CN111040961A - 一株降解高效氯氰菊酯的暹罗芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株高效氯氰菊酯的降解菌——暹罗芽孢杆菌L5(Bacillus siamensis)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2019年11月1日，保藏号为CCTCC M 2019885。本发明菌种对高浓度的高效氯氰菊酯具有一定的降解能力，在纯培养条件下对50mg/L的高效氯氰菊酯的降解率达89.1％。将该菌的发酵液与纳米腐殖酸土壤调理剂混合制备的降解剂能提高对高效氯氰菊酯的降解率，纳米腐殖质表面粗糙，结构较为疏松，孔隙结构发达，这样的结构为菌株L5的固着提供了有力的条件。该菌剂的制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株降解高效氯氰菊酯的暹罗芽孢杆菌及其应用。
背景技术
拟除虫菊酯类农药具有胃毒和触杀作用，虽然对作物安全，但是它们对人、畜有中等毒性，对水生生物、蜜蜂、家蚕高毒。高效氯氰菊酯是最常用的拟除虫菊酯类农药之一，在我国已有五十多年施用历史，占我国拟除虫菊酯农药总市场的一半以上。研究表明，高效氯氰菊酯对非靶标生物的内分泌有干扰作用。美国环境保护署(EPA)将高效氯氰菊酯列为潜在的致癌物质之一。
目前降解农药残留国际上较为普遍采用生物降解，利用微生物降解环境污染物具有操作简单、高效低成本、无二次污染等优点，被认为是环境污染物治理最有效、最可行和最可靠的方法。然而自然界中有上亿种微生物，目前报道的农药降解微生物种类较少，还有很大的筛选空间；已报道农药降解微生物解效率低且不稳定。因此，寻找一种提高高效氯氰菊酯降解率的微生物是亟待解决的办法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一株降解高效氯氰菊酯的暹罗芽孢杆菌及其应用。
本发明采取的技术方案为：一株降解高效氯氰菊酯的暹罗芽孢杆菌，本发明的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2019885，保藏日期为2019年11月1日。
一株高效氯氰菊酯的降解菌——暹罗芽孢杆菌，其保藏编号为：CCTCC M2019885，将其命名为：L5。
本发明还提供了暹罗芽孢杆菌L5在降解高效氯氰菊酯中的应用。
具体的，所述应用为将活化后的暹罗芽孢杆菌L5菌种接种至含高效氯氰菊酯的基础盐培养基中，30～33℃、pH 8.0～8.1条件下，振荡培养，菌液离心取菌体直接或悬浮于缓冲液中制成菌剂投入含高效氯氰菊酯的液体基础盐培养基中，对高效氯氰菊酯进行降解。
优选地，所述温度为33℃，pH值为8.1。
暹罗芽孢杆菌在制备降解高效氯氰菊酯菌剂中的应用。
一种降解高效氯氰菊酯菌剂的制备方法，包括以下步骤：将暹罗芽孢杆菌L5接种于以高效氯氰菊酯作为唯一碳源的基础盐培养基中活化后，接入LB培养基中扩大培养，将获得的发酵菌液与纳米腐殖酸土壤调理剂混合，即得降解高效氯氰菊酯的菌剂。
优选地，所述纳米腐殖酸土壤调理剂在降解高效氯氰菊酯菌剂中的质量浓度为2～6％。
优选地，所述纳米腐殖酸土壤调理剂在降解高效氯氰菊酯菌剂中的质量浓度为4％。
本发明的有益效果：本发明的高效氯氰菊酯降解菌可通过直接投加的方式应用于水体中高效氯氰菊酯的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的高效氯氰菊酯，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。
附图说明
图1菌株L5扫描电镜图。
图2菌株L5生长和降解高效氯氰菊酯的关系曲线图。
图3纳米腐殖酸土壤调理剂(A)和本发明所述菌剂扫描电镜图(B)。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1菌株的筛选与鉴定
培养基的配制
