CN110996981A - 博伊森莓、苹果和黑加仑组合物以及其制备方法和用途 - Google Patents

博伊森莓、苹果和黑加仑组合物以及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本公开包括由博伊森莓和苹果制得的组合物，以及由博伊森莓、苹果和黑加仑制得的组合物。本公开还包括制备这些组合物的方法以及使用这些组合物的方法，特别是用于治疗或预防呼吸系统病症，其包括但不限于：炎症、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、过敏性气道炎症、反应性气道疾病、气道纤维化以及气道重塑。

Description

博伊森莓、苹果和黑加仑组合物以及其制备方法和用途
相关应用
本申请要求于2017年8月8日提交的新西兰专利申请号734440的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及由博伊森莓和苹果制得的组合物，以及由博伊森莓、苹果和黑加仑制得的组合物。本公开还涉及制备此类组合物的方法，以及使用此类组合物的方法，包括治疗或预防呼吸道病症(诸如呼吸道的炎症病况，包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、过敏性气道炎症、反应性气道疾病、气道纤维化、气道重塑和导致这些病况的生理条件)的方法。
背景技术
气道重塑被理解为由于慢性炎症过程导致气道壁结构改变而导致的气道功能的进行性和不可逆性下降(67)。气道重塑可能涉及到气道壁的所有层，并可能发生在呼吸道从大气道到小气道的任意位置。重塑导致上皮组织的关键变化(68)。受损的上皮细胞释放促纤维化细胞因子，其包括EGF和TGF-β，导致成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞活化，并最终形成上皮下纤维化(69)。气道平滑肌肥大和增生导致气道壁增厚。反过来，这会导致肺功能加速下降和不可逆或仅部分可逆的气流阻塞。
引起气道炎症的急性病症包括哮喘和COPD。据估计，全世界有1.5亿人患有哮喘，儿童患病率为5-15％(61)。COPD的患病率估计在15-20％之间，并且据估计，每年会造成275万人死亡(86)。在慢性哮喘的情况下，有累积的组织重塑、纤维化并随之失去肺功能的证据(45,59)。纤维化和重塑也与COPD有关。重塑表现为呼吸困难等症状的进行性增加和相应的支气管扩张反应性降低(67)。目前的哮喘治疗旨在管理炎症，减轻哮喘发作的症状和严重程度(30,43)。COPD治疗也旨在控制炎症和改善气流。然而，目前还没有哮喘或COPD药物可以预防气道重塑(70-74)，也没有有效的治疗方法来预防异常重塑。
哮喘的发病机制和肺组织重塑与肺中促纤维化、精氨酸酶阳性、交替激活的巨噬细胞(AAM)增多有关(27,29,34)。然而，博莱霉素诱导肺纤维化模型中巨噬细胞数量的暂时性耗竭说明肺巨噬细胞也可能发展有助于肺纤维化解决的纤维分解功能(14)。
组织重塑的介质(诸如基质金属蛋白酶(MMP))在调节纤维化中发挥重要作用(5,7,8,10,38)。其中，MMP-9被广泛报道在肺炎症和纤维化的情况下增加，并与哮喘患者的症状改善有关(25,32,33)。MMP-9与其他MMP协同作用，发挥纤维分解活性，导致变性胶原的分解，从而缓解不适当的肺重塑(5,60)。因此，MMP-9可能是限制慢性哮喘和其他肺部疾病等肺损伤的一个可能的治疗靶点。
大型流行病学研究发现，水果和蔬菜的摄取量增加与哮喘症状的减轻有关(39,46,47)。这些群体研究发现，富含多酚的食物(诸如苹果、梨(13,51,62)、胡萝卜、西红柿(46-48)和柑橘(11))与报告的哮喘症状，特别是喘息和咳嗽症状(11,13,46,47)的频率和严重程度成反比。然而，富含多酚的水果对肺纤维化和组织重塑的作用尚不清楚。迄今为止，还没有成功的预防气道重塑的方法。
鉴于群体中呼吸系统病症(包括与哮喘相关的过敏性气道炎症、COPD、反应性气道疾病、气道纤维化和气道重塑)的发生，需要新的组合物，特别是源自自然来源的组合物，以恢复和维持呼吸系统健康。
发明内容
在一个方面，本发明包含一种治疗或预防呼吸道炎症的方法，其包括：向受试者给予包含博伊森莓和苹果浓缩物或博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物的组合物，从而治疗或预防该受试者呼吸道的炎症。
还包括一种组合物，例如，营养药物组合物，其包含用于治疗或预防受试者呼吸道炎症的博伊森莓和苹果浓缩物或博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物。
在另一方面，本发明包含一种治疗或预防哮喘的方法，其包括：向受试者给予包含博伊森莓和苹果浓缩物或博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物的组合物，从而治疗或预防该受试者的哮喘。
还包括组合物，例如，营养药物组合物，其包含用于治疗或预防受试者哮喘的博伊森莓和苹果浓缩物或博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物。
在又一方面，本发明包含一种治疗或预防慢性阻塞性肺疾病的方法，其包括：向受试者给予包含博伊森莓和苹果浓缩物或博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物的组合物，从而治疗或预防该受试者的慢性阻塞性肺疾病。
还包括组合物，例如，营养药物组合物，其包含用于治疗或预防受试者慢性阻塞性肺疾病的博伊森莓和苹果浓缩物或博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物。
还在另一方面，本发明包含一种治疗或预防呼吸道中异常胶原沉积或纤维化的方法，其包括：向受试者给予包含博伊森莓和苹果浓缩物或博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物的组合物，从而治疗或预防该受试者呼吸道中异常胶原沉积或纤维化。
还包括组合物，例如，营养药物组合物，其包含用于治疗或预防受试者体内异常胶原沉积或纤维化的博伊森莓和苹果浓缩物或博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物。
甚至在另一方面，本发明包含一种治疗或预防气道重塑的方法，其包括：向受试者给予包含博伊森莓和苹果浓缩物或博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物的组合物，从而治疗或预防该受试者气道重塑。
还包括组合物，例如，营养药物组合物，其包含用于治疗或预防受试者气道重塑的博伊森莓和苹果浓缩物或博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物。
在各个方面：
该组合物包括博伊森莓汁浓缩物、博伊森莓泥或博伊森莓粉。
该组合物包括苹果汁浓缩物、苹果泥或苹果粉。
该组合物包括黑加仑汁浓缩物、黑加仑泥或黑加仑粉。
该组合物包括剂量单位，所述剂量单位包括约5至约500mg总花青苷。
对于包含博伊森莓和苹果浓缩物的营养药物组合物，该组合物包括剂量单位，该剂量单位包括约5至约500mg总博伊森莓花青苷。
对于包含博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物的营养药物组合物，该组合物包括剂量单位，该剂量单位包括约5至约500mg总博伊森莓和黑加仑花青苷。
该组合物是为肠内给药而配制的。
该组合物是为口服而配制的。
该组合物被配制成糖浆或滴剂。
该组合物被配制成凝胶或冻胶。
该组合物被配制成片剂或胶囊。
该组合物被配制成以约0.1mg/kg至约10mg/kg总花青苷/受试者体重的剂量给药。
对于包含博伊森莓和苹果浓缩物的营养药物组合物，该组合物被配制成以约0.1mg/kg至约10mg/kg总博伊森莓花青苷/受试者体重的剂量给药。
对于包含博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物的营养药物组合物，该组合物被配制成以约0.1mg/kg至约10mg/kg总博伊森莓和黑加仑花青苷/受试者体重的剂量给药。
该组合物配制成以每天约10mg至约1000mg总花青苷的剂量给药。
对于包含博伊森莓和苹果浓缩物的营养药物组合物，该组合物被配制成以每天约10mg至约1000mg总博伊森莓花青苷的剂量给药。
对于包含博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物的营养药物组合物，该组合物被配制成以每天约10mg至约1000mg总博伊森莓和黑加仑花青苷的剂量给药。
或者，剂量为每天约10mg至约200mg总花青苷，或每天约50mg总花青苷。
对于包含博伊森莓和苹果浓缩物的营养药物组合物，剂量为每天约10mg至约200mg总博伊森莓花青苷，或每天约50mg总博伊森莓花青苷。
对于包含博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物的营养药物组合物，剂量为每天约10mg至约200mg总博伊森莓和黑加仑花青苷，或每天约50mg总博伊森莓和黑加仑花青苷。
该组合物包括添加的多酚。
该组合物配制用于与进一步的呼吸助剂共同给药。
该组合物配制用于与一种或多种慢性呼吸系统病症治疗方案共同给予。
该炎症与慢性呼吸系统病症有关。
该炎症与如下一种或多种有关：哮喘、慢性阻塞性肺疾病、过敏性气道炎症、反应性气道疾病、气道纤维化和气道重塑。
该哮喘是特应性或非特应性的。
该哮喘与气道纤维化或气道重塑有关。
该慢性阻塞性肺疾病与吸烟或污染有关。
该慢性阻塞性肺疾病与气道纤维化或气道重塑有关。
该异常胶原沉积或该纤维化与慢性呼吸系统病症有关。
该异常胶原沉积或该纤维化与哮喘或慢性阻塞性肺疾病有关。
该气道重塑与慢性呼吸系统病症有关。
该气道重塑与以下一种或多种有关：哮喘和慢性阻塞性肺疾病。
还在一进一步的方面，本发明包括使用包含博伊森莓和苹果浓缩物或博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物的组合物来制备用于以下的营养药物组合物：
(i)治疗或预防受试者的呼吸道炎症；
(ii)治疗或预防受试者的哮喘；
(iii)治疗或预防受试者的慢性阻塞性肺疾病；
(iv)治疗或预防受试者的过敏性气道炎症；
(v)治疗或预防受试者的反应性气道疾病；
(vi)治疗或防止受试者的异常胶原沉积；
(vii)治疗或预防受试者呼吸道中的纤维化；
(viii)治疗或预防受试者的气道重塑。
在各个方面，如上文所述，治疗用途采用组合物、剂量和配方，并且与各种病症相关。
上述概要概括地描述了本发明的某些实施例的特征和技术优势。进一步的技术优势将在本发明的详细描述和下面的实例中进行描述。
当结合任何附图和实例考虑时，将从本发明的详细描述中更好地理解被认为是本发明的特征的新颖特征。然而，本文提供的图和实例旨在帮助说明本发明或帮助形成对本发明的理解，并且不旨在限制本发明的范围。
附图简要说明
图1A-D.治疗性口服博伊森莓治疗减少了OVA诱导的慢性肺炎症。A：用OVA/明矾将6周龄雄性C57Bl/6小鼠(n＝10/组)经腹腔内致敏(第0天)，然后每隔7天用OVA经鼻内激发，进行10周。从第6周到第10周，在每次经鼻内OVA激发前1小时和每次经鼻内OVA激发后2天经口给予(管饲法)博伊森莓汁。B：未经处理(naive)、仅10周OVA激发(OVA)、用治疗性博伊森莓治疗进行10周OVA激发(OVA BoysB)以及单纯博伊森莓(BoysB)治疗的小鼠的肺组织的代表性H&E染色。箭头和*指示免疫细胞浸润。放大率X4(顶部)和X10(底部)。C：肺组织的代表性AB-PAS染色。箭头指示深紫色粘液阳性细支气管。放大率X4(顶部)和X20(底部)。D：每mlBALF的总细胞数和最终OVA激发后BALF中嗜酸性粒细胞百分比的流式细胞术定量。用图基事后检验(Tukey’s post hoc test)的单向方差分析**P<0.01，***P<0.001(n＝10/组)，比较了未经处理与OVA激发与治疗性博伊森莓处理以及仅博伊森莓处理的小鼠相。
图2A-D.在OVA诱导的慢性肺炎症过程中，博伊森莓治疗增加了肺组织中精氨酸酶的表达和巨噬细胞的积聚。A：有和无博伊森莓治疗时10周OVA激发的小鼠肺组织的代表性H&E染色。箭头指示巨噬细胞。放大率X100，刻度200μm。B：肺组织iNOS(135kDa)和精氨酸酶(37kDa)表达的代表性Western blot分析。同样的Western blot也显示出非相邻的条带。C和D：标准化为β-肌动蛋白信号的iNOS和精氨酸酶Western blot信号的定量。图基事后检验的单向方差分析**P<0.01(n＝10/组)。
图3A-B.在OVA诱导的慢性肺炎症过程中，博伊森莓治疗增加了精氨酸酶+交替激活的巨噬细胞的积聚。有和无博伊森莓治疗时10周OVA激发的小鼠肺组织的代表性免疫荧光标记。A：由*识别的CD68+CD206+巨噬细胞。B：由*识别的CD206+精氨酸酶+巨噬细胞。DAPI核染色(深蓝色)。放大率X40，刻度200μm。
图4A-E.在OVA诱导的慢性肺炎症过程中，博伊森莓治疗减少了的胶原沉积，增加了肺组织中MMP-9蛋白质的表达。A：代表性马森三色染色。放大率X40，刻度200μm。B：羟脯氨酸水平(mg/g肺组织)；图基事后检验的单向方差分析***P<0.001(n＝10)。C：ELISA测定的肺TGFβ浓度；图基事后检验的单向方差分析*P<0.05(n＝10/组)。D：有和无博伊森莓治疗时10周OVA激发的小鼠肺组织的MMP-9(pro 105kDa；活性92kDa)和TIMP-1(29kDa)的表达(示出来自相同Western blot的非相邻条带)的Western blot分析。E：标准化为β-肌动蛋白负荷对照的TIMP-1/MMP-9蛋白质表达的比值；与未经处理和OVA加博伊森莓治疗相比，图基事后检验的单向方差分析**P<0.01(n＝10)。
图5A-B.在OVA诱导的慢性肺炎症过程中，博伊森莓治疗通过交替激活的肺组织中的巨噬细胞增加了MMP-9的表达。A：MMP-9+巨噬细胞的DAB标记(箭头)。B：CD206+MMP-9+巨噬细胞的免疫荧光标记(*)。DAPI核染色(深蓝色)。放大率X40，刻度200μm。
图6A-B.肺巨噬细胞的耗竭减少口服博伊森莓治疗对OVA诱导的慢性肺炎症的作用。A：用OVA/明矾将6周龄雄性C57Bl/6小鼠(n＝10/组)经腹腔内致敏(第0天)，然后每隔7天用OVA经鼻内激发，进行5周。从第6周到第7周，在经口给予(管饲法)博伊森莓汁前一天，用氯膦酸盐脂质体(CloLip)耗竭巨噬细胞。B：最终氯膦酸盐巨噬细胞耗竭后BALF中巨噬细胞百分比的流式细胞术定量；图基事后检验的单向方差分析*P<0.05(n＝10/组)。C：肺中羟脯氨酸水平(mg/g肺组织)；图基事后检验的单向方差分析*P<0.05(n＝10/组)。
图7A-G.预防性口服博伊森莓治疗减少了OVA诱导的慢性肺炎症和胶原沉积。A：用OVA/明矾将6周龄雄性C57Bl/6小鼠(n＝10/组)经腹腔内致敏，然后每隔7天用OVA经鼻内激发，进行5周。每次经鼻内OVA激发1小时前和2天后经口给予(管饲法)博伊森莓汁。B：用每mlBALF的总细胞染色肺组织及最终OVA激发后BALF中嗜酸性粒细胞百分比的流式细胞术定量；图基事后检验的单向方差分析*P<0.05，**P<0.01(n＝10/组)。C：AB-PAS，深紫色粘液阳性细支气管(箭头)；放大率X20，刻度200μm。D：马森三色；放大率X40，刻度200μm。E：肺中羟脯氨酸水平(mg/g肺组织)。图基事后检验的单向方差分析*P<0.05，**P<0.01(n＝10/组)。F：iNOS、精氨酸酶、MMP-9和TIMP-1肺组织的Western blot分析。同样的Western blot也显示出非相邻的条带。G：标准化为β-肌动蛋白负荷对照的TIMP-1/MMP-9蛋白水平的比值。图基事后检验的单向方差分析*P<0.05(n＝10/组)。图4：试验治疗、冲洗和取样点示意图。
图8.在急性过敏性气道炎症模型中测试博伊森莓治疗组合的实验示意图。
图9.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗减少了急性过敏性气道炎症模型中的免疫细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性气道浸润后总细胞向肺的浸润。在OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数(n＝10/干预组)。
图10.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗减少了急性过敏性气道炎症模型中的嗜酸性粒细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性气道浸润后嗜酸性粒细胞向肺的浸润。在OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)嗜酸性粒细胞总数(n＝10/干预组)。BerriQiTM浓缩物和其他浓缩物在下面的实例2中进行描述。
图11.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗急性过敏性气道炎症模型。苹果治疗后肺组织的苏木精和伊红染色。
图12.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗急性过敏性气道炎症模型。博伊森莓治疗后肺组织的苏木精和伊红染色。
图13.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗急性过敏性气道炎症模型。BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗后肺组织的苏木精和伊红染色。(A,E)未经处理、(B,F)OVA、(C,G)BerriQiTM博伊森莓与苹果10以及(D,H)BerriQiTM博伊森莓与苹果1的代表性10X(A–D)和20X(E–H)图像。免疫细胞呈深粉红色/紫色簇状。
