CN110988107B - 一种结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置和方法 - Google Patents

一种结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种结晶温度可控的升华‑再结晶型质谱成像基质沉淀装置和方法，包括升华容器、冷却管道、回流管道、抽真空装置及升华容器内部的沉积玻片、样品架、基质托盘、制冷元件、加热元件，加热元件放置在升华容器的底部，基质托盘设置在加热元件的顶部，沉积玻片通过样品架固定在基质托盘的正上方，样品架的顶部放置制冷元件，冷却管道、回流管道分别与制冷元件连接，抽真空装置与升华容器连接。精确地影响基质沉积的主要变量，确保基质沉积更好的可重复的条件。沉积玻片表面的基质沉积较为均匀，避免了结晶过程中的移位现象。

Description

一种结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置 和方法
技术领域
本发明属于基质沉积技术领域，具体涉及一种结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置和方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
质谱成像(mass spectrometry imaging，MSI)作为一种新型的分子影像技术，可以获得样品表面多种分子化学组成及各组分的空间立体结构信息。随着质谱成像技术的不断发展与成熟，根据所用离子源及质量分析器不同，研究对象由元素分析发展到小分子质谱指纹图谱再到多肽及蛋白质分子成像。质谱成像技术已被广泛应用于基础医学、药学、微生物学、动物学、植物学等各个生命科学领域。而基质辅助激光解吸电离质谱成像技术(MALDI-MSI)是目前应用最为广泛的质谱成像技术。通过采用不同的基质，MALD1-MSI可以实现从蛋白质、多肽等生物大分子到脂类、核苷类物质等中等分子量生物分子及药物小分子的分析。其主要工作流程，主要包括组织样本切片、基质沉积和组织样本的质谱成像三个方面。研究表明基质在组织切片上分布的均匀度、结晶度和晶体颗粒的大小等因素是决定质谱成像质量的关键因素，如检测灵敏度、分子数量和分子的种类等。
目前基质沉积方法主要为基质喷涂两种。常用的商业基质喷涂仪有HTX TM-Sprayer和ImagePrep等装置。TM-Sprayer通过提高基质的温度以促进组织对于基质的吸收，控制干燥气以加快基质干燥结晶，另外一种全自动基质喷涂装置ImagePrep也被广泛应用于质谱成像的组织样本制备。该装置利用振动雾化的原理将基质均匀的喷洒在组织表面，并采用光学传感器在线监控基质结晶，因此具有极佳的重现性。但是，该装置振动雾化喷雾头易堵，且喷涂基质所用的时间较长。常见的商用升华器的材质为玻璃，玻璃容器和加热器之间的接触往往不均匀，难以实现均匀稳定的加热，不能实现最佳的基质沉积再现性，在与真空泵接连时连接口处的玻璃容易破碎。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置和方法。该装置可以实现生物样本表面基质的均匀喷涂，并且该装置结构简单、可以精确地控制影响基质沉积的主要变量，升华过程中更好地控制样品温度，升华室内的真空度和升华温度，实现了基质沉积更好的可重复的条件。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
一种结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置，包括升华容器、冷却管道、回流管道、抽真空装置及升华容器内部的沉积玻片、样品架、基质托盘、制冷元件、加热元件，加热元件放置在升华容器的底部，基质托盘设置在加热元件的顶部，沉积玻片通过样品架固定在基质托盘的正上方，样品架的顶部放置制冷元件，冷却管道、回流管道分别与制冷元件连接，抽真空装置与升华容器连接。
本发明利用升华原理使基质托盘内的基质发生升华，成为气体后向上运动与沉积玻片相遇，冷却后凝华结晶沉积在沉积玻片的表面得到基质玻片，基质在沉积玻片上均匀分布。本发明中制冷元件、加热元件的温度可控，通过控制加热温度和制冷温度，可以精确地影响基质沉积的主要变量，升华过程中更好地控制样品温度，升华室内的真空度和升华温度，实现了基质沉积更好的可重复的条件。