基础盐培养基：(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.01g，FeSO4·7H2O 0.001g，Na2HPO4·12H2O 1.5g，KH2PO4 1.5g，加蒸馏水定容至1L，pH 7.0，高压蒸汽灭菌后备用。
唯一碳源为高效氯氰菊酯的培养基：在上述基础盐培养基中添加高效氯氰菊酯，使其在基础盐培养基中的终浓度为100mg/L。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加蒸馏水定容至1L，pH 7.0，配制固体培养基时加入15g/L琼脂粉，高压蒸汽灭菌后备用。
菌株L5的分离纯化：
在广州从化品康源生态农场，取适量施用纳米腐殖酸土壤调理剂的土壤，接入灭菌水中，培养3天后转入基础盐培养基驯化培养，取其中的混合菌液适量接入到唯一碳源为100mg/L的高效氯氰菊酯的基础盐培养基中，30℃，150rpm摇床内振荡培养，每24h更换培养基并逐步提高高效氯氰菊酯的浓度当其浓度达到500mg/L时，挑取单菌落测定其降解率。筛选到1株能高效降解高效氯氰菊酯农药的菌株，将其命名为L5。在基础盐培养基中共培养7d后，该菌株对50mg/L的高效氯氰菊酯的降解率分别为89.1％。
菌株鉴定：
菌株L5在LB培养基平板上菌落呈微黄色，表面粗糙不透明，有很多隆起和皱褶。在扫描电镜下观察到菌株L5单个排列，长杆状(图1)。菌株L5生理生化测试结果如表1所示。以菌株L5的基因组DNA为模板，利用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增，得到长度为1413bp的扩增产物。经过BLAST比对，菌株L5与暹罗芽孢杆菌KCTC 13613(GenBanK登陆号AJVF01000043)同源性为100％。暹罗芽孢杆菌L5保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC M2019885)。
表1菌株L5部分生理生化特性
注释：“+”表示可以利用或阳性，“-”表示不利用或阴性
实施例2菌株L5降解特性鉴定
方法：挑取菌株L5单菌落入LB液体培养基中预培养12h，所得菌液于4000r/min离心2min后，弃去上清液，菌体用50mL 0.9％的灭菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液。降解测定时，取上述菌液2mL接种到装有50mL灭菌基础盐培养基的250mL三角瓶中，并添加高效氯氰菊酯母液，使其最终质量浓度为50mg/L，于在30℃、pH 8.0条件下，150r/min振荡培养7d，每天取样，用气相色谱法测定高效氯氰菊酯农药残留量，绘制农药降解曲线和菌体生长曲线。菌体生长以600nm下的吸光值OD600表征。以不接菌为对照，每个处理设3个重复。
结果：如图2所示，菌株L5能快速降解高效氯氰菊酯，可以利用其作为生长物质，且高效氯氰菊酯的降解与菌株生长呈正相关。在含有高效氯氰菊酯的基础盐培养液中，菌株L5生长没有明显的停滞期，且迅速进入对数生长期，1-3d为菌株的对数生长期，期间菌株L5对高效氯氰菊酯的降解速率最快，高效氯氰菊酯可能作为碳源参与降解菌L5的代谢过程，能转化为其生长代谢所需的营养能量物质，从而被菌株利用；第4d时菌株L5生长达到稳定期时，高效氯氰菊酯的降解曲线也趋于平缓；培养5d后，菌株进入衰亡期，到第7d时，高效氯氰菊酯降解率达到89.1％，而在不接菌的对照组中，高效氯氰菊酯7d的降解率不足10％。
实施例3菌株L5降解高效氯氰菊酯条件的优化
采用响应曲面分析法，以关键影响因子温度(X1)、pH(X2)和接种量(X3)为自变量，以高效氯氰菊酯降解率Y1为响应值，通过Box-Behnken设计，得到菌株L5降解条件的优化设计及其相应的降解率(表2)。
表2响应曲面法Box-Behnken设计及降解率
利用Minitab的响应面回归程序对数据进行多项式回归分析，拟合得到高效氯氰菊酯降解率(Y1)的二次回归方程：
Y1＝90.50+3.437X1+3.288X2+0.325X3-9.950X1 2+4.950X1X2+1.075X1X3-4.450X2 2+0.225X2X3-4.125X3 2