图14.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗减少了急性过敏性气道炎症模型中的中性粒细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性气道浸润后中性粒细胞向肺的浸润。在OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞总数(n＝10/干预组)。
图15.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗减少了急性过敏性气道炎症模型中的单核细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性气道浸润后单核细胞向肺的浸润。在OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)单核细胞总数(n＝10/干预组)。
图16.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗减少了急性过敏性气道炎症模型中的抗原呈递细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性气道浸润后抗原呈递细胞(APC)向肺的浸润。在OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)APC总数(n＝10/干预组)。
图17.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗急性过敏性气道炎症模型。苹果治疗后肺组织的阿辛蓝/过碘酸希夫淀粉酶染色。
图18.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗急性过敏性气道炎症模型。博伊森莓治疗后肺组织的阿辛蓝/过碘酸希夫淀粉酶染色。
图19.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗急性过敏性气道炎症模型。BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗后肺组织的阿辛蓝/过碘酸希夫淀粉酶染色。(A,E)未经处理、(B,F)OVA、(C,G)BerriQiTM博伊森莓与苹果10以及(D,H)BerriQiTM博伊森莓与苹果1的代表性10X(A–D)和20X(E–H)图像。粘液阳性杯状细胞呈深紫色。
图20.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗急性过敏性气道炎症模型。苹果治疗后肺组织的马森三色染色。
图21.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗急性过敏性气道炎症模型。博伊森莓治疗后肺组织的马森三色染色。
图22.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗急性过敏性气道炎症模型。BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗后肺组织的马森三色染色。(A,E)未经处理、(B,F)OVA、(C,G)BerriQiTM博伊森莓与苹果10以及(D,H)BerriQiTM博伊森莓与苹果1的代表性10X(A–D)和20X(E–H)图像。
图23.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗急性过敏性气道炎症模型。博伊森莓、苹果以及BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗后的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子水平。
图24.用BerriQiTM博伊森莓与苹果给药治疗急性过敏性气道炎症模型。博伊森莓、苹果以及BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗后的CCL11水平。
图25.用BerriQiTM博伊森莓与苹果(BA)给药治疗减少了慢性过敏性气道炎症模型中的免疫细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后总细胞向肺的浸润。在最后一次OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数。数据为平均值±SEM(n＝20/干预组)。与OVA相比，P<0.05，P<0.001；与未经处理相比，P<0.01。
图26.用BerriQiTM博伊森莓与苹果(BA)给药治疗减少了慢性过敏性气道炎症模型中的嗜酸性粒细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后嗜酸性粒细胞向肺的浸润。在最后一次OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞中嗜酸性粒细胞的数量。数据为平均值±SEM(n＝20/干预组)。与未经处理状态相比，P<0.001。
图27.用BerriQiTM博伊森莓与苹果(BA)给药治疗减少了慢性过敏性气道炎症模型中的抗原呈递细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后抗原呈递细胞(APC)向肺的浸润。在最后一次OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞中APC的数量。数据为平均值±SEM(n＝20/干预组)。与未经处理状态相比，P<0.01。
图28.用BerriQiTM博伊森莓与苹果(BA)给药治疗减少了慢性过敏性气道炎症模型中的单核细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后单核细胞向肺的浸润。在最后一次OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞中单核细胞的数量。数据为平均值±SEM(n＝20/干预组)。
图29.在慢性过敏性气道炎症模型中用BerriQiTM博伊森莓与苹果(BA)给药治疗。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后用苏木精和伊红染色的肺组织切片的显微照片。用OVA/明矾将小鼠经腹腔内致敏，然后7天后用OVA经鼻内激发，进行10周。5周后，于OVA激发2天前、OVA激发1小时前和激发后2天分别以管饲法对小鼠进行如下处理：不经口喂食任何东西(A-未经处理)，经口喂食水(B-OVA对照)、100％(C)50％(D)或25％(E)BerriQiTM博伊森莓与苹果，进行5周。
图30.在慢性过敏性气道炎症模型中用BerriQiTM博伊森莓与苹果(BA)给药治疗。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后经肺组织阿辛蓝/过碘酸希夫淀粉酶染色的肺组织切片的显微照片。用OVA/明矾将小鼠经腹腔内致敏，然后7天后用OVA经鼻内激发，进行10周。5周后，于OVA激发2天前、OVA激发1小时前和激发后2天分别以管饲法对小鼠进行如下处理：不经口喂食任何东西(A-未经处理)，经口喂食水(B-OVA对照)、100％(C)50％(D)或25％(E)BerriQiTM博伊森莓与苹果，进行5周。
图31.在慢性过敏性气道炎症模型中用BerriQiTM博伊森莓与苹果(BA)给药治疗。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后经肺组织马森三色染色的肺组织切片的显微照片。用OVA/明矾将小鼠经腹腔内致敏，然后7天后用OVA经鼻内激发，进行10周。5周后，于OVA激发2天前、OVA激发1小时前和激发后2天分别以管饲法对小鼠进行如下处理：不经口喂食任何东西(A-未经处理)，经口喂食水(B-OVA对照)、100％(C)50％(D)或25％(E)BerriQiTM博伊森莓与苹果，进行5周。
图32.在慢性过敏性气道炎症模型中用BerriQiTM博伊森莓与苹果(BA)给药治疗。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后肺中胶原的定量。用OVA/明矾将小鼠经腹腔内致敏，然后7天后用OVA经鼻内激发，进行10周。5周后，于OVA激发2天前、OVA激发1小时前和激发后2天分别以管饲法对小鼠进行如下处理：不经口喂食任何东西(未经处理)，经口喂食水(OVA对照)、100％、50％或25％BerriQiTM博伊森莓与苹果(BA)，进行5周。在最后一次OVA激发后4天用羟脯氨酸测定法测定胶原。数据为平均值±SEM(n＝20/干预组)。与所有其他治疗组相比，P<0.001。
图33.用BerriQiTM博伊森莓与黑加仑和苹果(BBA)给药治疗减少了慢性过敏性气道炎症模型中的免疫细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后总细胞向肺的浸润。在最后一次OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数(n＝20/干预组)。
图34.用BerriQiTM博伊森莓与黑加仑和苹果(BBA)给药治疗减少了慢性过敏性气道炎症模型中的嗜酸性粒细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后嗜酸性粒细胞向肺的浸润。在最后一次OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞中嗜酸性粒细胞的数量(n＝20/干预组)。与未经处理状态相比，P<0.001。
图35.用BerriQiTM博伊森莓与黑加仑和苹果(BBA)给药治疗减少了慢性过敏性气道炎症模型中的抗原呈递细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后抗原呈递细胞(APC)向肺的浸润。在最后一次OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞中APC的数量(n＝20/干预组)。与OVA相比，P<0.001，P<0.01。
图36.用BerriQiTM博伊森莓与黑加仑和苹果(BBA)给药治疗减少了慢性过敏性气道炎症模型中的单核细胞数量。卵清蛋白(OVA)诱导的慢性过敏性气道浸润后单核细胞向肺的浸润。在最后一次OVA激发后4天测定支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞中单核细胞的数量(n＝20/干预组)。
图37.在慢性过敏性气道炎症模型中，用BerriQiTM博伊森莓与黑加仑和苹果(BBA)给药治疗。卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性气道浸润后肺组织的苏木精和伊红染色。用OVA/明矾将小鼠经腹腔内致敏，然后7天后用OVA经鼻内激发，进行10周。5周后，于OVA激发2天前、OVA激发1小时前和激发后2天分别以管饲法对小鼠进行如下处理：不经口喂食任何东西(未经处理)，经口喂食水(OVA对照)、100％BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑(OVA+100％)，进行5周。
图38.在慢性过敏性气道炎症模型中，用BerriQiTM博伊森莓与黑加仑和苹果(BBA)给药治疗。卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性气道浸润后肺组织的阿辛蓝/过碘酸希夫染色。用OVA/明矾将小鼠经腹腔内致敏，然后7天后用OVA经鼻内激发，进行10周。5周后，于OVA激发2天前、OVA激发1小时前和激发后2天分别以管饲法对小鼠进行如下处理：不经口喂食任何东西(未经处理)，经口喂食水(OVA对照)、100％BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑(OVA+100％)，进行5周。
图39.在慢性过敏性气道炎症模型中，用BerriQiTM博伊森莓与黑加仑和苹果(BBA)给药治疗。卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性气道浸润后肺组织的马森三色染色。用OVA/明矾将小鼠经腹腔内致敏，然后7天后用OVA经鼻内激发，进行10周。5周后，于OVA激发2天前、OVA激发1小时前和激发后2天分别以管饲法对小鼠进行如下处理：不经口喂食任何东西(未经处理)，经口喂食水(OVA对照)、100％BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑(OVA+100％)，进行5周。
图40.在慢性过敏性气道炎症模型中，用BerriQiTM博伊森莓与黑加仑和苹果(BBA)给药治疗。卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性气道浸润后肺中胶原的定量。用OVA/明矾将小鼠经腹腔内致敏，然后7天后用OVA经鼻内激发，进行10周。5周后，于OVA激发2天前、OVA激发1小时前和激发后2天对小鼠以管饲法经口喂食100％BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑(100％BBA)，进行5周。在OVA激发后4天用羟脯氨酸测定法测定胶原(n＝20/干预组)。
具体实施方式
以下描述阐述了许多示例性配置、参数等。但是应当认识到，这种描述不旨在作为对本发明的范围的限制，而是作为对示例性实施例的描述而提供。
本说明书中引用的所有参考文献(包括专利和专利申请)在此通过引用并入。不承认任何参考文献构成现有技术。即使对任何参考文献进行讨论，也不承认该参考文献构成新西兰或任何其他国家本领域中公知常识的一部分。
定义
在本文的每个示例中，在本发明的描述、实施例和实例中，术语“包含”、“包括”(“comprising”,“including”)等应被非限制性地扩展解读。因此，除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise和comprising)”等应被解释为具有包容性意义而不是排他性意义，也就是说，是“包括但不限于”的意思。
如本文所用，术语“基本上由…组成”可能是指组合物中有浓缩物存在。例如，该浓缩物可能为该组合物的至少80重量％，或该组合物的至少85重量％、至少86重量％、至少87重量％、至少88重量％、至少89重量％、至少90重量％、至少91重量％、至少92重量％、至少93重量％、至少94重量％、至少95重量％、至少96重量％、至少97重量％、至少98重量％、至少99重量％、至少99.5重量％、至少99.8重量％，或至少99.9重量％(％w/w)。对于液体，该浓缩物可能为该组合物体积的至少80体积％，或该组合物体积的至少85体积％、至少86体积％、至少87体积％、至少88体积％、至少89体积％、至少90体积％、至少91体积％、至少92体积％、至少93体积％、至少94体积％、至少95体积％、至少96体积％、至少97体积％、至少98体积％、至少99体积％、至少99.5体积％、至少99.8体积％，或至少99.9体积％(％v/v)。
在本说明书中，冠词“一(a和an)”用于指冠词语法对象中的一个或多个(即至少一个)。举例来说，“一种元素”可以指一种或多种元素。
在整个说明书中，术语“约”用于指示值包括用于确定值的方法的误差标准偏差，例如，如本文中详细描述的化合物水平或剂量水平。特别地，术语“约”包括规定值或范围内10％到15％的偏差(正和负)，特别是规定值或范围内10％的偏差(正和负)。
“气道重塑”，也称为组织或肺重塑，是指气道壁发生特定结构变化。这可能包括，例如，重塑气道(例如肺中)内衬中的纤维结缔组织。气道重塑可能包括上皮下纤维化、肌成纤维细胞聚集、气道平滑肌增生和肥大、粘液腺和杯状细胞增生以及上皮破裂中的一种或多种。症状可能包括气道扩张性降低(即僵硬气道)、弹性回弹变小、FEV1(用力呼气量1)和FVC(用力肺活量)进行性下降、肺功能加速下降、不可逆或仅部分可逆的气流阻塞、呼吸困难及呼吸系统治疗(例如哮喘或COPD治疗)的反应性降低。
“哮喘”是指肺气道的炎症病症，其特征是可变的和再发的呼吸障碍，包括气流阻塞和支气管痉挛。气流阻塞可定义为FEV1降低和/或FEV1/VC比值降低。无论是否使用药物，哮喘中的气流阻塞可以是可逆的。哮喘的症状可能包括喘息、咳嗽、胸闷或疼痛以及呼吸短促中的一种或多种。包括特应性(例如过敏原或抗原诱导的)哮喘和非特应性哮喘，以及运动诱导的哮喘、职业性哮喘、阿司匹林诱导的哮喘以及酒精诱导的哮喘。
“呼吸助剂”是有助于气道功能或呼吸系统其他方面的组合物，例如药物、草药组合物、精油和各种用于吸入的组合物。
“气道”、“呼吸道”和“呼吸系统”是指参与气体交换(即呼吸)的任何器官、组织或细胞组分。这包括上呼吸道、气管、支气管、细支气管、肺泡、肺、胸膜和胸膜腔以及呼吸神经和肌肉。应理解，“气道”描述各种结构组分(例如细胞组分、组织和器官)以及气体交换发生的空间。
如本文所用，“苹果(Apple)”包括苹果属(Malus)的任何果实及其任何杂种、变种和遗传衍生物。具体地，是苹果(Malus pumila)，及以下特定品种：‘Gala’‘GoldenSupreme’‘McIntosh’‘Transparent’‘Primate’‘Sweet Bough’‘Duchess’‘Fuji’‘Jonagold’‘Golden Delicious’‘Red Delicious’‘Chenango’‘Gravenstein’‘McIntosh’‘Snow’‘Blenheim’‘Winesap’‘Granny Smith’‘King’‘Wagener’‘Swayzie’‘Greening’和‘Tolman Sweet’。也包括以下品种：‘Alice’‘Ambrosia’‘Ananasrenette’‘Aroma’‘Discovery’‘Envy’‘Braeburn’‘Bramley’‘Arkansas Black’‘Dougherty’/‘RedDougherty’‘Goldrenette’/‘Reinette’‘Jazz’‘Jonagold’‘James Grieve’‘YellowTransparent’‘Pacific rose’‘Lobo’‘Sampion’/‘Shampion’‘Sonya’‘Splendour’/‘Splendor’‘Summerred’‘Pink Lady’‘Belle de Boskoop’‘Cox Pomona’‘Cox's OrangePippin’‘Kidd's Orange Red’and‘SugarBee’。进一步包括以下品种：‘Haralson’‘Wealthy’‘Honeygold’和‘Honeycrisp’。还包括海棠、苹果-海棠杂交种和料理用苹果。