在一些实施例中，制冷元件的顶部设置铜臂，铜臂的上端穿过升华容器的顶部，与升华容器固定连接，所述铜臂为实心的铜质材质，形状为圆柱型或方型。本发明在制冷元件的顶部设置铜臂，铜臂有助于制冷元件散热，使制冷元件在工作过程中产生的热量从顶部散走，防止制冷元件的热量对沉积玻片的基质沉积产生影响。
在一些实施例中，抽真空装置与升华容器通过连接管连接，升华容器为不锈钢材质，连接管为塑料材质。
本发明提供了一种不锈钢材质的基质沉积装置，相比于玻璃材质的连接管，解决了玻璃材质的连接管容易破碎的问题。
优选的，连接管伸出升华容器的一端与数字真空计连接。通过数字真空计可以精确的实时反馈升华容器内部的真空度。
在一些实施例中，升华容器的外侧，冷却管道与水泵连接，回流管道与蓄水池连接。水泵将冷却水打入制冷元件，然后回水进入蓄水池。通过水制冷可以实现沉积玻片的温度最低温度达到-15℃。
在一些实施例中，升华容器的外侧设置制冷温度控制器，制冷温度控制器与升华容器内部的制冷元件连接，在升华容器的外侧，制冷温度控制器与水泵连接。
优选的，制冷温度控制器包括温度控制器和热电偶、固态继电器，热电偶、固态继电器分别与温度控制器连接。热电偶探测到腔体温度传回温度控制器，温度控制器通过调节固态继电器调节腔体温度，热电偶的一端与样品架接触。制冷温度控制器通过热电偶实时传输的温度进行PID运算，将运算值通过传感器控制水泵的开启，从而精密的控制样品架的温度。
在一些实施例中，升华容器的外侧设置加热温度控制器，加热温度控制器分别与加热元件、基质托盘连接。
优选的，加热温度控制器包括温度控制器和热电偶、固态继电器，热电偶、固态继电器分别与温度控制器连接，热电偶的一端与基质托盘相接触。热电偶探测到腔体温度传回温度控制器，温度控制器通过调节固态继电器调节腔体温度。加热温度控制器通过热电偶实时传输的温度进行PID运算，将运算值通过传感器控制加热元件的开启，从而精密的控制加热元件进行加热或保持恒温。
在一些实施例中，升华容器包括两端开口的管腔和管腔两端的盲板法兰，两个盲板法兰分别与管腔密封连接，铜臂与管腔顶部的盲板法兰连接。铜臂与盲板法兰连接，可以固定铜臂，并且有助于铜臂与盲板法兰接触进行散热。
在一些实施例中，基质托盘与沉积玻片之间的距离为10-20厘米；优选为14-16厘米。这个距离影响沉积的基质的厚度和均匀性。
在一些实施例中，所述基质托盘为圆形，基质托盘的厚度为0.5-1.5厘米，热电偶的一端位于基质托盘的下方。发明人发现基质托盘的不同几何形状，底部的厚度，热电偶的位置对基质的沉积具有一定的影响，如果基质覆盖大的表面，与基质被限制在较小区域相比，升华进行得更快。发明人发现圆形基质托盘能够实现更好的沉积均匀性效果。
在一些实施例中，样品架为矩形平板结构。在平板结构两侧固定扎带使沉积玻片与制冷元件的底部直接接触，制冷元件与沉积玻片进行接触换热。
利用上述装置进行基质沉淀的方法，具体步骤为：
在基质托盘内放入基质固体，使用扎带将沉积玻片与样品架连接；
打开抽真空装置，达到设置真空度时关闭抽真空装置；
开启水泵，达到预定制冷温度时关闭水泵；
抽真空后打开加热元件，达到设定温度后，使加热元件恒温加热基质托盘；
沉积后关闭加热元件，打开真空阀缓慢放气。
在一些实施例中，基质为1,5-二氨基萘(DAN)、2，5-二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸等。
在一些实施例中，沉积玻片为ITO玻片等质谱常用玻片。
在一些实施例中，基质的质量为18-22mg。所述基质的质量有助于进一步提高生物样本表面基质结晶的质量。基质的质量太多或太少，在一定的温度下，升华的质量太多或太少，影响沉积玻片表面的基质的均匀性。
在一些实施例中，基质恒温的温度为80-160℃。
在一些实施例中，制冷的温度为-15--5℃；优选为-15～-8℃。不同的冷却温度所结晶的程度不同，涂覆在样品表面的基质量，均匀程度，密度分布都不同。
在一些实施例中，升华过程的时间为4-12分钟。
针对相同的基质不同的加热温度，升华的时间不同。但超过某一恒定温度值后，升华时间明显缩短。
本发明的有益效果：
1.本发明提供的升华-再结晶基质沉积装置置中包含多个传感器，可以精确地控制影响基质沉积的主要变量。
