CN110982796A

CN110982796A - 一种ama合成酶及其在合成ama或其衍生物中的应用

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Publication number: CN110982796A
Application number: CN201911135070.7A
Authority: CN
Inventors: 雷晓光; 郭倩倩; 高磊
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-11-19
Also published as: CN110982796B

Abstract

本发明提供了一种AMA合成酶及其在合成AMA或其衍生物中的应用，属于基因工程技术领域。本发明所述的AMA合成酶基因序列如SEQ ID No.2所示，其编码蛋白序列如SEQ ID No.1所示。本发明发现来源于真菌的AMA合成酶能够低成本且高效地将O‑乙酰丝氨酸或O‑磷酸丝氨酸作为底物与天然氨基酸反应，生成Toxin A或其衍生物以及进一步催化Toxin A或其衍生物生成AMA和/或AMA衍生物中的任一种。本发明提供的AMA合成酶在抗生素佐剂制备领域具有广阔的应用前景。

Description

一种AMA合成酶及其在合成AMA或其衍生物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种来源于米曲霉的AMA合成酶及其在合成AMA或其衍生物中的应用。

背景技术

AMA是一种能由米曲霉、黄曲霉、杂色曲霉等多种丝状真菌分泌的植物毒素。最早在1958年，AMA被发现能够敖合Fe²⁺而使马铃薯、柳树、大麦等患萎蔫病，进而引起植物凋零。

二十世纪七十年代，人们发现AMA是一种良好的金属螯合剂，能够抑制包括能够血管紧张素转化酶、氨肽酶、羧肽酶在内的多种金属蛋白酶的活性，并且具有较低的体内毒性(LD50＝250mg/kg)。

2014年，Wright和其合作者报道了在从环境微生物获得的溶于DMSO的大量天然产物提取物中对NDM-1的天然抑制剂所做的一个筛选，其中的一种提取物(来自A.versicolor)表现出特别强的抗NDM-1活性，被识别出是aspergillomarasmine A(AMA)。发现AMA能够鳌合NDM-I活性中心的Zn²⁺,可与美罗培南联合用药从而恢复多药耐药革兰氏阴性菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性。AMA在体外和体内都能完全恢复针对拥有VIM-型或NDM-型抗性基因的细菌病原体的抗菌功效，AMA是无毒且能被很好耐受的。

耐药菌的出现以及快速蔓延趋势给全世界人民的身体健康都带来了极大的威胁。所以人们对新型抗生素的需求，对解决细菌耐药性的需求也变得越来越迫切。这不仅是为了保证人类能够继续治愈感染性疾病，同时也是为了确保器官移植、化疗、手术等医疗操作手段得以继续安全实施的前提条件，因为这些医疗手段都会增加患者被细菌感染的风险和几率。因此，AMA在降低细菌耐药性方面的独特功能，使得AMA有望成为一种抗生素佐剂应用于临床医学领域，造福人类。

然而现阶段AMA的制备主要通过化学合成的方法来实现，操作步骤繁琐、反应条件剧烈、分离纯化困难，且无法实现克级以上的生产，给临床前研究带来了巨大的挑战。例如2016年，Wright课题组和本申请的申请人分别用aziridine opening(7步，3.8％)和Latestage oxidation(11步，收率为7.3％)完成了AMA的首次全合成及立体构型修正。之后Wright课题组和申请人分别用sulfamidate strategy(5步骤，收率为19％)和Mitsunobureaction(6步骤，收率为28％)对AMA的全合成路线进行了优化。即便如此，化学合成需要严苛的反应条件，繁琐的操作步骤，以及表现出的环境不友好性，难以在短时间内获得大量的天然产物，无法满足产业化需求。目前除了从培养基中分离以及化学合成的方法，没有其他获得AMA的手段，大大限制了其临床应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、合成AMA的节能环保方法，以克服现有技术的不足。本发明首先提供一种效果优良的AMA合成酶，利用该AMA合成酶可以低成本、高效率合成AMA及其衍生物。

第一方面，本发明提供了一种新的AMA合成酶，其来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)具有：

1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸的序列与SEQ ID No.1同源性为80％、85％、90％、95％、98％、99％，且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

所述氨基酸的缺失是指例如30个氨基酸以内、较好是10个氨基酸以内的缺失。此外，数个氨基酸的取代是指例如25个氨基酸以内、较好是10个氨基酸以内的取代。另外，所述氨基酸的增加是指例如40个氨基酸以内、较好是20个氨基酸以内的增加。即使是具有这些改变的情况下，也必须分别具有活性。

本发明提供了编码所述AMA合成酶的基因，其具有：

1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供一种上述AMA合成酶的突变体，其为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第234的R突变为A；或第84位的Y突变为S,或第85位的S突变为T，或第145位的G突变为R，或第237位A突变为R。

上述突变体R234A相较于野生型AMA合成酶(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)能够进一步扩大底物识别谱，例如突变体R234A能够识别野生型AMA合成酶不能识别的底物赖氨酸、精氨酸、甲胺、乙胺、乙醇胺、环己胺、苯甲胺。上述突变体Y84S、S85T、G145R、A237R对酶的催化活性有影响，主要表现在这四种突变体均不同程度地降低酶的活性，即它们具备AMA合成酶的催化能力，但突变后的酶不如野生型AMA合成酶的催化AMA合成反应的活力强。