如本文所用，“黑加仑(Blackcurrant)”包括任何来自茶藨子科(Ribes)的黑色/深色醋栗属果实，包括但不限于Ribes nigrum，Ribes nigrum L.、Ribes americanum、Ribeshudsonianum、Ribes laxiflorum和Ribes x nidigrolaria。任何杂交种、变种及遗传衍生物也包括在内。包括其中的适合的黑加仑品种为：‘Andega’、‘Ben Ard’、‘Ben Alder’、‘BenDorain’、‘Ben Gairn’、‘Ben Hope’、‘Ben Lomand’、‘Ben More’、‘Ben Rua’、‘Ben Sarek’、‘Ben Tirran’、‘Blackadder’、‘Black Down’、‘Burga’、‘Orcs’、‘Magnus’、‘Murchison’、‘Sefton’、‘Wellington’、‘Invigo’、‘Titania’、‘Consort’、‘Crusader’、‘Geant deBoskoop’、‘Noir de Bourgogne’、‘Royal de Naples’、‘Boskoop Giant’、‘Tenah’、‘Tiben’、‘Tines’、‘Tisel’和‘Willoughby’。
如本文所用，“博伊森莓(Boysenberry)”包括悬钩子属(Rubus)杂交浆果，其包括但不限于从被鉴定为以下的植物所获得的浆果：Rubus ursinus var loganobaccus cvBoysenberry、Rubus ursinus x Rubus idaeus、Rubus loganbaccus x baileyanus Britt和Rubus idaeus x Rubus ulmifolius。通常，博伊森莓可能衍生自覆盆子和黑莓植物，或覆盆子、黑莓和洛根莓植物之间的杂交。包括各种博伊森莓杂交种、变种及其遗传衍生物。本文所指的博伊森莓为浆果或更广泛地为果实。
“慢性阻塞性肺疾病”或COPD是指与进行性气道阻塞和气流不畅有关的肺病症。气流阻塞可定义为FEV1降低和/或FEV1/VC比值降低。慢性阻塞性肺疾病的气流阻塞可能是不完全可逆的。症状包括但不限于呼吸短促、咳嗽和产痰(即痰瘀)。COPD可能与吸烟、空气污染、烹饪通风不良或取暖用火有关。遗传组分也可能参与COPD。该病症在其他已知术语中也被称为慢性阻塞性肺疾病(COLD)、慢性阻塞性气道疾病(COAD)、慢性支气管炎、肺气肿。
“浓缩物”，例如与博伊森莓、苹果或黑加仑浓缩物或其任何组合有关者，是指液体组分(例如果汁)已部分或实质上去除的组合物。可通过蒸发或任何其他方式去除液体组分。浓缩物可以制成例如泥、糊或粉，也可以由博伊森莓、苹果或黑加仑汁或其任意组合制成，例如制成果汁浓缩物。
如本文所述，呼吸道的“病症”包括影响任何涉及气体交换(即呼吸)的器官、组织或细胞组分的疾病或其他病况。这些病症可能是急性或慢性病况，诸如炎症和与炎症有关的病况。特别关注的病症包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、反应性气道疾病、气道纤维化和气道重塑。本文详细描述了其他病症。
植物的“遗传衍生物”是指从亲本原种中获得的后代、突变或其他品种。这包括从与亲本的遗传杂交中获得的后代，例如F1后代或F2后代。术语“遗传衍生物”可指衍生的植物、本身或指其果实。
“纤维化”，如在气道中或肺纤维化，是指呼吸道中胶原和其他细胞外基质组分的调节中断。在纤维化患者的气道中，细胞外基质沉积可能增加，诸如在网状基底膜区、固有层和/或粘膜下层中。瘢痕的形成和多余纤维结缔组织的积聚导致气道壁增厚。症状可能包括氧气供应减少、呼吸短促、慢性咳嗽、疲劳和/或虚弱、胸部不适(包括胸痛)、食欲不振和体重减轻。包括气道纤维化特发性形式，以及与吸烟、空气污染、结缔组织疾病(例如类风湿性关节炎、结节病等)、感染、药物(例如甲氨蝶呤、博莱霉素等)和放射治疗有关的气道纤维化。
“炎症”是指一种病况，其特征在于以下一者或多者：血管舒张、发热、发红、不适、肿胀、水肿、病变、裂缝、溃疡、白细胞外渗和功能丧失。包括炎症的急性和慢性形式，诸如急性气道炎症，以及其他炎症病症，例如自身免疫性疾病或过敏性病况。特别包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、气道纤维化、反应性气道疾病和气道重塑。其他炎症病症在本文件的其他地方有描述。
如本文所述，“冻干(lyophilising)”和“冻干(lyophilising)”作为同义词使用。应理解，术语“冻干(freeze drying/lyophilising)”并不排除使用更高的温度(即高于冷冻温度)。例如，在冻干程序的二次干燥阶段，可使用较高的温度去除残余水分。
“营养药物”是指给予受试者的标准化组合物。它可以是药物级组合物，并且可以维持或改善受试者的健康，或者可以治疗或预防受试者体内的一种或多种病症。
“反应性气道疾病”是指一种炎症气道病症，其特征在于由于外部刺激导致可逆性气道狭窄。该术语可包括其他已知病症，诸如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、上呼吸道感染等，或可指与这些病症相似但未直接诊断为此类病症的病况，例如有哮喘样综合征或哮喘样症状。患有反应性气道疾病的受试者在暴露于特定刺激(例如烟雾、蒸汽、浓烟或其他刺激物)时，可能显示咳嗽、喘息或呼吸短促中的一种或多种症状。
如本文所用，“受试者”可以是人或非人动物，特别是哺乳动物，包括牛、羊、山羊、猪、马和其他牲畜(包括狗、猫和其他家养宠物)。在特定方面，该受试者是人类。
如本文所用，“治疗”意指减少、改善或治愈病症，例如呼吸系统病症(诸如呼吸系统疾病或其他病况)。治疗将使得该病症的一种或多种症状减轻、改善或消除。
如本文所用，“预防”意指停止或延迟疾病的发作，例如呼吸系统病症(诸如呼吸系统疾病或其他病况)。预防措施将使得该病症的一种或多种症状停止或延迟，或者如果病症出现症状会减轻。应当理解，术语“治疗或预防”并不排除在任何给定的受试者身上同时获得治疗和预防(例如，在同一时间或不同时间)病症的可能性。同样，“哮喘或纤维化”的治疗并不排除获得两种病症治疗(例如同时或不同时)的可能性。
包含博伊森莓的组合物及这些组合物的相关生物活性
发明人发现，在慢性哮喘模型中，摄取博伊森莓组合物减少了过敏原诱导的肺重塑。对于这些实验，在慢性过敏性气道炎症的模型中，测试了博伊森莓摄取对肺纤维化、肺巨噬细胞表型和MMP-9表达的作用。结果证明，口服博伊森莓治疗支持肺巨噬细胞的发育，该肺巨噬细胞表达具有改善纤维化及促进平衡肺修复能力的混合抗纤维化、AAM(交替激活的巨噬细胞)表型(74；通过引用整体并入本文中)。除此之外，发明人还发现，博伊森莓和苹果组合物的组合给药及博伊森莓、苹果和黑加仑组合物的组合给药可用于降低与气道炎症相关的免疫细胞数量。这包括一个或多个嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和抗原呈递细胞。令人惊讶且有利的是，组合的博伊森莓和苹果组合物在低剂量下有效。
已知博伊森莓富含维生素C和纤维，并含有高水平的花青苷(120-160mg/100g)，使博伊森莓呈深暗色。博伊森莓的ORAC(氧自由基吸收能力，即抗氧化水平)为42μmol/TE/g，其几乎为众所周知的抗氧化食品蓝莓的两倍。博伊森莓含有大量鞣花酸(一种酚类化合物)。博伊森莓中鞣花酸水平为干重的5.98mg/g。博伊森莓的游离鞣花酸与总鞣花单宁的比例也很高。发明人已测试浓缩物以确认生物活性。
如实例2中所述，这些溶液包括：博伊森莓10(博伊森莓汁液)，6.7％，博伊森莓1(博伊森莓汁液)，0.67％，苹果10(苹果汁液)，18.7％，苹果1(苹果汁液)，博伊森莓和苹果10(BerriQiTM博伊森莓与苹果；组合汁液)，6.7％/18.7％，博伊森莓和苹果1(BerriQiTM博伊森莓与苹果；组合汁液)，0.67％/1.87％。另外的口服组合物如实例3-5中所述，其包括100％、50％或25％浓度的BerriQiTM博伊森莓与苹果组合物，及100％浓度的BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑组合物。该100％BerriQiTM博伊森莓与苹果组合物包括27％博伊森莓汁浓缩物及73％苹果汁浓缩物。该100％BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑组合物包括13.5％博伊森莓汁浓缩物、7％苹果汁浓缩物及13.5％黑加仑汁浓缩物。下面的实例部分提供了进一步的细节。
从发明人提供的结果可明显地看出博伊森莓和苹果以及博伊森莓、苹果和黑加仑可能被用于治疗或预防呼吸道炎症、治疗或预防哮喘、治疗或预防慢性阻塞性肺疾病、治疗或预防过敏性气道炎症、治疗或预防呼吸道纤维化或是治疗或预防气道重塑的组合物中。特别地，对于气道重塑，本发明组合物可能被用于治疗或预防以下一种或多种：肺泡壁增厚、气道中胶原纤维增多、胶原纤维扩散到气道组织，以及空隙塌陷或关闭。此外，本发明组合物可能用于减少会导致气道重塑的组织炎症和胶原沉积。
此外，根据本文显示的结果，应理解，博伊森莓和苹果组合物以及博伊森莓、苹果和黑加仑组合物可用于恢复、改善或维持呼吸系统的健康，例如，在以下一种或多种活动中：减少胶原沉积，消除异常胶原沉积，减少气道中细胞浸润，减少因细胞浸润造成的气道损伤，减少肺液中细胞(例如炎症细胞)，减少粘液产生，减少粘液阳性细胞，降低羟脯氨酸水平，增加基质金属肽酶表达水平(例如蛋白质水平)，增加MMP-9表达水平(例如蛋白质水平)，增加TGFβ表达水平(例如蛋白质水平)，降低TIMP-1/MMP-9比值水平(例如蛋白质比值水平)，降低炎症细胞的活化及数量，增加交替激活的巨噬细胞的数量或活性，增加精氨酸酶+巨噬细胞的数量或活性，增加CD68+/CD206+/精氨酸酶+巨噬细胞的数量或活性，或降低iNOS表达水平(例如蛋白质水平)。本文详细描述了这些组合物的进一步用途。
产生包含博伊森莓和苹果的组合物以及包含博伊森莓、苹果和黑加仑的组合物的方法
本发明通常涉及一种由博伊森莓和苹果制得的组合物，以及一种由博伊森莓、苹果和黑加仑制得的组合物。虽然本文描述了博伊森莓和苹果以及博伊森莓、苹果和黑加仑的特定组合，应理解，本发明的组合物可包括博伊森莓、苹果和黑加仑的任意组合。在一特定方面，该组合物由Rubus ursinus var loganobaccus cv Boysenberry制得。在其他方面，可使用来自博伊森莓植物的一种或多种遗传衍生物。例如，可能需要使用来自包括博伊森莓植物亲本原种的遗传杂交的F1或F2后代。或者，可使用从亲本获得的任何芽变或其他品种。可能需要特别从新西兰或者从智利获得博伊森莓。
该组合物优选地被制成博伊森莓浓缩物，例如博伊森莓泥、博伊森莓渣、博伊森莓糊、博伊森莓粉、博伊森莓汁浓缩物。博伊森莓和苹果组合物可能包含苹果浓缩物，例如苹果泥、苹果渣、苹果糊、苹果粉或苹果汁浓缩物。如果使用苹果汁浓缩物，其可能源自于混浊的苹果汁或清苹果汁。博伊森莓、苹果和黑加仑组合物可能包含黑加仑浓缩物，例如黑加仑泥、黑加仑渣、黑加仑糊、黑加仑粉、黑加仑汁浓缩物。应理解，特别地，可能使用博伊森莓、苹果或黑加仑渣，其包括榨汁后果实的固体残余物。所述的渣可能包括果实的果皮、果肉、种子及蒂中的一者或多者。此外，可能包括本文公开的组合物中的博伊森莓汁、苹果汁和黑加仑汁的一种或多种。
因此，该组合物可能制成液状或粉状，例如冻干粉末或任何其他适合的剂型。该组合物可配制成补剂、提取物、酏剂、舔剂、浓缩物、糖浆、溶液、悬浮液、乳剂、饮剂、泥、糊或滴剂。在其他方面，该组合物可配制成凝胶或冻胶，或胶囊，例如含有液体或半液体内容物。该组合物可能以小袋形式提供，例如粉末袋、或凝胶或冻胶袋。也包括呈细条状或胶囊固体形式的制剂，可以与食品或饮料混合。也可能为下文所述的其他配方。
在某些方面，可能需要将博伊森莓和苹果组合物(例如博伊森莓和苹果汁浓缩物或泥)或博伊森莓、苹果和黑加仑组合物(例如博伊森莓、苹果和黑加仑汁浓缩物或泥)配制成粉末。作为具体示例，苹果粉可能包括苹果渣粉或苹果果胶粉。如本文所述，商售的博伊森莓、苹果和黑加仑粉已知且可获得。粉末可配制成片剂(包括快速溶解片剂)或胶囊(包括延长释放胶囊)。片剂可能为带刻痕片剂、咀嚼片剂、泡腾片剂、口腔崩解片剂或用于形成悬浮液的片剂。例如，胶囊可能为凝胶胶囊，且可能包括粉状内容物。这包括由单片凝胶封装及两片凝胶封装制成的凝胶胶囊。还包括非明胶胶囊以及囊片。粉末可能以自由流动形式或作为固体饼提供。组合物可能以以下形式提供：用于形成悬浮液的粉末、用于形成溶液的粉末、散装口服颗粒剂或散装口服粉末。
本发明的组合物可由从一种或多种商业来源获得的博伊森莓、苹果或黑加仑汁浓缩物或果泥制成。例如，新西兰博伊森莓产品的商业来源包括Boysenberries New ZealandLtd,Nelson和Tasman Bay Berries,Nelson。可商购获得的产品包括单独快速冷冻浆果、博伊森莓泥、块状冷冻浆果、博伊森莓汁浓缩物和博伊森莓粉末。新西兰苹果和黑加仑产品的商业来源包括：EnzaFoods New Zealand Ltd,Hastings,New Zealand以及Juice ProductsNew Zealand,Timaru,New Zealand、NZ Blackcurrant Co-operative Ltd,Nelson,NewZealand、Fruit Solutions,FSL Foods,Nelson,New Zealand和Reso,Auckland,NewZealand，且包括混浊苹果汁浓缩物、澄清苹果汁浓缩物、苹果渣、苹果泥、黑加仑汁浓缩物和黑加仑泥。此外，苹果及黑加仑粉末可从
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FutureCeuticals、Nutradry、Sujon、ViberiTM、ZeaberryTM、Waitaki Biosciences等其他供应商商购获得。如本文所述，苹果及黑加仑汁浓缩物的特定供应商包括Infruit Ltd,Auckland,New Zealand和RD2International Ltd,Auckland,New Zealand，而制造商包括Profruit(2006)Ltd,Hastings,4175,New Zealand。
果汁浓缩物或果泥(例如组合的博伊森莓和苹果汁浓缩物及组合的博伊森莓、苹果和黑加仑汁浓缩物)的pH可介于3.2至3.8；或3.0至4.0；或3.1至3.9；或可为约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、或约4.0。对于用以制造组合的浓缩物的苹果汁浓缩物，其pH可介于2.8至4.4；2.9至4.3；3.0至4.2；或3.1至4.0；或可为约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、或约4.5。对于用以制造组合的浓缩物的黑加仑汁浓缩物，其pH可介于1.0至5.0；2.0至4.0；1.5至3.5；2.1至3.4；或2.3至3.3；或可为约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、或约4.0。
对于博伊森莓汁浓缩物，酸度(％w/w无水柠檬酸)可为约1至约20、约1.5至约15、约2至约12、约5至约10、约6至约9、约10、约9、约8.5、约8.3、约8.2、约8.17、约8.1、约8、约7、约6、或约5。对于苹果汁浓缩物，酸度(％w/w苹果酸)可为约0.5至约4.5、约0.8至约4.2、约1.0至约4.0、约1.2至约3.5、或约0.5、约0.7、约0.9、约1、约1.2、约1.5、约1.7、约1.9、约2、约2.2、约2.5、约2.7、约2.9、约3、约3.2、约3.5、约3.7、约3.9、约4、约4.2、或约4.5。对于黑加仑汁浓缩物，酸度(柠檬酸g/100g)可为约5至约20、约8至约18、约7至约17、或约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、或约25。
在一些情况下，可能需要调整果泥或最终组合物的pH至近似生理水平。特别地，获得介于6.0至8.0；或6.5至7.5；或6.8至7.2的pH可能是有益的；或约6.5、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、或约7.5的pH。
在某些方面中，本发明的组合物可由新西兰专利号235972(通过引用并入本文)中提到“软制浆”技术制得，其可适于产生“软”博伊森莓泥、苹果泥或黑加仑泥。在制备果泥时将种子除去可能是有益的。制备约1mm或更小筛孔尺寸的果泥也可能是有益的。
果汁浓缩物可制成天然糖溶液，其从果皮和果肉(且可包括种子)中提取或压榨并过滤。溶液可在真空下进行去果胶、过滤及蒸发至特定的白利糖度水平。例如，果汁浓缩物可浓缩至原始白利糖度值的约二至约七倍。特别地，浓缩物可浓缩至原始白利糖度值的约二倍、约三倍、约四倍、约五倍、约六倍、或约七倍。
在某些方面，博伊森莓汁浓缩物可由完好成熟的分级博伊森莓(例如，Rubusursinus var loganobaccus cv Boysenberry)制成。在特定方面，博伊森莓汁浓缩物可具有介于55°至75°白利糖度的最终糖水平；或59°至69°白利糖度；或61°至66°白利糖度；或约60°、约61°、约62°、约63°、约64°、约65°、约65.4°、约65.5°、约65.6°、约66°、约67°、约68°、约69°、约70°、或约71°白利糖度。在各个方面，组合的博伊森莓和苹果汁浓缩物及组合的博伊森莓、苹果和黑加仑汁浓缩物可具有如上直接所述的白利糖度值。类似地，若未校正酸度，用以制造组合的浓缩物的苹果汁浓缩物和黑加仑汁浓缩物可具有如上所述的白利糖度值。
果汁浓缩物可通过碾磨、糖化及压榨产生为单一浓度的果汁，其经离心、巴氏灭菌、去果胶、过滤，而后在标准化过程中通过蒸发进行浓缩并回收香气。然后使该标准化浓缩物经卫生填装头包装成所需包装样式而无需进一步热处理。可检验浓缩物是否符合纯果汁定义，例如，如由FSANZ-Food Standards Australia New Zealand所定义。