2.本发明提供的升华-再结晶基质沉积装置，在矩阵托盘的底部连接热电偶探头，该热电偶连接到一个可以调节电压的控制器，可以实现对升华温度进行精细的控制。
3.本发明提供的升华-再结晶基质沉积装置配备了水泵，输水管道，通过水制冷可以实现最低温度为-15℃。
4.本发明提供的升华-再结晶型基质沉积装置可以使基质均匀结晶，从而获得更好的再现性。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明设备结构图；
图2为使用本发明的升华-再结晶型基质沉淀装置在-15℃的ITO玻片上基质DAN沉积的SEM图像；
图3为使用商业HTX TM-Sprayer基质喷雾仪在ITO玻片上喷涂基质DAN的SEM图像；
图4为使用本发明的升华-再结晶型基质沉淀装置在-15℃的ITO玻片上基质DHB沉积的SEM图像；
图5为使用本发明的升华-再结晶型基质沉淀装置在-5℃的ITO玻片上基质DAN沉积的SEM图像；
图6为使用本发明的升华-再结晶型基质沉淀装置进行质谱成像的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的分布图。
其中，1、样品架，2、制冷温度控制器，3、水泵，4、顶部盲板法兰，5、蓄水池，6、数字真空计，7、真空泵，8、底部盲板法兰，9、加热元件，10、基质托盘，11、加热温度控制器，12、制冷元件，13、铜臂。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
由图1所示，包括升华容器、冷却管道、回流管道、抽真空装置及升华容器内部的沉积玻片、样品架1、基质托盘10、制冷元件12、加热元件9，加热元件9放置在升华容器的底部，基质托盘10设置在加热元件9的顶部，沉积玻片通过样品架1和扎带固定在基质托盘10的正上方，样品架1的顶部放置制冷元件12，冷却管道、回流管道分别与制冷元件12连接，抽真空装置与升华容器连接。
样品架1由平板结构和扎带组成，通过在平板结构两侧固定扎带使沉积玻片与制冷元件12的底部直接接触，制冷元件12与沉积玻片进行接触换热，样品架1与制冷元件、铜臂固定连接，通过扎带实现玻片与样品架的固定。
制冷元件12，如水冷块，其具有制冷功能，其利用水泵3循环的冷却水作为冷源，强化换热，循环后的水进入蓄水池5，因此可以实现-15℃的冷却温度，当基质遇到低温的沉积玻片，凝华结晶，形成基质沉淀。
铜臂13位于制冷元件12的顶部，铜臂13的导热效果比较好，制冷元件12在制冷的同时，产生热量，制冷元件12的产热端将热量传递给铜臂13，铜臂13将热量导出，导出到顶部法兰和外界的空气，避免影响升华容器内部的温度。
加热元件9放置在升华容器内部的底部，加热元件9的顶部放置基质托盘10。
所述基质托盘10为圆形，基质托盘10的厚度为1厘米，热电偶的一端位于基质托盘10的下方。基质托盘10可以为矩阵托盘。矩阵托盘可以放置固体。
升华容器包括两端开口的管腔和管腔两端的盲板法兰，顶部盲端法兰4和底部盲端法兰8分别与管腔实现密封连接，实现整个升华容器的负压，实现真空度的环境。
沉积玻片位于基质托盘10的正上方，可以方便于基质能够向正上方传递，在一个竖直空间内，基质均匀的沉积在沉积玻片上。
抽真空装置通过塑料材质的连接管与管腔连接，在图1中所示，抽真空装置为真空泵7，真空泵7将升华容器内部的真空度达到一定的数值，真空度通过数字真空计6进行显示。
本发明中的加热温度控制器11和制冷温度控制器2为通过热电偶进行检测温度的控制结构。
制冷温度控制器2包括温度控制器和热电偶、固态继电器，热电偶、固态继电器分别与温度控制器连接。热电偶探测到腔体温度传回温度控制器，温度控制器通过调节固态继电器调节腔体温度。在升华容器的外侧，制冷温度控制器与水泵连接。制冷温度控制器2通过热电偶实时传输的温度进行PID运算，将运算值通过传感器控制水泵的开启，从而精密的控制样品架的温度。
加热温度控制器11与加热元件9连接。加热温度控制器包括温度控制器和热电偶、固态继电器，热电偶、固态继电器分别与温度控制器连接，热电偶的一端与基质托盘10相接触。热电偶探测到腔体温度传回温度控制器，通过热电偶控制加热元件9并通过PID运算可以使加热元件9恒定在某一温度值。
所以得到本发明中可以精确的控制基质托盘内的温度和沉积玻片的温度。
实施例1
使用本发明的升华-再结晶型基质沉淀装置在ITO玻片上进行基质升华，包括如下步骤：
