CN111039981A - 一种化合物、及其盐或溶剂合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种化合物、及其盐或溶剂合物及其应用。本发明一方面提供一种化合物、及其盐或溶剂合物，所述化合物的化学结构式如式I所示：
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种化合物、及其盐或溶剂合物及其应用。
背景技术
质谱交联技术(XL-MS)是近些年发展起来的新技术，它是通过化学交联的方法，将蛋白质中距离接近、存在相互作用的位点进行共价连接，然后结合质谱技术进行交联肽段分析，以便全面了解生物体内目标功能体系的蛋白结构与相互作用信息。由于蛋白交联处理后，存在大量的未交联肽段等的干扰，如何从大量的肽段数据中有效提取并解读交联肽段的信息，一直是科学家们努力克服的挑战。新的交联剂和有效的数据分析、处理方法可以使XL-MS更好的应用。
亲和标签的引入可以有效的纯化与交联剂反应后的肽段；质谱条件下可解离的交联剂也可以很大的提高数据处理的效率；另外，数据的分析处理方法也会极大的影响最终的分析结果。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种化合物、及其盐或溶剂合物及其在交联剂上的应用以及在质谱交联技术中的应用。本发明的化合物、及其盐或溶剂合物作为交联剂使用时，以磷酸作为富集标签，具有较高的交联效率，同时，本发明基于条件概率的思路，提出了一种新的解析质谱交联肽段的方法，可以极大的减少数据处理时间并提高数据分析处理的灵敏度。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种化合物、及其盐或溶剂合物，所述化合物的化学结构式如式I所示：
其中，R1选自亚甲基；R2选自亚甲基；n1选自0～2，n2选自0～8，n3选自0～2，n1、n2、n3选自整数。
在本发明的一些实施方式中，所述化合物的盐选自式I化合物的钠盐和/或式I化合物的钾盐。
在本发明的一些实施方式中，所述化合物的溶剂合物选自式I化合物与四氢呋喃和/或二氧六环的混合物。
在本发明的一些实施方式中，所述R2位于磷酸基的间位或对位。
在本发明的一些实施方式中，所述n1选自0～1，n1选自整数。
在本发明的一些实施方式中，n2选自1～5，n2选自整数。
在本发明的一些实施方式中，n3选自0～1，n1选自整数。
本发明另一方面提供本发明所述的化合物、及其盐或溶剂合物的制备方法，所述式I化合物的合成包括如下步骤：
1)将式II化合物与
在碱和溶剂作用下反应合成式III化合物；
所述
中，X选自离去基团，所述离去基团选自卤族元素或三氟甲磺酸酯，n2选自0～8；
2)将步骤1)合成的式III化合物与亚磷酸二苄酯在催化剂、碱和溶剂下合成式IV化合物；
3)将步骤2)合成的式IV化合物水解反应合成式Ⅴ化合物；
4)将步骤3)合成的式Ⅴ化合物与N-羟基丁二酰亚胺缩合反应合成式Ⅵ化合物；
5)将步骤4)合成的式Ⅵ化合物进一步合成式Ⅰ化合物；
所述步骤1)～步骤5)中，R1选自亚甲基；R2选自亚甲基，n1选自0～2；n2选自0～8，n3选自0～2；n1、n2、n3选自整数。
本发明另一方面提供本发明所述的化合物、及其盐或溶剂合物在制备交联剂中的用途。
本发明另一方面提供一种交联剂，包括本发明所述的化合物、及其盐或溶剂合物。
在本发明的一些实施方式中，还包括缓冲溶液。
本发明另一方面提供本发明所述的化合物、及其盐或溶剂合物或本发明所述的交联剂在蛋白质交联中的应用。
本发明另一方面提供一种蛋白质交联和处理的方法，所述方法包括向蛋白质样品中加入本发明所述的化合物、及其盐或溶剂合物或本发明所述的交联剂，在缓冲液中反应后进一步处理得到交联肽段。
本发明另一方面提供一种解析质谱交联肽段的方法，包括本发明所述的蛋白质交联和处理的方法还包括：
1)将所述蛋白质交联和处理的方法提供的交联肽段进行质谱数据处理；
2)基于条件概率，将处理后得到的数据库分成三个亚群：(1)当存在肽段α和β的交联时，同时存在连接有链接子的α和β肽段时P(α-β＝1/αandβ＝1)；(2)当存在肽段α和β的交联时，同时存在连接有链接子的α肽段或同时存在连接有链接子的β肽段时P(α-β＝1/αorβ＝1)；(3)当存在肽段α和β的交联时，未检测到连接有链接子的α和β肽段时P(α-β＝1/αandβ＝0)；
