CN111004745A - 具有抑制大肠杆菌k88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具有抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌。保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年8月12日，保藏编号为CCTCC M 2019623，分类命名为Bacillus velezensis BV‑001‑SMX。该菌有助于提高动物对大肠杆菌型腹泻的抵抗力，从而提高动物的抗病性，是一种具有较高应用价值的猪源益生菌。

Description

具有抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌

技术领域

本发明属于农业畜牧应用领域，具体涉及一种具有抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BV-001-SMX。

背景技术

近年来，在世界范围内，由病原性微生物的侵袭造成的仔猪腹泻日益严重，并且这种危害可能会在生长发育过程中反复出现。研究表明：大肠杆菌K88作为主要致病菌侵袭仔猪肠道后，通常会伴随一系列的危害，包括：腹泻，仔猪生长发育速度减缓，严重的绒毛萎缩，肠道隐窝深度增加，紧密连接蛋白表达量降低，仔猪死亡等，已经造成了严重的经济损失。在生产过程中，通常利用抗生素对仔猪腹泻进行治疗；但抗生素的使用在造成大肠杆菌耐药性的同时，还会对环境、动物甚至人类本身产生不利的影响。因此，早在1986年，瑞典就已经成为抗生素类产品控制和限制使用的先驱；2000年，丹麦也颁布了相应政策法规；在2006 年，抗生素作为生长促进剂和抗菌剂的使用在欧盟被禁止；墨西哥也有类似的限制。中国也将于2020年全面禁止抗生素的饲用。因此，寻找能够替代抗生素预防和治疗仔猪细菌性腹泻的安全有效的产品已成为养猪业和饲料工业普遍关注的问题。在众多实践方案中，益生菌以其可靠的安全性和悠久的历史被认为是最可行的方案。益生菌的应用范围较广，可以应用于动物饲料、乳制品、功能性食品、膳食补充剂和药物等多个方面，并为人类和动物带来各种健康益处。作为一种可以促进生长、调节肠道内环境、提高饲料利用效率、调节动物免疫的添加剂，益生菌在猪的生产中的应用研究也在逐年增加。民猪作为中国东北地区地方性猪种，与外来猪种相比具有较强的抗病性，抗逆性及耐粗饲能力；民猪仔猪的腹泻率显著低于长白仔猪。肠道作为机体最大的免疫器官和防御致病菌侵袭的先天性屏障，是益生菌发挥功能的主要场所。因此，从民猪肠道菌群中筛选具有抑制仔猪腹泻致病菌功能的益生菌株具有现实意义。

发明内容

基于以上畜牧养殖生产过程中实际问题及需求，本发明的目的在于提供一具有抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) BV-001-SMX及应用，有助于提高动物对大肠杆菌型腹泻的抵抗力，从而提高动物的抗病性。

本发明的所采用的技术方案如下：一株抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮政编码：430072，保藏日期为2019 年8月12日，保藏编号为：CCTCCM 2019623，分类命名为Bacillus velezensis BV-001-SMX。

本发明还具有如下技术特征：

1、如上所述的民猪源贝莱斯芽孢杆菌，其生物学特征包括：菌落为白色，边缘不整齐。

2、如上所述的民猪源贝莱斯芽孢杆菌，其生长条件为温度20℃-50℃，pH＝5.1-8，NaCl质量浓度0.9％-5％。

3、如上所述的民猪源贝莱斯芽孢杆菌的培养方法，如下：取种子液按体积比1％的接种量至培养基中，温度37℃、220r/min条件下摇床振荡培养，所述的培养基采用BHI液体培养基。

4、如上所述的民猪源贝莱斯芽孢杆菌，对大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌K99、大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、绿脓杆菌ATCC2785均具有抑菌活性。

