CN111012949A - 一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法 - Google Patents

一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111012949A
CN111012949A CN201911414767.8A CN201911414767A CN111012949A CN 111012949 A CN111012949 A CN 111012949A CN 201911414767 A CN201911414767 A CN 201911414767A CN 111012949 A CN111012949 A CN 111012949A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tissue engineering
wharton
jelly
engineering scaffold
zinc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911414767.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111012949B (zh
Inventor
亓建洪
毕懿康
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Original Assignee
Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences filed Critical Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Priority to CN201911414767.8A priority Critical patent/CN111012949B/zh
Publication of CN111012949A publication Critical patent/CN111012949A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111012949B publication Critical patent/CN111012949B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/04—Metals or alloys
    • A61L27/047—Other specific metals or alloys not covered by A61L27/042 - A61L27/045 or A61L27/06
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/3654—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/10—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing inorganic materials
    • A61L2300/102—Metals or metal compounds, e.g. salts such as bicarbonates, carbonates, oxides, zeolites, silicates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/41—Anti-inflammatory agents, e.g. NSAIDs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，所述方法是利用从人脐带中分离出的沃顿胶，通过反复低温粉碎、冻融、梯度离心、胰酶消化洗脱、真空冷冻压缩干燥等过程制得单纯沃顿胶支架，将单纯沃顿胶支架在含锌离子的模拟体液中进行诱导沉积，然后置于水热釜中的氨水溶液内，进行气相水热反应，最后经真空冷冻干燥即得本发明所述含锌离子的软骨组织工程支架；利用所述方法制备的组织工程支架不仅组织相容性好，而且能成功负载锌离子并通过缓释作用释放，从而调节巨噬细胞极化，对于炎性环境中的软骨损伤发挥抗炎作用；能够诱导干细胞分化为软骨细胞，为软骨修复提供良好的内免疫环境。

Description

一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法
【技术领域】
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法。
【背景技术】