3)所述质谱数据落入(1)和(2)亚群；所述(1)和(2)亚群同时含有type 0肽段。
本发明的有益效果：
本发明提供的化合物、及其盐或溶剂合物作为交联剂使用含有可富集的官能团，具有较高的交联效率；本发明提供的交联剂具有质谱可断裂或者质谱不断裂特征，质谱条件下可解离的交联剂可以很大的提高数据处理的效率；本发明提供的新的解析质谱交联肽段的方法，可以极大的减少数据处理时间并提高数据分析处理的灵敏度，尤其是在复杂的体系中。
附图说明
图1是本发明中的交联剂与蛋白质BSA交联后，代表性交联肽段(LVTDLTKVHK-ALKAWSVAR)质谱图。
图2是本发明中的交联剂与蛋白质交联后，代表性交联肽段(BBTKPESER-LSQKFPK)质谱图。
图3是本发明中涉及的分析数据中设计条件概率的方程式。
图4是本发明中交联剂与蛋白质交联后，数据处理流程。
具体实施方式
下面详细说明本发明的化合物、及其盐或溶剂合物及与应用。
本发明第一方面提供一种化合物、及其盐或溶剂合物，所述化合物的化学结构式如式I所示：
其中，R1选自亚甲基；R2选自亚甲基；n1选自0～2，n2选自0～8，n3选自0～2，n1、n2、n3选自整数。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物中，所述化合物的盐选自式I化合物的钠盐和/或式I化合物的钾盐。所述化合物的溶剂合物选自式I化合物与四氢呋喃和/或二氧六环的混合物。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物中，作为优选的实施方式，所述R2位于磷酸基的间位或对位。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物中，在一些具体的实施例中，n1选自0～1，0，1，或2。其中n1选自整数。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物中，在一些具体的实施例中n2选自1～8，2～7，3～6，4～5，1～5，5～8，1～3，3～4，1～5，6～8，1，2，3，4，5，6，7，或8。其中n2选自整数。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物中，在一些具体的实施例中，n3选自0～1，0，1，或2。其中n3选自整数。
本发明第二方面提供本发明第一方面所述的化合物、及其盐或溶剂合物的制备方法，包括如下步骤：包括如下步骤：
1)将式II化合物与
在碱和溶剂作用下反应合成式III化合物；
所述
中，X选自离去基团，所述离去基团选自卤族元素或三氟甲磺酸酯，n2选自0～8；
2)将步骤1)合成的式III化合物与亚磷酸二苄酯在催化剂、碱和溶剂下合成式IV化合物；
3)将步骤2)合成的式IV化合物水解反应合成式Ⅴ化合物；
4)将步骤3)合成的式Ⅴ化合物与N-羟基丁二酰亚胺缩合反应合成式Ⅵ化合物；
5)将步骤4)合成的式Ⅵ化合物进一步合成式Ⅰ化合物；
所述步骤1)～步骤5)中，R1选自亚甲基；R2选自亚甲基，n1选自0～2；n2选自0～8，n3选自0～2；n1、n2、n3选自整数。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物的制备方法中，在一些具体的实施例中，n1选自0～1，0，1，或2。其中n1选自整数。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物的制备方法中，在一些具体的实施例中，n2选自1～8，2～7，3～6，4～5，1～5，5～8，1～3，3～4，1～5，6～8，1，2，3，4，5，6，7，或8。其中n2选自整数。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物的制备方法中，在一些具体的实施例中，n1选自0～1，0，1，或2。其中n1选自整数。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物的制备方法中，所述步骤1)是将式II化合物与
在催化剂和溶剂作用下反应合成式III化合物。
中，X选自离去基团，离去基团选自卤族元素或三氟甲磺酸(Otf)，优选地，X选自Br。n2选自0～8；在一些具体的实施方式中，n2选自1～8，2～7，3～6，4～5，1～5，5～8，1～3，3～4，1～5，6～8，1，2，3，4，5，6，7，或8；n2选自整数。进一步地，所述