预期博伊森莓汁浓缩物将具有丰富的着色。例如，博伊森莓汁浓缩物可具有约1.5至约3.0、约1.8至约2.8、约1.9至约2.2、或约1.9、约2、约2.01、约2.05、约2.1、或约2.2的色比(吸光度520nm/吸光度430nm)。此外，果汁浓缩物可具有约15至约30、约20至约28、约21至约25、约22至约24、或约22、约23、约23.2、约23.5、约23.7、约24、或约25的色彩强度(利用色度计)。预期果汁浓缩物外观也相对清澈，例如，澄清度水平为约0.01至约0.1、约0.02至约0.08、约0.03至约0.06、约0.04至约0.05、或约0.03、约0.04、约0.045、约0.047、约0.048、约0.05、或约0.06。
用以制造组合的浓缩物的黑加仑浓缩物也将具有深着色。例如，黑加仑浓缩物可具有约1.5至约4.0、约1.8至约3.8、或约2.0至约3.0的色比(pH 3时的吸光度520nm/吸光度430nm)；或约1.8、或约1.9、或约2.0、或约2.1、或约2.2、或约2.3、或约2.4、或约2.5、或约2.6、或约2.7、或约2.9、或约3.0、或约3.2、或约3.3、或约3.4、或约3.5的色比。
相比之下，用以制造组合的浓缩物的苹果汁浓缩物可相对无色，例如，在420nm12Bx下小于0.35abs，或在420nm 12Bx下至少小于0.45abs。对于苹果汁浓缩物，这也可以表示为约0.15至约0.45abs、约0.10至约50abs或约0.19至约45的一般范围(在440nm及11.5°白利糖度下)。苹果汁浓缩物可用作澄清浓缩物，例如没有雾度。各种果汁浓缩物的比重可为约1.2至约1.4、约1.29至约1.39、或约1.32至约1.36、或约1.2、约1.3、约1.31、约1.32、约1.33、约1.35、约1.36、约1.37、约1.38、约1.39、或约1.4(于20℃)。各种测量方法(例如色比、澄清度等)是本领域已知的，且可在例如AIJN code of practice in theInternational Fruit Juice Federation Handbook of Analysis(国际果汁联合会分析手册AIJN操作守则),1996,International Fruchtsaft-Union,Zug,Switzerland中找到。
在初始准备阶段，博伊森莓、苹果或黑加仑可经历预处理过程，其可包括浆果/果实的熟化、检查、分级和/或分选等众所周知的步骤。关于熟化，当生产本发明的组合物时，优选使用成熟的或长成的博伊森莓、苹果或黑加仑；然而，优选避免腐烂或腐蚀的材料。可使用本领域广泛已知并使用的方法评估成熟度。可在采摘或加工博伊森莓、苹果或黑加仑前测量成熟度。特别地，如本文所述，可使用白利糖度系统测量成熟度。过熟或正在发酵的博伊森莓、苹果或黑加仑可能不会产生理想的组合物。可于使用前以人工方式催熟白利糖度水平较理想低的博伊森莓、苹果或黑加仑。
作为加工的一部分，博伊森莓、苹果或黑加仑可经灭菌。果实可穿过具有一个或多个滚轮刷的组件以去除任何粘附异物。然后可采用常规的洗涤技术。例如，可使用一系列喷嘴洗涤博伊森莓、苹果或黑加仑。根据当地法规及要求，可采用有助于清洁或减少博伊森莓、苹果或黑加仑细菌数量的洗涤添加剂。例如，博伊森莓、苹果或黑加仑可以用氯清洗和/或臭氧浸渍水洗，然后用清水漂洗。
然后将灭菌的博伊森莓、苹果或黑加仑输送至料斗中。料斗可逐渐变细形成漏斗以将浆果或果实导引至压榨组件。该压榨组件可适于进行制浆或粉碎过程。与常规果实制浆技术相比，该过程相对轻柔且温和(“软制浆”)。使用软制浆，果实细胞或组分不会有明显分解或裂解。优选地，此过程仅破碎小部分(通常小于5-10％)的种子。
在一个实施例中，压榨组件通过在双收敛带式压榨机之间压榨对博伊森莓、苹果或黑加仑进行软制浆。压榨带可为绕一系列皮带轮旋转的多环路。压榨带的分隔距离在博伊森莓、苹果或黑加仑的行进方向上可能会降低。以这种方式，当其沿着压榨组件的长度行进时，可对博伊森莓、苹果或黑加仑施加增强的力。这可产生浆状物而不会对种子造成显著损伤。这反过来可防止种子污染浆状物。
由压榨组件产生的浆状物可用于筛选程序，以便将种子与浆状物分离。特别地，使用软机械筛选技术使浆状物与种子分离。例如，可使用打浆机。这包括旋转柔性叶轮，其在具有预定尺寸的孔的锥形筛网内旋转。在特定方面，选择的孔的尺寸能让浆状物及果汁通过该筛网同时将大部分(如果不是全部)的种子留在由筛网界定的内腔中。
在某些方面，可优选使用来自博伊森莓、苹果或黑加仑的糊状物而非泥状物。可将糊状物制成浓缩物。例如，可将果实加热数小时、过滤并减少成黏稠的浓缩形式。可在去除果皮后或者在制浆或制泥程序后加热果实。逐渐加热果实，然后保持在适宜温度边加热边搅拌。在增稠时，可将糊状物铺在平板上或转移至封装物，例如袋、管、罐、瓶或其他容器。糊状物可被无菌转移，以适于人类摄取。可能需要自成熟浆果/果实制备糊状物。糊状物可由浆化的果实制成。糊状物可为平滑制剂。
浆状物(例如，以糊或泥的形式)或果汁浓缩物可经冷冻步骤加工。然后可为干燥步骤或与干燥步骤一起使用。在替代实施例中，使浆状物干燥并加工成粉末，而未插入冷冻步骤。例如，可使用涉及滚筒干燥的方法。在滚筒干燥程序中，可在相对低温下，利用生产滚筒干燥产品片的旋转的、高容量滚筒来干燥泥状物或糊状物。在某些方面，可使用添加剂以加速或以其他方式辅助干燥过程。例如，可使用豌豆淀粉或其他干燥助剂。然后可将干燥产品研磨为成品片或粉末形式。有利地，滚筒干燥技术可用于产生保留其关键组分(例如酚类化合物)的干燥组合物，且可使用液体轻易复原。例如，可将滚筒干燥产品制成能溶于冷水。作为进一步的替代方案，可使用带式干燥或对流干燥。此类干燥方法众所周知且在本领域中广泛使用。
如果使用冷冻，优选在浆状物或果汁浓缩物产生后尽快冷冻以保持新鲜度。然而，根据需要，冷冻可进行24或48小时。冷冻方法众所周知，不需在本文详述。吹风式冷冻特别优选地适用于本发明。浆状物或果汁浓缩物可冻成标准尺寸板条，其用于收集加工后的新鲜浆状物/浓缩物。浆状物或果汁浓缩物可冷冻保存(例如于-18℃)直到需要使用。
冷冻浆状物或果汁浓缩物可冷冻干燥，即冻干。冷冻干燥技术广为人知且常用。冷冻干燥循环可能为约48小时；或介于40至56小时；或12至36小时；或36至60小时；或约40小时、约42小时、约44小时、约46小时、约48小时、约50小时、约52小时、或约54小时。较长的冷冻干燥循环，例如至少48小时(“温和冷冻干燥”，可用于保留最大活性。在特定方面，可进行该过程以避免形成水，并在加工过程中使水分含量最小化。
可能需要使用特定冻干过程以获得干燥产品。例如，冻干干燥程序可作为自动干燥系统的一部分。冻干过程可包括多个干燥步骤，例如逐步增加及降低温度。优选地，初级干燥设置被用于升华，之后使用一个或多个次级干燥设置以去除残余水分。在特定方面，冻干过程的最高温度不超过70℃。在其他方面，冻干过程的温度范围在-10℃至70℃之间。在另一方面，利用长达48小时的冻干。
然后可将所得干燥产物研磨成粉末，然后可适当地利用。研磨方法众所周知且在本领域中广泛使用。可使用标准网孔尺寸生产粉末，例如可使用US 20、US 23、US 30、US35、US 40、US 45或US 50网孔尺寸。用于粉末的筛网孔径的范围可自1.0至0.3mm；或0.84至0.4mm；或0.71至0.5mm；或可为约1.0mm、约0.84mm、约0.71mm、约0.59mm、约0.5mm、约0.47mm、约0.465mm、约0.437mm、约0.4mm、约0.355mm或约0.3mm。
为了确保最小程度的成分降解，制备过程在低于40℃的温度下进行。在各种实施例中，该过程是在以下范围的温度下进行：-4℃至40℃；或-1℃至10℃；或1℃至6℃；或约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、或约6℃。在整个制备过程中(包括整个果实被破开之前的储存及在制浆/制泥过程期间)保持这些温度。为了获得最佳结果，至少从果实被破开时保持这些温度。使用这些温度以避免果实氧化及还原剂的使用。在某些情况下可能获得有机认证。
优选的加工方法是能预防或至少最小化对果实中活性物质的任何损害或影响。为了确保最佳生产方法，可监测所得组合物的活性，例如花青素水平、多酚水平和/或抗氧化活性。
多酚的测定为本领域所熟知，且于下文中描述。特别地，可测量没食子酸当量(GAE)以确定多酚总含量。例如，可将Folin-Ciocalteu法(采用Folin-Ciocalteu试剂，也称为Folin酚试剂或Folin-Denis试剂)用于酚类化合物的比色体外测定(75)。预期博伊森莓汁浓缩物的多酚总含量将相对较高，例如约500至约5000mg GAE/100g FW、约1000至约3000mg GAE/100g FW、约1500至约2500mg GAE/100g FW、约3000、约2500、约2000、约1500、或约1000mg GAE/100g FW。应注意FW表示果汁浓缩物的鲜重。
可通过HPLC定量花青苷。这可用于分解各化合物并表示为矢车菊素3-葡萄糖苷当量(76)。例如，可在530nm处监测HPLC洗脱组分的花青苷。使用矢车菊素-3-葡萄糖苷标准(例如Extrasynthese)及总花青苷制备基于此计算的标准曲线。其他酚类也可由HPLC分析，例如在250-700nm处。可运行一系列标准品，包括没食子酸、鞣花酸、槲皮素、芸香苷和儿茶素。使标准品的吸收光谱和保留时间与HPLC痕量分析中的未知物质相比较。此分析可包括鞣花酸的测量。作为非限制性实例，博伊森莓汁浓缩物的花青素总含量(以矢车菊素3-葡萄糖苷当量表示)可为约1000至约10,000mg/100g FW、约2000至约8000mg/100g FW、约4000至约7000mg/100g FW、约5500至约6500mg/100g FW、或约8000、约7000、约6800、约6500、约6000、约5000、约4000、或约3000mg/100g FW。
对于组合的博伊森莓和苹果组合物，预期总花青苷可占这些组合物中存在的多酚总含量的约40-50％，或为这些组合物中存在的多酚总含量的至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、或至少55％。对于组合的博伊森莓、苹果和黑加仑组合物，预期总花青苷可占这些组合物中存在的多酚总含量的约70-80％，或为这些组合物中存在的多酚总含量的至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、或至少80％。
此外，对于组合的博伊森莓和苹果组合物及博伊森莓、苹果和黑加仑组合物，预期总多酚(包括花青苷)可占这些组合物中存在的多酚总含量的约80-90％，或为这些组合物中存在的多酚总含量的至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％。
除此之外，对于组合的博伊森莓和苹果组合物及博伊森莓、苹果和黑加仑组合物，预期可水解单宁将占该组合物中多酚总量的约25％至约35％。对于博伊森莓、苹果和黑加仑组合物，预期可水解单宁将占该组合物中多酚总量的约8％至约12％。如本文详述，测量可水解单宁的示例性方法为LC-MS(液相层析-质谱)分析。
抗氧化能力可通过ORAC和/或DPPH测定来测量。氧自由基吸光能力测定是最广泛利用的测定之一，用以测试食品的抗氧化潜能。ORAC测定测量抗氧化剂对过氧化氢自由基诱导的氧化的抑制作用(77,78,84)。Trolox(维生素E的水溶性类似物)可用作对照标准品。在另外的测定中，DPPH(2,2-二苯基-1-三硝基苯肼)可用于显示作为自由基清除剂的多酚的动力学行为。抗氧化活性越高，DPPH·浓度降低越多。当用抗氧化剂淬灭时，DPPH自由基的甲醇溶液从紫色变成无色。在515nm处，根据标准曲线(例如Trolox和DPPH·)测量DPPH·的减少(79,80)。
作为特定示例，博伊森莓汁浓缩物的抗氧化剂能力可为约10,000至约100,000ORAC值(μmol Trolox/100g FW)、约20,000至约80,000ORAC值、约30,000至约70,000ORAC值、约40,000至约50,000ORAC值、或约80,000、约70,000、约60,000、约50,000、约40,000、约30,000、或约20,000ORAC值。作为进一步的示例，博伊森莓汁浓缩物的抗氧化能力可经DPPH测定(于100％MeOH)测量为约1000至约6000μmol TEAC/100g FW、约2000至约5000μmol TEAC/100g FW、约2500至约2900μmol TEAC/100g FW，或约5000、约4000、约3000、约2800、约2500、约2000或约1000μmol TEAC/100g FW。
可选地或另外地，可测试组合物的其他成分，例如糖、叶酸盐和维生素C。相应测定众所周知。例如，可使用标准方法测定博伊森莓汁浓缩物的叶酸盐水平(参见例如83)，并且其可为约20μg/100g FW、约30μg/100g FW、约40μg/100g FW、或约50μg/100g FW、约60μg/100g FW、约70μg/100g FW、或约80μg/100g FW、或约10μg/100g FW至约100μg/100g FW、约20μg/100g FW至约80μg/100g FW、约30μg/100g FW至约70μg/100g FW、约20μg/100g FW至约50μg/100g FW、或约50μg/100g FW至约70μg/100g FW。
应理解，其他已知测定也可用于分析所公开的组合物(参见例如85)，且本发明不限于生物活性化合物(含括酚类、花青苷、抗氧化剂、维生素、碳水化合物等)的一种特定测定。还应理解，本文鉴定的果汁浓缩物水平可很容易地推断为粉末形式以及泥状物及糊状物形式。
在一些情况下，可能使用植物的遗传衍生物以获得本发明的组合物。预期由此类衍生物获得的组合物将与由原种获得的组合物具有相同的一个或多个特征。示例性特征包括：如上所述并在本文详述，多酚水平及多酚曲线(包含花青素水平及曲线)、维生水平及OVA诱导的炎症减少。关于果实本身，预期由遗传衍生物获得的果实将与亲本果实具有相似的组成构造。
包含博伊森莓和苹果的组合物及包含博伊森莓、苹果和黑加仑的组合物
发明人发现博伊森莓组合物包括有助于维持呼吸系统健康及治疗和预防呼吸系统疾病的有益成分。发明人表明博伊森莓浓缩物对减少气道炎症及纤维化特别有效。如本文所述，组合的博伊森莓和苹果浓缩物及组合的博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物同样有效。因此，本文所公开的博伊森莓组合物(包括组合的博伊森莓和苹果组合物及组合的博伊森莓、苹果及黑加仑组合物)可用于支持或改善整体呼吸系统健康和/或用于治疗或预防各种病症或其他呼吸道的病况，包括炎症、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、气道纤维化及气道重塑。通过这种方式，本公开的组合物应理解为抗炎组合物、抗哮喘组合物以及对慢性阻塞性肺疾病、反应性气道疾病、气道纤维化和气道重塑有效的组合物。
如本文所述，博伊森莓组合物可包括由博伊森莓制成的果汁浓缩物或粉末浓缩物。该组合物可进一步包括由苹果制成的果汁浓缩物或粉末浓缩物，或可进一步包括由黑加仑制成的果汁浓缩物或粉末浓缩物。作为各种替代方案，该组合物可由以下项组成或可基本上由以下项组成：由博伊森莓制成的果汁浓缩物或粉末浓缩物及由苹果制成的果汁浓缩物或粉末浓缩物，或由博伊森莓制成的果汁浓缩物或粉末浓缩物及由黑加仑制成的果汁浓缩物或粉末浓缩物。
通常而言，博伊森莓和苹果浓缩物可包括各种博伊森莓浓缩物与苹果浓缩物的比值。作为示例，博伊森莓浓缩物与苹果浓缩物的百分比(具100％v/v的组合百分比)可包括约17％博伊森莓浓缩物与约83％苹果浓缩物、约18％博伊森莓浓缩物与约82％苹果浓缩物、约19％博伊森莓浓缩物与约81％苹果浓缩物、约20％博伊森莓浓缩物与约80％苹果浓缩物、约21％博伊森莓浓缩物与约79％苹果浓缩物、约22％博伊森莓浓缩物与约78％苹果浓缩物、约23％博伊森莓浓缩物与约77％苹果浓缩物、约24％博伊森莓浓缩物与约76％苹果浓缩物、约25％博伊森莓浓缩物与约75％苹果浓缩物、约26％博伊森莓浓缩物与约74％苹果浓缩物、约27％博伊森莓浓缩物与约73％苹果浓缩物、约28％博伊森莓浓缩物与约72％苹果浓缩物、约29％博伊森莓浓缩物与约71％苹果浓缩物、约30％博伊森莓浓缩物与约70％苹果浓缩物、约31％博伊森莓浓缩物与约69％苹果浓缩物、约32％博伊森莓浓缩物与约68％苹果浓缩物、约33％博伊森莓浓缩物与约67％苹果浓缩物、或约34％博伊森莓浓缩物与约66％苹果浓缩物，这些百分比以v/v值表示。
同样，博伊森莓和黑加仑浓缩物与苹果浓缩物的百分比(具有100％v/v的组合百分比)可包括约17％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约83％苹果浓缩物、约18％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约82％苹果浓缩物、约19％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约81％苹果浓缩物、约20％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约80％苹果浓缩物、约21％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约79％苹果浓缩物、约22％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约78％苹果浓缩物、约23％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约77％苹果浓缩物、约24％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约76％苹果浓缩物、约25％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约75％苹果浓缩物、约26％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约74％苹果浓缩物、约27％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约73％苹果浓缩物、约28％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约72％苹果浓缩物、约29％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约71％苹果浓缩物、约30％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约70％苹果浓缩物、约31％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约69％苹果浓缩物、约32％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约68％苹果浓缩物、约33％博伊森莓和黑加仑浓缩物与约67％苹果浓缩物、或约34％博伊森莓及黑加仑浓缩物与约66％苹果浓缩物，这些百分比以v/v值表示。