由于缺乏血管神经的营养支持，关节软骨的再生能力及自愈能力差，以致于关节软骨损伤后修复非常困难。目前关节软骨全层损伤的治疗一直是骨科与运动医学医生面临的巨大挑战。微骨折术、软骨下骨钻孔术相继用于软骨损伤的治疗，但这些治疗方法也面临很多问题，其中最主要的问题是修复的软骨通常为纤维软骨，其生物力学及生理功能与透明软骨不可比，无法满足功能需求。其次，对非承重区的附加损伤和软骨损伤区域膨胀不足等，使得上述治疗手段的治疗效果上不够令人满意。
近年来，干细胞作为一种有希望的治疗关节软骨缺损的替代细胞引起了人们的兴趣，因为这些干细胞在一定条件作用下可以分化成软骨细胞。截至目前，研究人员已经从不同组织中分离出间充质干细胞(MSCs)，其中，骨髓间充质干细胞(Bone Marrowmesenchymal Stem Cells,BMSCs)作为标准应用于骨和软骨组织工程最为多见。
作为软骨组织工程的另一个重要因素——生物支架材料的功能要求也在不断提高。理想的支架材料不仅要求具有良好的支撑细胞和组织的作用，还要求能参与细胞信息传递调控，并可以影响到细胞增殖、迁移及分化。从脐带中分离的沃顿胶(Wharton’sJelly，WJ)，具备来源广泛、无二次创伤、可塑性极强、免疫源性低、成分与软骨组织接近、不涉及医学伦理问题等优点，而被众多学者认为是一种较为理想的软骨组织工程支架。
巨噬细胞作为组织-植入物相互作用的先锋细胞，是异物反应最重要的效应细胞之一。巨噬细胞可以极化成不同表型的细胞亚型而发挥不同的作用，巨噬细胞可转变为M1型会分泌促炎介质TNF-α或IL-6，不利于组织修复；巨噬细胞转变为M2型会分泌抗炎介质IL-4或IL-10提供一个促进组织修复的抗炎微环境。
近年来，随着免疫学的研究进展和对软骨修复的认识不断加深，越来越多的研究表明免疫系统与骨软骨系统的密切关系，如促炎因子白介素6在骨性关节炎发生发展过程中起到重要的促进作用，浸润于类风湿性关节炎患者关节滑膜中的巨噬细胞，淋巴细胞分泌的炎性因子在关节滑膜病变中发挥了重要作用。这些发现表明，软骨组织工程支架不仅应注重支架性能，还应注重体内复杂的免疫环境特别是炎症环境对成软骨的影响。
锌是人体必不可少的有益元素，有文献指出：1.25×10-6mol/l的锌足以降低促炎细胞因子的表达，但是当锌的浓度超过100×10-6mol/l时会增加促炎细胞因子的释放；因此，适量的锌离子浓度对免疫系统的炎症环境发挥重要作用。
【发明内容】
本发明的目的在于，提供一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，利用所述方法制备的组织工程支架不仅组织相容性好，而且在炎性环境中有很好的抗炎作用。
本发明采用如下技术方案：一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将脐带取出后，用生理盐水洗去脐血管内及表面残存的血，在无菌操作台上剔除脐带外部的被膜和内部的三根血管，分离得到的透明胶状物质即为人脐带沃顿胶；
(2)用蒸馏水反复清洗沃顿胶两次，然后将沃顿胶放置在粉碎机中，加入三蒸水后开机粉碎，反复数次，直至沃顿胶呈匀浆状态；
(3)将步骤(2)制备的沃顿胶匀浆放入-20℃冰箱中进行冷冻，然后置于室温下融化，反复冻融3～4次；
(4)使用梯度离心法离心后取上清液，依次加入TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、胰蛋白酶、Tris-HCl缓冲液后轻轻搅拌进行洗脱，洗脱后，取上层匀浆置于离心机中经离心、弃上清、收集沉淀即得脱细胞纳米级脐带凝胶悬浮液；
(5)将步骤(4)制得的凝胶悬浮液放入模具后，利用真空冷冻压缩干燥机作用16小时获得单纯沃顿胶支架；
(6)配制一定浓度的含锌模拟体液，并将步骤(5)制备的单纯沃顿胶支架置于模拟体液中进行诱导沉积；
(7)取出步骤(6)中浸泡后的沃顿胶支架，放置于水热釜中的氨水溶液内，进行气相水热反应得负载好锌离子的沃顿胶支架；
(8)将步骤(7)中制得的负载好锌离子的沃顿胶支架，置于真空冷冻干燥机中作用，然后进行辐照消毒，置于4℃冰箱中密封条件下保存备用。
优选地，步骤(4)中所述的梯度离心，离心机的转速为6000r/min，离心15min。
优选地，步骤(4)中所述TritonX-100的浓度为1％，胰蛋白酶的浓度为0.25％，Tris-HCl缓冲液的浓度为1mol/L，PH为6.8。
优选地，步骤(4)中所述洗脱是在4℃下，洗脱24小时，重复5次。
优选地，步骤(4)中所述的洗脱后进行的离心是在4℃下，离心机转速为10000r/min，离心40min。