本发明还提供了含有上述AMA合成酶编码基因或所述突变体编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒、载体、微生物、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞。

对于微生物，例如使用大肠杆菌的情况下，可以使用BL21(DE3)。

第三方面，本发明提供了所述AMA合成酶或其编码基因或上述的突变体或含有其编码基因的生物材料在催化合成Toxin A或其衍生物中的应用。

本发明提供了所述AMA合成酶或其编码基因或上述的突变体或含有其编码基因的生物材料在提高Toxin A或其衍生物产量中的应用。

本发明提供了所述AMA合成酶或其编码基因或上述的突变体或含有其编码基因的生物材料在催化合成AMA或其衍生物。

本发明提供了所述AMA合成酶或其编码基因或上述的突变体或含有其编码基因的生物材料在提高AMA或其衍生物产量中的应用。

使用微生物作为宿主的情况下，只要可以稳定地保持在菌体内，作为载体可以使用市售的任一种质粒。例如，使用大肠杆菌作为宿主的情况下，较好是使用pET29a等质粒。

通过将克隆了的基因(DNA片段)连接于特定的启动子序列的下游，可以大量地生产本发明的AMA和Toxin A。例如，pET29a具有可表达诱导的T7启动子，通过在培养的中途将异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加入培养基，可以生产作为目标的AMA和Toxin A。

转化体的培养通过通常的方法实施。即，若以属于芽孢杆菌属或大肠杆菌类的细菌为例进行说明，则培养基可以使用肉汤培养基、LB培养基(1％胰胨、0.5％酵母提取物、食盐)或MYT培养基(1.6％胰胨、酵母提取物、0.5％食盐)等，可以在该培养基中接种种菌后，在

下根据需要一边搅拌一边培养

小时，将得到的培养液离心分离，回收微生物菌体。

可以将上述微生物菌体通过机械破坏(采用旋转搅拌机、弗氏压碎器、匀浆器、研钵等)、冻结溶解、自我消化、干燥(采用冷冻干燥、风干等)、酶处理(采用溶菌酶等)、超声波处理、化学处理(采用酸、碱处理等)等公知的方法进行破碎，把得到的菌体的破碎物或者菌体的细胞壁或细胞膜的变性物等菌体处理物用作本发明的AMA和Toxin A的粗酶液。

此外，也可以根据情况从上述菌体处理物中通过通常的酶纯化方法(盐析处理、等电点沉淀处理、有机溶剂沉淀处理、透析处理、各种层析法处理等)纯化具有PNDK活性的组分，制成部分纯化酶或纯化酶使用。

添加于反应体系中的各酶只要具有所需的活性，可以是任意的形态，具体可以示例微生物的菌体(包括转化体)、该菌体的处理物或由该处理物得到的酶等。微生物的菌体的调制可以通过使用该微生物可生长的培养基，以通常的方法培养后以离心分离等收集菌体的方法来实施。若具体以属于芽孢杆菌属或大肠杆菌类的细菌为例进行说明，则培养基可以使用肉汤培养基、LB培养基(1％胰胨、0.5％酵母提取物、食盐)或2×YT培养基(1.6％胰胨、酵母提取物、0.5％食盐)等，可以在该培养基中接种种菌后，在

下根据需要一边搅拌一边培养

小时，将得到的培养液离心分离，回收微生物菌体。

第四方面，本发明提供一种催化合成AMA和/或其衍生物的方法，以A和B化合物为初始反应物，所述A为丝氨酸供体，优选为氧乙酰丝氨酸和/或氧磷酸丝氨酸；所述B为天然氨基酸和/或其对映异构体和/或普通胺类化合物；以本发明所述的AMA合成酶或本发明所述的突变体或含有AMA合成酶或所述突变体的编码基因的生物材料为催化剂，进行反应合成AMA和/或其衍生物。

所述丝氨酸供体，优选为氧乙酰丝氨酸和/或氧磷酸丝氨酸。

所述天然氨基酸为L-氨基酸或其对应的D构型的氨基酸；优选除碱性L-氨基酸外的L-氨基酸，具体为包括脂肪族的L-氨基酸例如L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸；羟基L-氨基酸例如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状的L-氨基酸例如L-脯氨酸；芳香族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸和L-组氨酸；含硫的L-氨基酸例如L-半胱氨酸、胱氨酸和L-甲硫氨酸；和酸性L-氨基酸和它们的酰胺例如L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。

对于本发明上述的催化合成AMA和/或其衍生物的方法，如果化合物A是化合物B的两个或两个以上的当量，则催化反应的终产物只有AMA，如果化合物A和B是相等量的当量，则终产物既有AMA，也有ToxinA。本领域技术人员可以根据对目标产物的要求，在合理的用量范围内进行调控，以期获得需要的目标物。

