CN110987878B - 基于纳米孔阵列的等离子体尺传感器、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种基于纳米孔阵列的三明治结构等离子体尺传感器、制备方法及其在生物检测中的应用，属于材料科学技术领域。上层为贵金属纳米孔阵列、中间层为间隔层及蛋白层、下层为贵金属层。在该结构中，上层的贵金属纳米孔阵列能够与下层的贵金属层产生强烈的反对称等离子体耦合效应，耦合效应的强弱取决于间隔层的厚度。该检测器能够灵敏响应间隔层变化，其灵敏度达到61nm/nm。在降钙素原检测中，检测限可达11.9pg/mL。该方法制备操作简单，涉及检测仪器成本低廉，具有使用价值。本发明利用特殊的夹层结构设计取代传统检测器利用表面检测的特征，实现高准确度，高灵敏度，快速高效的检测目标。
Description
技术领域
本发明属于材料科学技术领域，具体涉及一种基于纳米孔阵列的三明治结构等离子体尺传感器、制备方法及其在生物检测中的应用。该传感器基于纳米孔阵列的特殊光学性质，能够在pg/mL量级对检测蛋白进行精准检测，从而实现在生物检测中的应用。
背景技术
表面等离子共振是指在电磁波的激发下，在金属表面发生的电子集体振荡行为。其振荡频率或强度对其周围的介电环境响应极其敏感的特性，使其具有优异的检测性能，广泛应用于蛋白质、核酸、污染物含量的精准测量[Stewart,M.E.et al.Nanostructuredplasmonic sensors.Chem.Rev.108,494-521(2008)]。贵金属纳米孔阵列是一种易于制备，性能优异的一类表面等离子体共振材料。相对于贵金属纳米粒子，该类材料具有更高的折射率灵敏度。这种高灵敏度来自于纳米孔阵列本身特殊的光学性质。在实际血清标记物的诊断中，纳米孔阵列材料也展现出很好的检测能力[Blanchard-Dionne,A.-P.&Meunier,M.Sensing with periodic nanohole arrays.Adv.Opt.Photonics 9,891(2017)]。然而，对于目前存在的包括纳米孔阵列在内的表面等离子体检测材料，实现更高灵敏度、更简单的操作制备、更好的集成能力则是其目前所面临的挑战和发展趋势之一。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述缺点，本发明的目的是提供一种基于纳米孔阵列的三明治结构等离子体尺传感器、制备方法及其在生物检测中应用。
本发明结构特征在于贵金属纳米孔阵列/间隔层/金属层的夹层结构。其光学特征在于其反射谷在近红外波段，并能够依据其光学特性，进行蛋白质标记物含量的检测。本发明的核心思想是利用特殊的夹层结构设计取代传统检测器利用表面检测的特征，实现高准确度，高灵敏度，快速高效的检测目标。
本发明包括三明治结构的构筑、通过将贵金属纳米孔阵列转移至其他基底表面来实现夹层结构的构筑等操作。其具体操作为：预先制备贵金属/石英基底，随后将间隔层及蛋白层引入贵金属表面；最后，将贵金属纳米孔阵列盖在顶层。此制备过程操作相对简单，且所制备的三明治表面等离子体结构具有很好的结构完整性和稳定的光学特征。在该结构中，上层的贵金属纳米孔阵列能够与下层的贵金属层产生强烈的反对称等离子体耦合效应，耦合效应的强弱取决于间隔层的厚度。这也构成了该检测器能够用于蛋白标记物检测的基本原理，即对蛋白层厚度进行灵敏响应。其灵敏度达到61nm/nm。在降钙素原检测中，检测限可达11.9pg/mL。本发明利用了间隔层响应代替折射率灵敏度响应的策略，在不使用化学修饰下，以无标记的方式来实现高灵敏度的检测。
本发明所述的一种基于纳米孔阵列的三明治结构等离子体尺传感器的制备方法，如图1所示，其步骤如下：
(1)基底上贵金属层的制备：将基底依次置于正己烷、丙酮、无水乙醇、去离子水中分别超声2～3min，然后用去离子水充分清洗基底表面；再将基底放入清洗液(质量分数为98％浓硫酸和质量分数为30％过氧化氢的混合溶液，两者体积比为7：3)中于100℃加热1～2h，然后用去离子水清洗基底至无酸液残留；最后利用真空蒸镀的方法在清洗后的基底表面依次沉积2～5nm厚的铬(沉积速率0.01～0.03nm/s)和60～800nm贵金属(沉积速率0.05～0.2nm/s)，从而在基底上制备得到贵金属层；