优选地，步骤(6)中所述含锌模拟体液的成分及含量为：NaCl：120～150mmol/L、NaHCO3：2～4mmol/L、KCl：2～6mmol/L、K2HPO4·3H2O：2～5mmol/L、HCl：20～40mmol/L、CaCl2：2～4mmol/L、Na2SO4：0.2～1.0mmol/L、(CH2OH)3CNH2(Tris)：30～50mmol/L、Zn(CH3COO)2：5～50mmol/L。
优选地，步骤(6)中所述单纯沃顿胶支架置于模拟体液中在37℃下诱导沉积24小时。
优选地，步骤(7)中所述氨水溶液的浓度为5％～15％，在50℃～70℃下进行气相水热反应24～48小时。
优选地，步骤(8)中所述的辐照消毒的温度是60℃。
本发明的有益效果：本发明所述方法制备的一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架具有良好的组织相容性，细胞黏附良好，黏附干细胞在成软骨诱导培养基中可成功向软骨细胞诱导；当处于炎性环境中时，本发明支架可通过释放的锌离子诱导巨噬细胞极化为抗炎表型M2，并抑制巨噬细胞向M1型分化，抑制促炎介质IL-6、TNF-α的释放，并促进抗炎介质IL-4、IL-10的释放，发挥抗炎作用，为组织再生修复提供良好的内免疫环境。
【附图说明】
图1为单纯沃顿胶支架与实施例2和对比例1制备的含锌离子组织工程支架的电镜扫描对比图；
图2为单纯沃顿胶支架与实施例2和对比例1制备的含锌离子组织工程支架的能谱分析对比图；
图3是本发明所述含锌离子的软骨组织工程支架不同浓度锌离子的释放曲线；
图4是本发明所述含锌离子的软骨组织工程支架的细胞负载图；
图5是利用软骨组织工程支架复合大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)体外构建组织工程软骨小球的外观对比图；
图6是利用软骨组织工程支架复合大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)体外构建组织工程软骨的HE染色对比图；
图7是利用软骨组织工程支架复合大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)体外构建组织工程软骨的甲苯胺蓝染色对比图；
图8是利用软骨组织工程支架复合大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)体外构建组织工程软骨的相关基因表达对比柱状图；
图9是利用软骨组织工程支架复合大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)体外构建组织工程软骨中蛋白多糖(GAG)的含量对比柱状图。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的限制，应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1单纯沃顿胶支架的制备
(1)将脐带取出后，用生理盐水洗去脐血管内及表面残存的血，在无菌操作台上剔除脐带外部的被膜和内部的血管，分离得到的透明胶状物质即为人脐带沃顿胶；
(2)用蒸馏水反复清洗沃顿胶两次，然后将沃顿胶放置在粉碎机中，加入三蒸水后开机粉碎，反复数次，直至沃顿胶呈匀浆状态；
(3)将步骤(2)制备的沃顿胶匀浆放入冰箱中进行冷冻，然后置于室温下融化，反复冻融3～4次；
(4)使用梯度离心法取上清液，依次加入1％TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、0.25％胰蛋白酶、Tris-HCl缓冲液后轻轻搅拌，4℃洗脱24小时，重复5次；取上层匀浆置于10000r/min离心机中，4℃条件下离心40min，弃上清、收集沉淀即得脱细胞纳米级脐带凝胶悬浮液；
(5)将步骤(4)制得的凝胶悬浮液放入模具后，利用真空冷冻压缩干燥机作用16小时获得单纯沃顿胶支架，然后置于60℃辐照消毒机内进行辐照消毒，置于4℃冰箱中密封条件下保存备用。
实施例2
(1)按照实施例1中步骤(1)～(5)所述方法制备单纯沃顿胶支架；
(2)分别取NaCl：120mmol/L、NaHCO3：2.0mmol/L、KCl：4.0mmol/L、K2HPO4·3H2O：3.0mmol/L、HCl：40.0mmol/L、CaCl2：3.0mmol/L、Na2SO4：0.8mmol/L、(CH2OH)3CNH2(Tris)：40mmol/L、Zn(CH3COO)2：10mmol/L，配制含锌模拟体液，并将步骤(1)制备的单纯沃顿胶支架置于模拟体液在37℃下诱导沉积24小时；
(3)取出步骤(2)中浸泡后的沃顿胶支架，放置于水热釜中的浓度为5％的氨水溶液内，在50℃条件下进行气相水热反应24小时；
(4)将步骤(3)中制得的负载好锌离子的沃顿胶支架，置于真空冷冻干燥机中作用，然后置于60℃辐照消毒机内进行辐照消毒，置于4℃冰箱中密封条件下保存备用。
实施例3