本发明意外地发现AMA酶突变体R234A的适应底物除了野生型AMA酶能够识别的底物外，还能进一步拓展识别底物的范围，包括赖氨酸、精氨酸、甲胺、乙胺、环己胺、乙醇胺、苯甲胺。该突变体R234A能够以前述的底物中任一或多个与丝氨酸供体作为共同出发反应物，用于催化合成相关化合物。前述的AMA酶突变体R234A是指如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第234的R突变为A。

因此，本发明进一步地提供了AMA酶突变体R234A在识别底物催化相关反应中的应用，所述的底物包括赖氨酸、精氨酸、甲胺、乙胺、环己胺、乙醇胺、苯甲胺中的一种或多种，所述AMA酶突变体是如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第234的R突变为A。

本发明提供的催化合成AMA和/或其衍生物的方法中，所述O-磷酸丝氨酸/O-乙酰丝氨酸在反应体系中的初始浓度为

优选

所述L-氨基酸在反应体系中的初始浓度为

优选

进一步地，本发明酶的适宜反应条件为pH值

温度为15℃-35℃，优选25℃，一边搅拌一边反应

小时，合成AMA和/或其衍生物。

本发明的有益效果在于，本发明利用生物合成的方法，通过体外酶学手段以商业可得的氨基酸底物作为原料通过体外酶学手段获得大量的AMA，具有很高的原子经济性和环境友好性，解决了现有技术中AMA无法被大量制备的问题，除此之外，AMA合成酶具有很好的底物容忍性，能够在体外催化生成个一系列AMA和ToxinA的衍生物。例如在本发明实施例中，AMA合成酶用大肠杆杆菌表达，从1L大肠杆菌中可以纯化得到50mgAMA合成酶，表达量很高，易于纯化。用AMA合成酶催化的方法，AMA的核磁收率可以达到81％。远远优于现有的最好的化学合成路线的收率(6步骤，28％，且酶学方法反应条件温和，操作简单，绿色环保，可大量制备。

本发明提供的AMA合成酶来自米曲霉(Aspergillus oryzae)，本发明还意外发现了具有生物学活性的前述AMA合成酶的突变体，本发明的AMA合成酶及其突变体具有广谱的底物适应性，温度在15℃-30℃范围内，弱酸弱碱条件下(pH6-8)，AMA合成酶其突变体均表现良好的催化活性，能够低成本且高效地将底物催化生成Toxin A或其衍生物以及进一步催化Toxin A或其衍生物生成AMA和/或AMA衍生物中的任一种。其酶学催化的反应通式见图1本发明提供的AMA合成酶在抗生素佐剂制备领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的AMA合成酶催化底物的酶学催化反应通式。

