KR102317591B1 - 보이즌베리 조성물과 그 제조 방법 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 보이즌베리로부터 제조된 조성물을 포함한다. 또한, 본 개시내용은 상기 조성물의 제조 방법 및 상기 조성물의 사용 방법으로서, 특히, 호흡기계 장애, 그 중에서도 염증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 반응성 기도 질환, 기도 섬유증 및 기도 개형을 포함하는 호흡기계 장애를 치료 또는 예방하기 위한 사용 방법을 포함한다.

Description

보이즌베리 조성물과 그 제조 방법 및 그 용도{BOYSENBERRY COMPOSITIONS AND METHODS OF PREPARATION AND USE THEREFOR}

본 발명은 보이즌베리로 제조한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 호흡기의 염증성 질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 반응성 기도 질환, 기도 섬유증 같은 호흡기 장애 및 이러한 질환으로 이어지는 기도 개형과 생리적 질환의 치료 및 예방 방법을 포함하여 상기 조성물을 제조하는 방법과도 관련이 있다.

기도 개형은 기도 벽의 구조적 변화를 초래하는 만성적 염증 상태로 인한 점진적이고 회복 불가능한 기도 기능의 쇠퇴를 말한다(67). 기도의 개형은 기도 벽의 모든 층에 나타날 가능성이 있으며 큰 기도에서 작은 기도까지 호흡기 어디에서나 발생할 수 있다. 개형은 상피조직에 중요한 변화를 야기한다(68). 상피조직 손상은 EGF과 TGF-β를 포함한 전섬유 형성 시토카인을 방출하는데, 이것은 섬유아세포 증식, 근섬유아세포 활성화 그리고 궁극적으로 상피하 섬유증 형성으로 이어진다(69). 기도 평활근 비대 및 과형성은 기도 벽 두께의 증가로 이어진다. 결과적으로, 폐 기능의 감소가 가속화되고 기류 폐쇄가 회복 불가능하게 되거나 부분적으로만 회복 가능하게 된다.

전 세계적으로 1억 5천만 명이 천식에 감염되었으며, 아동의 유병률이 5~15%인 것으로 추정된다(61). COPD의 유병률은 15~20% 사이인 것으로 추정되며, 연간 275만 명이 이로 인해 사망하는 것으로 추정된다(86). 만성 천식의 경우에 누적 조직 개형, 섬유증 그리고 그 결과로 인한 폐 기능의 상실에 관한 증거가 있다(45, 59). 섬유증과 개형은 COPD와도 관련이 있다. 개형은 호흡곤란과 같은 증상의 점진적 증가와 그에 상응하는 기관지 확장제 반응성의 감소로 나타난다(67). 현재 천식 치료는 염증을 관리하고 천식 발작의 증상과 강도를 완화하도록 고안되어 있다(30, 43). COPD 치료는 감염을 제어하고 기류를 개선하도록 고안되어 있기도 하다. 하지만, 어떤 천식 약물이나 COPD 약물도 기도 개형을 예방한다고 알려져 있지 않으며(70~74), 이상 개형을 예방하는 데 사용 가능한 치료법은 현재 없다.

천식 발병과 폐 조직 개형은 폐에서 전섬유 형성, 아르기나아제 양성, 대체 활성화 대식세포(AAM)의 증가와 연관되어 있다(27, 29, 34). 하지만, 블레오마이신 유발성 폐섬유증 모델에서 대식세포군의 일시적 감소는 폐 대식세포가 섬유증 해결에 기여하는 섬유 용해 기능을 발달시킬 수도 있다는 것을 보여준다(14).

기질 금속단백분해효소(MMP)와 같은 조직 개형 매개체는 섬유증 조절에 중요한 역할을 한다(5, 7, 8, 10, 38). 이들 중에서, MMP-9는 폐 염증과 섬유화 질환에서 증가하는 것으로 널리 알려져 있으며 천식 환자들의 증상 개선과 관련이 있다(25, 32, 33). MMP-9는 그 밖의 MMP와 함께 섬유 용해 활동을 하여 부적절한 폐 개형을 완화시킬 수 있는 변성 콜라겐 분해로 이어진다(5, 60). 이처럼, MMP-9는 만성 천식뿐 아니라 그 밖의 폐질환에서 폐 손상을 제한하기 위해 가능한 치료 표적에 해당될 수도 있다.

대규모 전염병학 연구에서는 과일과 채소 섭취의 증가가 천식 증상의 감소와 관련되는 것으로 밝혀졌다(39, 46, 47). 이러한 모집단 연구에서는 사과, 배(13, 51, 62), 당근, 토마토(46~48) 그리고 감귤류(11)처럼 폴리페놀이 풍부한 음식이 천식 증상, 특히 천명과 기침 증상이 보고되는 빈도 및 강도와 역의 상관 관계에 있는 것으로 확인되었다(11, 13, 46, 47). 하지만, 폴리페놀이 풍부한 과일이 폐섬유증과 조직 개형에 미치는 효과는 알려져 있지 않다. 오늘날까지, 기도 개형을 예방하기 위한 전반적으로 성공적인 방법은 밝혀지지 않았다.

천식, COPD, 반응성 기도 질환, 기도 섬유증 그리고 기도 개형을 포함하여 모집단에서 호흡기 장애의 발생률을 고려할 때, 호흡기 건강을 회복시키고 유지하기 위해 특히 자연물에서 유래한 새로운 조성물에 대한 필요성이 있다.

일 양태에서, 본 발명은 호흡기의 염증을 치료 또는 예방하는 방법을 포함하며, 그 방법은, 시험대상자에게 보이즌베리 농축물로 구성된 조성물을 투여함으로써 시험대상자의 호흡기에서 염증을 치료하거나 예방하는 것을 포함한다.

조성물에는 예를 들어 시험대상자의 호흡기에서 염증을 치료하거나 예방하기 위한 보이즌베리 농축물을 포함하는 기능식품 조성물(nutraceutical composition) 또한 포함된다.

또 다른 일 양태에서, 본 발명은 호흡기의 염증을 치료 또는 예방하는 방법을 포함하며, 그 방법은, 시험대상자에게 보이즌베리 농축물을 포함하는 조성물을 투여함으로써 시험대상자의 천식을 치료하거나 예방하는 것을 포함한다.

조성물에는 예를 들어 시험대상자의 천식을 치료하거나 예방하기 위한 보이즌베리 농축물을 포함하는 기능식품 조성물 또한 포함된다.

또 다른 일 양태에서, 본 발명은 만성 폐쇄성 폐질환을 치료 또는 예방하는 방법을 포함하며, 그 방법은, 시험대상자에게 보이즌베리 농축물을 포함하는 조성물을 투여함으로써 시험대상자의 만성 폐쇄성 폐질환을 치료하거나 예방하는 것을 포함한다.

조성물에는 예를 들어 시험대상자의 만성 폐쇄성 폐질환을 치료하거나 예방하기 위한 보이즌베리 농축물을 포함하는 기능식품 조성물 또한 포함된다.

또 다른 일 양태에서, 본 발명은 이상 콜라겐 증착이나 호흡기의 섬유증을 치료 또는 예방하는 방법을 포함하며, 그 방법은, 시험대상자에게 보이즌베리 농축물을 포함하는 조성물을 투여함으로써 시험대상자의 이상 콜라겐 증착이나 호흡기의 섬유증을 치료하거나 예방하는 것을 포함한다.

조성물에는 예를 들어 시험대상자의 이상 콜라겐 증착이나 호흡기의 섬유증을 치료하거나 예방하기 위한 보이즌베리 농축물을 포함하는 기능식품 조성물 또한 포함된다.

또 다른 일 양태에서, 본 발명은 기도 개형을 치료 또는 예방하는 방법을 포함하며, 그 방법은, 시험대상자에게 보이즌베리 농축물을 포함하는 조성물을 투여함으로써 시험대상자의 기도 개형을 치료하거나 예방하는 것을 포함한다.

조성물에는 예를 들어 시험대상자의 기도 개형을 치료하거나 예방하기 위한 보이즌베리 농축물을 포함하는 기능식품 조성물 또한 포함된다.

다양한 양태에서는,

조성물이 보이즌베리 과즙 농축물이나 보이즌베리 분말을 포함한다.

조성물은 총 안토시아닌이 약 5~500mg 포함된 용량 단위를 포함한다.

조성물이 장관 투여용으로 제형된다.

조성물이 경구 투여용으로 제형된다.

조성물이 시럽이나 점적약으로 제형된다.

조성물이 겔이나 젤리로 제형된다.

조성물이 정제나 캡슐로 제형된다.

조성물이 총 안토시아닌/시험대상자 체중 비율로 하여 약 0.1mg/kg~약 10mg/kg 용량으로 투여되도록 제형된다.

조성물이 1일 약 10mg~약 1000mg 용량으로 투여되도록 제형된다.

아니면 총 안토시아닌을 1일 약 10mg~약 200mg 용량으로 투여하거나 1일 총 안토시아닌 약 50mg을 투여한다.

조성물은 폴리페놀이 추가되어 구성된다.

조성물은 추가적인 호흡 보조제와 함께 공동 투여되도록 제형된다.

조성물은 하나 이상의 만성 호흡기 장애 치료법과 함께 공동 투여되도록 제형된다.

염증은 만성 호흡기 장애와 관련이 있다.

염증은 다음 중 하나 이상과 관련이 있는데, 그 예로는, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 반응성 기도 질환, 기도 섬유증 그리고 기도 개형이 있다.

천식은 아토피성이거나 비아토피성이다.

천식은 기도 섬유증이나 기도 개형과 관련이 있다.

만성 폐쇄성 폐질환은 흡연이나 공해와 관련이 있다.

만성 폐쇄성 폐질환은 기도 섬유증이나 기도 개형과 관련이 있다.

이상 콜라겐 증착이나 섬유증은 만성 폐쇄성 폐질환과 관련이 있다.

이상 콜라겐 증착이나 섬유증은 천식이나 만성 폐쇄성 폐질환과 관련이 있다.

기도 개형은 만성 호흡기 장애와 관련이 있다.

기도 개형은 다음 중 하나 이상과 관련이 있는데, 그 예로는, 천식과 만성 폐쇄성 폐질환이 있다.

추가적인 일 양태에서, 본 발명은 기능식품 조성물을 조제하기 위한 보이즌베리 농축물을 포함하는 조성물의 용도를 포함하며, 그 사용 목적은,

(i) 시험대상자의 호흡기 염증 치료나 예방,

(ii) 시험대상자의 천식 치료나 예방,

(iii) 시험대상자의 만성 폐쇄성 폐질환 치료나 예방,

(iv) 시험대상자의 반응성 기도 질환 치료나 예방,

(v) 시험대상자의 이상 콜라겐 증착 치료나 예방,

(vi) 시험대상자의 호흡기 섬유증 치료나 예방,

(vii) 시험대상자의 기도 개형 치료나 예방이다.

다양한 양태에서, 치료에 조성물, 투약 그리고 제제를 활용하며, 위에 언급된 것처럼 다양한 질환과 관련이 있다.

상기의 간단한 요약은 본 발명의 특정 실시예의 특징과 기술적 이점을 포괄적으로 설명한 것이다. 추가적인 기술적 장점은 발명의 상세한 설명 및 예를 통해 아래에서 자세히 기술된다.

본 발명의 특성으로 여겨지는 새로운 기능들은 발명의 상세한 설명에서 함께 제시되는 모든 수치 및 예와 연관지어 고려할 때 더욱 잘 이해될 것이다. 하지만, 이 문서에 제시된 수치와 예들은 발명의 설명을 돕거나 발명에 대한 이해를 증진시키기 위해 제공된 것이며, 발명의 범위를 제한하지 않는다.