作为非限制性实例，组合的博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物中的黑加仑浓缩物的百分比可为约5％至约20％、或约8％至约18％、或约10％至约15％、或约5％、约8％、约10％、约13.5％、约15％、约18％、或约20％，这些百分比以v/v值表示。在特定方面，组合的博伊森莓、苹果及黑加仑浓缩物中的黑加仑浓缩物的百分比与博伊森莓浓缩物的百分比相同或实质上相同。
博伊森莓和苹果浓缩物及博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物(具有100％w/v的组合百分比)可包括小于1％的防腐剂，例如，约0.005％至约0.5％、或约0.05％至约0.15％，或可包括约0.04％、约0.06％、约0.08％、约0.1％、约0.12％、约0.14％、约0.16％、约0.18％、或约0.2％的防腐剂，这些百分比以w/v值表示。有用的防腐剂包括但不限于：山梨酸、山梨酸钠、山梨酸钾、柠檬酸、抗坏血酸、苹果酸、酒石酸、丙酸及苯甲酸(例如以其钠盐形式，如苯甲酸钠)。
组合物可配制成口服给药的液体，例如果汁浓缩物、糖浆、悬浮液或补剂或肠内给药的溶液。或者，组合物可配制成待封装或压片或者添加至或并入其他产品的粉末。特别包括延迟释放配方、延长释放配方及快速分解配方。具体包括胶囊(例如凝胶胶囊)以及小袋和咀嚼片剂。另外还包括组合配方，其包括与其他有益物质(例如一种或多种呼吸助剂)混合的本发明粉末。在各个方面，组合物可制成营养药物组合物、药物组合物、功能性食品或饮料、天然成分(例如天然添加剂)或天然补充物(例如膳食补充物)。
预期博伊森莓组合物(包括组合的博伊森莓和苹果组合物及组合的博伊森莓、苹果及黑加仑组合物)将制备成包括高水平花青苷。例如，组合物可包括约2至约50,000mg/ml总花青苷或总博伊森莓和黑加仑花青苷、或约20mg/ml至约40,000mg/ml、约25mg/ml至约35,000mg/ml、约30mg/ml至约30,000mg/ml、约40mg/ml至约25,000mg/ml、约50mg/ml至约20,000mg/ml、约60mg/ml至约15,000mg/ml、约70mg/ml至约10,000mg/ml、约80mg/ml至约8000mg/ml、约90mg/ml至约6000mg/ml、约100mg/ml至约5000mg/ml、约10mg/ml至约1000mg/ml、约20mg/ml至约800mg/ml、约30mg/ml至约600mg/ml、约50mg/ml至约200mg/ml、或约50,000mg/ml、约40,000mg/ml、约35,000mg/ml、约25,000mg/ml、约20,000mg/ml、约15,000mg/ml、约12,000mg/ml、约10,000mg/ml、约8000mg/ml、约7500mg/ml、约5000mg/ml、约2500mg/ml、约2000mg/ml、约1500mg/ml、约1200mg/ml、约1000mg/ml、约750mg/ml、约500mg/ml、约250mg/ml、约200mg/ml、约150mg/ml、约100mg/ml、约75mg/ml、约50mg/ml、约25mg/ml、约20mg/ml、或约10mg/ml总花青苷、或总博伊森莓和黑加仑花青苷、或其干重当量。
在具体方面，博伊森莓组合物(含括组合的博伊森莓和苹果组合物及组合的博伊森莓、苹果和黑加仑组合物)可以约1mg至约20,000mg总花青苷或总博伊森莓和黑加仑花青苷的剂量单位给药，或约1mg至约2000mg总花青苷或总博伊森莓和黑加仑花青苷，或约5mg至约5000mg、约10mg至约3000mg、约10mg至约1000mg、约15mg至约1500mg、约20mg至约1000mg、约25mg至约850mg、约30mg至约600mg、约35mg至约550mg、约50至约500mg、约5mg至约500mg、约10mg至约200mg、约1mg至约400mg、约1mg至约200mg、约40mg至约400mg、约40mg至约200mg、约20mg至约80mg、约30mg至约60mg、约45mg至约55mg、或约20,000mg、约15,000mg、约12,000mg、约10,000mg、约7500mg、约5000mg、约4000mg、约3000mg、约2000mg、约1500mg、约1200mg、约1000mg、或约500mg、约400mg、约300mg、约200mg、约100mg、约90mg、约95mg、约80mg、约75mg、约70mg、约65mg、约60mg、约55mg、约50mg、约45mg、约40mg、约35mg、约30mg、约25mg、约20mg、或约10mg总花青苷或总博伊森莓和黑加仑花青苷。在特定方面，该剂量单位可为约50mg至约500mg总花青苷或总博伊森莓和黑加仑花青苷。
根据需要，如上所述的剂量单位可每天给药一次、每天给药两次或每天给药三次或更多次。示例性且非限制性的日剂量可为约10mg至约1000mg总花青苷或总博伊森莓和黑加仑花青苷。该剂量可根据需要调整用于小儿、老年人、超重者、体重不足者或其他患者。
如果博伊森莓汁、苹果汁或黑加仑汁浓缩物是依据标准商业制造方法(大或小规模)制成或由商业来源获得，则该果汁浓缩物(包括组合的博伊森莓和苹果汁浓缩物及组合的博伊森莓、苹果和黑加仑汁浓缩物)可以约0.5ml至约50ml、约0.5ml至约20ml、约0.5ml至约10ml、约1ml至约9ml、约2ml至约8ml、约3ml至约7ml、约4ml至约6ml、或约50ml、约40ml、约30ml、约20ml、约15ml、约12.5ml、约10ml、约9ml、约8ml、约7ml、约6ml、约5ml、约4ml、约3ml、约2ml、约1ml、或约0.5ml果汁浓缩物的剂量单位给药。在特定方面，该剂量单位可为约5ml果汁浓缩物。根据需要，各种剂量单位可为每天给药一次、每天给药两次或每天给药三次或更多次。剂量可根据已知方法依患者尺寸及年龄调整。
各博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物将会是富含酚类、花青苷及其他有益成分的来源。例如，黑加仑汁浓缩物预期包括的总花青素含量(g/100g)为至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、或至少1.5。关于示例性的花青素定量法，参见(98)及(99)。黑加仑汁浓缩物预期将包括的维生素C(抗坏血酸；mg/100g)的水平为至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少780、至少800、至少850、或至少900。黑加仑汁浓缩物预期将进一步包括的总酚含量(g/100g)为至少3.0、至少3.2、至少3.4、至少3.6、至少3.8、至少4.0、至少4.2、至少4.4、至少4.6、至少4.8、或至少5.0。关于示例性的酚类定量法，参见(100)。
在某些情况下，可能需要从所用的果实中分离或富集多酚。特别地，使用博伊森莓、苹果或黑加仑以获得多酚富集的组合物、酚类浓缩物或包含分离的酚类(例如分离的花青苷)的组合物是有利的。例如，本发明的组合物可富集多酚，以提高其相对于该果实其他成分(例如糖)的浓度。在特定方面，本发明的组合物可包括已从果实其他成分中分离的(例如由其纯化的)多酚。本文详述了用于分离或富集的特定多酚。
富集及提取多酚的方法在本领域中广为人知(例如81，82)。相较于未经多酚富集或分离步骤而制备的组合物，所得的组合物可包括至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、或至少10倍的多酚量。该多酚富集的组合物、酚类浓缩物及包含分离的酚类的组合物可干燥成粉末并根据本发明使用。
剂型可含有赋形剂，例如抗黏着剂、黏合剂、涂层、分散剂、香料、色素、甜味剂、润滑剂、助滑剂、流动剂、抗结块剂、吸附剂或防腐剂的一种或多种。有用的赋形剂包括但不限于：硬脂，硬脂酸镁及硬脂酸；糖类及其衍生物，例如双糖(蔗糖、乳糖)；多糖及其衍生物，例如淀粉、纤维素或修饰的纤维素(诸如微晶纤维素及纤维素醚(诸如羟丙基纤维素))；糖醇，诸如异麦芽酮糖醇、木糖醇、山梨糖醇及麦芽糖醇；蛋白质，诸如明胶；合成聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇；脂肪酸、蜡、虫胶、塑料及植物纤维(例如玉米蛋白、玉米醇溶蛋白)；羟丙基甲基纤维素；交联聚合物，例如交联聚乙烯吡咯烷酮和交联钠羧甲基纤维素；羟甲基淀粉钠；二氧化硅，气相氧化硅，滑石及碳酸镁。
预期本文公开的博伊森莓组合物将包括各种成分，例如碳水化合物及多酚，特别是花青素。特别关注的花青素包括矢车菊素及芸香糖苷，诸如矢车菊素-3-O-槐糖苷、矢车菊素-3-O-糖苷、表儿茶素、矢车菊素-3-O-萄糖基芸香糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、矢车菊素-3-(6’-p-香豆基)糖苷-5-糖苷、矢车菊素-3,5-二糖苷和矢车菊素-3-O-2G-萄糖基芸香糖苷。同样特别关注的是可水解单宁，诸如鞣花单宁及鞣花酸。本发明的博伊森莓组合物还包括各种碳水化合物，特别是各种糖(包括中性糖)。至于中性糖，博伊森莓组合物可包括果糖、葡萄糖及蔗糖中的一种或多种。
类似地，本文所公开的苹果组合物将包括各种成分，包括各种碳水化合物和多酚。特别关注的是酚类化合物，诸如类黄酮和肉桂酸和苯甲酸衍生物。包括儿茶素、原花青苷及羟基肉桂酸酯，更特别地包括3-羟基类黄酮，诸如花青苷、黄烷醇及黄烷-3-醇。关键的个别化合物包括表儿茶素、儿茶素、原花青素二聚体B2,5-咖啡酰奎宁酸及槲皮素糖苷。特别地包括作为苹果中的类黄酮前体发现的二氢查尔酮(诸如根皮苷)。苹果皮可用来获得高水平多酚及类黄酮，诸如槲皮素糖苷及矢车菊素。苹果肉及核可用来获得高水平绿原酸。特殊品种可用来最大化多酚水平。特别地，酿酒用苹果可用来最大化使其具有涩味及苦味的原花青素。本发明的苹果组合物也可包括各种碳水化合物，特别是各种糖(包括中性糖)。至于中性糖，苹果组合物可包括果糖、葡萄糖及蔗糖中的一种或多种。
如本文所公开，本发明的黑加仑组合物将包括各种成分，包括糖和多酚。特别值得注意的是羟基肉桂酸酯，诸如绿原酸及p-香豆酰基奎宁酸，以及花青苷及黄酮醇糖苷。特别关注的是多酚化合物，诸如飞燕草素3-O-葡萄糖苷；飞燕草素3-O-芸香糖苷；飞燕草素-3-O-(6-p-香豆酰基)葡萄糖苷；矢车菊素3-O-葡萄糖苷；矢车菊素3-O-芸香糖苷；矢车菊素3-O-葡萄糖苷-6-p-香豆基；芍药素3-O-芸香糖苷；丁香素3-O-芸香糖苷；新绿原酸；p-香豆酸葡萄糖苷；杨梅黄酮衍生物；槲皮素3-O-芸香糖苷；槲皮素3-O-半乳糖苷；及槲皮素3-O-葡萄糖苷。例如，果皮可用于获得高水平花青苷。本发明的黑加仑组合物也可包括各种碳水化合物，特别是各种糖(包括中性糖)。至于中性糖，本发明的组合物可包括果糖、葡萄糖和蔗糖中的一种或多种。
使用包含博伊森莓和苹果的组合物及包含博伊森莓、苹果和黑加仑的组合物的方法
如上所述，本文公开的博伊森莓组合物(包括含有博伊森莓和苹果的组合物及含有博伊森莓、苹果和黑加仑的组合物)可用于支持或改善整体呼吸系统健康和/或用于治疗或预防各种呼吸道病况(包括炎症)及与炎症有关的呼吸系统病症(诸如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、反应性气道疾病、气道纤维化和气道重塑)。其他与呼吸道炎症有关的病况包括：过敏症或过敏性病症、肺气肿、支气管炎、呼吸性细支气管炎、间质性肺疾病、炎症气道疾病、纤维化肺泡炎、内源性肺泡炎、肺嗜酸性粒细胞增多症、肺血管炎、肺炎、间质性肺炎、脱屑性间质性肺炎、淋巴样间质性肺炎、非特异性间质性肺炎、嗜酸性粒细胞肺炎、局限性肺炎、胸膜炎、胸膜积水、囊肿纤维化、先天性纤毛运动异常症、急性呼吸窘迫综合征、类肉瘤病、皮肌炎、蛔虫症、韦格纳肉芽肿、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、干燥综合症、卡塔格内综合征、声带功能异常、痉挛性哮吼、自体免疫疾病(诸如狼疮)、反射性血管舒缩疾病和自主性病症。呼吸道中与炎症相关的其他因素包括：吸烟、空气污染、过敏原、感染(例如病毒或细菌)、某些药物(例如化疗药剂)、放射治疗、医疗装置(例如呼吸器)及手术。
本发明的组合物找到关于治疗或预防呼吸道炎症、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、气道纤维化、气道重塑或本文所述的其他病况的用途。作为示例性剂量，该组合物可以为使患者获得约0.1mg/kg至约200mg/kg、约0.2mg/kg至约180mg/kg、约0.25mg/kg至约150mg/kg、约0.5mg/kg至约125mg/kg、约0.6mg/kg至约100mg/kg、约0.7mg/kg至约90mg/kg、约0.1mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约20kg/mg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg，约1mg/kg至约5mg/kg、或约200mg/kg、约100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/kg、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/kg、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、或约0.1mg/kg与患者体重相关的总花青苷或总博伊森莓花青苷的剂量给药。在特定方面，该剂量可为约0.1mg/kg至约10mg/kg。根据需要，上述剂量可每天给药一次、每天给药两次、每天给药三次或更多次。可在用餐时或在餐前给药。本领域技术人员将能容易地确定适当的剂量及剂型。
组合物可使用各种给药途径，包括肠内给药和口服给药。口服给药可利用片剂、胶囊、小袋、滴剂、酏剂、舔剂、溶液、乳剂、悬浮液、饮剂、泥、糊、糖浆、凝胶、冻胶、补剂或其他已知方式。肠内给药可通过十二指肠管或胃管(包括鼻胃管)。不同给药方式是本领域已知的且可被技术人员利用。本文公开的组合物不受限于给药的特定形式。
加入一种或多种酚类化合物至本发明组合物可能是有用的，以进一步补充其中的酚类活性。示例性化合物包括但不限于：酚类衍生物，诸如酚酸；以及类黄酮，诸如木质素、原花青素、花青苷、花青素、异黄酮素、儿茶素、单宁、槲皮素、柚皮素及橙皮苷。本文描述了特别关注的特定花青素化合物。特别包括从以下一种或多种中提取的酚类化合物：茶、可可、葡萄酒、大豆、费约果、柑橘类、苹果、梨、葡萄、浆果和猕猴桃。特定酚类包括但不限于：鞣花酸、绿原酸、儿茶素、表儿茶素、山柰酚、E-咖啡酰-3-葡萄糖苷、E-咖啡酰-4-葡萄糖苷、新绿原酸、根皮苷、原花青素B1及B2、槲皮素、槲皮素鼠李糖苷及槲皮素芸香糖苷。
作为另外的方面，本发明的组合物可与一种或多种呼吸助剂共同给药。呼吸助剂可为药物(处方或非处方)或替代治疗(诸如草药或精油，例如用于蒸发和/或吸入)。特别关注的是本发明组合物在其他呼吸系统治疗期间和/或之后作为呼吸系统治疗的用途。例如，该组合物可与一种或多种药物或替代治疗配成组合剂型。或者，博伊森莓组合物可以单独剂型与一种或多种药物或替代治疗一起给予。呼吸助剂可具有一种或多种生理作用，例如抗炎症、抗痉挛、支气管扩张和/或肌肉松弛效应。任何呼吸助剂可为长效或短效，且可针对特定病症，诸如哮喘、慢性阻塞性肺疾病等。
示例性药物包括但不限于支气管扩张剂，其包括：短效支气管扩张剂，诸如沙丁胺醇(例如Vospire Er)、左旋沙丁胺醇(例如Xopenex)、异丙托溴铵(例如Atrovent)、沙丁胺醇/异丙托溴铵(例如Combivent)；皮质类固醇，诸如氟替卡松(例如Flovent、FloventDiskus、Flovent HFA)、布地奈德(例如Pulmicort、Pulmicort Flexhaler)、莫美他松(例如Asmanex)、倍氯米松(例如QVAR)、氟尼缩松(例如Aerospan)、去氢皮质醇、甲基去氢皮质醇和氢皮质酮；甲基黄嘌呤，诸如茶碱(例如Theochron、Theo-24、Elixophyllin)；长效支气管扩张剂，诸如阿地溴铵(例如Tudorza)、阿福莫特罗(例如Brovana)、福莫特罗(例如Foradil、Perforomist)、格隆溴铵(例如Seebri Neohaler)、茚达特罗(例如Arcapta)、奥达特罗(例如Striverdi Respimat)、沙美特罗(例如Serevent)、噻托溴铵(例如Spiriva)和芜地溴铵(例如IncruseEllipta)；两种或多种长效支气管扩张剂的组合，诸如格隆溴铵/福莫特罗(例如Bevespi Aerosphere)、格隆溴铵/茚达特罗(例如Utibron Neohaler)、噻托溴铵/奥达特罗(例如Stiolto Respimat)、芜地溴铵/维兰特罗(例如Anoro Ellipta)。