图2为实施例2的AMA合成酶的表达纯化的SDS-PAGE电泳图。

图3为AMA合成酶催化OPS/OAS和L-天冬氨酸的反应过程图。

图4为实施例3的UPLC检测结果图。4.11min处对应的峰是Fmoc-AMA，4.29min处对应的峰是Fmoc-ToxinA。

图5从左到右分别为不同温度对AMA合成酶活性的影响结果图、不同pH对AMA合成酶酶活的影响结果图、不同二价金属离子对AMA合成酶酶活的影响结果图。

图6为从酶学体系分离出的Fmoc-AMA的NMR H谱。

图7为AMA合成酶催化OAS/OPS与D-天冬氨酸的反应过程图。

图8为AMA合成酶催化OAS/OPS与D-天冬氨酸反应的UPLC检测图。

图9为AMA合成酶催化OAS/OPS与D-天冬氨酸反应生成(S,S,R)-AMA的MS检测图。

图10为AMA合成酶催化OAS/OPS与D-天冬氨酸反应生成(S,R)-ToxinA的MS检测图。

图11为AMA合成酶催化OAS/OPS与甘氨酸的反应过程图。

图12为AMA合成酶催化OAS/OPS与甘氨酸的反应的UPLC检测结果图。

图13为AMA合成酶催化OAS/OPS与甘氨酸的反应的终产物的MS检测结果图。

图14为AMA合成酶催化OAS/OPS与甘氨酸的反应的中间体的MS检测结果图。

图15为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-丙氨酸的反应过程图。

图16为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-丙氨酸的UPLC检测结果图。

图17为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-丙氨酸的反应终产物的质谱检测结果图。

图18为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-丙氨酸的反应中间体的质谱检测结果图。

图19为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-丝氨酸的反应过程图。

图20为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-丝氨酸反应的终产物的质谱检测结果见图20。

图21为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-丝氨酸中间体的质谱检测结果图。

图22为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-苏氨酸的反应过程图。

图23为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-苏氨酸反应的终产物的MS检测图。

图24为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-苏氨酸反应的中间体的MS检测图。

图25为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-脯氨酸的反应过程图。

图26为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-脯氨酸反应的终产物的MS检测图。

图27为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-脯氨酸反应的中间体的MS检测图。

图28为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-半胱氨酸的反应过程图。

图29为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-半胱氨酸的UPLC检测结果图。

图30为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-半胱氨酸终产物的质谱检测结果图。

图31为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-半胱氨酸的中间体的质谱检测结果图。

图32为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和D-丙氨酸的反应过程图。

图33为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和D-丙氨酸反应的终产物的质谱检测结果图。

图34为AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和D-丙氨酸反应的中间体的质谱检测结果图。

图35为R234A可以催化生成(S)-2-氨基-3-(甲胺基)丙酸、(S)-2-氨基-3-(环己胺基)丙酸等的化合物。

图36为R234A催化OPS与L-赖氨酸的反应过程图。

图37为R234A催化OPS与L-赖氨酸的UPLC检测结果图。

图38为R234A催化OPS与L-赖氨酸的质谱检测结果图。

图39为R234A催化OPS与L-精氨酸的反应过程图。

图40为R234A催化OPS与L-精氨酸的反应UPLC检测结果图。

图41为R234A催化OPS与L-精氨酸反应的质谱检测结果图。

图42为R234A催化OPS与甲胺的反应过程图。

图43为R234A催化OPS与甲胺反应的UPLC检测结果图。

图44为R234A催化OPS与甲胺反应的质谱检测结果图。

图45为R234A催化OPS与乙胺的反应过程图。

图46为R234A催化OPS与乙胺的反应UPLC检测结果图。

图47为R234A催化OPS与乙胺的反应质谱检测结果图。

图48为R234A催化OPS与环己胺的反应过程图。

图49为R234A催化OPS与环己胺的反应的UPLC检测结果图。

图50为R234A催化OPS与环己胺的反应的质谱检测结果图。

图51为R234A催化OPS与乙醇胺的反应过程图。

图52为R234A催化OPS与乙醇胺反应的UPLC检测结果图。

图53为R234A催化OPS与乙醇胺反应的质谱检测结果图。

图54为R234A催化OPS与苯甲胺的反应过程图。

图55为R234A催化OPS与苯甲胺反应的UPLC检测结果图。

图56为R234A催化OPS与苯甲胺反应的MS检测结果图。

图57为AMA合成酶突变体以OAS和ToxinA为底物的活性评价。

图58为AMA合成酶突变体以OPS和ToxinA为底物的活性评价。

图59为ToxinA的化学合成方法。

具体实施方式

以下实施例对本发明进行详细且具体的说明，但应理解本发明并不限定于以下的例子。此外，实施例中的DNA的调制、采用限制性酶的剪切、采用T4DNA连接酶的DNA连接以及大肠杆菌的转化方法全部按照《分子克隆实验室手册》第二版(“Molecular Cloning,aLaboratory Manual,Second Edition")(Maniatis Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989))实施。此外，反应液中的氨基酸类的定量通过UPLC法实施。具体来说，分离使用Waters公司制的BEH-C18柱，洗脱液使用乙腈和水(含0.1％甲酸)梯度洗脱。

不同pH值的缓冲液配置方法如下：

pH4-6 100mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液

pH 6-8 100mM Tris-HCl缓冲液

pH 8-9 100mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液

若未说明，以下实施例所用的试剂、原料均为市售可得。

实施例1 AMA合成酶基因的克隆

RNA提取：米曲霉菌种A.oryzae 3.9544的冻干粉用无菌0.8M NaCl复溶后，用PDA培养基培养三天，用0.8M NaCl收集孢子。孢子液接种于100mlCD液体培养基，孢子浓度为2×10⁸/ml，之后30℃，220rpm摇动培养。两周后，用天根生化有限公司的植物总RNA提取试剂盒提取米曲霉RNA。

cDNA制备：提取的RNA用DNAase 37℃处理半个小时后，用RNA纯化试剂盒进行纯化，用nanodrop测定回收浓度。用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNASynthesisKit逆转得到cDNA。

AMA合成酶基因序列的扩增：

引物序列：Pet29a-AMA合成酶-F:GGGAATTCCATATGGCCAATCTCAATGAACG

Pet29a-AMA合成酶-R:CCCAAGCTTATTAGTCGATACGGACAGTT

PCR反应体系(50μl体系)：

95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

各基因扩增后，对PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳并纯化各DNA片段。将该DNA与用限制性酶NdeI，HindIII消化了的Pet29a空载质粒连接。

连接方法如下：用Vazyme同源重组酶构建Pet29a-AMA合成酶质粒，10μl连接体系包括：1μl酶，2μl 5×CE buffer，3μl线性化载体，4μl PCR产物。

使用连接反应液转化大肠杆菌DH5α菌，从得到的卡那霉素抗性转化体分离质粒pET29a-AMA合成酶。

质粒pET29a-AMA合成酶为承载来源于米曲霉的含AMA合成酶基因的DNA片段的质粒。分析克隆的基因的碱基序列的结果为，该菌AMA合成酶基因是SEQ ID NO.2中所示的DNA碱基序列。该DNA碱基序列翻译成氨基酸序列的结果为，该菌AMA合成酶基因是SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列。