选自5-溴间苯二酚、(4-溴-1,2-亚苯基)二甲醇中的一种。
进一步地，所述式II化合物与
的摩尔比为1:2～1:6，1:3～1:5，1:2～1:3，1:3～1:4，或1:4～1:5；所述式II化合物和碱的摩尔比为1:2～1:6，1:3～1:5，1:2～1:3，1:3～1:4，或1:4～1:5；所述碱选自碳酸钾和/或氢化钠；通常情况下，溶剂的选择没有特殊的要求，在一些优选的实施方式中，所述溶剂选自丙酮和/或四氢呋喃。反应时，通常情况下，反应条件可以根据实际的反应设定，例如如果选择5-溴间苯二酚与溴代乙酸乙酯反应，碱可以选择碳酸钾，并在丙酮溶剂中常温反应，反应时间可以是1～12h，进一步经过滤、蒸干溶剂、柱层析纯化制得。再例如，如果选择(4-溴-1,2-亚苯基)二甲醇与溴代乙酸乙酯反应，催化剂可以选择氢化钠，并在四氢呋喃溶剂中，N2保护，冰浴下反应10～120min。进一步淬灭反应，萃取、干燥、旋转蒸除溶剂、柱层析纯化制得。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物的制备方法中，所述步骤2)是将步骤1)合成的式III化合物与亚磷酸二苄酯在催化剂和溶剂下合成式IV化合物。其中，所述步骤2)中式III化合物与亚磷酸二苄酯的摩尔比为1：1～1：2。所述步骤2)中式III化合物和催化剂的摩尔比为10：1～20：1，10：1～15：1，15：1～20：1。所述步骤2)中催化剂选自三苯基膦钯，所述碱选自碳酸铯。所述步骤2)中溶剂没有特殊限定，在一些具体的实施例中，所述溶剂选自四氢呋喃。通常情况下，所述步骤2)中的反应在微波100～200℃下，反应5～120min。一般情况下，还需要后处理过程，后处理过程主要包括冷却后过滤、洗涤、旋转蒸除溶剂得到式IV化合物的粗品，式IV化合物的粗品进一步经柱层析纯化得到式IV化合物。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物的制备方法中，所述步骤3)是将步骤2)合成的式IV化合物水解反应合成式Ⅴ化合物。具体地，式IV化合物在碱的作用下水解，所述步骤3)中式IV化合物与碱的摩尔比为1:1～1:5，1:2～1:4，1:1～1:3，或1:3～1:5。在一些具体的实施方式中，所述步骤3)中水解反应的碱选自氢氧化锂。所述步骤3)是在溶剂下反应，所述溶剂包括水和有机溶剂，所述有机溶剂没有特殊限定，在一具体实施例中，所述有机溶剂选自四氢呋喃。通常情况下，反应条件没有特殊的限定，在一些实施方式中，反应温度为0～40℃，反应时间为1～12h。反应后的式Ⅴ化合物的粗产物可以用HPLC分离纯化。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物的制备方法中，所述步骤4)是将步骤3)合成的式Ⅴ化合物与N-羟基丁二酰亚胺缩合反应合成式Ⅵ化合物。具体地，所述步骤4)中式Ⅴ化合物与N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:2～1:6，1:2～1:3，1:3～1:4，1:4～1:5，1:5～1:6。在缩合反应中需要用到缩合剂，在一具体实施例中，所述步骤4)中缩合反应的缩合剂选自二环己基碳二亚胺。通常情况下，反应用到的溶剂没有特殊限定，在一具体实施例中，所述步骤4)中溶剂选自二氯甲烷。反应条件可根据具体情况调整，例如，反应温度为0～60℃，反应时间为2～24小时。反应后冷却、过滤除去固体不溶物，将滤液旋转蒸除溶剂后得式Ⅵ化合物。
本发明所提供的化合物、及其盐或溶剂合物的制备方法中，所述步骤5)是将步骤4)合成的式Ⅵ化合物进一步合成式Ⅰ化合物。具体地，将式Ⅵ化合物溶剂体系中置换成氢气，所述溶剂体系例如可以是四氢呋喃。进一步向所述步骤5)中加入Pd/C进行氢化还原，反应条件可根据具体情况调整，例如，反应温度为0～60℃，反应时间为0.5～12h。进一步通过过滤、浓缩得到式Ⅰ化合物。
本发明第三方面提供本发明第一方面的化合物、及其盐或溶剂合物在制备交联剂中的用途。
本发明第四方面提供一种交联剂，包括本发明第一方面所述的化合物、及其盐或溶剂合物。
本发明所提供的交联剂中，还包括缓冲溶液。所述缓冲液没有特殊限定，例如可以是PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)。