进一步的示例性药物包括但不限于：吸入性皮质类固醇与长效支气管扩张剂的组合，诸如：布地奈德/福莫特罗(例如Symbicort)、氟替卡松/沙美特罗(例如Advair、AdvairDiskus)及氟替卡松/维兰特罗(例如BreoEllipta)；磷酸二酯酶-4抑制剂，诸如罗氟司特(例如Daliresp)；β激动剂，包括短效β激动剂(诸如沙丁胺醇(例如ProAir HFA、VentolinHFA)和左旋沙丁胺醇(例如Xopenex HFA))；抗胆碱剂，诸如异丙托溴铵(例如AtroventHFA)；长效β拮抗剂(LABA)，诸如福莫特罗(Perforomist)和沙美特罗(例如SereventDiskus))；白三烯调节剂，诸如孟鲁司特(Singulair)、扎鲁司特(Accolate)和齐留通(例如Zyflo、Zyflo Cr)；免疫调节剂，诸如美泊利单抗(Nucala)、奥马珠单抗(例如Xolair)、瑞利珠单抗(例如Cinqair)；支气管扩张剂，诸如肾上腺素(例如Primatene Mist、Bronkaid、Asthmahaler)、麻黄碱及茶碱-麻黄碱(例如Primatene片剂)。
实例
本文所述的实例是为了说明本发明的具体实施例而提供的，并不旨在以任何方式限制本发明。
实例1：OVA诱导的慢性气道炎症与博伊森莓口服治疗
概述
慢性哮喘中的肺纤维化对肺功能有负面影响，且与促纤维巨噬细胞表型的形成有关。流行病学研究发现，多摄取富含酚类的水果有益肺功能。然而，先前的研究尚未对博伊森莓组合物或其对气道系统中的纤维化或重塑的作用进行研究。
发明人在抗原诱导的慢性气道炎症的小鼠模型中，研究博伊森莓摄取在治疗和预防性治疗策略中的作用。摄取博伊森莓可减少胶原沉积并改善组织重塑，同时肺组织中CD68+CD206+精胺酸酶交替激活的巨噬细胞增加。组织重塑的减少与全肺组织中促纤溶性基质金属蛋白酶-9蛋白的表达增加有关。
发明人在摄取博伊森莓作为基质金属蛋白酶-9的来源的小鼠内发现了交替激活的巨噬细胞。发明人假设口服博伊森莓处理通过支持促纤溶性交替激活的巨噬细胞(表达基质金属蛋白酶-9)的发育而减轻慢性组织重塑。因此，规律地摄取博伊森莓能减轻哮喘和其他慢性肺疾病中的慢性肺重塑及纤维化。
材料
抗肌动蛋白(克隆Ac-15)、卵清蛋白(OVA)、4％福尔马林、吐温20、反式羟脯氨酸、3,3’-二氨基联苯胺(DAB)基质、氯胺酮/甲苯噻嗪及所有其他化学品均来自Sigma(Auckland，NZ)。明矾来自Serya(Heidelberg，Germany)。博伊森莓汁来自New Zealand65Brix博伊森莓汁浓缩物，由Berryfruit Export NZ提供，现以Boysenberries NewZealand Ltd(Nelson，New Zealand)进行销售。来自Berryfruit Export NZ的65Brix博伊森莓汁浓缩物在无菌水中稀释以获得100mg/ml总花青苷的浓度。由此制备进一步稀释液以获得10mg/kg的总花青苷剂量。此进一步稀释液称为博伊森莓溶液。
抗小鼠多克隆诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)(ab3523)、精氨酸酶、TIMP-1(ab38978)和MMP-9(ab38898)获自Abcam(Cambridge，UK)。抗小鼠CD68(克隆FA-11)、CD3e、CD8a、CD4、CD11b、CD11c和Gr-1抗体获自BioLegend(San Diego，CA)，而抗CD206(克隆MR5D3)获自AbDSerotec(Oxford，UK)。抗小鼠SiglecF、MHCII和CD45来自BD Biosciences(San Jose，CA)。
TGFβELISA试剂盒获自R&D Systems(Minneapolis，MN)。Vectastain Elite ABC染色试剂盒来自Vector Laboratories(Burlingame，CA)。IL-4、IL-5、IL-6、IL-13和IFNγ的Bio-Plex多重细胞因子测定、DC Lowry蛋白质测定试剂盒和PVDF膜来自Bio-Rad(Hercules，CA)。BSA、NuPage 4-12％凝胶、MES电泳缓冲液、加样缓冲液、预染的Novexsharp及MagicMark XP蛋白质标准品及所有其他缓冲液来自Life Technologies(Auckland，NZ)。
动物
在新西兰威灵顿Malaghan医学研究所的特定无病原体动物设施中，在具有过滤器顶部的常规聚碳酸酯笼中繁殖及分群圈养(每笼5只)C57BL/6J雄性小鼠。所有实验程序均获得惠灵顿维多利亚大学动物伦理委员会批准(批准号2011R3M)。
使小鼠维持在12-h光暗循环、21±2℃环境温度中，可自由取得辐射标准实验室啮齿动物食料(Specialty Feeds,Glen Forrest,WA,Australia)及酸化水。
OVA诱导的慢性气道炎症及博伊森莓口服治疗
六周龄小鼠被随机分配至实验组(每组n＝10)并于第0天经腹腔内以100μg OVA及200μl明矾佐剂致敏。第+7天经鼻内以100μg OVA或PBS激发小鼠。
为了建立慢性疾病，每周重复经鼻内激发(图1A和6A)。最后一次经鼻内OVA激发之后四天，将小鼠安乐死(氯胺酮/甲苯噻嗪过量)，收集支气管-肺泡灌洗液(BALF)、血清、纵膈淋巴结及肺组织。
对于该治疗研究，小鼠在经口管饲250μl博伊森莓溶液(见上文)前禁食过夜；在OVA激发当天给予剂量为10mg/kg的总花青苷或无菌水，OVA激发2天后再次给予(图1A和6A)。
肺巨噬细胞氯膦酸脂质体耗竭及组织分析
依先前所述方式制备氯膦酸脂质体(58)。持续5周建立慢性OVA诱导的组织损伤。然后在每次经口管饲250μl博伊森莓溶液(见上文；剂量为10mg/kg总花青苷)或无菌水前一天以100μl氯膦酸脂质体经鼻内给予小鼠(图6A)。最后一次经口管饲后2天将小鼠安乐死(氯胺酮/甲苯噻嗪过量)并收集BALF、血清、纵膈淋巴结及肺组织。
通过前述的流式细胞术，对从BALF分离的细胞的关键表面标记物进行染色以鉴定单核细胞/巨噬细胞(CD45+/CD11b+/Cd11c+/MHCIIlow)及嗜酸性粒细胞(CD45+/CD11b+/siglecF+)(52)。按照制造商说明对肺组织上清液进行TGFβELISA和Bio-Plex多重细胞因子测定。肺组织用4％福尔马林固定、切片及以苏木精和伊红(H&E)、马森三色或阿辛蓝-过碘酸-希夫(AB-PAS)染剂染色(Dept.of Pathology,Wellington School of Medicine,University of Otago,Wellington,NZ)。
切割其他切片用于免疫标记。肺切片与生物素-共轭的MMP-9一起孵育，然后用DAB标记并用苏木精对比染色。其他组织切片与荧光标记的CD68(31)、CD206(57)及精胺酸酶或MMP-9(44)一起孵育，然后与含DAPI的封固剂对比标记。
所有切片经Olympus BX51复式显微镜成像并使用cellSens(Olympus NZ)软件捕获，彩色代表亮光而灰阶代表荧光。用Pixelmator图像软件(Vilnius，Lithuania)加工荧光图像(裁剪、假上色及合并)。荧光标记细胞经四个独立盲测者加以量化。来自多个动物的随机区域细胞被计数并分为CD68、CD206、精氨酸酶或MMP-9阴性、单阳性或双阳性。以所计数总细胞的百分比表示数据。
生物化学及分子生物组织分析及统计分析
生物化学及分子生物组织分析。快速冷冻肺组织并储存在-70℃。如前所述，用羟脯氨酸测定定量肺胶原(2)。对于免疫印迹，在蛋白质裂解缓冲液(Tris·HCl，NaCl，10％Nonidet P-40，10％去氧胆酸钠，100nM EDTA，pH 7.4蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中均质化组织。按照制造商说明用Lowry蛋白质测定定量蛋白质浓度。
在还原条件下用SDS-PAGE凝胶电泳分离样品(30μg蛋白质)并将其转移到PVDF膜上。用3％BSA(10mM PBS及0.2％吐温20)阻断非特异性蛋白质结合并用对iNOS(64)、精氨酸酶(53)、MMP-9(44)和TIMP-1(55)或β-肌动蛋白(12)加载对照(4℃)具特异性的初级抗体对该膜探测过夜。洗涤膜，与辣根过氧化物酶共轭的第二抗体一起孵育，并在Carestream GelLogic Pro 6000成像仪上通过化学发光可视化。用ImageJ’s Gel分析工具光密度定量蛋白质表达并将其标准化为β-肌动蛋白(50)。在Pixelmator图像软件中加工及裁切图像。
如图所示，用单尾学生t检验(用于两组间的比较)或图基事后检验的单向方差分析(用于三组或多组间的比较)来分析数据(Prism,GraphPad,San Diego,CA)。P＜0.05或更小时被认为具有统计学意义。
结果-博伊森莓摄取改善OVA诱导的慢性气道炎症
为了研究博伊森莓治疗对已建立的肺重塑的作用，以鼻内OVA逐周激发小鼠，持续5周，然后以OVA逐周激发另外5周同时逐周用博伊森莓口服治疗(图1A)。
如图1B所示，OVA激发的小鼠的肺组织表现出细胞浸润增加且肺结构丧失。博伊森莓处理小鼠的OVA诱导的细胞浸润及肺损伤减少(图1B)。肺组织粘液产生染色显示，接受博伊森莓治疗的OVA激发的小鼠的粘液阳性细胞比仅OVA激发的小鼠少(图1C)。仅博伊森莓治疗不会影响细胞浸润、肺结构或粘液产生。
结果-博伊森莓治疗增加了OVA激发的小鼠肺中的AAM
相较于OVA小鼠，H&E染色的肺组织切片显示在OVA/博伊森莓治疗的小鼠中有更多巨噬细胞(图2A)。相较于仅OVA激发，肺组织免疫印迹分析鉴定出OVA/博伊森莓治疗的小鼠肺组织中的iNOS表达减少(图2，B和C)。同时，OVA激发的小鼠中可发现精氨酸酶表达增加(图2，B和D)。用博伊森莓治疗的OVA激发的小鼠的此作用进一步增强。仅博伊森莓治疗不会影响精氨酸酶表达。
表达精氨酸酶的AAM与肺重塑密切相关(29)。为了确定观察到的肺巨噬细胞是否被交替激活，用巨噬细胞标记CD68和AAM标记CD20及精氨酸酶荧光标记抗体染色肺组织。
与OVA激发的小鼠相比，OVA/博伊森莓治疗的小鼠的肺组织显示CD68+CD206+精氨酸酶+巨噬细胞增加(图3)。CD68+CD206+精氨酸酶+巨噬细胞的定量分析进一步证实，相较于OVA激发的小鼠，OVA/博伊森莓治疗的小鼠肺组织中的CD68+CD206+精氨酸酶+巨噬细胞百分比显著增加(60.00±3.54％，相较于23.47±5.61％，P＜0.001，单尾学生t检验)。这些数据一起鉴定出接受博伊森莓治疗的OVA激发的小鼠中表达交替激活表型的肺巨噬细胞数量增加。
结果-博伊森莓治疗减少了OVA诱导的胶原沉积并增加了肺中的MMP-9表达
AAM及精氨酸酶表达的增加通常与组织纤维化有关(14,27,66)；因此，研究了博伊森莓治疗对肺中OVA诱导的胶原沉积的影响。在此之后，肺组织中测量的羟脯氨酸水平可当作胶原沉积的替代标记(2,63)。
仅OVA激发造成气道中异常胶原沉积，且在整个肺组织中有胶原入侵的迹象，而这在OVA/博伊森莓治疗的小鼠的肺中却被消除(图4)。此外，用博伊森莓治疗的OVA激发的小鼠肺中的羟脯氨酸水平显著地下降，证实博伊森莓治疗改善OVA诱导的胶原沉积(图4B)。博伊森莓恢复OVA诱导的肺中TGFβ水平的减少(图4C)，但未影响IL-4、IL-5、IL-6、IL-13或IFNγ的水平(数据未显示)。
为了确定博伊森莓治疗如何减轻肺纤维化，用免疫印迹测定肺组织中的MMP-9表达。
相较于仅OVA激发的小鼠，确定以博伊森莓治疗的OVA激发的小鼠中MMP-9的表达增加(图4D)。仅博伊森莓治疗不会影响肺中的MMP-9水平。基质金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1)是MMP-9的内源性抑制剂(49)。慢性OVA激发的小鼠的肺组织中TIMP-1/MMP-9表达比值显著增加，而用博伊森莓治疗可逆转此增加(图4E)。这些结果表明博伊森莓介导的胶原沉积及组织重塑的减少与纤溶性MMP-9的产量提高及TIMP-1/MMP-9比值的随后重新平衡有关。
结果-交替激发的巨噬细胞是OVA/博伊森莓治疗的小鼠的肺中MMP-9蛋白质的来源
分析肺组织玻片以鉴定MMP-9的潜在细胞来源。相较于OVA治疗的对照，DAB-MMP-9染色在OVA/博伊森莓治疗的小鼠中鉴定出表现巨噬细胞形态的高度MMP+细胞(图5A)。荧光免疫染色(图5B)及肺组织定量分析证实相较于仅OVA激发，OVA/博伊森莓治疗的肺中有较多MMP-9+/CD206+/CD68+细胞存在(39.30±6.39对比于21.07±5.82％；P＜0.05，单尾学生t检验)。这些结果确定CD206+/CD68+AAM是MMP-9蛋白质水平增加的来源。
结果-在建立的慢性肺炎症中肺巨噬细胞耗竭会减少摄取博伊森莓对组织重塑的有益作用
其次，发明人研究耗竭肺巨噬细胞对于博伊森莓对慢性肺炎症有益作用的影响。在建立慢性肺炎症及重塑后，以及各博伊森莓治疗给药前，给予氯膦酸脂质体使巨噬细胞耗竭(图6A)。用流式细胞术证实肺巨噬细胞显著耗竭(图6B)，而这与以博伊森莓治疗的OVA激发的小鼠肺中的羟脯氨酸水平显著减少有关(图6C)。这些数据指出博伊森莓需要巨噬细胞来介导对肺组织重塑的有益影响。
结果-博伊森莓治疗预防性防止了OVA诱导的气道炎症
最后，使用预防性给药方案测试博伊森莓治疗的效果(图7A)。再次，博伊森莓治疗造成OVA诱导的组织重塑的消除且显著地减少肺灌洗液中的细胞(图7，B-D)。这与肺组织中较低的羟脯氨酸水平及TIMP-1/MMP-9表达的比值降低有关(图7，E-G)。
讨论
摄取水果与哮喘患者中改善的肺功能及实验模型中急性气道炎症的改善有关(16,19,40)。然而，尚未在与博伊森莓组合物、气道纤维化或气道重塑相关的研究中确立任何发现，而众人皆知其他已知的哮喘治疗方式未能解决气道重塑问题。
本文证明摄取博伊森莓组合物可在治疗和预防两方面减轻慢性肺重塑及纤维化。此外，数据表明巨噬细胞在博伊森莓介导的保护作用中举足轻重，且此保护作用可能是由AAM调节及MMP-9活性增加所致。
精氨酸酶活性(26,27,41)和AAM(4,9)二者的增加通常与哮喘发病机制有关。然而，有证据表明AAM的存在并未特别加强过敏性哮喘的发展(37)，这表示AAM可能扮演另一个角色。
如本文所示，博伊森莓治疗使慢性OVA激发的小鼠的肺组织中精氨酸酶阳性AAM数量增加，同时使iNOS表达降低。精氨酸酶及iNOS在调节肺炎症及修复方面有交互作用(34,35,66)。当iNOS活性与活跃性炎症相关时，精氨酸酶表达预示向炎症消退的转变(35,63)。因此，摄取博伊森莓似乎能重新平衡肺环境，通过调节肺中AAM的功能表型使炎症消退。
AAM的存在与肺炎症中减少的Th-2细胞因子生成有关(36,42)。然而，经确定，在OVA激发后摄取博伊森莓不会改变Th-2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平。这表明AAM对促炎性Th-2细胞因子产生的抑制作用对博伊森莓治疗的保护作用没有帮助。
临床及动物数据表明MMP-9在哮喘中的作用具多面性。在实验及临床环境中鉴定到产生MMP-9的肺巨噬细胞(1,5,49)。相较于健康对照，在哮喘患者的血浆及痰样品中发现活性MMP-9的水平升高(3,23)。增加的MMP-9表达与急性哮喘加剧有关，包括增加的肺嗜酸性粒细胞增多症(6,23)。相反地，MMP-9水平的增加与气道疾病中肺功能的改善有关(25,65)。MMP-9过度表达也被证明在肺纤维化模型中具有益影响(5)。相反地，来自MMP-9基因剔除小鼠的数据显示哮喘症状的发展部分减缓且重塑减少，但在某些情况下缺乏MMP-9已被证明会加重疾病(15,24,32)。
MMP-9对不同免疫参数(包括促炎及抗炎细胞因子的活化)发挥许多下游影响(15)。然而，本文所示数据表明，博伊森莓诱导的使肺组织免受慢性胶原沉积和纤维化的保护部分地是通过产生纤溶性AAM(其产生MMP-9)实现的。与此一致，数据显示炎症消退阶段巨噬细胞的耗竭会导致摄取博伊森莓情况下的胶原沉积增加。在博莱霉素诱导的肺纤维化中已说明巨噬细胞有类似的促进痊愈作用(14)。
基质金属蛋白酶受其天然抑制剂TIMP调节，且有人提出较高的TIMP-1/MMP-9比值有利于胶原沉积和肺重塑(21,28,38)。于此观察到慢性OVA激发的小鼠肺组织中TIMP-1/MMP-9表达的比值显著增加，而此被博伊森莓治疗逆转。因此，博伊森莓治疗的小鼠中TIMP-1/MMP-9比值的下降代表胶原沉积与分解调节中潜在的有益的重新调整。
TGFβ通过其在胞外基质产生中的作用而与正常(20)及病理(17,22,56)组织修复过程有关。在此研究中，观察到慢性OVA激发导致TGFβ水平降低，其因博伊森莓的摄取而逆转。证据表明TGFβ降低TIMP-1/MMP-9比值，从而有利于更纤溶性的环境(18,54,56)。如此，博伊森莓治疗后在OVA激发的小鼠肺中观察到的TGFβ水平增加可有助于通过降低TIMP-1/MMP-9比值来限制肺修复期间的过度组织纤维化和不当重塑。还已知TGFβ会刺激纤维母细胞收缩以进行正常组织修复(20)，其同样有助于博伊森莓治疗的有益效果。如此，TGFβ升高有可能借由多种机制促进肺中抗炎症、促分解的环境。
这些研究结果表明博伊森莓给药在治疗和预防方面均对慢性肺纤维化具有有益作用。这表明在哮喘控制不良及控制良好的情况下，摄取博伊森莓皆可能有助于避免不适当的纤维重塑。最后，这些发现提供第一个证据，即博伊森莓摄取可用于支持具有调节哮喘及其他表现纤维病变肺病况的适当肺重塑潜质的纤溶性AAM的发育。
总之，这些发现表示在呼吸道中博伊森莓组合物可用于减少炎症及异常胶原沉积，借此找到在治疗及预防各种气道病症(包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、反应性气道疾病、气道纤维化及气道重塑)中的用途。
实例2：OVA诱导的急性气道炎症及博伊森莓和苹果的口服治疗
材料及方法
如上文所述及以下修改以实例1方式处理并评价六周龄小鼠。该测试溶液包括：博伊森莓1和博伊森莓10(分别为0.67％和6.7％)，苹果1和苹果10(分别为1.87％和18.7％)，BerriQiTM博伊森莓与苹果1和BerriQiTM博伊森莓与苹果10(分别为0.67％/1.87％和6.7％/18.7％)。如实施例1所述，获得商购的博伊森莓汁浓缩物。苹果汁浓缩物是由Infruit Ltd(Titirangi,Auckland,New Zealand)提供，由Profruit(2006)Ltd(Hastings,New Zealand)制造。