(2)在步骤(1)得到的基底贵金属层表面旋涂浓度为1～3mg/mL的聚苯乙烯的甲苯溶液，聚苯乙烯分子量为20～30w；旋涂速度为2000～5000rpm，旋涂时间为50～80s，得到的聚苯乙烯间隔层的厚度为4～6nm；
(3)将步骤(2)得到的基底置于5～30μg/mL的抗体蛋白的溶液中进行孵育，孵育条件为4℃过夜；随后使用磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4)清洗基底3～5遍并浸泡于钝化液中30～60min；钝化液溶剂为磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4)，溶质为牛血清白蛋白(BSA)和Tris-HCl，钝化液中牛血清白蛋白(BSA)的浓度为50mg/mL，Tris-HCl的浓度为1毫摩尔/升；基底取出后用磷酸缓冲液清洗3～5遍后放入已知检测蛋白浓度的待测液体中30～60min；此过程中，检测蛋白与抗体蛋白特异性结合。基底再次取出后用TPBS溶液(溶质为Tween 20，溶剂为PBS，溶质的质量分数为0.05％)清洗5～8遍，再依次用磷酸缓冲液和去离子水冲洗，旋干；从而完成中间层(间隔层及蛋白层)的制备；
(4)贵金属纳米孔阵列的转移：将预先制备于石英基底表面的贵金属纳米孔阵列[贵金属纳米孔阵列属于常规制备技术，可由聚焦离子束刻蚀技术、电子束光刻技术、阳极氧化铝真空蒸镀技术、胶体晶体刻蚀技术等方法得到，参见Prasad A.et al.Biosensorsand Bioelectronics,130,185,(2019)]倾斜浸入HF溶液中，贵金属纳米孔阵列逐渐剥离至液体表面；用载玻片将贵金属纳米孔阵列捞起放入干净的水表面以去除残余的HF，然后再用载玻片将贵金属纳米孔阵列捞起后转入另外的干净水的表面；最后用步骤(3)得到的基底中间层朝上捞起贵金属纳米孔阵列，晾干后，得到基于纳米孔阵列的三明治结构等离子体尺传感器；
(5)使用反射光纤光谱仪检测步骤(4)得到的等离子体尺传感器，建立待测液体检测蛋白浓度与反射谷波长差值的关系曲线；然后再对未知检测蛋白浓度的待测溶液进行测量，把测得的反射谷波长差值数据代入上述关系曲线，计算得到待测液体的浓度。
反射谷波长差值是指在某一检测蛋白浓度(待测溶液中含有该浓度的检测蛋白)下，上述等离子体尺传感器由反射光纤光谱仪测得的反射谷位置与空白样(待测溶液中不含有检测蛋白)反射谷位置的差值；
步骤(1)中使用基底为石英基底、玻璃载玻片或单晶硅片。
步骤(1)中所述的贵金属为金或银；
步骤(3)中使用的抗体蛋白溶液，是将抗体溶于缓冲溶液后得到，缓冲溶液为0.05摩尔每升、pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液。抗体蛋白溶液可为炎症疾病检测中相关的降钙素原抗体(实施例)、C反应活性蛋白抗体；癌症相关的甲胎蛋白抗体、癌胚抗原抗体、前列腺特异性抗原抗体等；以及其他类型疾病相关的，如绒毛膜促性腺激素抗体、乙肝表面抗体等；相应的检测蛋白为降钙素原(实施例)、C反应活性蛋白；癌症相关的甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等；以及其他类型疾病相关的，如绒毛膜促性腺激素、乙肝表面抗原等。
步骤(4)中使用的HF溶液，质量分数为2％～10％。
步骤(4)中所述的贵金属为金或银，纳米孔阵列的周期为350～1000nm，孔径周期比为0.66～0.87；1，孔深为33～110nm。
步骤(4)中，也可以将浸入HF溶液中剥离后得到的金纳米孔阵列转移至纤维基底上进行长期储存。使用时，可以将纤维基底浸入水中实现金纳米孔阵列实现的剥离和转移。该操作可以大大提高实际应用场景下该检测器的使用简便性。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