本发明第五方面提供本发明第一方面所述的化合物、及其盐或溶剂合物或本发明第四方面提供交联剂在蛋白质交联中的应用。
本发明第六方面提供一种蛋白质交联和处理的方法，所述方法包括向蛋白质样品中加入本发明第一方面所述的化合物、及其盐或溶剂合物或本发明第四方面所述的交联剂，在缓冲液中反应后进一步处理得到交联肽段。
本发明所提供的蛋白质交联和处理的方法中，具体研究的是蛋白质结构或蛋白质相互作用。具体地：
首先将蛋白质样品与本发明第一方面所述的化合物、及其盐或溶剂合物或本发明第四方面所述的交联剂在缓冲液中反应。所述蛋白质样品例如可以蛋白BSA(牛血清白蛋白)、蛋白E.coil细胞裂解液等。所述缓冲液没有特殊限定，例如可以是PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)。通常情况下，在室温下振荡反应10～60min后淬灭反应，进一步除去过量小分子。
第二，将反应后的产物进一步处理得到交联肽段。在一具体实施方式中，处理方法包括：先以二硫苏糖醇还原，然后以碘代乙酰胺烷基化。随后加入测序级别胰酶，将交联后肽段酶解为肽段。酶解后肽段随后以二氧化钛微球富集，去除非交联肽段，富集后肽段脱盐处理即得交联肽段。
本发明第七方面提供一种解析质谱交联肽段的方法，包括本发明第六方面所述的蛋白质交联和处理的方法，还包括：
1)将所述蛋白质交联和处理的方法提供的交联肽段进行质谱数据处理；
2)基于条件概率，将处理后得到的数据库分成三个亚群：(1)当存在肽段α和β的交联时，同时存在连接有链接子的α和β肽段时P(α-β＝1/αandβ＝1)；(2)当存在肽段α和β的交联时，同时存在连接有链接子的α肽段或同时存在连接有链接子的β肽段时P(α-β＝1/αorβ＝1)；(3)当存在肽段α和β的交联时，未检测到连接有链接子的α和β肽段时P(α-β＝1/αandβ＝0)；
3)所述质谱数据落入(1)和(2)亚群；所述(1)和(2)亚群同时含有type 0肽段。
本发明所提供的解析质谱交联肽段的方法中，所述步骤1)是采用本发明第四方面所述的方法得到的交联肽段进行质谱数据处理。具体地，将本发明第四方面提供的脱盐后的交联肽段采用LC/MS/MS分析。样品溶解于甲酸，然后用Orbitrap质谱分析，该质谱配备50cm色谱柱和Easy spray离子源。分析分为两次，第一次分析：首先做一个母离子扫描，其中电荷数为2的最强的10个峰进行MS/MS扫描；第二次分析：首先做一个母离子扫描，其中电荷数为3-7的最强的10个峰进行MS/MS扫描。
本发明所提供的解析质谱交联肽段的方法中，所述步骤2)，具体地，条件概率为，当存在肽段α和β的交联时，(P(α-β＝1))＝1，分成三个亚群后，(1)亚群1：当存在肽段α和β的交联时，同时存在连接有链接子的α和β肽段时，P(α-β＝1/αandβ＝1)；(2)亚群2：当存在肽段α和β的交联时，同时存在连接有链接子的α肽段或同时存在连接有链接子的β肽段时，P(α-β＝1/αorβ＝1)；(3)亚群3：当存在肽段α和β的交联时，未检测到连接有链接子的α和β肽段，P(α-β＝1/αandβ＝0)。
本发明所提供的解析质谱交联肽段的方法中，所述步骤3)中，质谱数据落入(1)和(2)亚群，所述(1)和(2)亚群同时含有type 0肽段。因此，实际操作中，可以将第一轮数据库的搜索缩减到type 0肽段库。这将大大减少数据库的搜索空间。
本发明的有益效果：
本发明提供的化合物、及其盐或溶剂合物作为交联剂使用含有可富集的官能团，具有较高的交联效率；本发明提供的交联剂具有质谱可断裂或者质谱不断裂特征，质谱条件下可解离的交联剂可以很大的提高数据处理的效率；本发明提供的新的解析质谱交联肽段的方法，可以极大的减少数据处理时间并提高数据分析处理的灵敏度，尤其是在复杂的体系中。
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1
化合物pDSPE的制备
化合物pDSPE的合成路线如下：
具体制备步骤如下：
步骤a：化合物2的合成