对于该18.7％溶液，在100g水中稀释18.7g果汁浓缩物。对于该6.7％溶液，在100g水中稀释6.7g果汁浓缩物。对于该1.87％溶液，在100g水中稀释1.87g果汁浓缩物。对于该0.67％溶液，在100g水中稀释0.67g果汁浓缩物。对于该组合的6.7％/18.7％溶液，在100g水中稀释分别为6.7g和18.7g的果汁浓缩物。对于该组合的0.67％/1.87％溶液，在100g水中稀释分别为0.67g和1.87g的果汁浓缩物。关于该组合的溶液，博伊森莓与苹果的百分比为27％至73％。平行制备的BerriQiTM博伊森莓与苹果测试溶液，在给药前于80℃下加热8小时，以测试抗炎症活性的去活性化。
用于测试博伊森莓与苹果给药的组合给药实验计划是基于先前公开的用于诱导过敏性气道炎症的方法(52)。该急性炎症实验计划使用11天模型。为评价博伊森莓、苹果、组合的博伊森莓和苹果给药的疗效且为确定稀释10倍处理的效果，测试了以下处理组：1)基线控制组(无疾病)；2)疾病控制组；3)苹果10(18.7％)+疾病；4)苹果1(1.87％)+疾病；5)博伊森莓10(6.7％)+疾病；6)博伊森莓1(0.67％)+疾病；7)BerriQiTM博伊森莓与苹果10(6.7/18.7％)+疾病；8)BerriQiTM博伊森莓与苹果1(0.67/1.87％)+疾病；9)‘经烹煮的’BerriQiTM博伊森莓与苹果(6.7/18.7％)+疾病。每一组包含10只动物。实验重复三次。统计分析按如实施例1所述方式进行。
根据此模型先前的运用，使用以下剂量/激发方案。在激发前7天，对小鼠进行过敏性气道炎症致敏，于激发后4天收集样品。于第0天和第+2天以250μl所述处理或水(对照)给予(处理)小鼠(见下文)。对于博伊森莓10测试溶液(博伊森莓10和BerriQiTM博伊森莓与苹果10)，给予剂量以提供4.87mg/kg总花青苷。对于博伊森莓1测试溶液(博伊森莓1和BerriQiTM博伊森莓与苹果1)，给予剂量以提供0.487mg/kg总花青苷。
Figure BDA0002379793890000471
收集以下样品：1)肺冲洗液；2)肺组织；3)纵膈淋巴结；4)血液。根据(52)所述方法分析这些样品的以下者：1)细胞总数(及细胞成分)：肺冲洗液、肺组织及淋巴结；2)产生的细胞因子及趋化因子(包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、CCL11、IFNγ)：肺冲洗液、肺组织及血液；3)IgE、IgG1：仅血液。根据制造商的说明使用BioLegend LEGENDplexTM多分析物流动测定试剂盒测试细胞因子水平。
结果
图8显示测试示意图。由所获得的结果可知，卵清蛋白激发增加肺中炎症细胞的出现。特殊处理使此增加减少而回到未处理的水平，即未添加OVA。
该结果说明经鼻内以过敏原OVA激发的小鼠中全部免疫细胞浸润至肺中(图9)。单独以苹果治疗不会减少该细胞浸润。BerriQiTM博伊森莓与苹果于两种测试浓度均能减少该细胞浸润，而当BerriQiTM博伊森莓与苹果被加热至80℃持续8小时则此结果被逆转。
结果显示单独以苹果处理对于嗜酸性粒细胞数量、嗜中性粒细胞、单核细胞、或抗原呈递细胞(APC)作用不大(图10、14-16)。与此相反，低剂量水平的组合的BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗实质上减少嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞及单核细胞数量(图10、14、15)。在处理前加热BerriQiTM博伊森莓和苹果溶液会逆转此作用(图10、14、15)。组合的BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗还会减少APC数量(图16)。加热会逆转此作用(图16)。
苏木精和伊红染色显示卵清蛋白激发造成组织肿胀和免疫细胞浸润，然而相较于单独的OVA，组合的BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗似乎能减少组织肿胀(图13)。
AB-PAS染色显示不同处理间粘液产生情况有所不同(图17-19)。虽然在最低果实浓度下观察到更多会产生粘液的细胞，却没有任何一种处理使粘液生成更严重，也没有任何一种处理能预防粘液生成增加(图17-19)。这些结果被归因于对急性试验模型给药的持续时间短且次数少(两次)。此与较长试验测试期及上述实施例1提到的另外的给药形成对比。建议给予较长测试时间及另外的剂量能更好地观察对粘液产生的作用。
马森三色染色显示急性OVA激发不会实质上地增加纤维化。肺组织内胶原沉积没有增加(图20-22)。此组织学结果指出治疗对纤维化的作用无法在这个急性试验模型中进行测试。这证实急性试验模型的短持续时间无法提供足够时间来了解对长期症状(诸如粘液产生及胶原沉积)的作用。
评价获自测试及控制组动物的肺液的细胞因子水平，其包含粒性白细胞-巨噬细胞群体刺激因子水平(GM-CSF)、IFNγ、IFNβ、IL-1α、IL-1β、TNFα、IL-12(p40)、IL-10、IL-6、IL-27、CXCL1和CCL2。单独的博伊森莓治疗会减少GM-CSF水平(图23)，然而苹果治疗及组合的BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗不会减少GM-CSF水平(图23)。CCL11水平似乎未受显著影响(图24)。IFNγ、IFNβ、IL-1α、IL-1β、TNFα、IL-12(p40)、IL-10、IL-6、IL-27、CXCL1和CCL2未在受测样品中测得(数据未显示)。基于此，推测BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗的作用并非经由CCL11的分泌介导。
讨论
由这些结果总结出组合的BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗于标准或较低剂量皆能减少嗜酸性粒细胞浸润数量。此影响取决于BerriQiTM博伊森莓与苹果组合物的温度敏感元素。单独使用苹果的治疗对于嗜中性粒细胞、单核细胞或APC数量作用不大。组合的BerriQiTM博伊森莓与苹果的较低剂量治疗能减少嗜中性粒细胞及单核细胞数量，而于标准及较低剂量能减少APC数量。这些作用取决于温度敏感元素。显然地博伊森莓和苹果组合物的组合给药可用于减少与过敏性气道炎症相关的免疫细胞数量。
不同治疗间对粘液产生的评估有所不同，得出的结论为粘液抑制作用的其他或替代措施(诸如IL-13、IL-9产生)可能提供进一步澄清。用以鉴定促炎症细胞因子变化的肺组织上清液分析显示CCL11水平并未受BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗影响，表示嗜酸性粒细胞的减少并非由CCL11的抑制作用介导。其他分析可用于鉴定涉及此过程的特殊试剂。
总体而言，此急性研究的结果为阳性，显示BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗于两种测试浓度皆会减少细胞浸润，而仅苹果于任何测试浓度皆不会。仅博伊森莓也会减少细胞浸润，此与本文所述先前研究中之发现相类似(参见例如实施例1及(74))。尤其本研究中使用的过敏性气道炎症急性模型并没有充分地促进组织纤维化的发展，因此无法确定BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗能否促进抗纤维化巨噬细胞的发育并预防组织损伤。为确定此作用的存在，有必要对慢性过敏性气道炎症进行进一步的研究。
实例3：OVA诱导的慢性气道炎症以及用博伊森莓和苹果进行口服治疗概述
虽然已经研究了某些水果和蔬菜的摄取对健康的有益影响(87,88,91-94)，但本文所述的实验首次表明，特定的博伊森莓组合物具有显著的有益影响。参见实例1和实例2，以及(74)。实例1的研究的关键发现包括：1)博伊森莓摄取通过降低细胞浸润并增加抗炎蛋白产生，显著减轻了过敏原诱导的气道炎症；2)博伊森莓通过支持纤溶巨噬细胞(一种免疫细胞)的发育，降低了胶原沉积并辅助受损组织修复；3)博伊森莓治疗可预防卵清蛋白(OVA)诱导的气道炎症。
还研究了不同苹果品种对过敏性气道疾病的关键细胞因子的影响(96)，并在过敏性哮喘诱导的细胞培养模型中确定了不同苹果品种的细胞因子抑制能力。所述抑制能力与原花青素多酚的存在相关联(96)，并且这些化合物(单独地)是关键过敏性趋化因子CCL11(90)和CCL26(89)的有效抑制剂。本项目的主要目标是在慢性OVA诱导的过敏性气道炎症的动物模型中，对BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗(博伊森莓汁浓缩物和苹果汁浓缩物以及水的全新组合)进行评估。
材料及方法
为了进行此研究，如实例1中，使用了先前建立的小鼠模型以及慢性OVA诱导的过敏性气道炎症的口服剂量策略(也可参见(52)、(97))。简言之，用OVA/明矾将小鼠经腹腔内(i.p.)致敏，7天后用OVA经鼻内(i.n.)激发。这些经鼻内激发每周一次，进行10周。5周的OVA激发之后，开始BerriQiTM干预。对于这些干预，于经鼻内OVA激发2天前、经鼻内OVA激发1小时前以及OVA激发2天后，在对小鼠禁食4小时之后，以管饲法经口喂食水(疾病和媒介物对照)、BerriQiTM博伊森莓与苹果(以100％、50％或25％的浓度)。
干预组为：1)未经处理的小鼠(基线对照)；2)+OVA(疾病和水媒介物对照)；3)+OVA+含有源自新西兰的70°Brix苹果汁浓缩物和源自新西兰的65°Brix博伊森莓汁浓缩物的BerriQiTM100％(疾病加100％BerriQiTM博伊森莓与苹果)；4)+OVA+含有源自新西兰的70°Brix苹果汁浓缩物和源自新西兰的65°Brix博伊森莓汁浓缩物的BerriQiTM50％(疾病加50％BerriQiTM博伊森莓与苹果)；5)+OVA+含有源自新西兰的70°Brix苹果汁浓缩物和源自新西兰的65°Brix博伊森莓汁浓缩物的BerriQiTM25％(疾病加25％BerriQiTM博伊森莓与苹果)。博伊森莓汁浓缩物获自Boysenberry NZ(纳尔逊，新西兰)。苹果汁浓缩物由RD2International(奥克兰，新西兰)供应，由Profruit(黑斯廷斯，新西兰)制造。
计算BerriQiTM博伊森莓与苹果中博伊森莓的浓度，以向70kg的人类递送每次0.73mg/kg博伊森莓花青苷，这相当于小鼠的10mg/kg。这一剂量是根据先前的研究而选择的(参见实例1和(52))，这些研究确定10mg/kg博伊森莓花青苷的摄取量会使慢性过敏性气道炎症的小鼠模型中的炎症和组织纤维化减少。100％BerriQiTM博伊森莓与苹果向25g小鼠提供10mg/kg总博伊森莓花青苷；50％和25％BerriQiTM博伊森莓与苹果分别向25g小鼠提供5mg/kg和2.5mg/kg总博伊森莓花青苷。下面的实例5中提供了剂量的详细信息。
在经鼻内OVA激发4天后，对小鼠实施安乐死。如实例1中所述，对以下参数进行测量：1)细胞浸润：嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和抗原呈递细胞(APCs)；2)组织学变化：苏木精和伊红(H&E)、阿辛蓝和过碘酸-希夫(AB-PAS)、马森三色染色；3)胶原产生(采用羟脯氨酸测定)。对于羟脯氨酸测定，使用商用比色试剂盒(AbCam ab222941)。
结果
结果显示，用过敏原、OVA进行经鼻内激发的小鼠体内，向肺内的总免疫细胞浸润增加(图25)。在测试的50％和25％浓度下，BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗显著降低了细胞浸润(图25)。100％浓度BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗似乎对OVA诱导的肺中免疫细胞的增加没有影响。这被假定为显示了BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗的治疗窗。
免疫细胞被识别为嗜酸性粒细胞(图26)、抗原呈递细胞(图27)和单核细胞(图28)。嗜酸性粒细胞的数量在用OVA激发的小鼠体内呈现出显著增加(图26)。50％BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗实现了嗜酸性粒细胞数量的减少(图26)。用OVA激发后，抗原呈递细胞显著增多，并且50％和25％BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗实现了APC数量的减少(图27)。单核细胞的数量在用OVA激发的小鼠体内增加，并且50％和25％BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗实现了单核细胞数目的减少(图28)。
苏木精和伊红染色显示卵清蛋白激发导致了组织肿胀并证实免疫细胞浸润，并且这些症状可由BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗减轻(图29)。AB-PAS染色显示卵清蛋白激发导致粘液产生增加，而BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗以剂量依赖性的方式减少粘液产生(图30)。
马森三色染色显示反复的OVA激发导致气道内胶原纤维的弥散性蓝色染色(图31)。BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗减少了肺内这些蓝色胶原纤维的出现(图31)。
用羟脯氨酸测定对胶原水平进行定量，结果显示，用OVA激发，胶原并未增加(图32)，这与之前的结果相反。用100％或50％BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗，未见胶原水平发生显著变化(图32)。然而，用25％BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗，胶原水平发生显著变化(图32)。下面将对此进行更详细的讨论。
讨论
经鼻内OVA激发导致肺内炎症细胞增多，而50％和25％BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗可将其减少。与OVA激发的小鼠相比，100％BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗对浸润免疫细胞的数量没有影响，表明这种治疗可能存在最佳浓度。
BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗以剂量依赖性的方式减少粘液产生，其中25％BerriQiTM博伊森莓与苹果治疗可最大程度地减少粘液产生。
对肺部组织进行分析以定量总胶原的变化，结果显示胶原的量在OVA激发后并未发生变化，这与开始的羟脯氨酸测定结果不一致(参见，例如实例1和(74))。与开始的测定相比，本实例所用测定采用的测量试剂来自替代来源。
显著地，马森三色染色表明OVA激发导致胶原浸润到气道内，而BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗有助于逆转此浸润。因此，组织学方法证实OVA改变了组织周围胶原的位置，而BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗可解决这一问题。
需要进行进一步的研究，以充分阐明当前的羟脯氨酸测定结果。如上所述，一种可能的解释为测定差异。此外，可能的是，虽然来自OVA激发的总胶原的量没有发生变化，但是胶原的位置发生了改变，而BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗正在解决这一问题。如在25％BerriQiTM博伊森莓和苹果治疗时所看到的，胶原量的增加伴随着气道中胶原染色的减少，这也可能是炎症消退时发生组织重塑的结果。
实例4：OVA诱导的慢性气道炎症和用博伊森莓、苹果和黑加仑进行口服治疗
材料及方法
为了进行此研究，如实例1中，使用了小鼠模型以及慢性OVA诱导的过敏性气道炎症的口服剂量策略。另请参见(52)、(97)。简言之，用OVA/明矾将小鼠经腹腔内(i.p)致敏，7天后用OVA经鼻内(i.n)激发，此经鼻内激发每周一次，进行10周。5周的OVA激发之后，开始干预。对于所述干预，于经鼻内OVA激发2天前、经鼻内OVA激发1小时前以及OVA激发2天后，在对小鼠禁食4小时之后，以管饲法经口喂食水(疾病和媒介物对照)或BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑(以100％的浓度)。
干预组为：1)未经处理的小鼠(基线对照)；2)+OVA(疾病和水媒介物对照)；3)+OVA+含有源自新西兰的70Brix苹果汁浓缩物、源自新西兰的黑加仑汁和源自新西兰的65Brix博伊森莓汁浓缩物的BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑100％(疾病加100％BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑)。博伊森莓汁浓缩物获自Boysenberry NZ(纳尔逊，新西兰)。苹果汁浓缩物由RD2 International(奥克兰，新西兰)供应，由Profruit(黑斯廷斯，新西兰)制造。黑加仑汁浓缩物获自New Zealand Blackcurrant Co-operative Ltd(纳尔逊，新西兰)。
计算BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑口服组合物中博伊森莓的浓度，以向70kg的人类递送每次0.73mg/kg总花青苷，这相当于小鼠的10mg/kg。这一剂量是根据先前的研究而选择的(参见实例1和(52))，这些研究确定10mg/kg博伊森莓花青苷的摄取量会使慢性过敏性气道炎症的小鼠模型中的炎症和组织纤维化减少。100％BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑口服组合物向25g小鼠提供10mg/kg总花青苷。下面的实例5中提供了剂量的详细信息。
因此，在本研究中，测试了是否可以降低博伊森莓花青苷的浓度，而通过用等量的黑加仑汁浓缩物来补充博伊森莓汁浓缩物以使花青苷的总浓度达到10mg/kg。