实施例2 AMA合成酶的表达纯化方法

将大肠杆菌BL21(DE3)株以pET29a-AMA合成酶转化，将得到的转化体接种到液体LB培养基培养，之后取20mL转接到1L含有50μg/ml的卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm摇动培养直至菌液OD为0.8～1.0，16℃冷却1h后，加终浓度为0.5mM的IPTG诱导18-20h。培养结束后，通过离心分离(5000Xg，40分钟)回收菌体，用裂解缓冲液(50mM Tris,500mMNaCl，pH7.4)重悬菌体。进行超声波处理，破碎菌体(500W，30％的功率超声5s,停5s，共破碎1h)。再通过离心分离(15000rpm,1h),除去菌体残渣，收集上清并用0.22μm的滤膜过滤为粗酶液。镍柱用裂解缓冲液平衡5个柱体积，之后蛋白液以5ml/min的流速缓慢穿过镍柱。用含有30mM,40mM,50mM,60mM,70mM咪唑的缓冲液冲洗杂蛋白，之后用含有300mM咪唑的裂解缓冲液洗脱目的蛋白。洗脱下的目的蛋白由于结合了磷酸吡哆醛而呈现明亮的黄色。收集蛋白洗脱液并用10KD的超滤管浓缩蛋白至10mg/ml。AMA合成酶在大肠杆菌中的表达量高达50-60mg/L。取10μl蛋白液加入5×蛋白上样缓冲液100℃加热10min，进行10％的聚丙烯酰胺电泳检测，考马斯亮蓝染色。蛋白条带大小为57KD。纯化结果见图2。

实施例3 AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸(OPS)/氧乙酰丝氨酸(OAS)和L-天冬氨酸的反应

采用实施例2获得的AMA合成酶。AMA合成酶催化OPS/OAS和L-天冬氨酸的反应过程见图3。

如下所述测定AMA合成酶活性：20μM AMA合成酶,10mM氧磷酸丝氨酸/氧乙酰丝氨酸。10mM L-天冬氨酸钾，1mM PLP,2mM TCEP。室温反应16h。检测方法：取50μl上述反应液，加入50μl 100mM Fmoc-NHS，50μl 0.2M硼酸(pH10.0),50μl乙腈，反应6h后，用50μl甲醇淬灭反应。0.22μm滤膜过滤后，用以下液相方法进行UPLC-MS检测:0-0.3min:5％乙腈，95％水(含0.1％甲酸)；0.3-4min:乙腈浓度梯度升高到50％，水相浓度梯度降低到50％；4-7min：乙腈浓度梯度升高到95％，水相浓度梯度降低到5％。7-9min:100％乙腈。在相同底物浓度下，OPS与L-Asp在酶的催化下终产物只有AMA，而OAS与L-Asp在酶的催化下终产物有ToxinA和AMA，也反映了OPS是AMA合成酶的最适底物。UPLC检测结果显示见图4。

实施例4 AMA合成酶热稳定性和酸碱稳定性评价及二价金属离子的影响

采用实施例2获得的AMA合成酶。

热稳定性研究：100μl反应体系包括：20μM AMA合成酶，10mM氧磷酸-L-丝氨酸，5mMToxinA,1mM PLP。将反应温度分别替换为15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃。每个样品设置三个平行，以ToxinA的转化率评价酶活，转化率最高的温度即为该酶的最适温度。温度在15℃-30℃范围内，AMA合成酶均表现良好的催化活性。

酸碱稳定性研究：反应体系如上，反应缓冲液分别替换为pH 4-9,间隔为0.5。每个样品设置三个平行，以ToxinA的转化率评价酶活，转化率最高的温度即为该酶的最适温度。在pH6-8的范围内，AMA合成酶均表现良好的催化活性。

不同二价金属离子对酶活的影响：反应体系如上，体系中分别加入终浓度为5mM的二价金属离子，每个样品设置三个平行，以ToxinA的转化率评价酶活。结果表明AMA合成酶是非金属依赖的酶，且体系中添加Cu²⁺,Co²⁺,Ni²⁺会明显降低酶的活性。结果见图5。

实施例5 AMA的体外酶学法大量制备方法

采用实施例2获得的AMA合成酶。称取L-ASP-K固体17.19mg(0.1mmol，1.0equiv)和OPS固体18.50mg(0.5mmol，5.0equiv)于15mL反应管中，加入2mL Na₂HPO₄-NaOH(20mM)缓冲溶液使其溶解，调节反应液pH值至7.5，而后加入刚纯化的AMA合成酶(0.2mol％)，而后使用Na2HPO4-NaOH(20mM)缓冲溶液定容至5mL，置于20℃反应24小时。反应完成后，将反应液置于70℃加热5min使蛋白变性析出，而后10000rpm离心，取0.5mL上清液冻干，而后加入DMSO内标，氘水溶解得AMA核磁收率84％。结果见图6。

实施例6 AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和D-天冬氨酸的反应

采用实施例2的方法获得AMA合成酶。底物为OPS和D-天冬氨酸，底物浓度、反应条件及检测方法均同实施例4。反应通式见图7，UPLC检测结果见图8，(S,S,R)-AMA的质谱分析结果见图9，(S,R)-ToxinA的质谱分析结果见图10。(S,S,R)-AMA的核磁收率分别是21％。