5-溴间苯二酚(500mg，2.66mmol),溴代乙酸乙酯(1.2mL，10.4mmol)和碳酸钾(1.435g，10.4mmol)的混合物中加入丙酮(10mL).所得混合物在常温下反应3小时。过滤后，蒸干溶剂，柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)得到白色固体864mg(2.39mmol,89％产率).ESI-HRMS Calculated for C14H18BrO6[M+H]+:362.1960,Found:362.1386.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.67(s,2H),6.41(d,J＝1.4Hz,1H),4.54(s,4H),4.25(q,J＝7.1Hz,4H),1.28(t,J＝7.2Hz,6H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ168.21,159.36,123.00,111.49,101.29,65.44,61.53,14.14.
步骤b：化合物3的合成
化合物2(761mg，2.1mmol),三苯基膦钯(115.6mg，0.1mmol)和碳酸铯(781.9mg，2.4mmol)的混合物中加入四氢呋喃(6mL)，随后加入亚磷酸二苄酯(524.08mg，2mmol)，所得混合物在微波120℃条件下反应10分钟。冷却至室温后，过滤，滤液浓缩，柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，得到378mg(0.7mmol,35％yield)白色固体.ESI-HRMS Calculatedfor C28H32O9P[M+H]+:543.5288,Found:543.5767.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.31(d,J＝4.1Hz,10H),6.94(d,J＝15.0Hz,2H),6.68(d,J＝1.5Hz,1H),5.04(dt,J＝19.7,11.7Hz,4H),4.55(s,4H),4.22(q,J＝7.1Hz,4H),1.26(t,J＝7.1Hz,6H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ168.21,159.10,158.92,135.98,135.92,130.81,129.30,128.66,128.56,128.43,127.97,110.83,110.75,106.80,106.77,67.83,67.79,67.09,65.42,61.48,50.48,14.13.
步骤c：化合物4的合成
化合物3(378mg，0.7mmol)和氢氧化锂(87.7mg，2.1mmol)的四氢呋喃(6mL)和水(4mL)的混合溶液在常温下反应2小时.随后用稀盐酸调节反应体系pH为3到4.粗产物用制备HPLC纯化，得到122mg(0.25mmol,36％)白色产物.ESI-HRMS Calculated for C24H24O9P[M+H]+:487.4208,Found:487.4160.1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.42–7.28(m,10H),6.82(d,J＝14.8Hz,2H),6.76(s,1H),5.04(d,J＝7.9Hz,4H),4.72(s,4H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ169.83,159.13,158.95,136.30,128.49,128.25,127.75,109.85,105.87,67.15,64.78.
步骤d：化合物5的合成
化合物4(122mg，0.25mmol),N-羟基丁二酰亚胺(63mg，0.55mmol)和二环己基碳二亚胺(113mg，0.55mmol)的二氯甲烷溶液(6mL)在常温下反应12小时。随后反应溶液置于冰浴中，过滤，除掉固体。重复三次常温溶解、冰浴降温、过滤后得到88mg(0.13mmol,52％)白色固体.ESI-HRMS Calculated for C32H30N2O13P[M+H]+:681.5668,Found:681.5317.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.32(s,10H),7.04(d,J＝14.8Hz,2H),6.72(s,1H),5.13–5.01(m,4H),4.97(s,4H),2.84(s,8H).