도 1. 치료용 경구 보이즌베리 치료는 OVA 유발 만성 폐 염증을 줄인다. A: 생후 6주 수컷 C57Bl/6 마우스(그룹당 n = 10)를 OVA/alum(0일차)로 ip 준비한 다음 10주 동안 7일마다 OVA로 i.n. 면역 유발시켰다. 6주차부터 10주차까지 경구(위관 영양)로 각 i.n. OVA 면역 유발하기 1시간 전과 2일 후에 보이즌베리 과즙을 투여했다. B: 면역 유발을 하지 않은 마우스에서 얻은 폐 조직의 대표 H&E 염색, 10주차 OVA 면역성 시험만 사용(OVA), 10주차 치료용 보이즌베리(OVA BoysB) 치료와 함께 OVA 면역 유발 그리고 보이즌베리로만 치료한 마우스(BoysB). 화살표와 * 는 면역세포 침투를 나타낸다. 배율 X4(위)와 X10(아래). C: 폐 조직의 대표 AB-PAS 염색. 화살표는 포도색의 점액 양성 세기관지를 나타낸다. 배율 X4(위)와 X20(아래). D: ml BALF당 총 세포 및 최종 OVA 면역 유발 후 BALF에서 호산구 비율의 유세포 계측 정량화. **P < 0.01, ***P < 0.001(그룹당 n = 10) 치료용 보이즌베리 치료와 보이즌베리로만 치료한 마우스로 OVA 면역 유발한 그룹과 면역 유발을 하지 않은 그룹을 비교한 터키의 사후검정(Tukey’s post hoc test)으로 일원분산분석(ANOVA).
도 2. 보이즌베리 치료는 OVA 유발 만성 폐 염증이 일어날 때 폐 조직에서 아르기나아제 발현과 대식세포 축적을 증가시킨다. A: 보이즌베리 치료를 한 마우스와 치료하지 않은 마우스로 10주차 OVA 면역 유발 마우스에서 얻은 폐 조직의 대표 H&E 염색. 화살표는 대식세포를 나타낸다. 배율X100, 축척200 μm. B: 폐 조직에서 iNOS(135 kDa)와 아르기나아제(37 kDa) 발현의 대표 웨스턴 블롯 분석. 동일한 웨스턴 블롯에서 비연속 밴드가 나타난다. C와 D: β-액틴 신호로 정규화한 iNOS와 아르기나아제 웨스턴 블롯 신호의 정량화. **P < 0.01(그룹당 n = 10) 터키의 사후검정으로 일원분산분석(ANOVA).
도 3. 보이즌베리 치료는 아르기나아제+ 대체 활성화된 대식세포의 축적을 증가시킨다. 보이즌베리 치료를 하거나 치료하지 않고 10주차부터 OVA 면역 유발된 마우스에서 나온 폐 조직의 대표 면역 형광 표지. A: CD68+CD206+ 대식세포는 *로 식별한다. B: CD206+아르기나아제+ 대식세포는 *로 식별한다. DAPI 핵염색(남색). 배율X40, 축척200 μm.
도 4. 보이즌베리 치료는 콜라겐 증착을 줄이고 OVA 유발 만성 폐 염증이 일어날 때 MMP-9 단백질 발현을 증가시킨다. A: 대표 메이슨 트리크롬 염색. 배율X40, 축척200 μm. B: 하이드록시프롤린 수치(mg/g 폐 조직), ***P < 0.001(n = 10) 터키의 사후검정으로 일원분산분석(ANOVA). C: ELISA로 측정한 폐 TGFβ 농도, *P 0.05 (그룹당 n 10) 터키의 사후검정으로 일원분산분석(ANOVA). D: 보이즌베리 치료를 하거나 하지 않고 10주차부터 OVA 면역 유발된 마우스에서 나온 폐 조직의 MMP-9(전 105 kDa; 활성 92 kDa) 와 TIMP-1(29 kDa) 발현의 웨스턴 블롯 분석(동일한 웨스턴 블롯에서 비연속 밴드가 나타난다). E: β-액틴 부하 제어로 정규화한 TIMP-1/MMP-9 단백질 발현의 비율, **P < 0.01(n = 10) OVA와 보이즌베리 치료를 한 그룹과 면역 유발을 하지 않은 그룹을 비교한 터키의 사후검정으로 일원분산분석(ANOVA).
도 5. 보이즌베리 치료는 OVA 유발 만성 폐 염증이 일어날 때 폐 조직에서 대체 활성화된 대식세포로 MMP-9 발현을 증가시킨다. A: MMP-9+ 대식세포의 DAB 표지(화살표). B: CD206+MMP-9+ 대식세포의 면역 형광 표지(*). DAPI 핵염색(남색). 배율X40, 축척200 μm.
도 6. 폐 대식세포의 감소는 OVA 유발 만성 폐 염증에 미치는 경구 보이즌베리 치료의 효과를 줄였다. A: 생후 6주 수컷 C57Bl/6 마우스(그룹당 n = 10)를 OVA/alum(0일차)로 ip 준비한 다음 5주 동안 7일마다 OVA로 i.n. 면역 유발시켰다. 6주에서 7주까지 보이즌베리 과즙을 경구 투여(위관 영양)하기 전날 클로드로네이트 리포솜(CloLip)을 이용하여 대식세포를 감소시켰다. B: 최종 클로드로네이트 대식세포 감소 후에 BALF에서 대식세포 비율의 유세포 계측 정량화, *P < 0.05(그룹당 n = 10) 터키의 사후검정으로 일원분산분석(ANOVA). C: 폐에서 하이드록시프롤린 수치(mg/g 폐 조직), *P < 0.05(그룹당 n = 10) 터키의 사후검정으로 일원분산분석(ANOVA).
도 7. 예방적 경구 보이즌베리 치료는 OVA 유발 만성 폐 염증과 콜라겐 증착을 줄인다. A: 생후 6주 수컷 C57Bl/6 마우스(그룹당 n = 10)를 OVA/alum로 ip를 준비한 다음 5주 동안 7일마다 OVA로 i.n. 면역 유발시켰다. 경구(위관 영양)로 각 i.n. OVA 면역 유발하기 1시간 전과 2일 후에 보이즌베리 과즙을 투여했다. 최종 OVA 면역 유발 후에 ml BALF당 총 세포와 BALF에서 호산구 비율의 유세포 계측 정량화로 폐 조직을 염색했다. *P < 0.05, **P < 0.01(그룹당 n = 10) 터키의 사후검정으로 일원분산분석(ANOVA). C: AB-PAS, 포도색 점액 양성 세기관지(화살표), 배율X20, 축척200 μm. D: 메이슨 트리크롬(Masson’s trichrome), 배율X40, 축척200 μm. E: 폐에서 하이드록시프롤린 수치(mg/g 폐 조직). *P < 0.05, **P < 0.01(그룹당 n = 10) 터키의 사후검정으로 일원분산분석(ANOVA). F: iNOS, 아르기나아제, MMP-9 그리고 TIMP-1 폐 조직의 웨스턴 블롯 분석. 동일한 웨스턴 블롯에서 비연속 밴드가 나타난다. G: β-액틴 부하 제어로 정규화한 TIMP-1/MMP-9 단백질 수치의 비율. *P < 0.05(그룹당 n = 10) 터키의 사후검정으로 일원분산분석(ANOVA). 도 4: 시험 치료, 약물제거 및 샘플링 지점 도식.

다음 설명에는 수많은 예시적 구성이나 파라미터 등이 제시되어 있다. 그러나 이러한 설명은 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아닌, 예시적인 실시예로서 제공된 것임을 유념해야 한다.

특허 및 특허 출원을 비롯하여 본 설명에서 언급된 모든 참고문헌은 본 문서에 참고문헌으로 통합되어 있다. 참고문헌 중 어떠한 것이든 선행 기술로 간주되지 않는다. 또한 참고문헌에 대한 어떠한 논의도 그러한 참고문헌이 뉴질랜드 또는 기타 국가 내 당업계에서 공통적이고 일반적인 지식의 일부를 구성하는 것으로 간주되지 않는다.

용어의 정의

여기에 제시되는 설명, 실시예 및 본 발명의 예의 각 경우에서 사용되는 "구성", "포함" 등의 용어는 제한 없이 포괄적으로 해석되어야 한다. 따라서 설명 및 청구항 전반에 걸쳐서, "구성한다", "구성하는" 및 이와 유사한 단어들은 해당 문맥에서 달리 명시적으로 요구하지 않는 한, 배타적 의미로 해석되지 않고 포괄적인 의미, 즉, "다음을 포함하나 이에 국한되지 않는다"는 개념으로 해석되어야 한다.

여기에서 사용된 "필수적으로 이루어지는"이란 조성물에 농축물이 존재한다는 의미일 수도 있다. 예를 들어, 농축물은 조성물 중량의 최소 80%나 조성물 중량의 최소 85%, 최소 86%, 최소 87%, 최소 88%, 최소 89%, 최소 90%, 최소 91%, 최소 92%, 최소 93%, 최소 94%, 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 최소 99%, 최소 99.5%, 최소 99.8% 또는 99.9%일 수도 있다(% w/w). 액상의 경우, 농축물은 조성물 용량의 최소 80%나 조성물 용량의 최소 85%, 최소 86%, 최소 87%, 최소 88%, 최소 89%, 최소 90%, 최소 91%, 최소 92%, 최소 93%, 최소 94%, 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 최소 99%, 최소 99.5%, 최소 99.8% 또는 99.9%일 수도 있다(% v/v).

본 설명에서, 관사 “한”과 “하나”는 관사의 문법적 목적 중에서 하나나 하나 이상(즉, 최소 하나)을 의미하는 데 사용된다. 예로써, "성분"은 하나의 성분이나 하나 이상의 성분을 의미하는 것으로 받아들여질 수 있다.

본 설명 전반에 걸쳐서, 용어 "약"은 이 문서에 상세히 설명된 것처럼 값이 혼합물의 수치나 투여량과 같은 값을 결정하는 데 이용되는 방법에 대한 오류의 표준 편차를 포함한다는 것을 나타내는 데 사용된다. 특히, 용어 "약"은 표준 범위에서 10%에서 15%의 편차, 표시 값이나 범위에서 특히 10%의 편차(양수 및 음수)를 포함한다.

조직이나 폐 개형으로도 불리는 "기도 개형"은 기도 벽에서 특정한 구조적 변화의 전개를 말한다. 기도 개형에는 상피 섬유증, 근섬유아세포 축적, 기도 평활근 과형성 및 비대, 점액선 및 배상세포 과형성 그리고 상피 분열 중 하나 이상이 포함될 수도 있다. 증상에는 기도 팽창성 감소(즉, 더 뻣뻣한 기도), 탄력 반동 감소, FEV1(노력 호기량 1) 및 FVC(노력 폐활량)의 점진적 하락, 폐 기능 하락의 가속화, 회복 불가능한 또는 부분적으로만 회복 가능한 기류 폐쇄, 호흡 곤란 그리고 호흡기 치료(예를 들어, 천식이나 COPD 치료)에 대한 반응성 감소가 포함될 수도 있다.

"천식"은 폐 기도의 염증성 장애를 말하며, 기류 폐쇄와 기관지 경련을 포함하여 다양하고 반복적인 호흡 장애를 특징으로 한다. 기도 폐쇄는 FEV1 감소 및/또는 FEV1/VC 비율 감소로 정의될 수도 있다. 천식에서 기도 폐쇄는 약물을 사용하거나 사용하지 않고 회복될 수 있다. 천식의 증상에는 천명, 기침, 흉부 압박감이나 통증 그리고 숨가쁨 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 여기에는 아토피성(예를 들어, 알레르기 유발이나 항원 유발)과 비아토피성 천식뿐 아니라 운동 유발 천식, 직업성 천식, 아스피린 유발 천식 그리고 알코올 유발 천식이 포함된다.

"호흡 보조제"는 기도 기능이나 호흡계의 다른 양태를 돕는 조성물로, 그 예로는 약물, 허브 조성물, 정유 그리고 흡입용의 다양한 조성물이 있다. 기도, "호흡기" 그리고 "호흡계"는 가스 교환(즉, 호흡)에 관여하는 기관, 조직 또는 세포 성분 중 어느 하나를 말한다. 여기에는 상기도, 기관, 기관지, 세기관지, 폐포, 폐, 흉막 및 흉막강 그리고 호흡 신경 및 근육이 포함된다.

이 문서에 사용된 것처럼 “보이즌베리”는 Rubus 교배종 베리를 포함하는데, 이 베리에는 Rubus ursinus var loganobaccus cv Boysenberry, Rubus ursinus x Rubus idaeus, Rubus loganbaccus x baileyanus Britt 그리고 Rubus idaeus x Rubus ulmifolius로 확인된 식물에서 얻은 베리가 포함되나 이에 국한되지 않는다. 일반적으로 말해서, 보이즌베리는 라즈베리와 블랙베리 사이의 교잡이나 라즈베리, 블랙베리 그리고 로건베리 식물 사이의 교잡에서 얻을 수 있다. 다양한 보이즌베리 교배종, 품종 그리고 유전적 파생물이 이에 포함된다.

"만성 폐쇄성 폐질환"이나 COPD는 기도의 점진적 폐쇄와 열악한 기류와 연관된 폐 장애를 말한다. 기류 폐쇄는 FEV1의 감소 및/또는 FEV1/VC 비율의 감소로 정의될 수 있다. 만성 폐쇄성 폐질환에서 기류 폐쇄는 완전히 회복되지 않을 수 있다. 증상에는 숨가쁨 기침 그리고 가래 생산(즉, 담)이 포함되나 이에 국한되지 않는다. COPD는 흡연, 공기 오염, 요리나 난방 화염의 부실한 통풍과 관련성이 있을 수 있다. 유전 요소 또한 COPD에 관여될 수 있다. 이 장애는 그 외에 알려진 용어 중에서 만성 폐쇄성 폐질환(COLD), 만성 기도 폐쇄증(COAD), 만성 기관지염, 폐기종으로도 알려져 있다.

예를 들어, 보이즌베리 농축물과 관련하여 "농축물"은 액체 성분(예를 들어, 과즙)이 부분적으로나 대부분 제거된 조성물을 말한다. 농축물은 예를 들어 퓌레, 페이스트 또는 분말로 된 보이즌베리에서 조제되거나 예를 들어 과즙 농축물로서 보이즌베리 과즙에서 조제될 수 있다.

호흡기의 "장애"에는 이 문서에 언급된 것처럼 가스 교환(즉, 호흡)에 관여하는 기관, 조직 또는 세포 성분에 영향을 주는 질병이나 그 밖의 질환이 포함된다. 장애는 염증 및 염증과 관련된 질환처럼 급성이나 만성 질환일 수 있다. 특히 관심이 가는 장애에는 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 반응성 기도 질환, 기도 섬유증 그리고 기도 개형이 포함된다. 그 밖의 장애는 이 문서에 상세히 설명된다.

보이즌베리 식물의 "유전적 파생물"은 보이즌베리 부모계에서 얻은 자손, 변이종 또는 그 밖의 재배품종을 말한다. 여기에는 보이즌베리 부모와 유전 교잡으로 얻은 자손, 예를 들어 F1 자손이나 F2 자손이 포함된다. "유전적 파생물"이라는 용어는 파생된 식물, 그 자체 또는 그 과일을 말할 수 있다.