1、本发明制备过程简单，通过浸入溶液的转移操作，就能够实现三明治结构的构筑。
2、本发明对夹层厚度具有极其灵敏的响应，在最优化条件下，可以实现厚度灵敏度为61nm/nm(即厚度变化1nm，光谱反射谷位置变化61nm)的光谱信号响应，大幅度超越了现有等离子体尺传感器的灵敏度。蛋白标记物的检测限低至11.9pg/mL
3、特殊的结构设计能够保证检测信号不受外界折射率变化的影响。完成检测的基底也可以长时间放置并不出现光谱变动。
4、本发明能够在不使用化学修饰下，以无标记的方式实现良好的血清检测效果，证明了其在复杂组分液体中的检测能力。其检测精准度能达到临床检测的需求。
5、本发明检测设备简单，易于操作。检测时间小于1.5h，能够实现快速即时检测。
本发明从制备到检测具有简便快速的特点。在实际血清标记物检测中展现了很好的精准度和稳定性。
附图说明
图1(a)：三明治结构等离子体尺传感器检测器的结构示意图；
图1(b)：三明治结构等离子体尺传感器的扫描电镜照片(插图为截面扫描电镜照片)；
图1(c)：贵金属纳米孔阵列从石英基底上剥离的过程示意图；完成剥离后，转移至干净的水表面去除残余HF。
图2：(a)当使用不同厚度的聚苯乙烯涂层为间隔层时，三明治结构等离子体尺传感器所展现的反射光谱。在1000nm以上处的反射谷对应了贵金属纳米孔阵列与底层贵金属层的反对称电磁耦合。该反射谷位置(波长)随着间隔层厚度的增加发生光谱蓝移。
图2：(b)反射谷位置(波长)与间隔层厚度的关系曲线；其中模拟的数据来自时域有限差分法(FDTD)模拟。图中指数型的曲线关系属于等离子体尺传感器的特征，此外，FDTD模拟的数据与理论数据基本吻合。其中，在6.8nm～13.1nm厚度范围区间内，传感器灵敏度达到61nm/nm。此图中涉及的等离子体尺传感器参数为：孔周期695nm，孔深度110nm，孔径470nm。
图3：(a)利用三明治结构等离子体尺传感器检测降钙素原浓度的标准曲线。该曲线通过将包被抗体的贵金属/石英基底浸泡入不同标准浓度的降钙素原溶液中，空白样即为浸泡在无降钙素原溶液中的样品；在转移贵金属纳米孔阵列后，统计其反射谷位置。在绘制标准曲线时，纵坐标为反射谷峰位减去空白样反射谷峰位，即Δλ。此图中涉及的等离子体尺传感器参数为：孔周期695nm，孔深度110nm，孔径470nm。
图3：(b)三明治结构等离子体尺传感器在血清中检测降钙素的检出值与临床给出的检出值的对比图。
图3：(c)三明治结构等离子体尺传感器在血清中检测降钙素的检出值与临床给出的检出值的相关性(统计学中的相关系数R2)曲线。其中，直线表明了函数y＝x。同时，R2值的计算基于y＝x函数而非拟合函数。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，而不是要以此对本发明进行限制。
实施例1：不同孔径金纳米孔阵列的制备
所用基底为石英基底，将石英基底依次置于正己烷、丙酮、无水乙醇、去离子水中超声3min。用去离子水充分清洗后，放入清洗液(质量分数为98％浓硫酸和质量分数为30％过氧化氢的混合溶液，两者体积比为7：3)中100℃加热1.5h。用去离子水清洗至无酸液残留。将5％(质量体积分数)的聚苯乙烯球溶液缓慢用注射器注入水面，注入的微球在水的表面发生紧密的组装，聚苯乙烯球直径为695nm。用上述清洗过的石英基底捞出紧密组装的聚苯乙烯微球，晾干。放入等离子体刻蚀机腔体中，使用氧气等离子体分别刻蚀90s、135s、180s(刻蚀气压为50mTorr，刻蚀温度10℃，刻蚀功率为RF为100W，ICP为100W)。最终聚苯乙烯微球直径分别被降至608nm、566nm和477nm。再使用真空蒸镀的方法垂直基底表面蒸镀110nm的金(沉积速率0.1nm/s)。最后，将基底泡入甲苯中超声1min以去除聚苯乙烯微球掩板。在石英基底上得到金纳米孔周期为695nm，孔径分别为611nm、553nm、470nm的金纳米孔阵列。此处最终微球孔径与聚苯乙烯模板轻微差异，来源于垂直蒸镀的误差。
实施例2：不同周期金纳米孔阵列的制备
