacarídeo biotinilado contendo grupos amino primários e submetendo a mistura à aminação redutiva com um agente redutor, formando, assim, uma estrutura principal polimérica, em que o polissacarídeo é biotinilado, mas o polissacarídeo de antígeno-O ligado quimicamente não é biotinilado.
125. Método de produção de uma estrutura principal polimérica compreendendo pelo menos um polissacarídeo de antígeno- O biotinilado, em que o polissacarídeo de antígeno-O biotinilado compreende um grupo azida em sua extremidade terminal redutora, e pelo menos um polissacarídeo não biotinilado contendo alcinos, caracterizado pelo fato de que o método compreende: ligar o polissacarídeo de antígeno-O biotinilado, contendo grupos azido nas suas extremidades redutoras, por química click e na presença de um catalisador, com um polissacarídeo não biotinilado contendo alcinos, formando, assim, um estrutura principal polimérica , em que o polissacarídeo não é biotinilado e o polissacarídeo de antígeno-O ligado por química click é biotinilado.
126. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 123-125, caracterizado pelo fato de que o catalisador para ligar por química click o polissacarídeo de antígeno-O e o polissacarídeo via a cicloadição de alcino-azida é sulfato de cobre.
127. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 123-126, caracterizado pelo fato de que o grupo alcino para obter o derivado do polissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em 1-Amino-3-butino, 1-Amino-4-pentino, DBCO-amina e Alcino-PEG4-Amina.
128. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 123-127, caracterizado pelo fato de que o grupo azida para obter o derivado do polissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em Azido-PEG3-Amina, Azido-Propilamina e Azido-
Butilamina.
129. Estrutura principal polimérica, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 113-128.
130. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação à biotina e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência definida em qualquer uma dentre SEQ ID NOs:16 a
26.
131. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação à biotina e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência definida em qualquer uma dentre SEQ ID NOs:1-3 ou 6-26.
132. Método de produção de um MAPS variante, caracterizado pelo fato de que compreende a complexação de pelo menos uma estrutura principal polimérica definida na reivindicação 128 com pelo menos uma das proteínas de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 129-130.
133. Método de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pelo fato de que o MAPS variante é BP-1 MAPS, BP-1.2 MAPS, BP-2a MAPS, BP-2b MAPS ou BP-3 MAPS.
134. Método de avaliação da imunogenicidade e/ou da potência da composição imunogênica ou composição vacinal como definida em qualquer uma das reivindicações 1-92, caracterizado pelo fato de que a resposta imune é avaliada utilizando um ou mais de uma bateria de bioensaios in vitro, incluindo respostas de células B e células T como níveis de anticorpos por ELISA, níveis de anticorpos funcionais por FC, OPK e outros testes funcionais como aglutinação, motilidade, citotoxicidade, células Th1/Th17 e níveis de citocinas, e ensaios in vivo em modelos animais de doença nosocomial (pneumonia, sepse, feridas por queimadura, infecções Gl e no sítio cirúrgico), tais como eliminação de bactérias, proteção passiva e ativa após desafio com os patógenos nosocomiais que são os alvos da composição imunogênica.
135. Método de avaliação da imunogenicidade e/ou potência da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 93-100, caracterizado pelo fato de que a resposta imune é avaliada realizando um ou mais de uma bateria de bioensaios in vitro, incluindo respostas de células B e células T, como níveis de anticorpos por ELISA, níveis de anticorpos funcionais por FC, OPK e outros testes funcionais como aglutinação, motilidade, citotoxicidade, células Th1/ Th17 e níveis de citocinas, e ensaios in vivo em modelos animais de doença nosocomial (pneumonia, sepse, feridas por queimadura, infecções GI e no sítio cirúrgico), tais como eliminação de bactérias, proteção passiva e ativa após desafio com os patógenos nosocomiais que são os alvos da composição imunogênica.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] |
Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI N? 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI N? 9279/96, A CONCESS?O DA PATENTE EST? CONDICIONADA ? ANU?NCIA PR?VIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVA??O DOS TERMOS DO PARECER N? 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL N? 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVID?NCIAS CAB?VEIS. |
|
| B07G | Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette] |
Free format text: NOTIFICACAO DE DEVOLUCAO DO PEDIDO EM FUNCAO DA REVOGACAO DO ART. 229-C DA LEI NO 9.279, DE 1996, POR FORCA DA LEI NO 14.195, DE 2021 |
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