实施例7 AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和甘氨酸的反应

采用实施例2获得的AMA合成酶。底物为氧磷酸丝氨酸和甘氨酸，底物浓度、反应条件及检测方法均同实施例3。反应方程式见图11。反应体系中中间体和终产物都有很好的质谱响应信号。UPLC检测结果见图12，终产物的MS检测结果见图13，中间体的MS检测结果见图14。能检测到大量的(S)-2-氨基-3-((S)-1-羧基-2-((羧甲基)氨基)乙基)氨基)丙酸(核磁收率为56％)和少量的中间体。

实施例8 AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-丙氨酸的反应

采用实施例2获得的AMA合成酶。底物为OPS和L-丙氨酸，底物浓度、反应条件及检测方法均同实施例3。反应体系中中间体和终产物都有很好的质谱响应信号。反应方程式见图15，UPLC检测结果见图16，终产物的质谱检测结果见图17，中间体的质谱检测结果见图18。能检测到大量的终产物和少量的中间体。

实施例9 AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-丝氨酸的反应

采用实施例2获得的AMA合成酶。底物为OPS和L-丝氨酸，底物浓度、反应条件及检测方法均同实施例3。反应体系中中间体和终产物都有很好的质谱响应信号。反应方程式见图19，终产物的质谱检测结果见图20，中间体的质谱检测结果见图21。能检测到大量的终产物(核磁产率为33％)和少量的中间体。

实施例10 AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-苏氨酸的反应

采用实施例2获得的AMA合成酶。底物为OPS和L-苏氨酸，底物浓度、反应条件及检测方法均同实施例3。反应体系中中间体和终产物都有很好的质谱响应信号。反应方程式见图22，终产物的质谱检测结果见图23，中间体的质谱检测结果见图24。

实施例11 AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-脯氨酸的反应

采用实施例2获得的AMA合成酶。底物为OPS和L-脯氨酸，底物浓度、反应条件及检测方法均同实施例3。反应体系中中间体和终产物都有很好的质谱响应信号。反应方程式见图25，终产物的质谱检测结果见图26，中间体的质谱检测结果见图27。

实施例12 AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和L-半胱氨酸的反应

采用实施例2获得的AMA合成酶。底物为OPS和L-半胱氨酸，底物浓度、反应条件及检测方法均同实施例3。反应体系中中间体和终产物都有很好的质谱响应信号。反应方程式见图28，UPLC检测结果见图29，终产物的质谱检测结果见图30，中间体的质谱检测结果见图31。

实施例13 AMA合成酶催化氧磷酸丝氨酸和D-丙氨酸的反应

采用实施例2获得的AMA合成酶。底物为OPS和D-丙氨酸，底物浓度、反应条件及检测方法均同实施例3。反应体系中中间体和终产物都有很好的质谱响应信号。反应方程式见图32，终产物的质谱检测结果见图33(核磁收率为15％)，中间体的质谱检测结果见图34。

实施例14 AMA合成酶的突变体R234A的表达与纯化

以构建好的AMA合成酶表达质粒为模板，分别用P1/P2,P3/P4为引物扩增相应DNA片段，用Overlap的方法构建R234A的表达的质粒。所用引物序列如下：

Pet29a-Ao336-R234A-P1 gaaggagatatacatatgGCCAATCTCAATGAACGCAATG

Pet29a-Ao336-R234A-P2 CAAGGCGAACGAGGCTGGGCCCGGAACACGATCGCCAG

Pet29a-Ao336-R234A-P3 GTGTTCCGGGCCCAGCCTCGTTCGCCTTGATGAAACCCG

Pet29a-Ao336-R234A-P4 gagtgcggccgcaagcttATTAGTCGATACGGACAGTT

AMA合成酶突变体R234A的表达纯化方法同AMA合成酶的表达纯化方法。

实施例15 AMA合成酶突变体R234A的底物识别谱及活性检测

R234A可以进一步扩大AMA合成酶的底物识别谱，能够催化OPS与其他胺类物质反应，生成以下新的化合物，详见图35。

100μl反应体系包括20μM R234A,10mM氧磷酸丝氨酸，5mM赖氨酸、精氨酸、甲胺、乙胺、环己胺、乙醇胺、苯甲胺，1mM PLP。反应温度25℃，反应缓冲液为100mM磷酸钠(pH6.0)。衍生及检测方法同实施例3。

实施例16 R234A催化OPS与L-赖氨酸的反应

R234A的获得方法见实施例10。底物为OPS和L-赖氨酸，底物浓度，反应条件检测方法均同实施例11。反应式见图36，UPLC检测结果见图37，质谱检测结果见图38。

实施例17 R234A催化OPS与L-精氨酸的反应

R234A的获得方法见实施例10。底物为OPS和L-精氨酸，底物浓度，反应条件检测方法均同实施例11。反应式见图39，UPLC检测结果见图40，质谱检测结果见图41。