(1)按照实施例1中步骤(1)至(5)所述方法制备单纯沃顿胶支架；
(2)分别取NaCl：137.0mmol/L、NaHCO3：4.0mmol/L、KCl：3.6mmol/L、K2HPO4·3H2O：4.0mmol/L、HCl：30.0mmol/L、CaCl2：2.5mmol/L、Na2SO4：0.2mmol/L、(CH2OH)3CNH2(Tris)：30.0mmol/L、Zn(CH3COO)2：5.0mmol/L配制含锌模拟体液，并将步骤(1)制备的单纯沃顿胶支架置于模拟体液在37℃下诱导沉积24小时；
(3)取出步骤(2)中浸泡后的沃顿胶支架，放置于水热釜中浓度为5％的氨水溶液内，在70℃条件下进行气相水热反应48小时；
(4)将步骤(3)中制得的负载好锌离子的沃顿胶支架，置于真空冷冻干燥机中作用，然后置于60℃辐照消毒机内进行辐照消毒，置于4℃冰箱中密封条件下保存备用。
实施例4
(1)按照实施例1中步骤(1)至(5)所述方法制备单纯沃顿胶支架；
(2)分别取NaCl：120mmol/L、NaHCO3：4.0mmol/L、KCl：2mmol/L、K2HPO4·3H2O：5.0mmol/L、HCl：20mmol/L、CaCl2：2mmol/L、Na2SO4：0.2mmol/L、(CH2OH)3CNH2(Tris)：40mmol/L、Zn(CH3COO)2：50mmol/L配制含锌模拟体液，并将步骤(1)制备的单纯沃顿胶支架置于模拟体液在37℃下诱导沉积24小时；
(3)取出步骤(2)中浸泡后的沃顿胶支架，放置于水热釜中浓度为15％的氨水溶液内，在50℃条件下进行气相水热反应48小时；
(4)将步骤(3)中制得的负载好锌离子的沃顿胶支架，置于真空冷冻干燥机中作用，然后置于60℃辐照消毒机内进行辐照消毒，置于4℃冰箱中密封条件下保存备用。
实施例5
(1)按照实施例1中步骤(1)至(5)所述方法制备单纯沃顿胶支架；
(2)分别取NaCl：150mmol/L、NaHCO3：3.0mmol/L、KCl：6.0mmol/L、K2HPO4·3H2O：4.0mmol/L、HCl：35mmol/L、CaCl2：3mmol/L、Na2SO4：0.6mmol/L、(CH2OH)3CNH2(Tris)：50mmol/L、Zn(CH3COO)2：40mmol/L配制含锌模拟体液，并将步骤(1)制备的单纯沃顿胶支架置于模拟体液在37℃下诱导沉积24小时；
(3)取出步骤(2)中浸泡后的沃顿胶支架，放置于水热釜中浓度为15％的氨水溶液内，在50℃条件下进行气相水热反应48小时；
(4)将步骤(3)中制得的负载好锌离子的沃顿胶支架，置于真空冷冻干燥机中作用，然后置于60℃辐照消毒机内进行辐照消毒，置于4℃冰箱中密封条件下保存备用。
对比例1
(1)按照实施例1所述方法制备单纯沃顿胶支架；
(2)分别取NaCl：150mmol/L、NaHCO3：4.0mmol/L、KCl：6.0mmol/L、K2HPO4·3H2O：2.0mmol/L、HCl：20.0mmol/L、CaCl2：4.0mmol/L、Na2SO4：1.0mmol/L、(CH2OH)3CNH2(Tris)：50mmol/L、Zn(CH3COO)2：100mmol/L配制含锌模拟体液，并将步骤(1)制备的单纯沃顿胶支架置于模拟体液在37℃下诱导沉积24小时；
(3)取出步骤(2)中浸泡后的沃顿胶支架，放置于水热釜中的浓度为15％的氨水溶液内，在60℃条件下进行气相水热反应36小时；
(4)将步骤(3)中制得的负载好锌离子的沃顿胶支架，置于真空冷冻干燥机中作用，然后置于60℃辐照消毒机内进行辐照消毒，置于4℃冰箱中密封条件下保存备用。
试验例1
将上述实施例1～2和对比例1制备的支架分别置于电子显微镜下观察，其电镜扫描图分别如图1(a1)、(a2)、(a3)所示，从电镜扫描图中可以清楚的看到实施例2和对比例1制备的含锌离子的软骨组织工程支架表面有锌盐沉积，而实施例1制备的沃顿胶支架表面没有锌盐沉积；
分别对上述实施例1～2和对比例1制备的支架进行能谱分析，其能谱分析图分别如图2(b1)、(b2)、(b3)所示，图2(b2)和(b3)可见锌元素高峰，说明使用此方法制备的软骨组织工程支架可以很好的负载锌离子；
试验例2
检测实施例2和对比例1制备的支架中锌离子的释放情况，具体过程如下：
分别取1cm3实施例2和对比例1制备的含锌离子的组织工程支架，并将其浸泡于10ml的超纯水中，在37℃下静置21天。分别收集静置1天、3天、7天和21天时的浸提液，采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测所述支架表面的锌离子释放情况，绘制锌离子的释放折线图，如图3所示；