"섬유증"은 기도 섬유증이나 폐섬유증에서 처럼 호흡기에서 콜라겐 및 기타 세포외 기질 성분의 조절 혼란을 말한다. 섬유증 환자의 기도에서는 망상 기저막 부위, 고유판 및/또는 점막하 조직에서처럼 세포외 기질 증착이 증가할 수도 있다. 흉터 형성 및 과도한 섬유성 결합 조직의 축적은 기도 벽의 비후화로 이어진다. 증상에는 산소 공급 감소, 숨가쁨, 만성 기침, 피로 및/또는 쇠약, 가슴 통증을 포함한 가슴 불편감, 식욕 상실 그리고 체중 감소가 포함될 수 있다. 여기에는 특발성 형태의 기도 섬유증뿐 아니라 흡연, 공기 오염, 결합조직병(예를 들어, 류머티스성 관절염, 유육종증 등), 감염, 약물(예를 들어, 메토트렉사트, 블레오마이신 등) 그리고 방사선 치료와 관련된 기도 섬유증이 포함된다.

"염증"은 다음 중 하나 이상을 특징으로 하는 질환을 말하는데, 그 예로는, 혈관 확장, 열, 발적, 불편감, 부기, 부종, 병변, 열창, 궤양, 백혈구 혈관외 유출 그리고 기능 상실이 있다. 여기에는 급성 및 만성 형태의 염증이 모두 포함되며, 만성 염증의 경우 염증성 장애, 예를 들어 자가면역질환이나 알레르기성 질환이 포함된다. 특히 천식, 만성 폐쇠성 폐질환, 기도 섬유증, 반응성 기도 질환 그리고 기도 개형이 포함된다. 그 밖의 염증성 장애는 본 문서의 다른 곳에 설명되어 있다.

여기에서 언급된 바와 같이, “냉동 건조(lyophilising)”와 “동결 건조(freeze drying)”는 동의어로 사용된다. "동결 건조"(freeze drying/lyophilising)라는 용어는 더 높은 온도(즉, 동결 온도보다 높은 온도)의 사용을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 동결 건조(lyophilisation/freeze drying) 절차의 이차 건조 단계 중 잔여 수분을 제거하기 위해 더 높은 온도가 사용될 수 있다.

"기능식품"은 시험대상자에게 투여하기 위한 표준화된 조성물을 말한다. 이것은 제약 등급의 조성물일 수도 있고, 시험대상자의 건강을 유지하거나 개선시킬 수도 있으며 또는 시험대상자에게 있는 하나 이상의 장애를 치료하거나 예방할 수도 있다.

"반응성 기도 질환"은 외부 자극으로 인한 회복 가능한 기도 협착을 특징으로 하는 염증성 기도 장애를 말한다. 용어에는 천식, 만성 폐쇠성 폐질환, 상기도 감염 등과 같은 그 밖의 알려진 장애가 포함될 수 있으며, 아니면 이러한 장애와 유사하지만 이와 같이 직접적으로 진단받지 않은 질환, 예를 들어 천식과 같은 증후군이나 천식과 같은 증상을 말할 수 있다. 반응성 기도 질환 환자는 연기, 증기, 연무 또는 그 밖의 자극물과 같은 특정한 자극에 노출되어 기침, 천명 또는 숨가쁨 중에서 증상을 하나 이상 보일 수 있다.

여기에서 사용된 것처럼, "시험대상자"는 인간이거나 일반 동물, 특히 포유류일 수 있는데, 개, 고양이 그리고 그 밖의 길들여진 애완동물을 포함하여 소, 양, 염소, 말 그리고 그 밖의 가축이 포함된다. 특정 양태에서는 시험대상자가 인간이다.

여기에서 사용되는 "치료"는 장애, 예를 들어 호흡계의 질병이나 그 밖의 질환과 같은 호흡기 장애의 감소, 개선 또는 해결을 의미한다. 치료는 장애의 증상 중 하나 이상의 감소, 개선 또는 제거를 가져온다.

여기에서 사용되는 "예방"은 장애, 예를 들어 호흡계의 질병이나 그 밖의 질환과 같은 호흡기의 발병을 멈추거나 지연시킨다는 의미이다. 예방 조치는 장애의 증상 중에서 하나 이상을 멈추게 하거나 지연시키며 증상이 발생할 때 증상을 줄인다. "치료나 예방"이라는 용어는 주어진 시험대상자에서 장애의 치료와 예방 모두를 얻을 가능성(예를 들어, 동시에 또는 서로 다른 때에)을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 동일한 방식으로 "천식이나 섬유증"의 치료는 양쪽 장애를 치료할 가능성(예를 들어, 동시에 또는 동시가 아닌 때에)을 배제하지 않는다.

보이즌베리 및 관련 대생물 작용

발명가는 보이즌베리 조성물 섭취로 만성 천식 모델에서 알레르기 유발 폐 개형이 줄어든다는 것을 발견했다. 이러한 실험을 위해, 만성 알레르기성 기도 염증 모델에서 폐섬유증, 폐 대식세포 표현형 그리고 MMP-9 발현에 미치는 보이즌베리 섭취의 효과를 시험했다. 결과에서는 경구 보이즌베리 치료가 섬유증을 개선시키고 균형 잡힌 폐 회복을 촉진시키는 능력을 가진 혼합 항섬유증, AAM(대체 활성화 대식세포) 표현형을 발현하는 폐 대식세포 발달에 도움이 된다는 것이 입증되었다(74, 본 문서 전체에서 참고로 통합).

보이즌베리는 비타민C와 섬유소가 풍부하며 보이즌베리의 깊고 어두운 색깔로 인해 높은 수치의 안토시아닌(120-160 mg/100 g)을 함유하고 있다고 알려져 있다. 보이즌베리에 대한 ORAC(산소 라디칼 흡수 용량,즉 항산화 수치)는 산화방지 식품으로 잘 알려진 블루베리의 거의 두 배인 42 μmoles/TE/g이다. 보이즌베리는 페놀 화합물인 엘라그산을 상당량 함유하고 있다. 보이즌베리의 엘라그산 수치는 건조 중량으로 5.98 mg/g이다. 보이즌베리는 또한 총 엘라기타닌 대비 유리 엘라그산 비율이 높다.

발명가의 결과에서는 보이즌베리가 호흡기 염증의 치료나 예방, 천식의 치료나 예방, 만성 폐쇄성 폐질환의 치료나 예방, 호흡기 섬유증의 치료나 예방 또는 기도 개형의 치료나 예방을 위한 조성물에 사용될 수 있다는 것이 분명히 나타난다. 그뿐 아니라, 여기에 나와 있는 결과에서는 보이즌베리 조성물을 다음 중 하나 이상의 활동에서 호흡계의 건강을 회복, 개선 또는 유지하는 데 사용할 수 있는 것으로 이해되는데, 그 활동의 예로는, 콜라겐 증착 감소, 이상 콜라겐 증착 방해, 기도로 세포 침윤 감소, 세포 침윤에 의한 기도 손상 감소, 폐 유체에서 세포(예를 들어, 염증세포) 감소, 점액 생성 감소, 점액 양성 세포 감소, 하이드록시프롤린 수치 감소, 기질 메탈로펩티다아제 발현 수치(예를 들어, 단백질 수치) 증가, MMP-9 발현 수치(예를 들어, 단백질 수치) 증가, TGFβ 발현 수치(예를 들어, 단백질 수치) 증가, TIMP-1/MMP-9 비율 수치(예를 들어, 단백질 비율 수치) 감소, 염증세포의 활성이나 수 감소, 대체 활성화 대식세포의 수나 활성 증가, 아르기나아제+ 대식세포의 수나 활성 증가, CD68+/CD206+/아르기나아제+ 대식세포의 수나 활성 증가 또는 iNOS 발현 수치(예를 들어, 단백질 수치) 감소가 있다. 이러한 조성물의 추가 용도는 본 문서에서 자세히 설명된다.

보이즌베리 조성물 조제 방법

본 발명은 일반적으로 보이즌베리를 이용하여 조제한 조성물과 관련된다. 특정한 일 양테에서, 조성물은 Rubus ursinus var loganobaccus cv Boysenberry를 기반으로 조제된다. 또 다른 양태에서, 보이즌베리 식물의 유전적 파생물이 하나 이상 사용될 수도 있다. 예를 들어, 보이즌베리 식물의 부모계를 포함하는 유전 교잡에서 나온 F1이나 F2 자손을 이용하는 것이 바람직할 수도 있다. 아니면, 부모로부터 확보한 변이종 또는 기타 재배품종 중 어느 것이든 이용할 수 있다. 뉴질랜드에서 나온 보이즌베리나 그렇지 않으면 특히 칠레에서 나온 보이즌베리를 얻는 것이 바람직할 수 있다.

조성물은 가급적이면 보이즌베리 농축물, 예를 들어 보이즌베리 퓌레, 보이즌베리 페이스트, 보이즌베리 분말 또는 보이즌베리 과즙 농축물로 조제된다. 그에 따라, 조성물은 액상이나 분말 형태, 예를 들어 동결 건조 분말 또는 그 외 어떤 적합한 투여 형태로든 조제가 가능할 수 있다. 조성물은 강장제, 추출물, 엘릭시르, 지제, 농축물, 시럽, 용액, 현탁액, 유탁액, 물약, 퓌레, 페이스트 또는 점적약 형태로 제형될 수 있다. 다른 양태에서, 조성물이 겔이나 젤리 또는 액체나 반액체 내용물이 들어 있는 캡슐로 제형될 수 있다. 조성물은 포 형태, 예를 들어 분말 포, 겔이나 젤리 포 형태로 제공될 수 있다. 여기에는 얇은 스트립을 포함하는 제형이나 음식물 또는 음료와 섞을 수 있는 고형물을 캡슐에 담는 제형도 포함된다. 여기에 설명되는 바와 같이, 그 외 제형법도 가능하다.

어떤 양태에서, 보이즌베리(예를 들어, 보이즌베리 과즙 농축물이나 퓌레)를 분말로 제형하는 것이 바람직할 수도 있다. 여기에 언급된 것처럼 상용 보이즌베리 분말이 알려져 있으며 구매 가능하다. 분말은 정제(신속 용해 정제 포함)나 캡슐(서방형 캡슐 포함)로 제형할 수도 있다. 정제로는 할선 정제, 츄어블 정제, 발포성 정제, 경구 붕해 정제 또는 현탁액 제형용 정제를 사용할 수 있다. 캡슐은 겔 캡슐을 사용할 수 있으며, 예를 들어 분말로 된 내용물이 포함될 수도 있다. 여기에는 싱글 피스(single piece) 겔 캡슐화 및 투 피스(two piece) 겔 캡슐화를 통해 제조된 겔 캡슐들이 포함된다. 비젤라틴 캡슐과 당의정도 포함된다. 분말은 자유 유동 형태 또는 고체 덩어리 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 현탁액 제형용 분말, 용액 제형용 분말, 벌크 경구 과립제 또는 벌크 경구 분말로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물은 한 가지 이상의 상용 출처를 통해 얻는 보이즌베리 과즙 농축물을 기반으로 조제할 수 있다. 예를 들어, 뉴질랜드 보이즌베리 제품의 상용 출처에는 Boysenberries New Zealand Ltd, Nelson 그리고 Tasman Bay Berries, Nelson이 포함된다. 상용으로 구매 가능한 제품에는 개별 급속 냉동 베리, 보이즌베리 퓌레, 블록 냉동 베리, 보이즌베리 과즙 농축물 그리고 보이즌베리 분말이 포함된다.

농축물이나 퓌레의 pH는 3.2~3.8 또는 3.0~4.0 아니면 3.1~3.9 범위에 속하거나 아니면 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9 또는 약 4.0일 수도 있다. 보이즌베리 과즙 농축물의 경우에 산도(% w/w 무수 구연산)는 약 1~약 20, 약 1.5~약 15, 약 2~약 12, 약 5~약 10, 약 6~약 9, 약 10, 약 9, 약 8.5, 약 8.3, 약 8.2, 약8.17, 약 8.1, 약 8, 약 7, 약 6 또는 약 5일 수 있다. 일부의 경우에, 퓌레 또는 최종 조성물의 pH를 근사 생리학적 수준으로 조정하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 6.0~8.0, 6.5~7.5 또는 6.8~7.2의 범위에 속하거나, 약 6.5, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4 또는 약 7.5으로 pH를 확보하는 것이 유용할 수 있다.

특정 양태들에서, 본 발명의 조성물이 뉴질랜드 특허 번호 235972(여기에 참조자료로 포함됨)에서 언급된 “저강도 과육 제거(soft pulping)” 기법을 이용하여 조제될 수 있다. 이는 "부드러운" 보이즌베리 퓌레를 제조하고자 할 때 적절히 변경하여 활용할 수 있다. 씨를 제거하고 퓌레를 준비하는 것이 유용할 수도 있다. 퓌레를 약 1mm 이하의 체로 걸러 준비하는 것 또한 바람직하다.

보이즌베리 과즙 농축물을 보이즌베리 껍질, 과육 그리고 씨에서 추출하거나 가압한 다음 걸러낸 천연 당액으로 준비할 수도 있다. 당액을 특정한 브릭스 수치로 진공 상태에서 탈팩틴화, 여과 및 탈수시킨다. 예를 들어, 과즙 농축물을 원래 브릭스 값의 약 2배에 약 7배까지 농축할 수도 있다. 특히, 농축물을 원래 브릭스 값의 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배 또는 약 7배까지 농축할 수도 있다. 그에 따라, 보이즌베리 과즙 농축물은 최종 당도가 55~75° 브릭스, 59°~69° 브릭스. 61°~66° 브릭스, 약 60° 브릭스, 약 61°, 약 62°, 약 63°, 약 64°, 약 65°, 약 65.4°, 약 65.5°, 약 65.6°, 약 66°, 약 67°, 약 68° 또는 약 69° 브릭스이다.