步骤e：化合物pDSPE的合成
化合物5(88mg,0.13mmol)的四氢呋喃(5mL)溶液体系置换成氢气后，加入Pa/C(5mol％),常温反应40分钟。过滤，浓缩，即可得到无色液体pDSPE(50mg,0.1mmol,77％).ESI-HRMS Calculated for C18H18N2O13P[M+H]+:501.3168,Found:501.3735。
实施例2
化合物pDSBE的制备
化合物pDSBE的合成路线如下：
其具体制备步骤如下：
步骤a：化合物7的合成
将氢化钠(460.7mg，11.5mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，冰浴下加入化合物(4-溴-1,2-亚苯基)二甲醇(500mg，2.3mmol)，N2保护，冰浴下反应30min，随后加入溴乙酸乙酯(1.27mL，11.5mmol)，N2保护，冰浴下反应30min。加入20mL水淬灭反应液，用乙酸乙酯萃取(3*20mL)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋转蒸除溶剂后得粗品，加入10mL乙酸乙酯和2g 60-100目硅胶，拌匀旋干。粗品经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)得无色油状液体7(666mg，1.7mmol，74％)。ESI-HRMS Calculated for C16H22BrO6[M+H]+:390.2500,Found:390.2418.1H NMR(500MHz,MeOD)δ7.61(s,1H),7.45(d,J＝8.1Hz,1H),7.32(d,J＝8.2Hz,1H),4.67(d,J＝22.9Hz,4H),4.20(dd,J＝12.5,5.9Hz,4H),4.15(d,J＝14.9Hz,5H),1.30–1.22(m,7H).13C NMR(126MHz,MeOD)δ172.03,140.04,136.29,132.71,132.11,131.87,122.88,71.19,70.95,68.56,68.41,61.93,61.90,14.50.
步骤b：化合物8的合成
将上一步所得化合物7(666mg，1.72mmol)，三苯基膦钯(90.34mg，0.078mmol)和碳酸铯(610mg，1.872mmol)溶于四氢呋喃(6mL)中，随后加入亚磷酸二苄酯(408mg，1.56mmol)在微波反应器中120℃下搅拌反应10min。冷却至室温后后，过滤除去固体不溶物，用二氯甲烷(10mL*2)洗涤固体不溶物，将滤液直接减压旋转蒸除溶剂后得粗品。加入10mL CH2Cl2和2g 60-100目硅胶，拌匀旋干。粗品经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)得浅黄色油状液体56-11(295mg，0.51mmol，33％)。ESI-HRMS Calculated for C30H36O9P[M+H]+:571.5828,Found:571.4443.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝13.6Hz,1H),7.75(dd,J＝13.1,7.8Hz,1H),7.59–7.53(m,1H),7.27(dd,J＝14.9,5.0Hz,10H),5.03(dt,J＝19.8,11.6Hz,4H),4.71(d,J＝44.2Hz,4H),4.24–4.13(m,4H),4.07(d,J＝27.0Hz,4H),1.24(dd,J＝7.4,6.0Hz,6H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ169.94,169.92,140.95,140.92,135.98,135.93,135.66,135.54,132.49,132.40,131.95,131.87,131.74,131.66,128.75,128.62,128.37,128.20,128.05,127.78,126.54,70.57,70.11,67.62,67.51,67.46,67.45,60.75,60.73,14.06.