本试验模型决定系数R2为0.9769，表明约98％预测值覆盖了试验响应值，高度的相关性说明所选用的响应面模型适用于菌株L5对高效氯氰菊酯降解的预测，且所选用模型极显著(P＝0.001<0.01)，说明该模型能准确反映因变量和自变量的关系，结果可信度高。
对回归的二次多项模型方程求一阶偏导，可得到菌株L5降解条件的最佳点，X1、X2和X3对应值分别为温度33.0℃、pH 8.1和接种量0.2g/L，此时模型预测菌株L5对高效氯氰菊酯的降解率为92.0％。
实施例4降解菌剂的制备方法
取适量菌株L5接种于含200mg/L高效氯氰菊酯为唯一碳源的液体基础盐培养基，33℃、150rpm震荡培养24h，按体积比10％接种于液体LB培养基中，33℃、150rpm震荡培养24h。将所得的50mL菌液与2g纳米腐殖酸土壤调理剂混合，得到菌剂。本发明中的使用的纳米腐殖酸土壤调理剂主要成分为腐殖质，购自广州品康源农业发展有限公司，货号BSDFZ00301。
本发明的降解菌剂对土壤中高效氯氰菊酯的降解过程如图3所示，随着降解时间的延长，菌剂对高效氯氰菊酯的降解率增大，第42天的降解率达到82.2％，而不加菌剂的空白中降解率不足20％。该降解过程符合一级动力学方程，拟合方程的相关系数R2为0.9479，速率常数为0.035，降解半衰期为19.8天。
将本发明的的降解菌剂与单独添加菌液的降解剂进行比较，检验其降解高效氯氰菊酯的效果，结果如表3所示。
表3降解结果
由表3可以看出，在菌液中添加了纳米腐殖酸土壤调理剂的实验组降解率均高于空白对照组和单独使用菌液进行降解的实验组，这是由于纳米腐殖质表面粗糙，结构较为疏松，孔隙结构发达，这样的结构为菌株L5的固着提供了有力的条件。在添加了纳米腐殖酸土壤调理剂的实验组中，添加2g纳米腐殖酸土壤调理剂的降解率高于其他添加1g和3g的实验组，这可能是由于菌液与纳米腐殖酸土壤调理剂的存在适当的比例，纳米腐殖酸土壤调理剂含量过少菌体没有足够的附着物，纳米腐殖酸土壤调理剂含量过多造成菌体的生长空间减少，因此，降低了菌体的降解效率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一株高效氯氰菊酯的降解菌，其特征在于，所述降解菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)，其保藏编号为：CCTCC M 2019885，将其命名为：L5。
2.如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌L5在降解高效氯氰菊酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，具体为：将活化后的暹罗芽孢杆菌L5菌种接种至含高效氯氰菊酯的基础盐培养基中，30～33℃、pH 8.0～8.1条件下，振荡培养，菌液离心取菌体直接或悬浮于缓冲液中制成菌剂投入含高效氯氰菊酯的液体基础盐培养基中，对高效氯氰菊酯进行降解。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述温度为33℃，pH值为8.1。
5.如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌L5在制备降解高效氯氰菊酯菌剂中的应用。
6.一种降解高效氯氰菊酯菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将暹罗芽孢杆菌L5接种于以高效氯氰菊酯作为唯一碳源的基础盐培养基中活化后，接入LB培养基中扩大培养，将获得的发酵菌液与纳米腐殖酸土壤调理剂混合，即得降解高效氯氰菊酯的菌剂。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述纳米腐殖酸土壤调理剂在降解高效氯氰菊酯菌剂中的质量浓度为2～6％。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述纳米腐殖酸土壤调理剂在降解高效氯氰菊酯菌剂中的质量浓度为4％。
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