实施例18 R234A催化OPS与甲胺的反应

R234A的获得方法见实施例10。底物为OPS和甲胺，底物浓度，反应条件检测方法均同实施例11。反应式见图42，UPLC检测结果见图43，质谱检测结果见图44。

实施例19 R234A催化OPS与乙胺的反应

R234A的获得方法见实施例10。底物为OPS和乙胺，底物浓度，反应条件检测方法均同实施例11。反应式见图45，UPLC检测结果见图46，质谱检测结果见图47。

实施例20 R234A催化OPS与环己胺的反应

R234A的获得方法见实施例10。底物为OPS和环己胺，底物浓度，反应条件检测方法均同实施例11。反应式见图48，UPLC检测结果见图49，质谱检测结果见图50。

实施例21 R234A催化OPS与乙醇胺的反应

R234A的获得方法见实施例10。底物为OPS和乙醇胺，底物浓度，反应条件检测方法均同实施例11。反应式见图51，UPLC检测结果见图52，质谱检测结果见图53。

实施例22 R234A催化OPS与苯甲胺的反应

R234A的获得方法见实施例10。底物为OPS和苯甲胺，底物浓度，反应条件检测方法均同实施例11。反应式见图54，UPLC检测结果见附图55，质谱检测结果见图56。

实施例23 与氧乙酰丝氨酸/氧磷酸丝氨酸识别有关的氨基酸残基

通过将AMA合成酶与其他氧乙酰丝氨酸巯解酶、氧磷酸丝氨酸巯解酶的多重序列比对，申请人认为本发明野生型AMA酶的突变体Y84S、S85T、G145R、A237R，与OAS/OPS的识别有关。以AMA合成酶表达质粒为模板，Y84S、S85T、G145R、A237R的引物序列如下：

Y84S-F：AATACTATCATCGAGAGTAGTTCCGGATCCACG

Y84S-R：CGTGGATCCGGAACTACTCTCGATGATAGTATT

S85T-F：ACTATCATCGAGTACACGTCCGGATCCACGGTG

S85T-R：CACCGTGGATCCGGACGTGTACTCGATGATAGT

G145R-P1：GAAGGAGATATACATATGGCCAATCTCAATGAACGCAATG

G145R-P2：GCACTTTGGATACCTCGTCGCTCGTCATACGGTTCAGGTT

G145R-P3：GAACCGTATGACGAGCGACGAGGTATCCAAAGTGCCCGGAG

G145R-P4：GAGTGCGGCCGCAAGCTTATTAGTCGATACGGACAGTT

A237R-P1：GAAGGAGATATACATATGGCCAATCTCAATGAACGCAATG

A237R-P2：ACGGGTTTCATCAACCTGAACGACCTTGGGCCCGGA

A237R-P3：TCCGGGCCCAAGGTCGTTCAGGTTGATGAAACCCGT

A237R-P4：GAGTGCGGCCGCAAGCTTATTAGTCGATACGGACAGTT

突变体的表达纯化方法同AMA合成酶。底物为OAS/OPS和ToxinA，底物和酶的浓度，反应条件，衍生及检测方法均同实施例4。以ToxinA的转化率评价突变体的活性。结果见图57(以OAS和ToxinA为底物)和图58(以OPS和ToxinA为底物)此四个突变体的活性相对野生型AMA合成酶都有所下降，可用于工业生产上控制酶的活性。

实施例24((S)-2-氨基-2-羧乙基)-L-天冬氨酸(Toxin A)的合成

化学反应方程式见图59。0℃下，向新合成的((S)-2-氨基-3-苄氧基-3-氧代丙基)-L-天冬氨酸二丁酯(参考文献：Zhang，J.et al，J.Org.Chem.2017，82，13643-13648)64.7mg，0.153mmol)的二氯甲烷(7mL)溶液加入苯甲醚(83μL，0.766mmol)后，滴入三氟甲磺酸(54μL，0.612mmol)。加毕后，反应液保持0℃反应0.5h，然后升温至室温继续反应1.5h。将反应液降温至0℃后向其中滴入碳酸氢钠(129mg，1.531mmol)的水(10mL)溶液淬灭，并继续搅拌1h。用二氯甲烷(10mL×3)洗涤反应混合物并用旋转蒸发器浓缩干燥水相。残留的固体用凝胶柱分离可得到Toxin A的钠盐(42.5mg，97％)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京大学

<120> 一种AMA合成酶及其在合成AMA或其衍生物中的应用

<130> KHP191114996.1

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 519

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Asn Leu Asn Glu Arg Asn Val Tyr Phe Gly Arg Asp Ser Leu