步骤c：化合物9的合成
将上一步所得化合物8(295mg，0.52mmol)，LiOH(65.08mg，1.55mmol)溶于四氢呋喃(6mL)和水(4mL)中，室温搅拌反应。通过TLC薄层色谱法检测反应完全。用稀盐酸将反应液pH值调至3～4，用制备HPLC(固定相为C-18硅胶柱，流动相为CH3CN/H2O＝10～100％，30分钟)分离得到产物无色油状液体56-12(90mg，0.175mmol)，产率34％。ESI-HRMS Calculatedfor C26H28O9P[M+H]+:515.4748,Found:515.3465.1H NMR(500MHz,MeOD)δ7.82(d,J＝13.7Hz,1H),7.71(dd,J＝13.2,7.8Hz,1H),7.60(d,J＝6.6Hz,1H),7.33(s,10H),5.07(d,J＝8.6Hz,4H),4.75(d,J＝27.0Hz,4H),4.14(d,J＝11.8Hz,4H).13C NMR(126MHz,MeOD)δ173.78,142.87,137.37,133.79,133.77,133.12,133.04,132.49,132.24,130.03,129.93,129.64,129.60,129.19,71.12,71.06,69.35,69.31,68.28,68.23。
步骤d：化合物10的合成
将上一步所得化合物9(90mg，0.175mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(44mg，0.385mmol)和二环己基碳二亚胺(80mg，0.385mmol)溶于二氯甲烷(6mL)中，室温下搅拌反应过夜。反应完成后，将反应液置于冰浴下冷却，快速过滤除去固体不溶物，重复此操作3次，将滤液直接减压旋转蒸除溶剂后得白色固体56-13(88mg，0.13mmol)，产率92％。ESI-HRMS Calculatedfor C34H34N2O13P[M+H]+:709.6208,Found:709.6852.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.85–7.73(m,2H),7.55(d,J＝4.7Hz,1H),7.31(s,10H),5.06(dt,J＝19.6,11.4Hz,4H),4.79(d,J＝43.5Hz,4H),4.48(d,J＝15.3Hz,4H),2.84(s,8H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ169.68,169.15,168.96,165.87,140.38,140.35,136.19,136.14,135.45,135.33,133.06,132.97,132.36,132.28,129.36,129.24,128.90,128.64,128.49,128.08,127.39,71.14,70.72,67.85,67.81,34.03,25.72,25.55,25.05.
步骤e：化合物pDSBE的合成
将步骤d所得化合物10(50mg，0.07mmol)溶于四氢呋喃(5mL)，在N2保护下，加入10mg 5％Pd/C。在室温下H2作用下搅拌反应过夜。过滤除去Pd/C不溶物，滤液经减压旋转蒸除溶剂后得无色油状物pDSBE(50mg，0.1mmol，77％)。ESI-HRMS Calculated forC20H22N2O13P[M+H]+:529.3708,Found:529.3614.
实施例3
pDSPE交联剂对蛋白BSA的交联
pDSPE(50mM,20μL)的水溶液加入到200μL BSA(5mg/mL)的PBS(pH 7.4,780uL)溶液中,所得混合物在室温下振荡反应30min.随后用Tris·HCl(100mM,pH 7.4)淬灭反应，调至浓度为10mM.通过PallTMNanosep(3kDa Omega)除去过量小分子。
实施例4
pDSPE交联剂对蛋白E.coil细胞裂解液的交联
化合物pDSBE(50mM,30μL)的水溶液加入到150μL E.coil裂解液(20mg/mL)的PBS(pH 7.4,120uL)溶液中,所得混合物在室温下振荡反应30min.随后用Tris·HCl(100mM,pH7.4)淬灭反应，调至浓度为10mM.通过PallTMNanosep(3kDa Omega)除去过量小分子。
实施例5
蛋白样品处理
按实施例3交联后的BSA首先以二硫苏糖醇还原，然后以碘代乙酰胺烷基化。随后加入测序级别胰酶，将交联后肽段酶解为肽段。酶解后肽段随后以二氧化钛微球富集，去除非交联肽段，保留交联肽段。富集后肽段采用C18固相萃取柱脱盐。
实施例6
蛋白样品质谱数据处理