基底清洗与聚苯乙烯球液面组装步骤与实施例1相同，但使用的聚苯乙烯球尺寸为938nm和573nm。将基底放入等离子体刻蚀机腔体中，使用氧气等离子体分别刻蚀225s和90s(刻蚀气压为50mTorr，刻蚀温度10℃，刻蚀功率为RF为100W，ICP为100W)，最终微球直径分别被降至627nm和472nm。再使用真空蒸镀的方法垂直基底表面蒸镀110nm的金(沉积速率0.1nm/s)。最后，将基底泡入甲苯中超声1min以去除聚苯乙烯微球掩板。得到金纳米孔周期为938nm和573nm，孔径分别为621nm和450nm的金纳米孔阵列。
实施例3：不同深度金纳米孔阵列的制备
基底清洗与聚苯乙烯球液面组装及等离子体刻蚀步骤与实施例1相同，使用真空蒸镀的方法垂直基底表面蒸镀30～100nm的金(沉积速率0.1nm/s)。最后，将基底泡入甲苯中超声1min以去除聚苯乙烯微球掩板。得到的金纳米孔深度为30～100nm的金纳米孔阵列。
实施例4：不同厚度聚苯乙烯间隔的等离子体尺传感器的制备
所用基底为石英基底，按照实施例1中进行清洗，利用真空蒸镀的方法在基底表面依次沉积3nm铬(沉积速率约0.02nm/s)和70nm金(沉积速率0.1nm/s)。随后，在其表面旋涂聚苯乙烯(PS)的甲苯溶液，旋涂浓度分别为2、3、5、7.5、10mg/mL，聚苯乙烯分子量为28w。旋涂条件为3000rpm。原子力显微镜测的聚苯乙烯厚度分别为6.8、13.1、18.4、30.8、47.2nm。将实施例1中得到的纳米孔阵列基底，倾斜浸入10％(质量分数)HF溶液中，使纳米孔阵列剥离至液体表面。用载玻片将金纳米孔阵列捞起放入干净的水表面以去除参与HF后，再转入另外的干净水的表面。最后用本实施例前面得到的基底捞起该金纳米孔阵列，用反射光纤光谱仪测得反射光谱，如图2所示。
实施例5：降钙素原抗体在金/石英基底上的包被
所用基底为石英基底，按照实施例1中进行清洗，利用真空蒸镀的方法在基底表面依次沉积3nm铬(沉积速率约0.02nm/s)和70nm金(沉积速率0.1nm/s)。随后，在其表面旋涂聚苯乙烯(PS)的甲苯溶液，旋涂浓度为2mg/mL，聚苯乙烯分子量为28w。旋涂条件为3000rpm、60s，最终旋涂层厚度为4nm。将降钙素原抗体配置成30μg/mL的碳酸盐缓冲溶液，并将上述得到的PS/金/石英基底放入孵育过夜，孵育温度为4℃。取出后，用PBS溶液清洗3遍。将得到的基底浸泡于钝化液中60min；钝化液溶剂为PBS，溶质为50mg/mL BSA和1毫摩尔每升Tris-HCl。用PBS清洗3次后分别浸泡入降钙素原标准溶液(用于绘制标准曲线)、空白溶液(不含降钙素原)及待测溶液中(含有降钙素原的血清，本实施例是测量血清中降钙素原的浓度)。持续30分钟后取出，用TPBS清洗6遍。最后用PBS和去离子水冲洗，旋干。
实施例6：降钙素原的检测
将实施例1中得到的纳米孔阵列基底，倾斜浸入10％(质量分数)HF溶液中，使纳米孔阵列剥离至液体表面。用载玻片将金纳米孔阵列捞起放入干净的水表面以去除参与HF后，再转入另外的干净水的表面。最后用实施例5中得到的基底捞起金纳米孔阵列。晾干后，即可使用反射光纤光谱仪(DT 1000CE光源，海洋光学)获取光学检测信号。根据其反射谷位置与空白样反射谷位置差值，绘制降钙素原浓度-反射谷波长差值标准曲线，如图3a所示。同时将血清样品的反射谷位置与空白样反射谷位置差值代入该标准曲线，可计算得出血清中降钙素原的浓度(血清由吉林大学中日联谊医院提供，经患者知情同意和伦理委员会批准)。通过等离子体尺传感器检测器得到的检测数据与临床给出的检测进行对比，即图3b、图3c所示，两者并无显著差异。其中，临床检测方法为上转换发光免疫层析技术。
Claims (10)
1.一种基于纳米孔阵列的等离子体尺传感器的制备方法，其步骤如下：
(1)基底上贵金属层的制备：将基底依次置于正己烷、丙酮、无水乙醇、去离子水中分别超声2～3min，然后用去离子水充分清洗基底表面；再将基底放入清洗液中于100℃加热1～2h，然后用去离子水清洗基底至无酸液残留；最后利用真空蒸镀的方法在清洗后的基底表面依次沉积2～5nm厚的铬和60～800nm贵金属，从而在基底上制备得到贵金属层；