放置ITO玻片于样品架，在基质托盘放置20mgDAN基质，开启真空泵使得腔体内的真空度达到0.1mbar。
将水泵与水龙头紧密连接，开启水龙头，使得冷却水循环流出。设置制冷温度为-15℃。
当制冷温度达到-15℃时，关闭真空泵。设置加热台温度为100℃，开启升华加热台，此时基质开始升华。升华过程持续10分钟后，关闭加热台。打开真空阀，腔体内真空度恢复至大气压，打开升华腔体取出ITO玻片。利用电子扫描显微镜(SEM)对沉积到玻片上的基质进行表征，结果如图2所示。结果表明，使用发明装置沉积得到的基质结晶颗粒较小且均匀，操作过程简便，避免了有机溶剂的使用。
对比例
为了更好的比较本发明进行基质沉积的效果，我们还利用了商业HTXTM-Sprayer基质喷雾仪在ITO玻片上进行了基质喷涂，包括如下步骤：
使用50％的乙腈水溶液配置10mg/mL的DAN基质溶液，设置喷雾温度为30℃，液泵流速为0.1mL/min,氮气压强为10psi。喷雾结束后取出ITO玻片。利用SEM对沉积到玻片上的基质进行表征，结果如图3所示。结果表明，使用商业HTXTM-Sprayer基质喷雾仪沉积得到的基质结晶颗粒大且不均匀，且无法避免有机溶剂的使用，容易造成结晶过程中的移位。
实施例2
使用本发明的升华-再结晶型基质沉淀装置在ITO玻片上进行基质升华，包括如下步骤：
放置ITO玻片于样品架，在基质托盘放置20mg 2,5-二羟基苯甲酸(DHB)基质，开启真空泵使得腔体内的真空度达到0.1mbar。基质托盘与沉积玻片之间的距离为15厘米，基质托盘的厚度为1厘米。
将水泵与水龙头紧密连接，开启水龙头，使得冷却水循环流出。设置制冷温度为-15℃。
当制冷温度达到-15℃时，关闭真空泵。设置加热台温度为120℃，开启升华加热台，此时基质开始升华。升华过程持续5分钟后，关闭加热台。打开真空阀，腔体内真空度恢复至大气压，打开升华腔体取出ITO玻片。利用电子扫描显微镜(SEM)对沉积到玻片上的基质进行表征，结果如图4所示。结果表明，使用发明装置沉积得到的基质结晶颗粒较小且均匀，操作过程简便，避免了有机溶剂的使用。
实施例3
与实施例1不同的是冷却温度为-5℃，得到如图5所示的结果，发现，当冷却温度改变后，结晶到沉积玻片表面的基质量减少，密度减小。
实施例4
利用实施例2中的升华-再结晶型基质沉淀装置及升华条件对草莓中花青素成分的MALDI-TOF-MSI分析方法，包括如下步骤：
(1)将草莓置于液氮冷冻后，使用美国ThermoCryostar NX50冷冻切片机将草莓切成70um的组织切片，覆于ITO玻片上。
(2)使用实施例2中的升华方法，将DHB基质升华于组织切片的表面。
(3)利用Bruker rapifleX MALDI Tissuetyper system质谱成像仪对草莓切片进行成像。具体条件如下：正离子扫描模式；扫描范围：m/z 100-700；激光波长：355nm；激光能量:70％；采用反射模式；采样率：1.25GS s-1；加速电位：±20kV，真空压力：3-5x10-7mbar；脉冲离子提取延迟：100ns；分辨率：50um；激光类型：Single模式。
(4)利用SCils2019b软件对质谱成像结果进行分析，以天竺葵素-3-O-葡萄糖苷(Mz＝433.1)为例分析其在草莓切片上的分布，结果如图6所示。结果表明，利用本发明的升华-再结晶型基质沉淀装置和方法进行植物组织的基质升华，可以灵敏的检测出切片中的目标活性物质，检测图像具有良好的分辨率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：具体步骤为：
在基质托盘内放入基质固体，将沉积玻片与样品架通过扎带固定；
打开抽真空装置，达到设置真空度时关闭抽真空装置；
开启水泵，达到预定制冷温度时关闭水泵；
抽真空后打开加热元件，达到设定温度后，使加热元件恒温加热基质托盘；
沉积后关闭加热元件，关闭抽真空装置；
结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置，包括升华容器、冷却管道、回流管道、抽真空装置及升华容器内部的沉积玻片、样品架、基质托盘、制冷元件、加热元件，加热元件放置在升华容器的底部，基质托盘设置在加热元件的顶部，沉积玻片通过样品架固定在基质托盘的正上方，样品架的顶部放置制冷元件，冷却管道、回流管道分别与制冷元件连接，抽真空装置与升华容器连接；