由图3可知，实施例2～4制备的含锌离子的组织工程支架的锌离子释放浓度分别约为1.01mg/l(15×10-6mol/l)、0.7mg/l(10.8×10-6mol/l)、5.8mg/l(89×10-6mol/l)符合人体抗炎浓度的要求；对比例1制备的含锌离子组织工程支架的锌离子释放浓度约为7.2mg/l(110×10-6mol/l)，其浓度超过100×10-6mol/l会增加促炎细胞因子的释放；因此，对比例1制备的含锌离子组织工程支架不符合人体抗炎浓度的要求。
试验例3
检测细胞对实施例2制备的含锌离子的软骨组织工程支架的黏附情况，具体过程如下：
(1)取1cm3实施例2制备的含锌离子的软骨组织工程支架，并将500ul制备浓度为1.0×105cells/ml的大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的细胞悬液轻轻滴加到所述支架上，然后浸泡在α-MEM完全培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)培养3天后，首先用PBS轻轻冲洗三次，然后用4％多聚甲醛在室温下固定10分钟，冲洗3次，每次5分钟，然后用浓度为0.1％的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)透膜2分钟。
(3)分别用鬼笔环肽染色法和细胞核染色法(DAPI)在室温下分别染色1小时和5分钟，然后采用荧光显微镜观察细胞黏附情况如图4所示，由图4可知细胞能够很好的黏附在支架上，说明本发明制备的支架具有良好的组织相容性。
试验例4
利用组织工程支架复合大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)体外构建组织工程软骨，具体过程如下：
(1)取大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)，将rBMSCs与预处理的支架进行复合培养；试验分四组：
WJS组：rBMSCs复合沃顿胶支架；
Zn-WJS组：rBMSCs复合含锌离子的沃顿胶支架；
Conditioned+WJS组：rBMSCs复合条件-沃顿胶支架；
Conditioned+Zn-WJS组：rBMSCs复合条件-含锌离子的沃顿胶支架；
其中所述的WJS组和Zn-WJS组是分别将实施例1和实施例2制备的支架与rBMSCs复合，然后置于成软骨诱导培养基中进行培养；Conditioned+WJS组和Conditioned+Zn-WJS组分别是将实施例1和实施例2制备的支架与rBMSCs复合，然后置于条件培养基中进行培养；所述的条件培养基是利用LPS活化巨噬细胞的细胞培养基和成软骨诱导培养基配制而成，模拟成软骨诱导的炎性环境。
上述各组复合物，复合培养21天后，取出观察其宏观状态，各组复合物的外观如图5所示，其中WJS组和Zn-WJS组形成的软骨小球外观如图5(a)和(b)所示，小球外观规则饱满，体积较大；Conditioned+WJS组形成的软骨小球外观如图5(c)所示，小球相对较小，形状不规则；Conditioned+Zn-WJS组形成的软骨小球外观如图5(d)所示，小球体积较大，接近WJS组和Zn-WJS组，说明Conditioned+Zn-WJS组形成的软骨小球具有很好的抗炎作用。
试验例5
对试验例4制备的各复合物进行组织学染色
取复合培养21天后的各组细胞复合物，将所述各组复合物切片分别进行HE染色和甲苯胺蓝染色，结果如图6和图7所示，其中，图6中的(a～d)分别是上述四组复合物经过HE染色的图片，图7中的(a～d)分别是各组复合物经过甲苯胺蓝染色的图片；从图中可以看出只有Conditioned+WJS组复合物的切片染色后细胞体积较小，形状不规则。
试验例6
对试验例4制备的各组复合物的相关基因表达情况进行检测，具体过程如下：
(1)提取RNA：
a.将试验例3制备的各组复合物加100ul TRIzol试剂消化，然后置于玻璃匀浆器中磨碎制得匀浆；
b.将上述匀浆样品在室温下静置5-10min后加入20ul氯仿，震荡15s后2-8℃下12000r/min离心15min，得到的上层无色液体即为所要提取的RNA；
c.小心吸取上层液体转移至干净的EP管中，加入50ul异丙醇，混匀后-20℃下静置15min，然后置于离心机中2-8℃下12000r/min离心10min；
d.移去上层悬液后将RNA沉淀用1ml75％的酒精洗涤，在震荡器上混匀，然后置于离心机中2～8℃下7500r/min离心5min；
e.取下层沉淀加入适量0.1％DEPC水，完全溶解RNA，置于离心机中，2000r/min离心20s；
(2)总RNA定量：
a.紫外分光光度计开机预热30min；用蒸馏水洗涤石英比色皿，吸水纸吸干，加入0.1％的DEPC水后，放入样品室的S池架上，关上盖板；
b.设定紫外光波长(260nm、280nm)后校零(每次检测前均需调零)；将待测样品适当稀释(RNA 1μl用DEPC水稀释至250μl)后，记录编号和稀释度；