(2)在步骤(1)得到的基底贵金属层表面旋涂浓度为1～3mg/mL的聚苯乙烯的甲苯溶液，聚苯乙烯分子量为20～30w；旋涂速度为2000～5000rpm，旋涂时间为50～80s，得到的聚苯乙烯间隔层的厚度为4～6nm；
(3)将步骤(2)得到的基底置于5～30μg/mL的抗体蛋白的溶液中进行孵育，孵育条件为4℃过夜；随后使用磷酸缓冲液清洗基底3～5遍并浸泡于钝化液中30～60min；钝化液溶剂为磷酸缓冲液，溶质为牛血清白蛋白和Tris-HCl，钝化液中牛血清白蛋白的浓度为50mg/mL，Tris-HCl的浓度为1毫摩尔/升；基底取出后用磷酸缓冲液清洗3～5遍后放入已知检测蛋白浓度的待测液体中30～60min；此过程中，检测蛋白与抗体蛋白特异性结合；基底再次取出后用TPBS溶液清洗5～8遍，再依次用磷酸缓冲液和去离子水冲洗，旋干；TPBS溶液的溶质为Tween 20，溶剂为PBS，溶质的质量分数为0.05％；从而完成中间层的制备；
(4)贵金属纳米孔阵列的转移：将预先制备于石英基底表面的贵金属纳米孔阵列倾斜浸入HF溶液中，贵金属纳米孔阵列逐渐剥离至液体表面；用载玻片将贵金属纳米孔阵列捞起放入干净的水表面以去除残余的HF，然后再用载玻片将贵金属纳米孔阵列捞起后转入另外的干净水的表面；最后用步骤(3)得到的基底中间层朝上捞起贵金属纳米孔阵列，晾干后，得到基于纳米孔阵列的三明治结构等离子体尺传感器；
(5)使用反射光纤光谱仪检测步骤(4)得到的等离子体尺传感器，建立待测液体检测蛋白浓度与反射谷波长差值的关系曲线；然后再对未知检测蛋白浓度的待测溶液进行测量，把测得的反射谷波长差值数据代入上述关系曲线，计算得到待测液体的浓度；
其中，反射谷波长差值是指在某一检测蛋白浓度下，上述等离子体尺传感器由反射光纤光谱仪测得的反射谷位置与空白样反射谷位置的差值。
2.如权利要求1所述的一种基于纳米孔阵列的等离子体尺传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中使用基底为石英基底、玻璃载玻片或单晶硅片。
3.如权利要求1所述的一种基于纳米孔阵列的等离子体尺传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的贵金属为金或银。
4.如权利要求1所述的一种基于纳米孔阵列的等离子体尺传感器的制备方法，其特征在于：步骤(3)中使用的抗体蛋白溶液，是将抗体蛋白溶于缓冲溶液后得到，缓冲溶液为0.05摩尔每升、pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液。
5.如权利要求4所述的一种基于纳米孔阵列的等离子体尺传感器的制备方法，其特征在于：抗体蛋白为降钙素原抗体、C反应活性蛋白抗体、甲胎蛋白抗体、癌胚抗原抗体、前列腺特异性抗原抗体、绒毛膜促性腺激素抗体或乙肝表面抗体；与上述抗体蛋白特异性结合的检测蛋白为降钙素原、C反应活性蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、绒毛膜促性腺激素或乙肝表面抗原。
6.如权利要求4所述的一种基于纳米孔阵列的等离子体尺传感器的制备方法，其特征在于：步骤(4)中使用的HF溶液的质量分数为2％～10％。
7.如权利要求4所述的一种基于纳米孔阵列的等离子体尺传感器的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的贵金属为金或银，纳米孔阵列的周期为350～1000nm，孔径周期比为0.66～0.87；孔深为33～110nm。
8.如权利要求4所述的一种基于纳米孔阵列的等离子体尺传感器的制备方法，其特征在于：步骤(4)中可以将浸入HF溶液中剥离后得到的金纳米孔阵列转移至纤维基底上进行长期储存；使用时，将纤维基底浸入水中实现金纳米孔阵列实现的剥离和转移。
9.一种基于纳米孔阵列的等离子体尺传感器，其特征在于：是由权利要求1～8任何一项所述的方法制备得到。
10.权利要求9所述的基于纳米孔阵列的等离子体尺传感器在生物检测中的应用。
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