5、一种益生菌制剂，含有如上所述的具有抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌。

本发明的优点及有益效果：本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌菌株对大肠杆菌 K88抑制效果较好，同时发现对大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌K99、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、绿脓杆菌ATCC27853均具有抑制效果，无溶血活性，无抗生素敏感性，在一定的温度、pH、NaCl条件下均能够生长，综上所述，民猪源贝莱斯芽孢杆菌BV-001-SMX是一种具有较高应用价值的猪源益生菌，其对畜牧养殖业和饲料发酵工业的发展具有重要意义。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌BV-SMX-001物种进化树图；

图2为溶血活性对比图；

其中，a、贝莱斯芽孢杆菌,b、金黄色葡萄球菌,c、大肠杆菌K88；

图3为本发明的菌体形态图；

具体实施方式：

通过以下实施例对本发明内容进行进一步说明，但这并不构成对本发明任何意义的限定。

供试材料：大肠杆菌K88，大肠杆菌K99，大肠杆菌(ATCC 25922)，金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)，绿脓杆菌(ATCC 27853)，鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)，东北农业大学动物营养研究所提供；民猪粪便，采集自兰西县种猪场。

实施例1：

菌株筛选与鉴定

具体按以下步骤进行：

1.培养基的配置：本实验选择利于大肠杆菌生长富集的BHI培养基作为用于抑菌活性测定的筛选培养基。其中BHI固体培养基：胰蛋白胨10g，牛心浸粉17.5g，氯化钠5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钠(12H₂O)2.5g，琼脂13.5g，1000ml 去离子水，121℃，高压灭菌而成；BHI液体培养基：胰蛋白胨10g，牛心浸粉 17.5g，氯化钠5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钠(12H₂O)2.5g，1000ml去离子水，10ml 分装，121℃，高压灭菌而成；

2.指示菌液的制备：取冻存的大肠杆菌划线至上述固体培养基中，37℃恒温培养，活化菌株；挑取单菌落接种于上述液体培养基中，220rpm、37℃过夜培养，然后再将过夜菌种接种于新的液体培养基中培养2-4h，直至细菌处于对数生长期，离心收集细菌，用无菌PBS冲洗，再将所得的细菌数调整为10⁵CFU/mL；

3.微生物代谢物的收集：称取民猪粪便1g，溶解于100mL无菌生理盐水中，梯度稀释后，涂布于固体平板上37℃恒温培养24h，挑取单菌落。将单菌落接入相应液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养24h后，12000rpm离心6min，取上清，经0.22微米水系滤器过滤备用；

4.抑制大肠杆菌的菌株筛选：取100微升上清与指示菌液等量混合加入96 孔板中，同时以指示菌液与灭菌PBS溶液的混合物作为阳性对照组，以液体培养基作为阴性对照组，置37℃恒温培养18±2h后，液体培养基澄清作为标准，利用酶标仪对各样本的吸光度值进行测定；

5.抑菌活性的结果：根据吸光度值判断菌株抑菌活性，吸光度值越小表明抑菌能力越强，筛选菌株的抑菌活性结果见表1；

表1不同菌株抑菌活性

注：^a-k每个效应下同列肩标不同表示差异显著(P<0.05)

6.菌株复筛纯化：将得到抑菌活性较好的菌株多次划线纯化；

7.菌株生理生化鉴定：本实施例发现菌株生物学特性如下：菌落为白色，边缘不整齐(如图3所示)；

本发明菌株的生理生化特征如下(见表2)：

表2菌株生理生化特征

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性

菌株鉴定过程及结果如下所示：本实施例采用一代测序的方法对筛选出的菌株进行了鉴定。细菌基因组DNA的提取是按照细菌DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek，USA)的指示进行，然后用引物进行PCR扩增：上游引物， AGTTTGATCMTGGCTCAG和下游引物，GGTTACCTTGTTACGACTT。然后，利用blast程序将菌株的序列与NCBI数据库进行比较，以确定物种，并绘制菌株的系统发育树，与菌株的近似度比对达到100％(见图1)。

经形态观察、生理生化反应和16S rDNA分子鉴定，确定本菌株为贝莱斯芽孢杆菌。首次发现民猪消化道中贝莱斯芽孢杆菌具有抑制大肠杆菌K88生长的能力，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BV-001-SMX。

实施例2：

菌株抑菌动力学实验

1.菌株活化：取冻存菌株划线至固体培养基上，37℃恒温培养活化菌株，挑取单菌落接种至上述液体培养基，220rpm，37℃培养48h；

2.指示菌液的制备：取冻存的大肠杆菌K88划线至上述固体培养基中，37 ℃恒温培养，活化菌株；挑取单菌落接种于上述液体培养基中，220rpm、37℃过夜培养，然后再将过夜菌种接种于新的液体培养基中培养2-4h，直至细菌处于对数生长期，离心收集细菌，用无菌PBS冲洗，并调整菌液浓度约10⁶cfu/ml；

3.微生物代谢物的收集：将震荡培养48h的菌液，12000rpm离心6min，取上清，经0.22微米水系滤器过滤备用；

4.抑菌动力学实验：取200微升指示菌液加入50ml上清液中，置于220rpm、 37℃培养24h，并以200微升指示菌液加入50mlPBS溶液和BHI液体培养基作为对照，培养结束后，各取培养液1ml梯度稀释涂板，计算1ml培养液中活菌数；

5.菌株抑菌动力学实验结果：菌株抑菌效果如下表(表3)所示，菌株分泌抑菌物质能够抑制大肠杆菌K88的生长，随着抑菌物质浓度不断降低，大肠杆菌数目增多。

表3.菌株抑菌动力学测定

实施例3：

菌株对其他致病菌抑制能力的测定

1.菌株活化：取冻存菌株划线至固体培养基上，37℃恒温培养活化菌株，挑取单菌落接种至上述液体培养基，220rpm，37℃培养24h；

2.指示菌液的制备：选取大肠杆菌K99、大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、绿脓杆菌ATCC27853分别作为指示菌，制备方法具体方法参考实施例1的指示菌液制备方法；

3.微生物代谢物的收集：具体方法参考实施例1；

4.抑菌活性测定：具体方法参考实施例1；

5.菌株抑菌活性结果：菌株抑菌效果如下表4所示，菌株BV-001-SMX对多种致病菌均具有抑制作用。

表4.菌株对其他致病菌抑制能力

注：^a-c同列肩标不同表示差异显著(P<0.05)

实施例4：

菌株在不同温度下的生长能力测定

1.菌株活化：取冻存菌株划线至固体培养基上，37℃恒温培养活化菌株，挑取单菌落接种至上述液体培养基，220rpm，37℃过夜培养后，以1％的比例转接培养3h；

2.菌株相应温度下的生长测定：冻存菌株活化后，在4℃、6000g下离心 10分钟，收集细菌细胞，并利用PBS溶液洗2次。将100μL菌悬液接种于相应的肉汤培养基中，20℃、30℃、37℃、45℃、50℃、55℃培养3h，培养结束后，检测培养物的OD_600nm值，并接种稀释液100μL至固体培养基上，37℃培养12h，以确定所选菌株的生长情况；

3.菌株生长能力实验结果：贝莱斯芽孢杆菌在不同温度下的生长情况如下表(表5)所示，在一定温度范围内，随着温度升高在相同时间内菌株生长速度加快，但一旦超过温度范围，菌株生长速度放缓。超过55℃，菌株无法生长。

表5贝莱斯芽孢杆菌在不同温度下的生长及存活情况

实施例5：

菌株在不同pH环境下的生长能力测定

1.菌株活化：实验操作方法同实施例4；

2.菌株相应pH条件下的生长测定：冻存菌株活化后，在4℃、6000g下离心10分钟，收集细菌细胞，并利用PBS溶液洗2次。将100μL菌悬液接种于 pH 3.5、4.3、5.1、6、8的肉汤培养基中37℃培养3h，培养结束后，检测培养物的OD_600nm值，并接种稀释液100μL至固体培养基上，37℃培养12h，以确定所选菌株的生长情况；

3.菌株相应pH条件下生长能力实验结果：贝莱斯芽孢杆菌在不同pH条件下的生长情况如下表(表6)所示，结果表明：菌株对酸性环境具有一定的敏感性，当pH低于3.5时菌株无法存活。

表6贝莱斯芽孢杆菌在不同pH条件下的生长及存活情况

实施例6：

菌株在不同NaCl浓度条件下的生长能力测定

1.菌株活化：实验操作方法同实施例4；

2.菌株相应NaCl浓度条件下的生长测定：冻存菌株活化后，在4℃、6000g 下离心10分钟，收集细菌细胞，并利用PBS溶液洗2次。将100μL菌悬液接种于0.9％、2％、3.5％、4％、4.5％、5％、6.5％NaCl浓度条的肉汤培养基中37℃条件下，培养3h。培养结束后，检测培养物的OD_600nm值，并接种稀释液100μL至固体培养基上，37℃培养12h，以确定所选菌株的生长情况；

3.菌株相应NaCl浓度条件下生长能力实验结果：贝莱斯芽孢杆菌在不同 NaCl浓度条件下的生长情况如下表(表7)所示，结果表明：菌株在不同NaCl 浓度条件下均可存活，但随着NaCl浓度的增加，菌株生长速度减慢。

表7贝莱斯芽孢杆菌在不同NaCl浓度条件下的生长及存活情况

实施例7：

菌株溶血活性测定

1.菌株活化：实验操作方法同实施例4；

2.菌株溶血活性测定：冻存菌株活化后，在4℃、6000g下离心10分钟，收集细菌细胞，并利用PBS溶液洗2次。取10μL菌悬液接种至血琼脂培养基上， 37℃培养12h，以大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌作为对照；

3.菌株溶血判定标准：如果菌株发生溶血产生溶血圈，则说明菌株溶血，否则说明无溶血活性，菌株溶血活性如下图(图2)所示。结果表明：菌株 BV-001-SMX无溶血活性。

实施例8：

菌株抗生素敏感性测定

1.菌株活化及浓度调整：菌株活化操作方法同实施例4；然后，将培养液与新的液体培养基混合，重新悬浮，将浓度调整至约10⁵cfu/ml；

2.菌株抗生素敏感性测定：根据欧洲食品安全局(EFSA，2012)的指导方针，用最小抑菌浓度(MIC)评价了该菌株对青霉素、链霉素、卡那霉素、万古霉素、庆大霉素、克林霉素、红霉素和四环素的敏感性。将初始浓度为20mg/l 的梯度抗生素溶液与细菌溶液混合37℃培养20±2h；

3.菌株抗生素敏感性判定标准：根据MIC值，并参考EFSA的菌株抗生素浓度判定值进行判定，如低于该值，说明菌株对该抗生素未超过界定范围，不敏感；

4.菌株抗生素敏感性：结果如下表(表8)所示，菌株对各抗生素均不敏感，低于界定值。

表8贝莱斯芽孢杆菌的抗生素敏感性

注：+,敏感；-,不敏感。

Claims (6)

1.一种具有抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年8月12日，保藏编号为CCTCC M 2019623，分类命名为Bacillusvelezensis BV-001-SMX。

2.根据权利要求1所述的一株具有抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，其生物学特征包括：菌落为白色，边缘不整齐。

3.根据权利要求1所述的一株具有抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：其生长条件为温度20℃-50℃，pH＝5.1-8，NaCl质量浓度0.9％-5％。

4.根据权利要求1所述的一株具有抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，方法如下：取种子液按体积比1％的接种量至培养基中，温度37℃、220r/min条件下摇床振荡培养，所述的培养基采用BHI液体培养基。

5.根据权利要求1所述的一株具有抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，对大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌K99、大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、绿脓杆菌ATCC2785均具有抑菌活性。

6.一种益生菌制剂，其特征在于：含有如权利要求1所述的具有抑制大肠杆菌K88生长的民猪源贝莱斯芽孢杆菌。

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