c.把装有稀释后待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板；分别测定260nm和280nm波长时的OD值(吸光度在0.1—0.5范围为最佳)，通过标准曲线计算相关基因(II型胶原、SOX9、聚集蛋白聚糖)的表达情况，并绘制柱状图，结果如图8所示；
从图8可以看出Conditioned+WJS组的II型胶原蛋白(A)、SOX9(B)、聚集蛋白聚糖(C)的表达最低，说明免疫环境对于干细胞成软骨确实存在很重要的影响，而Conditioned+Zn-WJS组的表达接近没有条件培养基的WJS组和Zn-WJS组，说明锌离子可以很好的抑制炎症。
试验例7
对试验例4制备的各组复合物中蛋白多糖(GAG)的含量进行检测，具体过程如下：
(1)试验例4所述的各组复合物复合培养3周后，取出各复合物在57℃下用木瓜蛋白酶溶液消化16小时，然后置于离心机中12000r/min离心3分钟；
(2)取0.1mg/ml的硫酸软骨素标准储存液用双蒸水稀释成不同浓度，利用分光光度仪检测525nm的波长下的吸光度并制作标准曲线；
(3)取步骤(1)中上清液用1,9-二甲基亚甲基蓝(DMMB)染料染色2min。在525nm的波长下读取吸光度，通过标准曲线法计算GAG含量，绘制柱状图，如图7所示。
由图9可知Conditioned+WJS组的蛋白多糖生成量最低，Conditioned+Zn-WJS组生成量接近WJS组合Zn-WJS组，从而进一步确认锌离子抑制活化的巨噬细胞诱导的炎症，从而为软骨形成提供有利的环境。
试验例4～7的检测结果均显示在炎性条件下的Conditioned+WJS组成软骨效果最差，说明活化的巨噬细胞抑制了干细胞的软骨形成，而Conditioned+Zn-WJS组中的锌离子很好的抑制炎症影响，成软骨效果接近WSJ组和Zn-WJS组，说明本发明制备的含锌离子的软骨组织工程支架具有免疫调节作用即抗炎作用，可在炎性环境下促进软骨再生。

Claims (10)

1.一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将脐带取出后，用生理盐水洗去脐血管内及表面残存的血，在无菌操作台上剔除脐带外部的被膜和内部的三根血管，分离得到的透明胶状物质即为人脐带沃顿胶；
(2)用蒸馏水反复清洗沃顿胶两次，然后将沃顿胶放置在粉碎机中，加入三蒸水后开机粉碎，反复数次，直至沃顿胶呈匀浆状态；
(3)将步骤(2)制备的沃顿胶匀浆放入-20℃冰箱中进行冷冻，然后置于室温下融化，反复冻融3～4次；
(4)使用梯度离心法取上清液，依次加入TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、胰蛋白酶、Tris-HCl缓冲液后轻轻搅拌进行洗脱，洗脱后，取上层匀浆置于离心机中经离心、弃上清、收集沉淀即得脱细胞纳米级脐带凝胶悬浮液；
(5)将步骤(4)制得的凝胶悬浮液放入模具后，利用真空冷冻压缩干燥机作用16小时获得单纯沃顿胶支架；
(6)配制一定浓度的含锌模拟体液，并将步骤(5)制备的单纯沃顿胶支架置于模拟体液中进行诱导沉积；
(7)取出步骤(6)中浸泡后的沃顿胶支架，放置于水热釜中的氨水溶液内，进行气相水热反应；
(8)将步骤(7)中制得的负载好锌离子的沃顿胶支架，置于真空冷冻干燥机中作用，然后进行辐照消毒，置于4℃冰箱中密封条件下保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的梯度离心的转速为6000r/min，离心15min。
3.根据权利要求1所述的一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述TritonX-100的浓度为1％，胰蛋白酶的浓度为0.25％，Tris-HCl缓冲液的浓度为1mol/L，PH为6.8。
4.根据权利要求1所述的一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述洗脱是在4℃下，洗脱24小时，重复5次。
5.根据权利要求1所述的一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述洗脱后的离心是在4℃下，离心机转速为10000r/min，离心40min。
6.根据权利要求1所述的一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述含锌模拟体液的成分及含量为：NaCl：120～150mmol/L、NaHCO3：2～4mmol/L、KCl：2～6mmol/L、K2HPO4·3H2O：2～5mmol/L、HCl：20～40mmol/L、CaCl2：2～4mmol/L、Na2SO4：0.2～1mmol/L、(CH2OH)3CNH2(Tris)：30～50mmol/L、Zn(CH3COO)2：5～50mmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述单纯沃顿胶支架置于模拟体液中在37℃下诱导沉积24小时。