脱盐后的肽段采用LC/MS/MS分析。
按实施例4交联后的E.coil细胞裂解液再按实施例5同样的方法处理后，所的样品溶解于0.1％甲酸，然后用Orbitrap质谱分析，该质谱配备50cm色谱柱和Easy spray离子源。分析分为两次，第一次分析：首先做一个母离子扫描，其中电荷数为2的最强的10个峰进行MS/MS扫描；第二次分析：首先做一个母离子扫描，其中电荷数为3-7的最强的10个峰进行MS/MS扫描。
实施例7
质谱数据分析方法
基于条件概率的思路，可以将数据库分为三个亚群。分别为当存在肽段α和β的交联时(P(α-β＝1)＝1)：(1)P(α-β＝1)，同时存在连接有链接子的α和β肽段(P(α-β＝1/αandβ＝1))；(2)P(α-β＝1)，同时存在连接有链接子的α肽段；或者P(α-β＝1)，同时存在连接有链接子的β肽段(P(α-β＝1/αorβ＝1))；(3)未检测到连接有链接子的α和β肽段，(P(α-β＝1/αandβ＝0))。质谱可以检测到的数据大多数都落在前面两个亚群中，而这两个亚群均含有单链接肽段(type0)。图3是本发明中涉及的分析数据中设计条件概率的方程式。
如图4所示，以此先搜索数据库鉴定出所有的单链接肽段(type 0)，从而建立type0肽段库；进而结合整个数据库产生的肽段库，产生交联肽段；进一步通过比较检测所得肽段分子量和其理论分子量(Mp＝Mα+Mβ+Mlinker)是否在合理的分值内，来考察所有候选交联肽段的可信度。
本发明所涉及的方法将第一轮数据库的搜索缩减到type 0肽段库，相比以前的方法同时搜索整个肽段库，大大的减少了数据库的搜索空间，从而提高数据的分析灵敏度。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种化合物、及其盐或溶剂合物，所述化合物的化学结构式如式I所示：
其中，R1选自亚甲基；R2选自亚甲基；n1选自0～2，n2选自0～8，n3选自0～2，n1、n2、n3选自整数。
2.如权利要求1所述的化合物、及其盐或溶剂合物，其特征在于，所述化合物的盐选自式I化合物的钠盐和/或式I化合物的钾盐。
3.如权利要求1所述的化合物、及其盐或溶剂合物，其特征在于，还包括如下技术特征的一项或多项：
A1)所述化合物的溶剂合物选自式I化合物与四氢呋喃和/或二氧六环的混合物；
A2)所述R2位于磷酸基的间位或对位；
A3)所述n1选自0～1，n1选自整数；
A4)所述n2选自1～5，n2选自整数；
A5)所述n3选自0～1，n1选自整数。
4.如权利要求1～3任一项权利要求所述的化合物、及其盐或溶剂合物的制备方法，所述式I化合物的合成包括如下步骤：
1)将式II化合物与
在碱和溶剂作用下反应合成式III化合物；
所述
中，X选自离去基团，所述离去基团选自卤族元素或三氟甲磺酸酯，n2选自0～8；
2)将步骤1)合成的式III化合物与亚磷酸二苄酯在催化剂、碱和溶剂下合成式IV化合物；
3)将步骤2)合成的式IV化合物水解反应合成式Ⅴ化合物；
4)将步骤3)合成的式Ⅴ化合物与N-羟基丁二酰亚胺缩合反应合成式Ⅵ化合物；
5)将步骤4)合成的式Ⅵ化合物进一步合成式Ⅰ化合物；
所述步骤1)～步骤5)中，R1选自亚甲基；R2选自亚甲基，n1选自0～2；n2选自0～8，n3选自0～2；n1、n2、n3选自整数。
5.如权利要求1所述的化合物、及其盐或溶剂合物在制备交联剂中的用途。
6.一种交联剂，包括权利要求1所述的化合物、及其盐或溶剂合物。
7.如权利要求6所述的交联剂，其特征在于，还包括缓冲溶液。
8.如权利要求1～3任一权利要求所述的化合物、及其盐或溶剂合物或如权利要求6～7所述的交联剂在蛋白质交联中的应用。
9.一种蛋白质交联和处理的方法，所述方法包括向蛋白质样品中加入如权利要求1～3任一权利要求所述的化合物、及其盐或溶剂合物或如权利要求6～7所述的交联剂，在缓冲液中反应后进一步处理得到交联肽段。
10.一种解析质谱交联肽段的方法，包括如权利要求9所述的蛋白质交联和处理的方法，其特征在于，还包括：
1)将所述蛋白质交联和处理的方法提供的交联肽段进行质谱数据处理；
2)基于条件概率，将处理后得到的数据库分成三个亚群：(1)当存在肽段α和β的交联时，同时存在连接有链接子的α和β肽段时P(α-β＝1/αandβ＝1)；(2)当存在肽段α和β的交联时，同时存在连接有链接子的α肽段或同时存在连接有链接子的β肽段时P(α-β＝1/αorβ＝1)；(3)当存在肽段α和β的交联时，未检测到连接有链接子的α和β肽段时P(α-β＝1/αandβ＝0)；
3)所述质谱数据落入(1)和(2)亚群；所述(1)和(2)亚群同时含有type 0肽段。
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