특정 양태에서, 보이즌베리 과즙 농축물은 건강하고 잘 익은 단계의 보이즌베리에서 제조될 수 있다(예를 들어, Rubus ursinus var loganobaccus cv Boysenberry). 분쇄, 으깸 그리고 가압하여 원심분리, 저온 살균, 탈팩틴화한 다음 표준화 과정에서 환원된 향으로 증발 건조하여 농축시킨 천연과즙으로 만들어 농축물을 생산할 수 있다. 표준화된 농축물을 추가적인 열 처리 없이 위생적인 충전재 헤드를 통해 요구되는 포장 용기에 포장할 수 있다. 농축물은 순수과즙의 정의, 예를 들어 호주뉴질랜드 식품기준청(FSANZ-Food Standards Australia New Zealand)에 따른 정의를 준수하는지 점검받을 수 있다.

보이즌베리 과즙 농축물은 천연색이 풍부할 것으로 예상된다. 예를 들어, 보이즌베리 과즙 농축물은 색 비율(흡광도 520nm/흡광도 430nm)이 약 1.5~3.0, 약 1.8~약 2.8 약 1.9~약 2.2 또는 약 1.9, 약 2, 약 2.01, 약 2.05, 약 2.1 또는 약 2.2일 수 있다. 뿐만 아니라, 과즙 농축물은 색 강도(색도계 활용)가 약 15~약 30, 약 20~약 28, 약 21~약 25, 약 22~약 24 또는 약 22, 약 23, 약 23.2, 약 23.5, 약 23.7, 약 24 또는 약 25일 수 있다. 과즙 농축물은 또한 투명도가 약 0.01~약 0.1, 약 0.02~약 0.08, 약 0.03~약 0.06, 약 0.04~약 0.05 또는 약 0.03, 약 0.04, 약 0.045, 약 0.047, 약 0.048, 약 0.05 또는 약 0.06으로 외관상 상대적으로 맑을 것으로 예상된다. 당업계에 색 비율, 투명도 등과 같은 다양한 측정 방법이 알려져 있으며, International Fruit Juice Federation Handbook of Analysis, 1996, International Fruchtsaft-Union, Zug, Switzerland의 AIJN 시행 규약에서 찾을 수 있다.

초기 조제 단계에서는 보이즌베리 과일에 전처리 공정을 해야할 수도 있는데, 여기에는 잘 알려져 있는 보이즌베리의 숙성, 검사, 평가 및/또는 분류 단계가 포함될 수 있다. 숙성에 관하여 가급적 잘 익은 또는 성숙한 보이즌베리를 이용하는 것이 본 발명의 조성물을 조제하기에 적합하다. 하지만, 썩거나 부패한 재료는 피하는 것이 좋다.

성숙도는 당업계에서 널리 알려져 있고 흔히 사용되고 있는 방법을 이용하여 평가할 수 있다. 성숙도는 보이즌베리를 고르거나 가공하기 전에 측정할 수 있다. 특히 성숙도는 이 문서에 언급된 것처럼 브릭스 시스템을 이용하여 측정할 수도 있다. 지나치게 숙성 또는 발효되어 있는 보이즌베리 과일은 적합한 조성물을 제공하지 못할 수 있다. 적합한 브릭스 수치에 미달되는 보이즌베리는 사용 전에 인공적으로 숙성시킬 수 있다.

이러한 가공 과정에서, 보이즌베리를 멸균할 수도 있다. 이 경우 한 개 이상의 롤러 브러쉬가 장착된 어셈블리에 과일을 통과시켜 과일에 붙어 있는 모든 이물질들을 제거할 수 있다. 그 후에는 기존의 세척 기법을 사용할 수 있다. 예를 들어 여러 개의 분사 노즐을 이용해 보이즌베리를 세척하는 것이 가능하다. 현지 규정 및 요건에 따라 보이즌베리에 기생하는 박테리아를 세척하거나 감소시키는 데 유용한 세척용 첨가제를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 염소 세제 및/또는 오존 함침수 세제로 과일을 씻은 뒤 새 물로 헹굴 수 있다.

그 후에 멸균된 보이즌베리를 호퍼로 전달할 수 있다. 호퍼는 보이즌베리를 한 개씩 가압 어셈블리로 곧장 전달할 수 있는 통로가 형성되는 첨형으로 설계할 수 있다. 가압 어셈블리는 과육 제거 또는 분쇄 공정을 수행할 수 있도록 조정할 수 있다. 이러한 공정은 기존의 과일 과육 제거 기법에 비해 비교적 순하고 약한 강도(“저강도 과육 제거”)로 수행할 수 있다. 저강도 과육 제거 방법을 이용하면 과일 세포 또는 성분이 크게 분해 또는 용해되지 않는다. 가급적이면 이 공정에서 씨앗의 극히 일부(대체로 5-10% 미만)만 분리된다.

한 실시예에서는 가압 어셈블리가 트윈 수렴형 벨트 프레스 사이에서 보이즌베리에 압력을 가하는 방식으로 보이즌베리의 저강도 과육 제거를 수행한다. 프레스 벨트로는 여러 개의 도르래를 회전하는 다수의 루프를 사용할 수 있다. 프레스 벨트 간 간격은 보이즌베리가 이동되는 방향에 가까워질수록 좁아지게 할 수도 있다. 이런 방식으로 보이즌베리가 가압 어셈블리에서 이동되는 동안 키위에 더 높은 힘이 가해질 수 있다. 이렇게 하여 씨앗에 큰 손상을 주지 않고도 보이즌베리의 과육을 제거할 수 있다. 결과적으로 씨앗에 의한 과육 오염이 방지될 수 있는 것이다.

가압 어셈블리에서 생성된 과육은 스크리닝 공정으로 전달되며, 여기에서 씨앗과 과육이 분리된다. 특히 저강도 기계적 스크리닝 기법을 통해 씨앗에서 과육을 분리할 수 있다. 예를 들어, 과육 피니셔를 사용할 수 있다. 여기에는 회전식 플렉시블 임펠러가 포함되며, 이 임펠러는 사전에 지정된 크기의 개구부를 갖춘 원뿔 모양의 스크린 내에서 회전된다. 특정 양태들에서는 보이즌베리의 과육과 과즙이 스크린을 통과할 수 있으면서도, 스크린에 의해 규정된 내부 구멍 내에서 씨앗의 상당 부분(전부는 아니더라도)을 유지시킬 수 있는 크기의 개구부가 선택된다.

특정 양태들에서는 보이즌베리 기반의 퓌레보다 페이스트를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 보이즌베리 페이스트를 농축물로 만들 수도 있다. 예를 들어, 과일을 수시간 동안 가열하고 압착하여 두터운 농축 형태로 축소시킬 수 있다. 과일은 과피를 제거한 후에 가열하거나 과육 제거 또는 으깨기 공정 후에 가열할 수 있다. 과일은 점진적으로 가열할 수 있으며, 그 후 적정한 온도에서 가열 상태를 유지하며 혼합할 수 있다. 과일이 걸쭉해지면 평평한 시트 위에 펼치거나 가방, 튜브, 통, 병 또는 그 외 용기로 옮겨 포장할 수 있다. 페이스트는 사람이 섭취하기 적합할 수 있도록 무균 처리하여 이동될 수 있다. 성숙한 보이즌베리를 기반으로 한 페이스트를 준비하는 것이 바람직할 수 있다. 과육 제거한 과일에서 페이스를 조제할 수 있다. 페이스트는 매끈한 제형일 수 있다.

과육(예를 들어, 페이스트나 퓌레 형태에서)이나 과즙 농축물을 냉동 단계로 가공 할 수 있다. 이 단계는 건조 단계 전에 오거나 건조 단계와 통합하여 사용될 수 있다. 다른 실시예에서는 중간 냉동 단계 없이 과육을 건조하고 분말로 가공한다. 예를 들어, 드럼 건조 단계가 포함된 방법을 사용할 수도 있다, 드럼 건조 공정에서는 여러 시트의 드럼 건조 결과물을 생성하는 회전식 고용량 드럼 위에서 퓌레 또는 페이스트를 상대적으로 저온에서 건조할 수 있다. 특정 양태들에서는 첨가제를 사용하여 건조 공정을 가속화하거나 그 외의 방법으로 보조할 수도 있다. 예를 들어, 예를 들어 완두 전분 또는 기타 건조 조제를 활용할 수 있다. 그 후에 건조물을 마감 처리된 플레이크 또는 분말 형태로 제분할 수 있다. 드럼 건조 기법은 페놀 화합물과 같은 주요 성분들을 보존하고 액체를 이용하여 손쉽게 조제할 수 있는 건조된 조성물을 생산하는 데 유리하게 이용할 수 있다. 예를 들어, 드럼 건조 생산물은 차가운 물에 녹을 수 있도록 조제할 수 있다. 또 다른 대안으로는 벨트 건조 또는 대류 건조를 사용할 수 있다. 이러한 건조 방법은 당업계에서 널리 알려져 있으며 흔히 사용되고 있다.

동결 작업을 수행하는 경우에는 과육을 제조한 후 최대한 빨리 동결시키는 것이 신선도 유지에 바람직하다. 하지만, 필요에 따라 24시간 또는 48시간 이내에 동결 작업을 할 수도 있다. 동결 방법은 익히 알려져 있기 때문에 아래에서 아주 자세히 설명할 필요는 없다. 본 발명의 활용 시에는 특히 송풍 동결이 유리하다. 과육이나 과즙 농축물은 표준 크기의 페일(pale)에서 동결시킬 수 있으며, 이는 가공 후 신선한 과육/농축물을 수집하는 데 사용된다. 과육이나 과즙 농축물을 필요한 시점까지 동결 상태로 보관(예를 들어 -18°C)할 수 있다.

동결된 과육이나 과즙 농축물은 동결 건조될 수 있다. 동결 건조 기법은 널리 알려져 있고 흔히 사용되고 있다. 동결 건조 주기는 약 48시간이거나, 40~56시간, 12~36시간, 36~60시간 또는 약 40시간, 약 42시간, 약 44시간, 약 46시간, 약 48시간, 약 50시간, 약 52시간 또는 약 54시간일 수 있다. 최대 활성도를 유지하기 위해 더 긴 동결 건조 주기, 예를 들어 최소 48시간 이상(“저강도 동결 건조”)을 사용할 수도 있다. 특정 양태들에서는 가공 중 수분 형성을 방지하여 수분 함량을 최소화하도록 이 공정을 수행할 수 있다.

특별한 동결 건조 공정을 사용하여 건조물을 확보하는 것이 바람직할 수도 있다. 예를 들어, 자동화 시스템의 일부로서 동결 건조 프로그램을 사용할 수 있다. 이 동결 건조 공정에는 여러 건조 단계,예를 들어 단계별 온도 증감이 포함될 수 있다. 가급적이면 승화의 목적으로 일차 건조 설정을 사용하고, 그 뒤에 한 가지 이상의 이차 건조 설정을 하여 잔여 수분을 제거하는 데 사용하는 것이 좋다. 특정 양태들에서는 동결 건조 공정의 최고 온도가 70°C를 초과하지 않는다. 다른 양태들에서는 동결 건조 공정의 온도가 -10°C에서 70°C 사이이다. 다른 일 양태에서는 최대 48시간의 동결 건조 방식이 사용된다.

그 후 건조된 결과물을 분말로 제분하고, 이 분말을 적절하게 활용할 수 있다. 제분 방법은 당업계에서 익히 알려져 있고 널리 사용되고 있다. 분말 제조 시에는 표준 메쉬 크기를 사용할 수 있는데, 예를 들어 US 20, US 23, US 30, US 35, US 40, US 45 또는 US 50의 메쉬 크기가 사용될 수 있다. 분말용 체 크기는 1.0~0.3 mm, 0.84~0.4 mm 또는 0.71~0.5 mm의 범위에 속하거나, 약 1.0 mm, 약 0.84 mm, 약 0.71 mm, 약 0.59 mm, 약 0.5 mm, 약 0.47 mm, 약 0.465 mm, 약 0.437 mm, 약 0.4 mm, 약 0.355 mm 또는 약 0.3 mm일 수 있다.

보이즌베리 성분이 최소한도로 분해되도록 하려면, 40°C 미만의 온도에서 조제 공정을 수행할 수 있다. 다양한 실시예들에서는 공정이 -4°C~40°C, -1°C~10°C 또는 1°C~6°C의 범위에서 수행되거나, 약 0°C, 약 1°C, 약 2°C, 약 3°C, 약 4°C, 약 5°C 또는 약 6°C에서 수행된다. 이러한 온도는 과일을 통째로 보관하는 과정, 과일을 파쇄하기 전 과정, 그리고 과육 제거/으깨기 공정 중의 과정들을 포함하는 전체 조제 공정 동안 유지될 수 있다. 최적의 결과를 위해서는 과일을 파쇄하는 시점부터 최소한 이 온도를 유지한다. 이러한 온도는 과일의 산화와 환원제 사용을 방지해준다. 특정 상황에서는 유기농 인증을 획득하는 것이 가능할 수도 있다.

가공 방법은 가급적이면 보이즌베리의 활성 물질에 대한 손상 또는 영향을 방지하거나 최소화할 수 있도록 수행한다. 생산 방법을 최적으로 유지하기 위해, 결과 조성물을 안토시아닌 수치, 폴리페놀 수치 및/또는 항산화 작용과 같은 작용에 대해 모니터링할 수 있다.

폴리페놀 분석법은 당업계에 익히 알려져 있으며 아래에도 설명되어 있다. 특히, 총 폴리페놀 함량을 알아내기 위해 갈륨산 등가물(GAE)을 측정할 수 있다. 예를 들어, 페놀 화합물의 시험관 내 비색분석 시험에 Folin-Ciocalteu 방법(Folin 페놀 시약 또는 Folin-Denis 시약으로도 알려진 Folin-Ciocalteu 시약을 사용)을 사용할 수 있다(75). 보이즌베리 과즙 농축물의 총 폴리페놀 함량은 상대적으로 높을 것으로 예상되는데, 예를들어, 약 500~약 5000 mg GAE/100 g FW, 약 1000~약 3000 mg GAE/100 g FW, 약 1500~약 2500 mg GAE/100 g FW, 약 3000, 약 2500, 약 2000, 약 1500 또는 약 1000 mg GAE/100 g FW이다. FW가 과즙 농축물의 생중량을 나타낸다고 한다.

안토시아닌은 HPLC로 정량화될 수 있다. 이 방법은 개별 화합물을 분해하는 데 사용될 수 있으며 시아니딘-3-글루코사이드 등가물로 발현될 수 있다(76). 예를 들어, HPLC 용출 성분은 안토시아닌의 경우 530nm에서 모니터링 할 수 있다. 시아니딘-3-글루코사이드 표준(예를 들어, Extrasynthese에서)을 사용하여 표준 곡선을 준비할 수 있고 총 안토시아닌은 이 기준으로 계산할 수 있다. 기타 페놀류 또한 250~700m에서 HPLC로 분석할 수 있다. 갈산, 엘라그산, 케르세틴, 루틴 그리고 캐친을 포함한여 다양한 표준물질이 실행될 수 있다. 표준물질의 흡광도 스펙트럼과 체류 시간을 HLPC 기록에서 미지 시료와 비교할 수 있다. 이러한 분석에는 엘라그산에 대한 측정값이 포함될 수 있다. 보이즌베리 과즙 농축물의 총 안토시아닌 함량(시아니딘-3-글루코사이드 등가물로 발현)은 약 1000~약 10,000 mg/100 g FW, 약 2000~약 8000 mg/100 g FW, 약 4000~약 7000 mg/100 g FW, 약 5500~약 6500 mg/100 g FW 또는 약 8000, 약 7000, 약 6500, 약 6800, 약 6000, 약 5000, 약 4000 또는 약 3000 mg/100 g FW이며, 이에 국한되지 않는다.

항산화 작용은 ORAC 및/또는 DPPH 분석법으로 측정할 수 있다. 산소 라디칼 흡수 용량(oxygen radical absorbance capacity) 분석법은 식품의 항산화 가능성을 시험하는 데 가장 널리 활용되는 분석법 중 하나이다. ORAC 분석법은 퍼옥실 라디칼 유발 산화의 산화방지 억제력을 측정한다(77, 78, 84). 비타민E의 수용성 유사물인트롤록스가 제어 기준으로 사용될 수 있다. 추가 분석에서, DPPH(2,2-디페닐-1-피크릴히드라질)는 라디칼 소거제로서 폴리페놀의 운동 작용을 보여주는 데 사용될 수 있다. 항산화 작용이 높을수록, DPPH·농도가 더 크게 감소한다. 항산화제를 넣어 식히면 DPPH 라디칼의 메탄올 용액이 보라색에서 무색으로 변한다. DPPH·의 감소는 트롤록스 및 DPPH·와 같은 표준 곡선과 비교하여 515nm에서 측정된다(79, 80).

특정 예시로서, 보이즌베리 과즙 농축물의 항산화 작용은 약 10,000~약 100,000 ORAC 값(μmol Trolox/100 g FW), 약 20,000~약 80,000 ORAC 값, 약 30,000~약 70,000 ORAC 값, 약 40,000~약 50,000 ORAC 값 또는 약 80,000, 약 70,000, 약 60,000, 약 50,000, 약 40,000, 약 30,000 또는 약 20,000 ORAC 값이다. 추가 예시로서, 보이즌베리 과즙 농축물의 항산화 작용은 DPPH 분석법(100% MeOH에서)으로 측정하여 약1000~약 6000 μmol TEAC/100 g FW, 약 2000~약 5000 μmol TEAC/100 g FW, 약 2500~약 2900 μmol TEAC/100 g FW 또는 약 5000, 약 4000, 약 3000, 약 2800, 약 2500, 약 2000 또는 약 1000 μmol TEAC/100 g FW이다.

대안적으로 또는 추가적으로, 구성물을 다른 성분, 예를 들어 당, 엽산 그리고 비타민C에 대해 시험할 수 있다. 해당하는 분석법은 널리 알려져 있다. 예를 들어, 보이즌베리 과즙 농축물의 엽산 수치는 표준 방법(예시 83 참조)을 사용하여 측정할 수 있으며, 약 20 μg/100 g FW, 약 30 μg/100 g FW, 약 40 μg/100 g FW, 약 50 μg/100 g FW, 약 60 μg/100 g FW, 약 70 μg/100 g FW, 약 80 μg/100 g FW, 약 10~약 100 μg/100 g FW, 약 20~약 80 μg/100 g FW, 약 30~약 70 μg/100 g FW, 약 20~약 50 μg/100 g FW 또는 약 50~약 70 μg/100 g FW이다.

그 밖에 알려진 분석법 또한 공개된 조성물(예시 85 참조)을 분석하는 데 사용할 수 있으며 본 발명은 페놀수지, 안토시아닌, 항산화제, 비타민, 탄수화물 등을 포함한 생체 활성 화합물에 대한 하나의 특정 분석법에 제한받지 않는 것으로 이해될 것이다. 또한 과즙 농축물에 대해 여기에서 확인된 수치는 분말 형태뿐 아니라 퓌레와 페이스트 형태에 대해서 쉽게 추론할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일부 상황에서는 본 발명의 조성물을 얻기 위해 보이즌베리의 유전적 파생물을 사용하는 것이 가능할 수도 있다. 이러한 파생물로부터 얻은 조성물은 고유한 보이즌베리계에서 얻은 조성물의 특성 중 한 가지 이상을 동일하게 보유할 것으로 예상된다. 예시적 특징으로는 상기에서 언급되고 여기에서 자세히 공개한 바와 같이, 안토시아니딘 수치 및 프로필을 포함하여 폴리페놀 수치 및 폴리페놀 프로필, 비타민 수치 그리고 OVA 유발 염증이 있다. 과일 자체에 관해서는 유전적 파생물에서 얻은 보이즌베리가 보이즌베리 부모와 유사한 조성적 구성을 동일하게 보유할 것으로 예상된다.

보이즌베리를 포함한 조성물

발명가들이 발견한 바에 따르면 보이즌베리 조성물은 호흡계의 건강 유지뿐 아니라 호흡 문제의 치료와 예방에 도움이 되는 유익한 성분들을 포함하고 있다. 발명가들은 보이즌베리 농축물이 기도 염증과 섬유증을 줄이는 데 특히 효과적이라는 것을 보여주었다. 이처럼, 본 문서에서 공개된 보이즌베리 조성물은 전체적 호흡 건강의 유지나 개선 및/또는 염증, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 기도 섬유증 그리고 기도 개형을 포함한 호흡기의 다양한 장애나 그밖의 질환을 치료나 예방하는 데 사용할 수 있다. 이런 방식으로, 공개된 조성물은 항염증 조성물이며 항천식 조성물일뿐만 아니라, 만성 폐쇄성 폐질환, 반응성 기도 질환, 기도 섬유증, 그리고 기도 개형에 효력이 있는 조성물인 것으로 이해될 수 있다

본 문서에 설명된 것처럼, 보이즌베리 조성물은 보이즌베리에서 조제한 과즙 농축물이나 분말 농축물을 포함할 수 있다. 다양한 대안으로서 조성물이 보이즌베리에서 조제한 과즙 농축물이나 분말 농축물을 포함할 수도 있거나 반드시 포함한다. 보이즌베리 조성물은 액상, 예를 들어 과즙 농축물, 시럽, 현탁액 또는 경구 투여용 강장제나 장관 투여용 용액으로 제형될 수 있다. 아니면, 보이즌베리 조성물은 캡슐이나 정제에 담은 분말로 제형되거나 다른 제품에 첨가하거나 포함될 수 있다. 특히, 지연성 방출 제형법, 서방성 제형법을 비롯해 신속 분해용 제형법이 포함된다. 겔 캡슐과 같은 캡슐과 더불어 포와 츄어블 정제가 특별히 포함된다. 또한 한 가지 이상의 호흡 보조제와 같은 그 밖의 유익한 제제들과 본 발명의 분말을 혼합하여 포함시키는 복합제 제형법도 포함된다. 다양한 양태에서, 보이즌베리 조성물은 기능식품 조성물, 제약 조성물, 기능식품이나 음료, 천연 성분(예를 들어, 천연 첨가제) 또는 천연 보충제(예를 들어, 식이 보충제)로 조제될 수 있다.

보이즌베리 조성물이 고함량의 안토시아닌을 포함하도록 조제될 것으로 예상된다. 예를 들어, 조성물은 총 안토시아닌을 약 10~약 50,000 mg/ml, 약 20~약 40,000 mg/ml, 약 25~약 35,000 mg/ml, 약 30~약 30,000 mg/ml, 약 40~약 25,000 mg/ml, 약 50~약 20,000 mg/ml, 약 60~약 15,000 mg/ml, 약 70~약 10,000 mg/ml, 약 80~약 8000 mg/ml, 약 90~약 6000 mg/ml, 약 100~약 5000 mg/ml, 약 10~약 1000 mg/ml, 약 20~약 800 mg/ml, 약 30~약 600 mg/ml, 약 50~약 200 mg/ml 또는 약 50,000, 약 40,000, 약 35,000, 약 25,000, 약 20,000, 약 15,000, 약 12,000, 약 10,000, 약 8000, 약 7500, 약 5000, 약 2500, 약 2000, 약 1000, 약 1500, 약 1200, 약 1000, 약 750, 약 500, 약 250 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 75 mg/ml, 약 50 mg/ml, 약 25 mg/ml, 약 20 mg/ml 또는 약 10 mg/ml 포함할 수 있다.

특정 양태에서, 보이즌베리 조성물은 총 안토시아닌의 투여량을 약 1 mg~약 20,000 mg 총 안토시아닌, 약 1 mg~약 2000 mg 총 안토시아닌, 약 5 mg~약 5000 mg, 약 10 mg~약 3000　mg, 약 10~약 1000, 약 15 mg~약 1500 mg, 약 20 mg~약 1000 mg, 약 25 mg~약 850　mg, 약 30 mg~약 600 mg, 약 35 mg~약 550 mg,약 50~약 500 mg, 약 5~ 약 500, 약 10 mg~약 200 mg, 약 1~약 400 mg, 약 1~약 200 mg, 약 40 mg~약 400 mg, 약 40~약 200 mg, 약 20 mg~약 80 mg, 약 30 mg~약 60 mg, 약 45 mg~약 55 mg 또는 약 20,000　mg, 약 15,000 mg, 약 12,000 mg, 약 10,000 mg, 약 7500 mg, 약 5000 mg, 약 4000 mg, 약 3000 mg, 약 2000 mg, 약 1500　mg, 약 1200 mg, 약 1000 mg, 약 500 mg, 약 400 mg, 약 300 mg, 약 200 mg, 약 100 mg, 약 90 mg, 약 95 mg, 약 80 mg, 약 75 mg, 약 70 mg, 약 65 mg, 약 60 mg, 약 55 mg, 약 50 mg, 약 45 mg, 약 40　mg, 약 35 mg, 약 30 mg, 약 25 mg, 약 20 mg 또는약 10 mg로 하여 투여한다. 특정 양태들에서는 총 안토시아닌 투여량이 약 50 mg~약 500 mg일 수 있다. 상기에 언급된 것처럼 투여량은 1일 1회, 1일 2회 또는 1일 3회 아니면 필요에 따라 더 자주 투여할 수 있다. 전형적이고, 비제한적인 일 투여량은 총 안토시아닌이 약 10 mg~약 1000 mg일 것이다. 투여량은 소아, 노인, 과체중, 저체중 또는 그 밖의 환자나 필요에 따라 조정될 수 있다.

보이즌베리 과즙 농축액을 표준 상용 제조법(대규모나 소규모)으로 제조하거나, 상용 출처에서 획득한 경우에, 과즙 농축액은 투여량을 약 0.5~약 50 ml, 약 0.5~약 20 ml, 약 0.5~약 10 ml, 약 1~약 9 ml, 약 2~약 8 ml, 약 3~약 7 ml, 약 4~약 6 ml 또는 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1 또는 약 0.5 ml으로 하여 투여할 수 있다. 특정 양태들에서는 보이즌베리 과즙 농축액 약 5ml을 투여량으로 할 수 있다. 1일 1회, 1일 2회 또는 1일 3회 아니면 필요에 따라서 다양한 투여량으로 투여할 수 있다. 알려진 방법에 따라 환자의 크기에 연령에 맞게 투여량을 변경할 수 있다.

특정 상황에서는 보이즌베리에서 폴리페놀을 분리하거나 강화하는 것이 바람직할 수도 있다. 특히, 폴리페놀 강화 조성물, 페놀 농축물 또는 분리 안토시아닌과 같은 분리 페놀류로 구성된 조성물을 얻고자 할 때 보이즌베리를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 폴리페놀을 강화시켜 그 농도를 보이즌베리의 다른 성분, 예를 들어 당에 비례하여 증가시킬 수 있다. 특정 양태들에서는 보이즌베리의 다른 성분으로부터 분리된(예를 들어, 정제된 형태) 폴리페놀이 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 폴리페놀의 강화와 추출 방법은 당업계에서 널리 알려져 있다(예를 들어, 81, 82). 결과 조성물에는 폴리페놀의 양이 폴리페놀 강화 또는 분리 단계가 없이 조제된 조성물에 비해 최소 2배, 최소 3배, 최소 4배, 최소 5배 또는 최소 10배 더 많이 포함될 수있다. 폴리페놀 강화 조성물, 페놀 농축물, 그리고 분리된 페놀류를 포함하는 조성물은 분말로 건조되어 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

투여 형태에는 첨가제, 예를 들어 한 가지 이상의 유착방지제, 결합제, 코팅, 분해제, 향미제, 색소, 감미료, 윤활제, 활택제, 유동제, 고결방지제, 흡수제 또는 보존제가 포함될 수 있다. 유용한 첨가제로는 스테아린, 스테아린산 마그네슘, 스테아르산, 당류 및 그 유도체(예를 들어, 이당류: 수크로스, 락토스), 다당류 및 그 유도체(예를 들어 전분, 셀룰로스, 또는 변형 셀룰로스(마이크로크리스탈린 셀룰로스, 그리고 하이드록시프로필 셀룰로스와 같은 셀룰로스 에테르), 당알코올(이소말트, 자일리톨, 소르비톨 및 말리톨 등), 단백질(젤라틴 등), 합성 중합체(폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜), 지방산, 왁스, 셸락, 플라스틱 및 식물 섬유소(옥수수 단백질 제인), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 교차결합 중합체(예를 들어, 교차결합 폴리비닐피롤리돈(크로스포비돈) 및 교차결합 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스(크로스카르멜로스 나트륨)); 전분 글리콘산 나트륨; 이산화규소, 흄드 실리카(fumed silica), 활석 및 탄산마그네슘이 포함되며, 이에 국한되지 않는다.

본 문서에서 공개된 보이즌베리 조성물은 다양한 성분, 예를 들어 탄수화물, 폴리페놀 그리고 특히 안토시아닌 성분을 포함할 것으로 예상된다. 관심이 가는 특정 안토시아니딘에는 시아니딘과 시아니딘-3-O-소포로사이드, 사아니딘-3-O-글루코사이드, 에피카테킨, 시아니딘-3-O-글루코실루티노사이드, 시아니딘-3-O-루티노사이드, 시아니딘-3-(6’-p-쿠마릴)글리코사이드-5-글리코사이드, 시아니딘-3-O-글리코사이드, 시아니딘-3,5-디글리코사이드 그리고 사이니딘-3-O-2G-글루코실루티노사이드과 같은 루티노사이드가 포함된다. 본 발명의 보이즌베리 조성물은 또한 다양한 탄수화물 및 특히 중성당을 포함한 다양한 당류를 포함할 수 있다. 중성 당과 관련해서는 본 발명의 조성물에 포함된 하나 이상의 당류로는, 과당과 포도당이 있다.

보이즌베리 조성물 사용 방법

위에 언급된 것처럼, 본 문서에서 공개된 보이즌베리 조성물은 전체적 호흡 건강의 유지나 개선 및/또는 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 반응성 기도 질환, 기도 섬유증 그리고 기도 개형과 같이 염증 및 염증과 관련된 호흡기 장애를 포함한 호흡기의 다양한 질환을 치료나 예방하는 데 사용할 수 있다. 호흡기에서 염증과 관련된 그 밖의 질환으로는, 알레르기나 알레르기성 장애, 기종, 기관지염, 호흡세기관지염, 간질성 폐 질환, 염증성 기도 질환, 섬유성 폐포염, 내재성 폐포염, 폐호산구 증가증, 폐 혈관염, 폐렴(pneumonia), 간질성 폐렴, 박리성 간잘성 폐렴, 림프구 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴, 호산구성 폐렴, 폐렴(pneumonitis), 흉막염(pleuritus), 흉막 삼출증, 낭성 섬유증, 원발성 섬모운동 이상증, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 유육종증, 피부근염, 톡소카라증, 베게너 육아종증, 랑게르한스 세포 조직 구균증, 쇼그렌 증후군, 카르타게너 증후군, 성대 기능장애, 발작성 후두기관염, 루푸스와 같은 자가 면역 질환, 반사성 혈관 운동 질환 그리고 자율신경계 이상이 포함된다. 호흡기에서 염증과 관련된 추가 요인으로는 흡연, 공기오염, 알레르기 유발 항원, 감염(예를 들어, 바이러스성, 박테리아성), 특정 약물(예를 들어, 화학 요법 작용제), 방사선 치료, 의료 기기(예를 들어, 산소 호흡기) 그리고 수술이 포함된다.

호흡기 염증, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 기도 섬유증, 기도 개형 또는 그밖에 여기에 설명된 질환을 치료하거나 예방하는 데 본 발명의 보이즌베리 조성물을 사용할 용도를 확인한다. 예시적 투여량으로서, 조성물은 환자 체중 대비 총 안토시아닌의 투여량을 약 0.1~약 200　mg/kg, 약 0.2~약 180 mg/kg, 약 0.25~약 150 mg/kg, 약 0.5~약 125　mg/kg, 약 0.6~약 100 mg/kg, 약 0.7~약 90 mg/kg, 약 0.1~약 50 mg/kg, 약 0.1~약 20 kg/mg, 약 0.1~약 10 mg/kg, 약 0.1~약 5 mg/kg, 약 0.1~약 1　mg/kg, 약 1~약 20 mg/kg, 약 1~약 10 mg/kg, 약1~약 5 mg/kg 또는 약 200 mg/kg, 약 100 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.7　mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.2　mg/kg 또는 약 0.1 mg/kg이 되도록 투여할 수 있다. 특정 양태들에서, 투여량은 약 0.1 mg/kg~약 10 mg/kg이 될 수 있다. 위에 표시된 투여량은 1일 1회, 1일 2회 또는 1일 3회 아니면 필요에 따라 더 자주 투여할 수 있다. 음식과 함께 또는 식사 전에 투여할 수 있다. 적절한 투여량과 투여 형태는 당업자가 사전에 결정한다.

보이즌베리 조성물은 장관 투여 및 경구 투여를 포함하여 다양한 투여 경로를 활용할 수 있다. 경구 투여는 정제, 캡슐, 포, 점적, 엘릭시르, 지제, 액제, 유탁제, 현탁액, 물약, 퓌레, 페이스트, 시럽, 겔, 젤리, 강장제 또는 그밖에 알려진 제형으로 이루어질 수 있다. 비위관을 포함하여 십이지장관 또는 위관으로 장관 투여가 이루어질 수 있다. 당업계에는 다양한 투여 방식이 알려져 있고 숙련자가 이를 활용할 수 있다. 본 문서에 공개된 조성물은 특정 투여 제형에 국한되지 않는다.

본 발명의 조성물에 하나 이상의 페놀 화합물을 추가하여, 조성물 내부에 페놀 활성을 더 보충하는 것이 유용할 수 있다. 예시적 화합물에 포함되는 것으로는, 페놀산과 같은 페놀 유도체와 리그닌, 프로안토시아니딘, 안토시아닌, 안토시아니딘, 이소플라본, 카테킨, 타닌, 케르세틴, 나린게닌 그리고 헤스페리딘과 같은 플라보노이드가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 관심이 가는 특정 안토시아닌 화합물은 본 문서에 설명되어 있다. 다음 원료 중 하나 이상에서 추출한 페놀 화합물이 특별히 포함되어 있는데, 이런 원료로는, 차, 코코아, 와인, 대두, 페이조아, 감귤류 과일, 사과, 포도, 베리 그리고 키위가 있다. 특정 페놀류가 포함되지만 이에 국한되지 않는데, 이런 페놀류로는, 엘라그산, 클로로겐산, 카테킨, 에피카테킨, 켐페롤, E-카피오일-3-글루코사이드, E-카페오일-4-글루코사이드, 에피카테킨, 네오클로로제닉산, 플로리진, 프로시아니딘 B1 및 B2, 케르세틴 람노시드 그리고 케르세틴 루티노시드가 있다.

추가적인 양태에서 본 발명의 조성물은 하나 이상의 호흡 보조제와 병용 투여될 수 있다. 호흡 보조제에는 약물, 처방 약이나 비처방 약 또는 한방 치료나 정유(예를 들어, 증기 및/또는 흡입용)와 같은 대체 치료가 포함될 수 있다. 기타 호흡기 치료 중에 및/또는 후에 본 발명의 보이즌베리 조성물을 호흡기 치료에 사용하는 데 특히 관심이 간다. 예를 들어, 보이즌베리 조성물은 하나 이상의 약물이나 대체 치료와 결합된 투여 형태로 제형될 수 있다. 아니면, 보이즌베리 조성물을 하나 이상의 약물이나 대체 치료와 더불어 별도의 투여 형태로 투여할 수도 있다. 호흡 보조제는 하나 이상의 생리학적 효과가 있는데, 예를 들어 항염증, 항경련, 기관지 확장 및/또는 근육 이완 효과가 있다. 어떤 호흡 보조제는 작용이 길거나 짧을 수 있으며, 작용이 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 등과 같은 특정한 장애에 미칠 수 있다.

예시적 약물에는 알부테롤(예를 들어, Vospire ER), 레발부테롤(예를 들어, Xopenex), 이프라트로피움(예를 들어, Atrovent), 알부테롤/이프라트로피움(예를 들어, Combivent)과 같은 단기 작용 기관지 확장제, 플로티카손(예를 들어, Flovent, Flovent Diskus, Flovent HFA), 부테소니드(예를 들어, Pulmicort, Pulmicort Flexhaler), 모메타손(예를 들어, Asmanex), 베클로메타손(예를 들어, QVAR), 플루니솔라이드(예를 들어, Aerospan), 프레드니솔론, 메틸프레디느솔론 그리고 하이드로코르티손과 같은 코르티코스테로이드, 테오필린(예를 들어, Theochron, Theo-24, Elixophyllin)과 같은 메탈잔틴계, 아클리디늄(예를 들어, Tudorza), 아르포르모테롤(예를 들어, Brovana), 포르모테롤(예를 들어, Foradil, Perforomist), 글리코피롤레이트(예를 들어, Seebri Neohaler), 인다카테롤(예를 들어, Arcapta), 올로다테롤(예를 들어, Striverdi Respimat), 살메테롤(예를 들어, Serevent), 티오트로피움(예를 들어, Spiriva) 그리고 유메클리디늄(예를 들어, Incruse Ellipta)과 같은 장기 작용 기관지 확장제, 글리코피롤레이트/포르모테롤(예를 들어, Bevespi Aerosphere), 글리코피롤레이트/인타카테롤(예를 들어, Utibron Neohaler), 티오티로피움/올로다테롤(예를 들어, Stiolto Respimat), 유메클리디늄/빌란테롤(예를 들어, Anoro Ellipta)과 같은 두 가지 이상 장기 작용 기관지 확장제의 조합을 포함한 기관지 확장제가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.

추가적인 예시적 약물에는 부데소니드/포르모테롤(예를 들어, Symbicort), 플루티카손/살메테롤(예를 들어, Advair, Advair Diskus) 및 플루티카손/빌란테롤(예를 들어, Breo Ellipta)과 같은 흡입성 코르티코스테로이드와 장기 작용 기관지 확장제의 조합, 로플루밀라스트(예를 들어, Daliresp)과 같은 포스포디에스터라제-4-억제제, 알부테롤(예를 들어, ProAir HFA, Ventolin HFA) 및 레바부테롤(예를 들어, Xopenex HFA)과 같은 단기 작용 베타 작용제를 포함한 베타 작용제, 브롬화 이프라트로피움(예를 들어, Atrovent HFA)과 같은 콜린 억제제, 포르모테롤(Perforomist) 및 살메테롤(예를 들어, Serevent Diskus)과 같은 장기 작용 베타 길항제(LABAs), 몬테루카스트(Singulair), 자피를루카스트(Accolate) 및 질레우톤(예를 들어, Zyflo, Zyflo CR)과 같은 류코드리엔 조정제, 메폴리주맙(Nucala), 오말리주맙(예를 들어, Xolair), 레슬리주맙(예를 들어, Cinqair)과 같은 면역조절제, 에피네프린(예를 들어, Primatene Mist, Bronkaid, Asthmahaler), 에페드린 및 페오플린-에페드린(예를 들어, Primatene tablets)와 같은 기관지 확장제가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.

[실시예]

본 문서에 설명된 예시는 본 발명의 특정 실시예를 설명하고자 하는 목적으로 제공되며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한할 의도로 제공된 것이 아니다.

[실시예 1] 개요

폐섬유증은 만성 천식에서 폐 기능에 부정적 영향을 주며 전섬유 형성 대식세포 표현형의 발달과 연관성이 있다. 역학 연구에서는 폴리페놀이 많이 함유된 과일 섭취를 늘리면 폐 기능에 도움이 되는 것으로 확인되었다. 하지만, 이전의 연구에서는 보이즌베리 조성물에 대한 조사나 이 조상물이 기도계에서 섬유증이나 개형에 미치는 영향 조사를 하지 않았다.

발명가들은 항원 유발 만성 기도 염증이 있는 마우스 모델에서 보이즌베리 섭취가 치료 및 예방 전략에 미치는 영향을 조사했다. 보이즌베리 섭취는 폐 조직에서 CD68+CD206+ 아르기나아제 대체 활성화 대식세포 존재의 증가와 함께 콜라겐 증착을 줄이고 조직 개형을 개선시킨다. 조직 개형의 감소는 전체 폐 조직에서 전섬유 용해 기질 금속단백분해효소-9 단백질의 발현 증가와 관련되어 있었다.

발명가들은 기질 금속단백분해효소-9의 공급원으로서 보이즌베리를 섭취한 마우스에서 대체 활성화 대식세포를 확인했다. 발명가들은 경구 보이즌베리 치료가 전섬유 용해 기질 금속단백분해효소-9을 발현하는 대체 활성화 대식세포의 발달에 도움을 주어 만성 조직 개형을 완화시킨다는 가설을 제기한다. 따라서 규칙적으로 보이즌베리를 섭취하면 천식의 만성 폐 개형과 섬유증 및 그 밖의 만성 폐질환을 완화시킬 수 있다.

[실시예 2] 재료

항 액틴(클론AC-15), 난백 알부민(OVA), 4% 포르말린, Tween 20, 트랜스-하이드록시프롤린, 3,3’-다이아미노벤지딘(DAB) 기질, 케타민/자일라진 그리고 그 밖의 화학물질은 Sigma(Auckland, NZ)에서 입수했다. 명반은 Serya(Heidelberg, Germany)에서 입수했다. 보이즌베리 과즙은 현재 Boysenberries New Zealand Ltd(Nelson, New Zealand)로 영업하는 Berryfruit Export NZ에서 제공한 뉴질랜드 65브릭스 보이즌베리 과즙 농축물로 입수했다. Berryfruit Export NZ에서 얻은 65브릭스 보이즌베리 과즙 농축물을 멸균수에 희석하여 총 안토시아닌 100 mg/ml을 얻었다. 이것을 추가로 희석시켜 총 안토시아닌 10 mg/kg의 투여량을 얻었다. 이런 추가 희석은 보이즌베리 용액이라고 말하지 않는다.

항마우스 다클론성 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)(ab3523), 아르기나아제, TIMP-1(ab38978) 그리고 MMP-9(ab38898)는 Abcam(Cambridge, UK)에서 입수했다. 마우스 CD68(클론 FA-11) CD3e, CD8a, CD4, CD11b, CD11c 그리고 Gr-1에 대한 항체는 BioLegend(San Diego, CA)에서 입수했으며 항-CD206(클론MR5D3)은 AbDSerotec(Oxford, UK)에서 입수했다. 항마우스 SiglecF, MHCII 그리고 CD45는 BD Biosciences(San Jose, CA)에서 입수했다.

TGFβ ELISA 키트는 R&D Systems(Minneapolis, MN)에서 입수했다. Vectastain Elite ABC 염색 키트는 Vector Laboratories(Burlingame, CA)에서 입수했다. IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 그리고 IFNγ용 Bio-Plex 멀티플렉스 시토카인 분석표, DC Lowry 단백질 분석 키트 그리고 PVDF 막은 Bio-Rad(Hercules, CA)에서 입수했다. BSA, NuPage 4-12% 겔, MES 러닝 버퍼(running buffer), 견본 로딩 버퍼(loading buffer), 날카롭게 사전에 염색된 Novex와 MagicMark XP 단백질 표준물 그리고 그 밖의 모든 버퍼는 Life Technologies(Auckland, NZ)에서 입수했다.

[실시예 3] 동물

C57BL/6J 수컷 마우스는 Malaghan Institute of Medical Research, Wellington, New Zealand에 있는 특정 병원균이 없는 동물 시설의 필터 지붕이 있는 기존의 폴리카보네이트 사육장에서 번식하고 집단 사육(사육장당 5마리)되었다. 모든 실험 절차는 웰링턴 빅토리아대학교 동물윤리위원회(Victoria University of Wellington Animal Ethics Committee)의 승인을 받았다(승인번호 2011R3M).

표준 실험실에서 빛을 조사시켜 설치류가 자유롭게 먹이(특수사료, Glen Forrest, WA, Australia)와 산성화된 물을 먹게 하여 주위온도 21 ± 2°C에서 12시간 낮-밤 주기로 마우스를 유지시켰다.

[실시예 4] OVA 유발 기도 염증과 경구 보이즌베리 치료

생후 6주 마우스를 실험 그룹(그룹당 n = 10)에 무작위로 배정했고 0일차에 백반 보조제 100 μg OVA in 200 μl를 복강내(ip) 투여하여 준비했다. +7일차에 100 μg OVA나 PBS로 마우스를 비강내(i.n.) 면역 유발시켰다.

i.n. 면역 유발을 매주 반복하여 만성 질병을 안착시켰다(도 1A 및 6A). 마지막 i.n. OVA 면역 시험 후 4일이 경과하고 마우스는 안락사 시켰으며(케타민/자일라진 과다 투여) 기관지-폐포 세척 유체(BALF), 혈청, 종격 림프절 그리고 폐 조직을 채집했다.

치료 연구를 위해 마우스를 하루밤 동안 절식시킨 다음 경구 위관 영양으로 보이즌베리 용액(위 참조) 250 μl을 공급했다. OVA 면역 시험 일과 OVA 면역 시험 2일 후에 다시 총 안토시아닌 10 mg/kg 투여 또는 멸균수 공급(도 1A 및 6A).

[실시예 5] 폐 대식세포의 클로드로네이트 리포솜 감소 및 조직 분석

클로드로네이트 리포솜은 이전에 설명된대로 준비되었다(58). 만성 OVA 유발 조직 손상을 5주 이상 안착시켰다. 그런 후에 마우스에게 경구 위관 영양으로 보이즌베리 용액 250 μl(위 참조: 총 안토시아닌 10 mg/kg 투여)이나 멸균수를 공급하기에 앞서 전날에 클로드로네이트 리포솜 100 μl 을 비강내로 공급하여 처치했다(도 6A). 마지막 경구 위관 영영 2일 후에 마우스를 안락사 시켰고(케타민/자일라진 과다 투여) BALF, 혈청, 종격 림프절 그리고 폐 조직을 채집했다.

BALF에서 분리한 세포는 중요 표면 표지 염색을 하여 이전에 설명한 것처럼 유세포 분석기로 단핵구계/대식세포(CD45+/CD11b+/Cd11c+/MHCIIlow)와 호산성 백혈구(CD45+/CD11b+/siglecF+)를 확인했다(52). 제조사의 지시에 따라 폐 조직 상청액에 대해 TGFβ ELISA와 Bio-Plex 멀티플랙스 시토카인 분석법을 실시했다. 폐 조직은 4% 포르말린으로 고정되어, 박편으로 만들어졌으며 그리고 헤마톡실린 및 에오신(H&E), 메이슨 트리크롬 또는 과요오드산-쉬프(AB-PAS) 염색(Dept. of Pathology, Wellington School of Medicine, University of Otago, Wellington, NZ)으로 염색되었다.

면역학적 표지를 위해 박편을 추가로 절개했다. 비오틴 결합 MMP-9으로 폐 박편을 배양한 다음, DAB로 표지하고 헤마톡실린체로 대조 염색을 했다. 기타 조직 박편을 형광 표지된 CD68(31), CD206(57) 그리고 아르기나아제나 MMP-9(44)로 배양한 다음, DAPI-함유 봉입제로 대조 표지했다.

모든 박편을 Olympus BX51 복합 현미경에서 영상을 확인하고 색깔이 밝은 빛이고 흑백이 형광으로 나오는 cellSens(Olympus NZ) 소프트웨어를 사용하여 캡쳐했다. 형광 이미지는 Pixelmator 이미지 소프트웨어(Vilnius, Lithuania)에서 처리(잘라내기, 펄스 컬러 및 병합)되었다. 4명의 독립, 맹검 관찰자가 형광 표지된 세포를 정량화했다. 복수의 동물로부터 나온 무작위 필드에서 세포를 계산하며 CD68, CD206, 아르기나아제 또는 MMP-9에 대해 음성, 단일 양성 또는 이중 양성으로 기록했다. 데이터는 계산된 총 세포의 비율로 표현되었다.

[실시예 6] 생화학적 및 분자생물학적 조직 분석과 통계 분석

생화학적 및 분자생물학적 조직 분석. 폐 조직을 순간 냉동하고 -70°C에서 저장했다. 폐 콜라겐은 이전에 설명된 것처럼 하이드록시프롤린 분석법으로 정량화했다(2). 웨스턴 블롯을 하기 위해서 조직을 단백질 용해 버퍼(Tris·HCl, NaCl, 10% Nonidet P-40, 10% 소디움데옥시콜레이트, 100 nM ETDA, pH 7.4 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 포함)에서 균질화했다. 단백질 농도는 제조사의 지시에 따라 로우리 단백질 분석법(Lowry protein assay)으로 정량화했다.

표본(30 μg 단백질)은 환원 조건 하에서 SDS-PAGE 겔 전기영동법으로 분리하여 PVDF 막으로 이동시켰다. 비특이적 단백질 결합을 3% BSA(0.2% Tween 20을 포함한 10 mM PBS)로 차단했고 iNOS(64), 아르기나아제(53), MMP-9(44) 및 TIMP-1(55) 또는 β-액틴(12) 부하 제어(4°C)에 특이적인 1차 항체로 막을 탐침 조사했다. 막을 세척하고 서양고추냉이 과산화효소 결합 2차 항체로 배양한 다음 Carestream Gel Logic Pro 6000 영상장치에서 화학 발광으로 시각화했다. 단백질 발현을 농도계로 정량화하고 ImageJ’s Gel 분석 도구를 사용하여 β-액틴으로 정규화했다(50). 이미지를 Pixelmator 이미지 소프트웨어에서 처리하고 잘라 냈다.

두 그룹 사이의 비교를 위해 단측 스튜던트 t-검정(Student’s t-test)을 사용해 데이터를 분석하거나 지시된대로 세 그룹 이상의 비교를 위해 터키의 사후검정으로 일원분산분석(ANOVA)을 사용해 데이터를 분석했다(Prism, GraphPad, San Diego, CA). P값이 0.05 미만(< 0.05)이면 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.

[실시예 7] 결과 - 보이즌베리 섭취가 OVA 유발 기도 염증을 개선한다

보이즌베리 치료가 안착된 폐 개형에 미치는 효과를 조사하기 위해서 마우스를 5주 동안 비강내 OVA로 매주 면역 유발을 한 다음 보이즌베리를 매주 경구 치료하면서 추가로 5주 동안 OVA로 매주 면역 유발을 했다(도 1A).

도 1B에 나와 있는 것처럼, OVA 면역 유발 마우스에서 나온 폐 조직에서는 세포 침윤물이 증가하고 폐 구조가 상실되었다. OVA 유발 세포 침윤물과 폐 손상은 보이즌베리 치료 마우스에서 감소했다(도 1B). 점액을 생성하는 폐 조직을 염색하여 OVA로만 면역 유도를 한 마우스와 비교했을 때 보이즌베리 치료를 받은 OVA 면역 유발 마우스에서 점액 양성 세포가 더 적다는 것을 확인했다(도 1C). 보이즌베리 치료만으로는 세포 침윤, 폐 구조 또는 점액 생성에 효과가 없었다.

[실시예 8] 결과 - 보이즌베리 치료는 OVA 면역 유발 마우스의 폐에서 AAM을 증가시킨다.

H&E-염색 폐 조직 박편에서는 OVA 마우스와 비교하여 OVA/보이즌베리 치료 마우스에서 대식세포가 더 많은 것으로 나타났다(도 2A). 폐 조직의 면역 블롯 분석에서는 OVA 면역 유발만 한 마우스와 비교하여 OVA/보이즌베리 치료 마우스의 폐 조직에서 iNOS 발현이 감소하는 것으로 확인되었다(도 2, B 및 C). 동시에, OVA 면역 유발 마우스에서 아르기나아제 발현이 증가하는 것으로 관찰되었는데(도 2, B 및 D), 이런 증가는 보이즌베리로 치료한 OVA 면역 유발 마우스에서 더 강화되었다. 보이즌베리 치료만으로는 아르기나아제 발현에 효과가 없었다.

아르기나아제를 발현하는 AAM은 폐 개형과 밀접한 관련이 있다(29). 관찰된 대식세포가 대체 활성화된 것인지 여부를 확인하기 위해서, 폐 조직을 대식세포 표지 CD68 및 AAM 표지 CD20 그리고 아르기나아제에 대해 형광 표지된 항체로 염색했다.

OVA/보이즌베리 치료 마우스에서 나온 폐 조직에서는 OVA 면역 유발 마우스와 비교하여 CD68+CD206+아르기나아제+대식세포의 증가가 나타났다(도 3). CD68+CD206+아르기나아제+대식세포의 정량 분석에서는 OVA 면역 유발 마우스와 비교하여 OVA/보이즌베리 치료 마우스의 폐 조직에서 CD68+CD206+아르기나아제+대식세포의 비율에서 유의미한 증가가 추가로 확인되었다(23.47 ± 5.61%와 비교하여 60.00 ± 3.54% , P < 0.001, 단측 스튜던트 t-검정). 이러한 데이터를 종합하여 보면 보이즌베리 치료를 받은 OVA 면역 유발 마우스에서 대체 활성화 대식세포를 발현하는 폐 대식세포의 수 증가가 확인된다.

[실시예 9] 결과 - 보이즌베리 치료는 OVA 유발 콜라겐 증착을 줄이고 폐에서 MMP-9 발현을 증가시킨다.

AAM과 아르키나아제 발현 증가는 공통적으로 조직 섬유증(14, 27, 66)과 관련이 있다. 따라서 폐에서 OVA 유발 콜라겐 증착에 대한 보이즌베리 치료의 효과를 조사했다. 이 조사에 따라 콜라겐 증착의 대리 표지로서 폐 조직에서 하이드록시프롤린 수치를 측정했다(2, 63).

OVA 면역 유발만 하는 경우에는 OVA/보이즌베리 치료 마우스의 폐에서 폐기된 폐 조직 전체에서 콜라겐 증착의 징후가 나타나서 기도에 비정상적 콜라겐 증착이 생겼다(도 4). 게다가, 보이즌베리로 치료한 OVA 면역 유발 마우스의 폐에서 하이드록시프롤린 수치가 유의미하게 하락하여, 보이즌베리 치료가 OVA 유발 콜라겐 증착을 개선시킨다는 것을 확인했다(도 4B). 보이즌베리는 폐에서 OVA 유발로 인한 TGFβ의 수치 감소를 회복시켰지만 (도 4C) IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 또는 IFNγ의 수치에는 영향을 주지 않았다(데이터 표시되지 않음).

보이즌베리 치료가 폐섬유증을 완화시킬 수 있는지 밝히기 위해, 면역 블롯으로 폐 조직에서 MMP-9의 발현을 측정했다.

OVA 만으로 면역 유발한 마우스와 비교하여 보이즌베리로 치료한 OVA 면역 유발 마우스에서 MMP-9 발현이 증가한 것으로 밝혀졌다(도 4D). 보이즌베리 치료만으로는 폐의 MMP-9 수치에 영향을 주지 않는다. 기질 금속단백분해효소-1의 조직 억제제(TIMP-1)는 MMP-9의 내생 억제제이다(49). TIMP-1/MMP-9의 발현 비율은 만성 OVA 면역 유발 마우스의 폐 조직에서 유의미하게 증가했으며 이러한 증가는 보이즌베리 치료로 뒤바뀌었다(도 4E). 이러한 결과는 콜라겐 증착과 조직 개형에서 보이즌베리 매개 감소는 섬유 용해 MMP-9의 생성 증가 및 뒤이어 나타는 TIMP-1/MMP-9 비율의 균형 재조정과 관련이 있다는 의미한다.

[실시예 10] 결과 - 대체 활성화 대식세포는 OVA/보이즌베리 치료 마우스의 폐에서 MMP-9 단백질의 공급원이다.

폐 조직 슬라이드를 분석하여 MMP-9의 잠재적 세포 공급원을 확인했다. DAB-MMP-9 염색에서는 OVA 치료 통제군과 비교하여 OVA/보이즌베리 치료 마우스의 대식세포 형태를 보이는 MMP+ 세포의 비율이 높다는 것을 확인했다(도 5A). 폐 조직에 대한 면역 형광 염색(도 5B)과 정량 분석을 통해 OVA만으로 면역 유발을 한 폐에서보다 OVA/보이즌베리 치료 폐에 MMP-9+/CD206+/CD68+ 세포가 더 많이 존재한다는 것을 확인했다(39.30 ± 6.39 대 21.07 ± 5.82%; P < 0.05, 단측 스튜던트 t-검정). 이러한 결과를 통해 CD206+/CD68+ AAM이 MMP-9 단백질 수치 증가의 원천이라는 것을 확인한다.

[실시예 11] 결과 - 폐 대식세포의 감소는 안착된 만성 폐 염증에서 조직 개형에 미치는 보이즌베리 섭취의 유익한 효과를 줄인다.

다음으로 발명가들은 폐 대식세포의 감소가 만성 폐 염증에 미치는 보이즌베리의 유익한 효과에 미치는 영향을 살펴보았다. 만성 폐 염증을 안착시킨 다음 각각의 보이즌베리를 투여하기 전에 클로드로네이트 리포솜을 투여하여 대식세포를 감소시켰다(도 6A). 유세포 분석기를 사용하여 폐 대식세포가 유의미하게 감소하였다는 사실과(도 6B) 이러한 감소가 보이즌베리로 치료한 OVA 면역 유발 마우스의 폐에서 하이드록시프롤린 수치의 유의미한 감소와 연관된다는 사실을 확인하였다(도 6C). 이러한 데이터는 보이즌베리가 폐 조직 개형에 유익한 효과를 매개하려면 대식세포가 필요하다는 것을 의미한다.

[실시예 12] 결과 - 보이즌베리 치료가 OVA 유발 기도 염증을 예방 차원에서 막는다

마지막으로, 보이즌베리 치료의 효과는 예방 투여 요법을 사용하여 시험했다(도 7A). 다시 말해, 보이즌베리 치료는 OVA 유발 조직 개형을 저지하며 폐 세척 유체에서 세포의 유의미한 감소를 가져왔다(도 7, B-D). 이러한 결과는 폐 조직에서 하이드록시프롤린의 낮은 수치 및 TIMP-1/MMP-9 발현 비율의 감소와 관련이 있었다.

[실시예 13] 고찰

과일 섭취는 실험 모델에서 천식 환자의 폐 기능 개선 및 급성 기도 감염의 개선과 관련이 있었다(16, 19, 40). 하지만, 이러한 연구에서 보이즌베리 조성물, 기도 섬유증 또는 기도 개형과 관련하여 연구결과가 확립되어 있지 않았으며 그 밖의 알려진 천식 치료가 기도 개형을 다루는 데 실패했다는 사실이 잘 확립되어 있다.

본 문서에서는 보이즌베리 조성물을 섭취하여 치료적, 예방적 상황 모두에서 만성 폐 개형과 섬유증이 완화된다는 것이 입증된다. 게다가, 대식세포가 보이즌베리 매개 방어에 중요한 역할을 하며 이러한 방어가 AAM의 조절과 MMP-9 활성 증가로 인해 생긴다는 것을 데이터가 보여 준다.

아르기나아제 활성(26, 27, 41) 증가 및 AAM(4, 9)의 증가 모두 천식 발병과 흔히 관련이 있다. 하지만, AAM의 존재가 알레르기성 천식이 발병을 특별히 뒷받침하지 않는다는 증거가 있는데(37), 이런 증거는 AAM이 대안적 역할을 할 수도 있다는 의미이다.

본 문서에 나타난 것처럼, 보이즌베리 치료는 만성 OVA 면역 유발 마우스의 폐 조직에서 iNOS 발현의 감소와 함께 아르기나아제 양성 AAM의 개체군을 증가시켰다. 아르기나아제와 iNOS는 폐 염증과 회복에 대안적 역할을 한다(34, 35, 66). iNOS 활성이 활성 염증과 관련이 있는 경우에, 아르기나아제 발현은 염증 해결을 위한 스위치를 의미한다(35, 63). 따라서 보이즌베리 섭취는 폐 환경의 균형을 재조정하는 것으로 보이며, 폐에서 AAM의 기능적 표현형을 조절하여 염증 해결에 도움을 준다.

AAM의 존재는 폐 염증에서 Th-2 시토카인 감소와 연관되었다(36, 42). 하지만, OVA 면역 유발 후에 보이즌베리 섭취를 하여서는 Th-2 시코카인 IL-4, IL-5 그리고 IL-13 수치에 변화가 없는 것으로 밝혀졌다. 이러한 사실은 AAM에 의한 전염증성 Th-2 시코카인 생성 억제가 보이즌베리 치료의 보호 효과에 기여하지 않는다는 것을 의미했다.

임상 및 동물 데이터에서는 천식에서 MMP-9의 역할이 다면적인 것으로 나타났다. MMP-9을 생성하는 폐 대식세포는 실험실 및 임상 환경 모두에서 확인되었다(1, 5, 49). 건강한 통제군과 비교할 때 천식 환자에서 나온 혈장과 가래에서 활성화 MMP-9의 수치 상승이 확인되었다(3, 23). MMP-9 발현 증가는 폐 호산구 증가증을 포함하여 급성 천식 악화와 연관성이 있었다(6, 23). 반대로, MMP-9 수치 증가는 기도 질환에서 폐 기능의 개선과 관련이 있었다(25, 65). MMMP-9 과발현은 또한 폐섬유증 모델에서 유익한 영향을 주는 것으로 나타났다(5). 그에 반해, MMp-9 유전자 결손 마우스에서 얻은 데이터에서는 천식 증상의 전개를 부분적으로 감소하고 개형이 줄어든 것으로 나타나지만, 일부의 경우에 MMp-9의 부족이 질병을 악화시키는 것으로 나타났다(15, 24, 32).

MMP-9은 전염증성 및 항염증성 시토카인의 활성화를 포함하여 여러가지 다른 면역 매개변수에 후속 효과를 발휘한다(15). 그럼에도 불구하고, 본 문서에 나타난 데이터에서는 만성 콜라겐 증착과 섬유증에서 나온 폐 조직에 대한 보이즌베리 유발 보호가 MMP-9을 생성하는 섬유 용해 AAM의 발생을 통해 어느 정도 조직되는 것으로 나타났다. 이러한 사실과 일치하여, 데이터에서는 염증의 해결 단계 중에 대식세포의 감소가 보이즌베리 섭취로 콜라겐 증착의 증가로 이어지는 것으로 나타난다. 대식세포의 유사한 해결 촉진 역할은 블레오마이신 유발성 폐섬유증에서 입증되었다(14).

기질 금속단백분해효소는 천연 억제제 TIMP에 의해 조절되며 높은 TIMP-1/MMP-9 비율은 콜라겐 증착과 폐 개형을 촉진하는 것으로 제시되었다(21, 28, 38). 여기에서 만성 OVA 면역 유발 마우스의 폐 조직에서 TIMP-1/MMP-9 발현 비율의 유의미한 증가가 관찰되었으며 보이즌베리 치료로 이런 증가가 뒤바뀌었다. 따라서 보이즌베리 치료 마우스에서 TIMP-1/MMP-9 비율의 하락은 콜라겐 증착 및 분해의 조절에서 잠재적으로 유익한 재조정을 나타낸다.

TGFβ은 세포외 기질 생성에서 하는 역할을 통해 정상적(20) 및 병리적(17, 22, 56) 조직 복구 과정과 관련이 있다. 본 연구에서는 만성 OVA 면역 유발이 보이즌베리 섭취에 의해 역전된 TGFβ 수치의 감소로 이어진다는 것이 관찰되었다. TGFβ가 TIMP-1/MMP-9 비율을 낮추며, 따라서, 섬유 용해 환경에 더 유리하다는 증거가 있다(18, 54, 56). 이처럼 보이즌베리 섭취 후 OVA 면역 유발 마우스의 폐에서 관찰된 TGFβ 수치 증가는 TIMP-1/MMP-9 비율을 낮추어 폐 복구 시에 과도한 폐섬유증과 부적절한 개형을 제한하는 역할을 할 수 있었다. TGFβ는 또한 정상 조직 복구를 위해 섬유 아세포 수축을 자극하는 것으로 알려져 있는데(20), 이것도 마찬가지로 보이즌베리 치료의 유익한 효과에 기여할 수 있었다. 이처럼 TGFβ의 증가는 다수의 기전을 통해 폐 내애서 염증에 불리하고 해결에 유리한 환경 조성을 촉진할 가능성이 있다.

이러한 연구의 결과에서는 보이즌베리 투여가 치료 및 예방 환경 모두에서 만성 폐섬유증에 유익한 효과를 보이는 것으로 나타난다. 이러한 결과는 보이즌베리 섭취가 잘 통제되지 않거나 잘 통제되는 천식 두 가지 경우 모두에서 부적절한 섬유증 개형을 피하는 데 도움이 될 수도 있다는 것을 의미한다. 마지막으로, 이러한 연구결과는 천식 및 섬유증의 병증을 보이는 그 밖의 폐 질환에서 폐 개형을 적절하게 조절할 수 있는 가능성을 가진 섬유 용해 AAM의 발달을 돕는 데 보이즌베리 섭취를 사용할 수 있다는 첫 번째 증거를 제공한다.

요약하자면, 이러한 연구결과에서는 호흡기의 감염과 이상 콜라겐 증착을 줄이는 데 보이즌베리 조성물을 사용할 수 있으며, 따라서 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 반응성 기도 질환, 기도 섬유증 그리고 기도 개형을 포함하여 기도의 다양한 장애를 치료하고 예방하는 데 용도를 찾을 수 있는 것으로 나타났다.

당업자는 여기에 제시된 공개물과 개념들을 활용하여 과도한 실험 없이도 다른 실시예와 변형예를 만들어 낼 수 있다. 이러한 모든 실시예와 변형예는 본 발명에 귀속되는 것으로 간주된다.

그에 따라, 당업자는 이 공개물들을 활용함으로써 여기서 설명된 실시예와 실질적으로 동일한 기능 또는 결과를 달성하는 향후 수정예, 대체예 및/또는 변형예들을 각각 해당되는 본 발명의 관련 실시예에 따라 이용할 수 있다는 것을 쉽게 이해하게 될 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 여기에 공개되는 물질, 화합물, 수단, 방법 및/또는 단계들의 과정, 제조 및 구성에 대한 수정예, 대체예 및 변형예를 포함한다.

본 문서에 있는 설명은 청구된 발명의 범위에 포함되지 않는 주제를 포함할 수도 있다. 이러한 주제는 발명의 이해에 도움을 줄 목적으로 포함되어 있다.

이 명세서에서, 특허명세서와 그 밖의 문서를 포함하여 정보의 외부 출처를 언급했다면, 일반적으로 본 발명의 특징을 논의하기 위한 맥락을 제공하는 데 그 목적이 있다. 달리 서술되지 않는다면, 정보의 이런 출처에 대한 언급은 어떤 관할 구역에서도 정보의 이런 출처가 선행 기술이거나 업계의 공통적이고 일반적인 지식의 일부를 구성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않는다.

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Claims (11)

1. 시험대상자의 호흡기에 형성된 콜라겐의 이상 증착을 감소시키기 위한 보이즌베리 농축물을 포함하는 기능식품 조성물.
2. 제1항에 있어서, 보이즌베리 과즙 농축물 또는 보이즌베리 분말을 포함하는 기능식품 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 5 mg 내지 500 mg의 총 안토시아닌을 포함하는 용량 단위를 포함하는 기능식품 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 장관 또는 경구 투여를 위한 기능식품 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시럽, 점적약, 겔, 젤리, 정제 또는 캡슐인 기능식품 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 총 안토시아닌/시험대상자 체중 비율이 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg인 용량을 포함하는 기능식품 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1일 10 mg 내지 1000 mg의 총 안토시아닌 용량을 포함하는 기능식품 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가된 폴리페놀을 포함하는 기능식품 조성물.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가의 호흡 보조제와 함께 투여하기 위한 기능식품 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 콜라겐의 이상 증착이 만성 호흡기 장애와 관련된 기능식품 조성물.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 콜라겐의 이상 증착이 만성 폐쇄성 폐질환, 반응성 기도 질환, 기도 섬유증, 또는 기도 개형과 관련된 기능식품 조성물.

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