8.根据权利要求1所述的一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述氨水溶液的浓度为5％～15％，在50～70℃下进行气相水热反应24～48小时。
9.根据权利要求1所述的一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(8)中所述的辐照消毒的温度是60℃。
10.权利要求1～9任一项所述方法制备的具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架。
CN201911414767.8A 2019-12-31 2019-12-31 一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法 Active CN111012949B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911414767.8A CN111012949B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911414767.8A CN111012949B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111012949A true CN111012949A (zh) 2020-04-17
CN111012949B CN111012949B (zh) 2022-05-31

Family

ID=70201098

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911414767.8A Active CN111012949B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111012949B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113456892A (zh) * 2021-07-20 2021-10-01 中南大学湘雅医院 一种以人脐带沃顿胶制备软骨组织工程支架的方法及软骨组织工程支架

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100036503A1 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 Chen Silvia S Composition for a Tissue Repair Implant and Methods of Making the Same
CN101829357A (zh) * 2010-03-30 2010-09-15 浙江大学 一种促骨融合的种植体表面仿生涂层材料及其制备方法
CN102198292A (zh) * 2010-03-26 2011-09-28 卢世璧 组织工程用脐带去细胞Wharton胶支架及其制备方法
CN105233342A (zh) * 2015-10-27 2016-01-13 泰山医学院 一种仿生多孔组织工程软骨支架制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100036503A1 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 Chen Silvia S Composition for a Tissue Repair Implant and Methods of Making the Same
CN102198292A (zh) * 2010-03-26 2011-09-28 卢世璧 组织工程用脐带去细胞Wharton胶支架及其制备方法
CN101829357A (zh) * 2010-03-30 2010-09-15 浙江大学 一种促骨融合的种植体表面仿生涂层材料及其制备方法
CN105233342A (zh) * 2015-10-27 2016-01-13 泰山医学院 一种仿生多孔组织工程软骨支架制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐立璋等: "锌修饰硅酸钙陶瓷涂层与骨整合", 《中国组织工程研究》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113456892A (zh) * 2021-07-20 2021-10-01 中南大学湘雅医院 一种以人脐带沃顿胶制备软骨组织工程支架的方法及软骨组织工程支架