在经鼻内OVA激发4天后，对小鼠实施安乐死。如在实例1中所述，对以下参数进行测量：1)细胞浸润：嗜酸性粒细胞、单核细胞和抗原呈递细胞(APC)；2)组织学变化：苏木精和伊红(H&E)、阿辛蓝和过碘酸-希夫(AB-PAS)、马森三色染色；3)胶原产生(采用羟脯氨酸测定)。对于羟脯氨酸测定，使用商用比色试剂盒(AbCam ab222941)。
结果
结果显示，用过敏原、OVA进行经鼻内激发的小鼠体内，向肺内的总免疫细胞浸润增加(图33)。BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗显著降低了测试浓度下的细胞浸润(图33)。
浸润细胞由嗜酸性粒细胞(图34)、抗原呈递细胞(图35)和单核细胞(图36)构成。在用OVA激发的小鼠体内，嗜酸性粒细胞的数量增加，但这一增加并未受到BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗的影响(图34)。OVA激发使抗原呈递细胞的数量显著增加，而BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗显著降低了该APC数量(图35)。在用OVA激发的小鼠体内，单核细胞的数目趋向于增加，而BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗降低了该单核细胞数目(图36)。
苏木精和伊红染色显示，卵清蛋白激发导致组织肿胀和免疫细胞浸润，而BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗缓解了这一状况(图37)。AB-PAS染色显示卵清蛋白激发导致粘液产生增多，这一状况不受BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗的影响(图38)。
马森三色染色显示反复的OVA激发导致气道内胶原纤维的弥散性蓝色染色(图39)。BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗减少了肺内这些蓝色胶原纤维的出现(图39)。
羟脯氨酸测定显示用OVA激发并未使总胶原增加(图40)，这与开始的发现相反。在此测定中，与其他组相比，100％BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗使胶原的量显著增加(图40)。下面将对此进行更详细的讨论。
讨论
经鼻内OVA激发导致肺内炎症细胞增多。肺内嗜酸性粒细胞的数量未受BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗的影响，但是BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗显著减少了APC的数量。OVA激发使单核细胞趋向于增多，而用BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗后则趋向于减少。
对肺组织进行分析以定量胶原的变化，结果显示总胶原的量在OVA激发后并未改变，这与开始的测定的结果不一致(参见，例如实例1和(74))。然而，马森三色染色表明OVA激发导致胶原浸润到气道内，而100％BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗逆转了该浸润。
正如上文所述，羟脯氨酸测定结果的差异可能是由于这些测定的差异所致。此外，可能的是，虽然来自OVA激发的总胶原的量没有发生变化，但是胶原的位置发生了改变，而BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗正在解决这一问题。从BerriQiTM博伊森莓与苹果和黑加仑治疗得到的观察结果(包括胶原量增加以及气道内出现的胶原染色减少)也可能是炎症经历消退时发生组织重塑的结果。
实例5：用于口服治疗的剂量计算
实例3和实例4的口服治疗剂量是根据以下信息计算的。
表1：慢性激发小鼠研究的剂量计算
四个治疗组：
Figure BDA0002379793890000551
基于200μL的BerriQiTM浓缩物的剂量对于25g的小鼠相当于对于70kg的人类(以总花青苷计)
Figure BDA0002379793890000552
参见实例1和(74)
*HED＝以mg/kg计的动物剂量x(以kg计的动物重量/以kg计的人类重量)0.33
例如：＝10mg/kg小鼠剂量x(0.025kg小鼠/70kg人类)0.33
＝对于70kg人类的0.73mg/kg总花青苷
表2：起始浓缩物和它们的组合物
Figure BDA0002379793890000561
表3：花青素浓度的计算
Figure BDA0002379793890000562
Figure BDA0002379793890000571
表4：基于花青素浓度的剂量计算
Figure BDA0002379793890000572
表1中如实例3中所用的100％BerriQiTM浓缩物(1)的剂量的详细计算(博伊森莓与苹果)：
计算以确定小鼠剂量
对于25g的小鼠，需要10mg花青素/kg的剂量(实例1和(74))-100％
对于25g的小鼠，10mg花青素/kg的剂量将需要0.25mg的花青素
因此：需要0.172g BerriQiTM浓缩物(1)以递送0.25mg剂量的花青素
＝需要0.129mL BerriQiTM浓缩物(1)以递送0.25mg剂量花青素
＝需要128.667μL BerriQiTM浓缩物(1)以递送0.25mg剂量花青素
比重1.34g/ml
用于小鼠试验的口服组合物的制备
取128.667μL BerriQiTM浓缩物(1)并用H2O使其达200μL
对于25g的小鼠，现在在200μL小鼠剂量(10mg/kg)中有0.25mg的花青素
表1中如实例4中所用的100％BerriQiTM浓缩物(2)的剂量的详细计算(博伊森莓与苹果和黑加仑)：
计算以确定小鼠剂量
对于25g的小鼠，需要10mg花青素/kg的剂量(实例1和(74))-100％
对于25g的小鼠，10mg花青素/kg的剂量将需要0.25mg的花青素
因此：需要0.106g BerriQiTM浓缩物(2)以递送0.25mg剂量的花青素
＝需要0.079mL BerriQiTM浓缩物(2)以递送0.25mg剂量的花青素
＝需要79.054μL BerriQiTM浓缩物(2)以递送0.25mg剂量的花青素
比重1.340g/ml
用于小鼠试验的口服组合物的制备
取79.054μL BerriQiTM浓缩物(2)并用H2O使其达200μL
对于25g的小鼠，现在在200μL小鼠剂量(10mg/kg)中有0.25mg的花青素
BerriQiTM浓缩物(1)(博伊森莓+苹果)的替代剂量计算详情：
小鼠重25g
剂量(总花青苷)10mg/kg(或0.1mg/10g)
因此：剂量＝每只小鼠0.25mg
BerriQiTM(博伊森莓+苹果)总花青苷145mg/100g(或1.45mg/g)
需要的产品重量0.25mg/1.45mg＝0.172g BerriQiTM
由于比重已知，因此能够计算水中产品的重量
比重1.34kg/L(或1.34g/mL)
需要的体积0.172g/1.34g＝0.128.66mL
这相当于每只小鼠129μL加71μL水(200μl减去129μl)
实例6：治疗制剂的组成分析
对BerriQiTM液体制剂进行化学分析以确定花青素和酚类成分。测定的制剂包括：样本1，BerriQiTM与苹果浓缩物1(BB+AP)；样本2，BerriQiTM与苹果加黑加仑浓缩物2(BB+BC+AP)。参见实例5。将称重后的等分样本用10％甲酸aq稀释5倍，用于超高压液相色谱(UHPLC)分析。对于其他酚类物质的液相色谱-质谱(LC-MS)分析，将样本用0.1％甲酸aq稀释10倍。确定样本密度，并取样本进行干物质计算。
花青苷的UHPLC分析：使用Dionex UltiMate 3000系列UHPLC(ThermoFisherScientific，美国加州圣何塞)测定花青素浓度，其中PDA(光电二极管阵列)检测为520nm处。维持在40℃，使用4.6 x 250mm的Synergi 4μhydro-RP 80A柱(Phenomenex，美国加州托伦斯)实现化合物分离。溶剂为(A)5:5:90乙腈:甲酸:水v/v/v和(B)5:95v/v甲酸:乙腈，流速为1mL/min。初始流动相100％A保持了1min，然后在16min内线性倾斜至84％A，随后以5％A冲洗柱子，然后重置为原始条件。进样量为0.5μL。借助UHPLC，使用矢车菊素3-O-葡萄糖苷的纯标准品对检测到的花青苷进行定量，且单个花青苷和总花青苷的结果均表示为矢车菊素3-O-葡萄糖苷等价物。
LC-MS确认：LC-MS使用配备有ESI界面的LTQ线性离子阱质谱仪(ThermoFisherScientific，美国加州圣何塞)，其联接至Ultimate 3000UHPLC和PDA检测器(Dionex，美国加州桑尼维尔)。
花青素确认：维持在70℃，使用2.7μ2.1x 150mm的Poroshell 120SB-C18柱(Agilent，美国加州托伦斯)实现花青素化合物分离。溶剂为(A)5:3:92乙腈:甲酸:水v/v/v和(B)乙腈+0.1％甲酸，流速为200μL/min。初始流动相100％A保持了2min，然后在14min时线性倾斜至88％A，15min时至5％A，保持4min后重置为原始条件。进样量为10μL。使用依赖数据的LC-MS3方法，以正模式获取MS数据。此方法分离并破碎最强的母离子以提供MS2数据(子离子)，然后分离并破碎最强的子离子(MS3数据)。
其他酚类物质：维持在45℃，使用Hypersil GOLD aQ 1.9μC18
Figure BDA0002379793890000591
(ThermoScientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)，150×2.1mm柱实现其他酚类化合物分离。溶剂为(A)水+0.1％甲酸和(B)乙腈+0.1％甲酸，流速为200μl/min。初始流动相95％A/5％B在10min时线性倾斜至85％A，保持3.75min，然后在18min时线性倾斜至75％A，在25min时至67.2％，在28min时至50％A，在29min时至3％A，保持4min后重置为原始条件。进样量为4μL。于200-600nm吸光度下进行Uv-vis检测。使用三种依赖数据的LC-MS3方法，通过ESI电离以正模式和负模式两者获取MS数据，第一种方法使用优化用于检测低分子量酚类化合物的质量范围[m/z 150-900]，第二种方法使用优化用于检测鞣花单宁的质量范围[m/z 150-2000]，第三种方法使用优化用于检测高分子量可溶单宁类物质的质量范围[m/z 150-4000]。还通过APCI电离以正模式和负模式两者获取MS数据。
使用酚酸、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸(3-咖啡酰奎宁酸)、咖啡酸的纯标准品，通过LC-MS对这些化合物进行定量。使用对香豆酸，通过LC-MS对检测到的香豆酸衍生物进行定量，并表示为对香豆酸等价物。使用黄烷-3-醇、异位儿茶素和儿茶素以及原花青素B2的纯标准品，通过LC-MS对这些化合物进行定量。使用异位儿茶素，通过LC-MS对未知物质m/z563和m/z 579进行定量，并表示为异位儿茶素等价物。使用之前已分离的地榆素H6的标准品(LC-MS纯度>98％)，通过LC-MS对可水解的单宁类物质进行定量。通过LC-MS将检测到的其他单宁类物质和未知物质m/z 639定量为地榆素H6等价物。使用鞣花酸的标准品，通过LC-MS对鞣花酸进行定量。使用槲皮素3-O-葡萄糖苷的纯标准品，通过LC-MS对检测到的黄酮醇苷进行定量，并表示为槲皮素3-O-葡萄糖苷等价物。使用非糖基化的黄烷醇、槲皮素和杨梅素、查尔酮、根皮素和根皮素-2-O-葡萄糖苷的纯标准品，通过LC-MS对这些化合物进行定量。使用防腐剂山梨酸的纯标准品，通过LC-MS对此化合物进行定量。
分析的结果如下所示。
表5.BerriQiTM样本的密度和干物质数据
Figure BDA0002379793890000601
表6.BerriQiTM样本1和样本2中检测到的酚类物质的定量汇总(表示为μg/mL和μg/g干重(DW))
Figure BDA0002379793890000611
Figure BDA0002379793890000621
nd＝未检测到
#＝检测为[M+甲酸盐]-加合物
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相应地，本领域的普通技术人员将从本公开内容中很容易地意识到，可以根据本发明的此类相关实施例，利用与本文所述的实施例实施基本相同的功能或实现基本相同的结果的后续修改、替换和/或变体。因此，本发明旨在在其范围内涵盖本文所公开的工艺、制造、物质组成、化合物、方式、方法和/或步骤的此类修改、替换和变体。
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Claims (23)

1.一种营养药物组合物，其包括博伊森莓和苹果浓缩物，或者博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物，用于：
(i)治疗或预防受试者的呼吸道炎症；
(ii)治疗或预防受试者的哮喘；或者
(iii)治疗或预防受试者的慢性阻塞性肺疾病。
2.根据权利要求1所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物包括以下项中的一者或多者：博伊森莓汁浓缩物、博伊森莓粉、苹果汁浓缩物、苹果粉、黑加仑汁浓缩物、黑加仑粉。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物包括剂量单位，所述计量单位包括约5mg至约500mg总花青苷。
4.根据权利要求1至权利要求3中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物配制用于肠内给药或口服给药。
5.根据权利要求1至权利要求3中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物配制为糖浆、滴剂、凝胶、冻胶、片剂或胶囊。
6.根据权利要求1至权利要求5中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物配制成获得约0.1mg/kg至约10mg/kg总花青苷/受试者体重的剂量。
7.根据权利要求1至权利要求5中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物配制成获得每天约10mg至约1000mg总花青苷的剂量。
8.根据权利要求1至权利要求7中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物包含添加的多酚。
9.根据权利要求1至权利要求8中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物配制用于与进一步的呼吸助剂共同给药。
10.根据权利要求1至权利要求9中任一项所述的营养药物组合物，其中所述炎症与慢性呼吸系统病症有关。
11.根据权利要求1至权利要求10中任一项所述的营养药物组合物，其中所述炎症与过敏性气道炎症、反应性气道疾病、气道纤维化或气道重塑有关。
12.一种营养药物组合物，其包括博伊森莓和苹果浓缩物，或者博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物，用于：
(i)治疗或预防受试者呼吸道中的异常胶原沉积；
(ii)治疗或预防受试者呼吸道中的纤维化；或者
(iii)治疗或预防受试者呼吸道中的气道重塑。
13.根据权利要求12所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物包括以下项中的一者或多者：博伊森莓汁浓缩物、博伊森莓粉、苹果汁浓缩物、苹果粉、黑加仑汁浓缩物、黑加仑粉。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物包括剂量单位，所述计量单位包括约5mg至约500mg总花青苷。
15.根据权利要求12至权利要求14中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物配制用于肠内给药或口服给药。
16.根据权利要求12至权利要求14中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物配制为糖浆、滴剂、凝胶、冻胶、片剂或胶囊。
17.根据权利要求12至权利要求16中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物配制成获得约0.1mg/kg至约10mg/kg总花青苷/受试者体重的剂量。
18.根据权利要求12至权利要求16中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物配制成获得每天约10mg至约1000mg总花青苷的剂量。
19.根据权利要求12至权利要求18中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物包括添加的多酚。
20.根据权利要求12至权利要求19中任一项所述的营养药物组合物，其中所述营养药物组合物配制用于与进一步的呼吸助剂共同给药。
21.根据权利要求12至权利要求20中任一项所述的营养药物组合物，其中所述气道重塑与慢性呼吸系统病症有关。
22.根据权利要求12至权利要求20中任一项所述的营养药物组合物，其中所述气道重塑与过敏性气道炎症、哮喘、慢性阻塞性肺疾病或反应性气道疾病有关。
23.使用包含博伊森莓和苹果浓缩物或者博伊森莓、苹果和黑加仑浓缩物的组合物来制备营养药物组合物，所述营养药物组合物用于：
(i)治疗或预防受试者的呼吸道炎症；
(ii)治疗或预防受试者的哮喘；
(iii)治疗或预防受试者的慢性阻塞性肺疾病；
(iv)治疗或预防受试者的过敏性气道炎症；
(v)治疗或预防受试者的反应性气道疾病；
(vi)治疗或预防受试者呼吸道中的异常胶原沉积；
(vii)治疗或预防受试者呼吸道中的纤维化；
(viii)治疗或预防受试者的气道重塑。
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