基质托盘与沉积玻片之间的距离为10-20厘米；
制冷的温度为-15--5℃。
2.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：制冷元件的顶部设置铜臂，铜臂的上端穿过升华容器的顶部，与升华容器固定连接，所述铜臂为实心的铜质材质，形状为圆柱型或方型。
3.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：抽真空装置与升华容器通过连接管连接，升华容器为不锈钢材质，所述连接管为塑料材质。
4.根据权利要求3所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：连接管伸出升华容器的一端与数字真空计连接。
5.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：升华容器的外侧，冷却管道与水泵连接，回流管道与蓄水池连接。
6.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：升华容器的外侧设置制冷温度控制器，制冷温度控制器与升华容器内部的制冷元件连接，在升华容器的外侧，制冷温度控制器与水泵连接。
7.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：制冷温度控制器包括温度控制器和热电偶、固态继电器，热电偶、固态继电器分别与温度控制器连接；热电偶探测到腔体温度传回温度控制器，温度控制器通过调节固态继电器调节腔体温度，热电偶的一端与样品架接触； 制冷温度控制器通过热电偶实时传输的温度进行PID运算，将运算值通过传感器控制水泵的开启，从而精密的控制样品架的温度。
8.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：升华容器的外侧设置加热温度控制器，加热温度控制器分别与加热元件、基质托盘连接。
9.根据权利要求8所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：加热温度控制器包括温度控制器和热电偶、固态继电器，热电偶、固态继电器分别与温度控制器连接，热电偶的一端与基质托盘相接触；热电偶探测到腔体温度传回温度控制器，温度控制器通过调节固态继电器调节腔体温度。
10.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：升华容器包括两端开口的管腔和管腔两端的盲板法兰，两个盲板法兰分别与管腔密封连接，铜臂与管腔顶部的盲板法兰连接。
11.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：基质托盘与沉积玻片之间的距离为14-16厘米。
12.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：所述基质托盘为圆形，基质托盘的厚度为0.5-1.5厘米，热电偶的一端位于基质托盘的下方。
13.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：样品架为矩形平板结构。
14.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：基质为1,5-二氨基萘、2，5-二羟基苯甲酸、芥子酸。
15.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：沉积玻片为ITO玻片。
16.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：基质的质量为18-22mg。
17.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：基质恒温的温度为80-160℃。
18.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：制冷的温度为-15～-8℃。
19.根据权利要求1所述的利用结晶温度可控的升华-再结晶型质谱成像基质沉淀装置进行基质沉淀的方法，其特征在于：升华过程的时间为4-12分钟。
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