Also Published As

Publication number Publication date
CN111012949B (zh) 2022-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102238970B (zh) 利用动物组织粉末制造多孔立体支架的方法及其多孔立体支架
Yin et al. Induction of mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and functional cartilage microtissue formation for in vivo cartilage regeneration by cartilage extracellular matrix-derived particles
Pope et al. Bioartificial organs I: silica gel encapsulated pancreatic islets for the treatment of diabetes mellitus
CN109536440A (zh) 外泌体的提取方法
CN102552981A (zh) 一种组织工程骨/软骨一体支架的制备方法
CN102188748A (zh) 一种新型软骨细胞外基质膜及其制备方法
US20040030404A1 (en) Method for cultivating a cartilage replacement and a biomatrix produced according to this method
CN104056304B (zh) 负载生长因子壳聚糖微球的dbm支架修复关节软骨材料
CN111012949B (zh) 一种具有抗炎功能的含锌离子组织工程支架的制备方法
CN115536866A (zh) 一种用于软骨缺损修复的可注射水凝胶及其制备方法
CN114642630B (zh) 一种负载牙龈间充质干细胞外泌体的矿化胶原凝胶及其制备方法
CN1297658C (zh) 一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法
Li et al. A composite scaffold of Wharton’s jelly and chondroitin sulphate loaded with human umbilical cord mesenchymal stem cells repairs articular cartilage defects in rat knee
URIST et al. An osteosarcoma cell and matrix retained morphogen for normal bone formation.
CN107496413A (zh) 芒果苷在制备促进骨缺损修复的药物中的应用
Yu et al. In situ fabrication of an anisotropic double-layer hydrogel as a bio-scaffold for repairing articular cartilage and subchondral bone injuries
CN116942912A (zh) 诱导组织再生的细胞外基质支架及其制备方法和应用
US20240091407A1 (en) Cartilage tissue engineering complex and use thereof
CN114796614B (zh) 一种人脂肪组织脱细胞外基质及其制备与应用
Yoshikawa et al. Osteogenesis with cryopreserved marrow mesenchymal cells
CN114848895A (zh) 3d打印钛合金多孔支架载双因子壳核微球缓释系统
Jin et al. The Effect of Stromal‐Derived Factor 1α on Osteoinduction Properties of Porous β‐Tricalcium Phosphate Bioceramics
CN112569408B (zh) 组织工程补片及其制备方法
CN109106988B (zh) 黄芪多糖用于组织工程皮肤中促进新生皮肤血管网络再生的应用
CN112641997B (zh) 髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant