CN111000987B - 金钱鱼催产用激素试剂盒及批量获得金钱鱼受精卵的人工催产和授精方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种金钱鱼催产用激素试剂盒及批量获得金钱鱼受精卵的人工催产和授精方法，属于水产养殖技术领域。金钱鱼催产用激素试剂盒包括独立分装的促性腺激素释放素A4、马来酸地欧酮和人绒毛膜促性腺激素。本发明基于激素试剂盒，采用三针法对金钱鱼进行人工催产，有效解决效应时间长，雌鱼出现滞产，催产后人工挤卵难度大，有卵块和性腺退化的问题。本发明采用人工授精方法，有效解决了金钱鱼自然产卵卵子过熟或体内溃解，受环境影响大、催产成功率、受精率和孵化率极低，难以批量获得受精卵的难题。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及金钱鱼催产用激素试剂盒及获得批量金钱鱼受精卵的人工催产和授精方法。
背景技术
金钱鱼(Scatophagus argus Linnaeus1766)隶属鲈形目(Perciformes)、刺尾鱼亚目(Acanthuroidei)、金钱鱼科(Scatophagidae)、金钱鱼属(Scatophagus)，广泛分布于印度－太平洋水域，在我国主要分布于东海南部至南海及北部湾区域。金钱鱼体形优美、色彩斑斓，性情温顺，肉质鲜美，是一种具有观赏和食用价值的名贵海水经济鱼类。金钱鱼环境适应性和抗病抗逆性极强，不仅能在海水和咸淡水中生长发育，而且也适宜淡水中养殖，成为近年来我国南方沿海池塘和网箱养殖的重要种类。经济价值极高。
由于雌、雄鱼性腺成熟不同步、卵巢不易充分发育成熟、催产不及时、卵巢很快退化、催产后亲鱼死亡率高等原因，金钱鱼的人工繁殖一直比较困难。目前，金钱鱼的人工繁育己有一些研究，但仍存在较多问题。其亲鱼人工催产方法主要是依靠注射激素，但现有催产方法催产成功率低，自然产卵存在受精率和孵化率都极低的缺点，无法满足规模化生产的需求，因此提高亲鱼促熟催产成功率，是获得大量优质受精卵的关键，进行人工授精是通过构建选育家系方式进行良种选育工作的基础。由于不同的鱼种其催产的激素种类和条件往往会有较大的差别，因此对金钱鱼的人工催产和人工授精方法进行明确十分有必要。目前国内外使用促黄体素释放激素类似物(LHRH-A)、促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)、17α,20β-二羟黄体酮+人绒毛膜促性腺激素(HCG)、褪黑激素(MT)等激素对金钱鱼亲鱼进行人工催产，有些方法未取得实用性成果，有些方法可自然产卵，但受环境影响大催产成功率、受精率和孵化率很低，难以批量获得受精卵，不能满足规模化生产需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种金钱鱼催产用激素试剂盒及批量获得金钱鱼受精卵的人工催产和授精方法，具有催产成功率高，显著提高金钱鱼的受精率和孵化率，实现规模化生产。
本发明提供了一种金钱鱼催产用激素试剂盒，包括独立分装的促性腺激素释放素A4、马来酸地欧酮和人绒毛膜促性腺激素。
优选的，每1kg金钱鱼雌性亲鱼，所述促性腺激素释放素A4的注射用量为23～45μg，所述马来酸地欧酮的注射用量为18～35μg，所述人绒毛膜促性腺激素的注射用量为500～1000IU；每1kg金钱鱼雄性亲鱼，所述促性腺激素释放素A4的注射用量为8～15μg。
优选的，每1kg金钱鱼雌性亲鱼，所述促性腺激素释放素A4的注射用量为35μg，所述马来酸地欧酮的注射用量为25mg，所述人绒毛膜促性腺激素的注射用量为800IU；每1kg金钱鱼雄性亲鱼，所述促性腺激素释放素A4的注射用量为12μg。
本发明提供了所述金钱鱼催产用激素试剂盒进行批量获得金钱鱼受精卵的人工催产和授精方法，包括以下步骤：
1)选择2龄以上、鱼体健康经促熟培育的雌性亲鱼和雄性亲鱼作为待催产亲鱼，将所述雌性亲鱼和雄性亲鱼分开放置；
2)对雌性亲鱼进行第一针激素注射，每1kg体重的雌性亲鱼注射促性腺激素释放素A43～5μg和马来酸地欧酮3～5mg，雄性亲鱼不注射；
3)距第一针激素注射后20～30h进行第二针激素注射，每1kg体重的雌性亲鱼注射促性腺激素释放素A4 5～10μg和马来酸地欧酮5～10mg，每1kg体重的雄性亲鱼注射促性腺激素释放素A4 3～5μg；
4)距所述第二针激素注射后20～30h进行第三针激素注射，每1kg体重的雌鱼亲本注射促性腺激素释放素A4 15～30μg、绒毛膜促性腺激素500～1000IU和马来酸地欧酮10～20mg，每1kg体重的雄鱼亲本注射促性腺激素释放素A4 5～10μg；
5)距所述第三次注射激素后6～12h，分别采集精子和卵子进行人工授精，向得到的受精卵加入新鲜海水静置，将上浮的受精卵置于新鲜海水中充气孵化。
优选的，所述雌性亲鱼的选择标准为雌鱼性腺发育至Ⅳ期，腹部饱满微膨大的金钱鱼；
所述雄性亲鱼的选择标准为压腹部靠近生殖孔位置有白色精液流出的金钱鱼雄鱼。
优选的，所述雌性亲鱼和雄性亲鱼的尾数比为1:2～3。
优选的，所述第一针激素注射、第二针激素注射和第三针激素注射的位置为在胸鳍基部凹陷处腹腔注射。
优选的，所述促性腺激素释放素A4、马来酸地欧酮和绒毛膜促性腺激素均用质量分数0.9％生理盐水溶解成混合药液；每条亲鱼注射混合药液的体积为0.3～1ml。
优选的，采集精子的方法为擦干雄鱼体表水分，挤压雄鱼腹部收集精液，前段混有尿液的精液丢弃不用，用4℃预冷0.9％生理盐水按1:50～100的比例稀释精液；
采集卵子的方法为待雌鱼腹部膨大生殖孔突出，挤压腹部使透明分散卵粒流入新鲜海水中，操作时间不超过1分钟。
优选的，所述人工受精时，卵子和精子原液的体积比为500～1000:1。
本发明提供的金钱鱼催产用激素试剂盒，包括独立分装的促性腺激素释放素A4、马来酸地欧酮和人绒毛膜促性腺激素。经过大量实验验证，使用促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)、马来酸地欧酮(DOM)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)对金钱鱼亲鱼进行人工催产，取得良好的催产效果，实现金钱鱼亲鱼同步成熟、集中产卵。实验结果表明，采用激素试剂盒进行金钱鱼催产，催产成功率达到80％，受精率达79％，孵化率达95％。
本发明提供了金钱鱼受精卵的人工催产和授精方法，本发明采用三针法进行人工催产，有效解决了效应时间长，有些雌鱼出现滞产，催产后人工挤卵难度大，有卵块和性腺退化的问题；同时采用人工授精方法，有效解决了金钱鱼自然产卵卵子过熟或体内溃解，受环境影响大、催产成功率、受精率和孵化率极低，难以批量获得受精卵的难题。
具体实施方式
本发明提供了一种金钱鱼催产用激素试剂盒，包括独立分装的促性腺激素释放素A4、马来酸地欧酮和人绒毛膜促性腺激素。本发明选择促性腺激素释放素A4、马来酸地欧酮和人绒毛膜促性腺激素三种激素配合用于金钱鱼催产，与其他激素组合相比，具有催产成功率更高，金钱鱼亲鱼同步成熟、集中产卵的特点。本发明对所述促性腺激素释放素A4、马来酸地欧酮和人绒毛膜促性腺激素的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的三种激素的来源即可。
在本发明中，每1kg金钱鱼雌性亲鱼，所述促性腺激素释放素A4的注射用量优选为23～45μg，所述马来酸地欧酮的注射用量优选为18～35μg，所述人绒毛膜促性腺激素的注射用量优选为500～1000IU，每1kg金钱鱼雄性亲鱼，所述促性腺激素释放素A4的注射用量优选为8～15μg；更优选的，每1kg金钱鱼雌性亲鱼，所述促性腺激素释放素A4的注射用量为25～35μg，所述马来酸地欧酮的注射用量为20～30mg，所述人绒毛膜促性腺激素的注射用量为700～900IU，每1kg金钱鱼雄性亲本，所述促性腺激素释放素A4的注射用量为10～15μg；最优选的，每1kg金钱鱼雌性亲鱼，所述促性腺激素释放素A4的注射用量为35μg，所述马来酸地欧酮的注射用量为25mg，所述人绒毛膜促性腺激素的注射用量为800IU；每1kg金钱鱼雄性亲鱼，所述促性腺激素释放素A4的注射用量为12μg。三种激素在上述合理的使用浓度范围可诱导繁殖期亲鱼的性激素分泌达到理想的浓度。
本发明提供了所述金钱鱼催产用激素试剂盒进行批量获得金钱鱼受精卵的人工催产和授精方法，包括以下步骤：
1)选择2龄以上、鱼体健康经促熟培育的雌性亲鱼和雄性亲鱼作为待催产亲鱼，将所述雌性亲鱼和雄性亲鱼分开放置；
2)对雌性亲鱼进行第一针激素注射，每1kg体重的雌性亲鱼注射促性腺激素释放素A4 3～5μg和马来酸地欧酮3～5mg，雄性亲鱼不注射；
3)距第一次注射后20～30h进行第二针激素注射，每1kg体重的雌性亲鱼注射促性腺激素释放素A4 5～10μg和马来酸地欧酮5～10mg，每1kg体重的雄性亲鱼注射促性腺激素释放素A4 3～5μg；
4)距所述第二针激素注射后20～30h进行第三针激素注射，每1kg体重的雌鱼亲本注射促性腺激素释放素A4 15～30μg、绒毛膜促性腺激素500～1000IU和马来酸地欧酮10～20mg，每1kg体重的雄鱼亲本注射促性腺激素释放素A45～10μg；
5)距所述第三次注射激素后6～12h，分别采集精子和卵子进行人工授精，向得到的受精卵加入新鲜海水静置，将上浮的受精卵置于新鲜海水中充气孵化。
本发明选择2龄以上、鱼体健康经促熟培育的雌性亲鱼和雄性亲鱼作为待催产亲鱼，将所述雌性亲鱼和雄性亲鱼分开放置。所述雌性亲鱼的选择标准优选为雌鱼性腺发育至Ⅳ期，腹部饱满微膨大的金钱鱼。所述雄性亲鱼的选择标准优选为压腹部靠近生殖孔位置有白色精液流出的金钱鱼雄鱼。本发明对所述金钱鱼亲鱼的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的金钱鱼亲鱼的来源均可。所述雌性亲鱼和雄性亲鱼的尾数比优选为1:2～3，准备合适的雌雄亲鱼比例有利于提高后期催产得到的卵子和精子量达到合适的比例，提高受精率。
得到雌性亲鱼和雄性亲鱼后，本发明对雌性亲鱼进行第一针激素注射，每1kg体重的雌性亲鱼注射促性腺激素释放素A4 3～5μg和马来酸地欧酮3～5mg，雄性亲鱼不注射。
在本发明中，所述第一针激素注射的位置优选在胸鳍基部凹陷处腹腔注射。每1kg体重的雌性亲鱼优选注射促性腺激素释放素A4 4μg和马来酸地欧酮4mg。首先对雌鱼亲鱼注射促性腺激素释放素A4和马来酸地欧酮，诱导雌鱼卵巢进一步发育。
进行第一针激素注射后，本发明距第一针激素注射后20～30h进行第二针激素注射，每1kg体重的雌性亲鱼注射促性腺激素释放素A4 5～10μg和马来酸地欧酮5～10mg，每1kg体重的雄性亲鱼注射促性腺激素释放素A4 3～5μg。
在本发明中，注射后效应时间不足性腺不能充分促熟发育，继续注射药物叠加过量，造成早产不能受精或亲鱼死亡；延后注射药物已经代谢性腺发育停滞甚至退化导致催产失败，因此本发明经过实验验证两次激素注射间隔20～30h有利于提高性腺的促熟发育。距第一针激素注射后优选23～27h进行第二针激素注射。
在本发明中，第二针激素注射，每1kg体重的雌性亲鱼优选注射促性腺激素释放素A4 8μg和马来酸地欧酮8mg，每1kg体重的雄性亲鱼优选注射促性腺激素释放素A4 4μg。雄性亲鱼注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)，能增加雄激素分泌，促进精子形成和排精。
第二针激素注射后，本发明距所述第二针激素注射后20～30h进行第三针激素注射，每1kg体重的雌鱼亲本注射促性腺激素释放素A4 15～30μg、绒毛膜促性腺激素500～1000IU和马来酸地欧酮10～20mg，每1kg体重的雄鱼亲本注射促性腺激素释放素A4 5～10μg。
在本发明中，优选距所述第二针激素注射后23～27h进行第三针激素注射。每1kg体重的雌鱼亲本优选注射促性腺激素释放素A4 18～25μg、绒毛膜促性腺激素700～900IU和马来酸地欧酮12～18mg，每1kg体重的雄鱼亲本注射促性腺激素释放素A4 7～9μg；更优选的，每1kg体重的雌鱼亲本优选注射促性腺激素释放素A4 23μg、绒毛膜促性腺激素800IU和马来酸地欧酮15mg，每1kg体重的雄鱼亲本注射促性腺激素释放素A4 8μg。
在本发明中，将三种激素分别分三针进行间隔注射，并且具体限定每针注射的激素种类和剂量，有利于实现高效催产目的。本发明使用的上述3种激素在鱼体内半衰期很短，金钱鱼催产雌鱼性腺尚未达到Ⅴ期，一次注射或两次注射都不能持续刺激脑垂体分泌激素促进性腺发育成熟并产卵，两次注射激素在鱼体的效应时间也不能达到催产的目的，因此，分三次注射解决了上述问题。所述第三针激素注射的位置优选在胸鳍基部凹陷处腹腔注射。
在本发明中，所述促性腺激素释放素A4、马来酸地欧酮和绒毛膜促性腺激素优选均用质量分数0.9％生理盐水溶解成混合药液；每条亲鱼注射每种混合药液的体积优选为0.3～1ml，更优选为0.4～0.8ml，最优选为0.5ml。
进行第三次注射激素后，本发明距所述第三次注射激素后6～12h，分别采集精子和卵子进行人工授精，向得到的受精卵加入新鲜海水静置，将上浮的受精卵置于新鲜海水中充气孵化。
在本发明中，采集精子的方法优选为擦干雄鱼体表水分，挤压雄鱼腹部收集精液，前段混有尿液的精液丢弃不用，用4℃预冷0.9％生理盐水优选按1:50～100的比例稀释精液，更优选按1:80的比例稀释精液。所述采集卵子的方法优选为待雌鱼腹部膨大生殖孔突出，挤压腹部使透明分散卵粒流入新鲜海水中，操作时间优选不超过1min。所述人工受精时，卵子和精子原液的体积比优选为500～1000:1，更优选为800:1。本发明对所述充气孵化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的充气孵化的方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的金钱鱼催产组合物及批量金钱鱼受精卵的人工催产和授精方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、催产亲鱼的选择
选取2龄以上、鱼体健康、经促熟培育的金钱鱼作为待催产亲鱼，雌鱼性腺发育至Ⅳ期，腹部饱满微膨大，雄鱼轻压腹部靠近生殖孔位置有白色精液流出，雌雄数量比为1：2，雌雄亲鱼分别放置待产池中。
2、三针法人工催产
第一针激素注射：在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼注射药物和剂量为每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)3μg+马来酸地欧酮(DOM)3mg，雄鱼不注射，雌雄亲鱼分别放置于500L孵化桶中暂养便于后面观察与操作；
第二针激素注射：第一次注射后22h，在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)6μg+马来酸地欧酮(DOM)5mg，雄鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)3μg；
第三针药物注射：第二次注射后24h，在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)15μg+绒毛膜促性腺激素(HGG)800IU+马来酸地欧酮(DOM)10mg，雄鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)5μg。
GnRH-A4、DOM和HCG用0.9％生理盐水按照药物剂量稀释，每条亲鱼注射稀释药液0.5ml。
3、人工授精
第三次注射激素后8h，陆续人工挤压采集精子和卵子进行人工授精；
擦干雄鱼体表水分，挤压雄鱼腹部收集精液，用4℃预冷0.9％生理盐水1:100进行稀释，4℃冰箱保存备用；
盆中准备5L新鲜海水，待雌鱼腹部膨大生殖孔突出，轻挤腹部使透明分散卵粒流入盆中，开始挤卵同时倒入30ml准备好的稀释精液进行授精，静置1分钟加入5L新鲜海水，静置1分钟将上浮受精卵置于新鲜海水中充气孵化。
催产10尾雌鱼，20尾雄鱼，催产成功率60％，6尾雌鱼人工授精共获得鱼卵262万粒，受精卵169万粒，孵出仔鱼146万尾，批次受精率和孵化率分别为64.5％，86.4％。
实施例2
1、催产亲鱼的选择
选取2龄以上、鱼体健康、经促熟培育的金钱鱼作为待催产亲鱼，雌鱼性腺发育至Ⅳ期，腹部饱满微膨大，雄鱼轻压腹部靠近生殖孔位置有白色精液流出，雌雄比例为1：2，雌雄亲鱼分别放置待产池中。
2、三针法人工催产
第一针激素注射：在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼注射药物和剂量为每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)5μg+马来酸地欧酮(DOM)3mg，雄鱼不注射，雌雄亲鱼分别放置于500L孵化桶中暂养便于后面观察与操作；
第二针激素注射：第一次注射后25h，在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)10μg+马来酸地欧酮(DOM)7.5mg，雄鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)5μg；
第三针药物注射：第二次注射后24h，在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)20μg+绒毛膜促性腺激素(HGG)1000单位+马来酸地欧酮(DOM)15mg，雄鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)7.5μg。
GnRH-A4、DOM和HCG用0.9％生理盐水按照药物剂量稀释，每条亲鱼注射稀释药液0.6ml。
3、人工授精
第三次注射激素后6h，陆续人工挤压采集精子和卵子进行人工授精；
擦干雄鱼体表水分，挤压雄鱼腹部收集精液，用4℃预冷0.9％生理盐水1:100进行稀释，4℃冰箱保存备用；
盆中准备5L新鲜海水，待雌鱼腹部膨大生殖孔突出，轻挤腹部使透明分散卵粒流入盆中，操作时间不超过1分钟，开始挤卵同时倒入40ml准备好的稀释精液进行授精，静置1.5分钟加入10L新鲜海水，静置1.5分钟将上浮受精卵置于新鲜海水中充气孵化。
催产8尾雌鱼，16尾雄鱼，催产成功率75％，6尾雌鱼人工授精共获得鱼卵271万粒，受精卵215万粒，孵出仔鱼206万尾，批次受精率和孵化率分别为79.3％，95.8％。
实施例3
1、催产亲鱼的选择
选取2龄以上、鱼体健康、经促熟培育的金钱鱼作为待催产亲鱼，雌鱼性腺发育至Ⅳ期，腹部饱满微膨大，雄鱼轻压腹部靠近生殖孔位置有白色精液流出，雌雄比例为1：3，雌雄亲鱼分别放置待产池中。
2、三针法人工催产
第一针激素注射：在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼注射药物和剂量为每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)5μg+马来酸地欧酮(DOM)5mg，雄鱼不注射，雌雄亲鱼分别放置于500L孵化桶中暂养便于后面观察与操作；
第二针激素注射：第一次注射后30h，在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)10μg+马来酸地欧酮(DOM)10mg，雄鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)5μg；
第三针药物注射：第二次注射后26h，在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)30μg+绒毛膜促性腺激素(HGG)500IU+马来酸地欧酮(DOM)20mg，雄鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)10μg。
GnRH-A4、DOM和HCG用0.9％生理盐水按照药物剂量稀释，每条亲鱼注射稀释药液1ml。
3、人工授精
第三次注射激素后8h，陆续人工挤压采集精子和卵子进行人工授精；
擦干雄鱼体表水分，挤压雄鱼腹部收集精液，用4℃预冷0.9％生理盐水1:100进行稀释，4℃冰箱保存备用；
盆中准备3L新鲜海水，待雌鱼腹部膨大生殖孔突出，轻挤腹部使透明分散卵粒流入盆中，操作时间不超过1分钟，开始挤卵同时倒入50ml准备好的稀释精液进行授精，静置2分钟加入5L新鲜海水，静置2分钟将上浮受精卵置于新鲜海水中充气孵化。
结果：催产5尾雌鱼，15尾雄鱼，催产成功率80％，4尾雌鱼人工授精共获得鱼卵169万粒，受精卵103万粒，孵出仔鱼89万尾，批次受精率和孵化率分别为60.9％，86.4％。
对比例1
1、催产亲鱼的选择
选取2龄以上、鱼体健康、经促熟培育的金钱鱼作为待催产亲鱼，雌鱼性腺发育至Ⅳ期，腹部饱满微膨大，雄鱼轻压腹部靠近生殖孔位置有白色精液流出，雌雄比例为1：3，雌雄亲鱼分别放置待产池中。
2、二针法人工催产
第一针激素注射：在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)10μg+马来酸地欧酮(DOM)7.5mg，雄鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)5μg；
第二针药物注射：第二次注射后24h，在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)20μg+绒毛膜促性腺激素(HGG)1000单位+马来酸地欧酮(DOM)15mg，雄鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)7.5μg。
GnRH-A4、DOM和HCG用0.9％生理盐水按照药物剂量稀释，每条亲鱼注射稀释药液0.6ml。
3、人工授精
第二次注射激素后6h，陆续人工挤压采集精子和卵子进行人工授精；
擦干雄鱼体表水分，挤压雄鱼腹部收集精液，用4℃预冷0.9％生理盐水1:100进行稀释，4℃冰箱保存备用；
盆中准备5L新鲜海水，待雌鱼腹部膨大生殖孔突出，轻挤腹部使透明分散卵粒流入盆中，操作时间不超过1分钟，开始挤卵同时倒入40ml准备好的稀释精液进行授精，静置1.5分钟加入10L新鲜海水，静置1.5分钟将上浮受精卵置于新鲜海水中充气孵化。
结果：催产5尾雌鱼，15尾雄鱼，催产成功率20％，1尾雌鱼人工授精共获得鱼卵39万粒，受精卵8.6万粒，孵出仔鱼4.2万尾，受精率和孵化率分别为22.1％，48.8％。部分雌鱼腹部膨大至一定程度后性腺不再继续发育逐渐吸收变小恢复至催产前状态，催产成功率极低。
对比例2
1、催产亲鱼的选择
选取2龄以上、鱼体健康、经促熟培育的金钱鱼作为待催产亲鱼，雌鱼性腺发育至Ⅳ期，腹部饱满微膨大，雄鱼轻压腹部靠近生殖孔位置有白色精液流出，雌雄比例为1：2，雌雄亲鱼分别放置待产池中。
2、三针法人工催产
第一针激素注射：在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼注射药物和剂量为每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)5μg+马来酸地欧酮(DOM)3mg，雄鱼不注射，雌雄亲鱼分别放置于500L孵化桶中暂养便于后面观察与操作；
第二针激素注射：第一次注射后25h，在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)10μg+马来酸地欧酮(DOM)7.5mg，雄鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)5μg；
第三针药物注射：第二次注射后24h，在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)20μg+马来酸地欧酮(DOM)15mg，雄鱼每1kg体重注射促性腺激素释放素A4(GnRH-A4)7.5μg。
GnRH-A4和DOM用0.9％生理盐水按照药物剂量稀释，每条亲鱼注射稀释药液0.6ml。
3、人工授精
第三次注射激素后9h后，陆续人工挤压采集精子和卵子进行人工授精；
擦干雄鱼体表水分，挤压雄鱼腹部收集精液，用4℃预冷0.9％生理盐水1:100进行稀释，4℃冰箱保存备用；
盆中准备5L新鲜海水，待雌鱼腹部膨大生殖孔突出，轻挤腹部使透明分散卵粒流入盆中，操作时间不超过1分钟，开始挤卵同时倒入40ml准备好的稀释精液进行授精，静置1.5分钟加入10L新鲜海水，静置1.5分钟将上浮受精卵置于新鲜海水中充气孵化。
结果：催产6尾雌鱼，12尾雄鱼，催产成功率33.3％，2尾雌鱼人工授精共获得鱼卵92万粒，受精卵6.8万粒，孵出仔鱼1.9万尾，批次受精率和孵化率分别为7.4％，27.9％。显微镜观察发现大部分卵子内部结构崩解，大部分受精卵胚胎发育异常，发育至原肠期后陆续死亡。
对比例3
1、催产亲鱼的选择
选取2龄以上、鱼体健康、经促熟培育的金钱鱼作为待催产亲鱼，雌鱼性腺发育至Ⅳ期，腹部饱满微膨大，雄鱼轻压腹部靠近生殖孔位置有白色精液流出，雌雄比例为1：2，雌雄亲鱼分别放置待产池中。
2、三针法人工催产
第一针激素注射：在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼注射药物和剂量为每1kg体重注射绒毛膜促性腺激素(HGG)200IU+马来酸地欧酮(DOM)3mg，雄鱼不注射，雌雄亲鱼分别放置于500L孵化桶中暂养便于后面观察与操作；
第二针激素注射：第一次注射后24h，在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射绒毛膜促性腺激素(HGG)500IU+马来酸地欧酮(DOM)7.5mg，雄鱼每1kg体重注射绒毛膜促性腺激素(HGG)200IU；
第三针药物注射：第二次注射后24h，在胸鳍基部凹陷处腹腔注射，雌鱼每1kg体重注射绒毛膜促性腺激素(HGG)1000IU+马来酸地欧酮(DOM)15mg，雄鱼每1kg体重注射绒毛膜促性腺激素(HGG)500IU。
DOM和HCG用0.9％生理盐水按照药物剂量稀释，每条亲鱼注射稀释药液0.6ml。
结果：催产6尾雌鱼，12尾雄鱼，雄鱼可以挤出精液，仅1条雌鱼腹部微膨胀后又恢复扁平状，催产失败未能进行人工授精。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种基于金钱鱼催产用激素试剂盒进行批量获得金钱鱼受精卵的人工催产和授精方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）选择2龄以上、鱼体健康经促熟培育的雌性亲鱼和雄性亲鱼作为待催产亲鱼，将所述雌性亲鱼和雄性亲鱼分开放置；
2）对雌性亲鱼进行第一针激素注射，每1kg体重的雌性亲鱼注射促性腺激素释放素A43~5μg和马来酸地欧酮3~5mg，雄性亲鱼不注射；
3）距第一针激素注射后20~30h进行第二针激素注射，每1kg体重的雌性亲鱼注射促性腺激素释放素A4 5~10μg和马来酸地欧酮5~10mg，每1kg体重的雄性亲鱼注射促性腺激素释放素A4 3~5μg；
4）距所述第二针激素注射后20~30h进行第三针激素注射，每1kg体重的雌鱼亲本注射促性腺激素释放素A415~30μg、绒毛膜促性腺激素500~1000IU和马来酸地欧酮10~20mg，每1kg体重的雄鱼亲本注射促性腺激素释放素A4 5~10μg；
5）距所述第三次注射激素后6～12h，分别采集精子和卵子进行人工授精，向得到的受精卵加入新鲜海水静置，将上浮的受精卵置于新鲜海水中充气孵化；
所述试剂盒包括独立分装的促性腺激素释放素A4、马来酸地欧酮和人绒毛膜促性腺激素。
2.根据权利要求1所述人工催产和授精方法，其特征在于，所述雌性亲鱼的选择标准为雌鱼性腺发育至Ⅳ期，腹部饱满微膨大的金钱鱼；
所述雄性亲鱼的选择标准为压腹部靠近生殖孔位置有白色精液流出的金钱鱼雄鱼。
3.根据权利要求1或2所述人工催产和授精方法，其特征在于，所述雌性亲鱼和雄性亲鱼的尾数比为1:2~3。
4.根据权利要求1所述人工催产和授精方法，其特征在于，所述第一针激素注射、第二针激素注射和第三针激素注射的位置为在胸鳍基部凹陷处腹腔注射。
5.根据权利要求1所述人工催产和授精方法，其特征在于，所述促性腺激素释放素A4、马来酸地欧酮和绒毛膜促性腺激素均用质量分数0.9%生理盐水溶解成混合药液；每条亲鱼注射混合药液的体积为0.3~1ml。
6.根据权利要求1所述人工催产和授精方法，其特征在于，采集精子的方法为擦干雄鱼体表水分，挤压雄鱼腹部收集精液，前段混有尿液的精液丢弃不用，用4℃预冷0.9%生理盐水按1:50~100的比例稀释精液；
采集卵子的方法为待雌鱼腹部膨大生殖孔突出，挤压腹部使透明分散卵粒流入新鲜海水中，操作时间不超过1分钟。
7.根据权利要求1或6所述人工催产和授精方法，其特征在于，所述人工受精时，卵子和精子原液的体积比为500~1000:1。
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