1 5 10 15

Lys Lys Tyr Phe Asp Pro Asp Cys Gln Pro Pro Leu Pro Leu Val Glu

20 25 30

Leu Pro Glu His Leu Asn Pro Tyr His Gln Asp Gly Val Arg Val Tyr

35 40 45

Ala Lys Met Met Thr Met His Pro Ala Asn Asn Val Lys Ala Met Pro

50 55 60

Ala Met Asn Met Leu Glu Lys Ser Val Thr Pro Gly Lys Thr Asn Thr

65 70 75 80

Ile Ile Glu Tyr Ser Ser Gly Ser Thr Val Ile Ser Met Ser Met Ile

85 90 95

Ala Arg Val Met His Gly Ile Gln Asp Thr Arg Ala Phe Leu Ser Asn

100 105 110

Lys Thr Ser Glu Ala Lys Leu Gln Leu Met Gln Phe Phe Gly Leu Asn

115 120 125

Ile Thr Leu Phe Gly Gly Pro Ser Gln Pro Glu Pro Tyr Asp Glu Arg

130 135 140

Gly Gly Ile Gln Ser Ala Arg Arg Met Ala Leu Asp Ser Asp Ser Val

145 150 155 160

Leu Asn Pro Asn Gln Tyr Glu Asn Asp Asn Asn Trp Gln Ser His Ile

165 170 175

Arg Trp Thr Gly Pro Gln Ile Tyr Lys Gln Leu Pro Glu Ile Asn Val

180 185 190

Leu Cys Ala Gly Met Gly Thr Ser Gly Thr Met Thr Gly Leu Gly Thr

195 200 205

Tyr Phe Lys Glu Ala Lys Pro Ser Val Leu Arg Leu Gly Val Cys Thr

210 215 220

Ala Pro Gly Asp Arg Val Pro Gly Pro Arg Ser Phe Ala Leu Met Lys

225 230 235 240

Pro Val Glu Phe Pro Trp Lys Ala Ala Val Asp Val Ile Glu Glu Val

245 250 255

Asn Ser Ser Asp Ser Phe Ser Leu Ser Leu Asp Leu Cys Arg Glu Gly

260 265 270

Ile Val Cys Gly Pro Ser Ser Gly Phe Asn Leu Gln Gly Leu Phe Gln

275 280 285

Met Leu Glu Lys Arg Lys Ala Ala Gly Thr Leu Ser Glu Ile Ala Gly

290 295 300

Pro Asp Gly Ser Ile His Cys Val Phe Leu Cys Cys Asp Leu Pro Tyr

305 310 315 320

Gln Tyr Ile Gly Glu Tyr Phe Gln Lys Leu Gly Ala Asp Lys Phe His

325 330 335

Pro Ile Gln Asn Glu Arg Leu Thr Lys Val Asp Leu Tyr Arg Tyr Asp

340 345 350

Glu Ser Trp Glu Arg Ser Pro Val Val Leu Phe Thr His Phe Tyr Asn

355 360 365

Thr Pro Asn Val Leu Ser Glu Cys Leu Leu Ser Asp Ile Lys Leu Arg

370 375 380

Pro Leu Cys Cys Val Leu Asp Leu Arg Thr Thr Ala Asp Phe Ala Ser

385 390 395 400

Trp His Leu Pro Gly Ser Val Asn Ile Pro Leu Arg Ser Leu Asp Ser

405 410 415

His Thr Val Lys Pro Phe Ser Asp Pro Gly Val Leu Glu Ala Gln Trp

420 425 430

Ser Glu Leu Glu Ala Met Phe Lys Asp Pro Ser Val Ile Thr Lys Leu

435 440 445

Asp Ser His His Val Leu Val Ile Cys Tyr Asn Gly Asp Thr Ala Arg

450 455 460

Val Ala Thr Ser Val Leu Arg Ala Lys Gly Ile Glu Ala Asp Ser Leu

465 470 475 480

Arg Gly Gly Tyr Gln Ala Leu Lys Asp His Gly Leu Trp Gly Ser Ser

485 490 495

Gly Val Glu Ser Val Glu Lys Asn Thr Tyr Pro Thr Thr Thr Thr Thr

500 505 510

Glu Leu Ser Val Ser Thr Asn

515

<210> 2

<211> 1664

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccaatc tcaatgaacg caatgtatac ttcgggcgag attcgctcaa gaagtacttt 60

gatccagact gccagcctcc tctacctcta gttgaacttc cagaacatct gaatccttat 120

catcaggatg gtgtacgagt ctatgccaag atgatgacga tgcacccagc aaacaacgtc 180

aaggcaatgc caggtacata cacaccatat atgaaatact caagaatgat cagctaataa 240

tgtagcaatg aacatgcttg agaagagtgt gacgcccggt aaaacaaata ctatcatcga 300

gtacagttcc ggatccacgg tgatctcaat gtctatgatc gccagagtca tgcatggcat 360

tcaagacacg cgtgcattct tgagcaataa gacaagcgag gccaagctcc agctaatgca 420

gttctttggg cttaatatca ctctttttgg tggtccctcc caacctgaac cgtatgacga 480

gcgagggggt atccaaagtg cccggaggat ggcactggat tcagacagtg tcctcaaccc 540

gaaccaatac gagaacgaca ataactggca atcacacatt cgctggacgg gaccccagat 600

ctacaaacaa ctccctgaaa taaatgttct ttgtgcgggt atggggacat ctggaacaat 660

gactggattg ggtacatact tcaaggaagc gaagccatcg gtactccgtc tgggagtgtg 720

cacagcccct ggcgatcgtg ttccgggccc aaggtcgttc gccttgatga aacccgtgga 780

gttcccctgg aaagcagccg tagatgttat tgaggaagta aattcgtcgg actcgttttc 840

attgtcacta gacctgtgcc gcgaaggtat tgtctgtggc ccttcatctg gcttcaacct 900

gcaaggcctc tttcagatgt tggaaaagcg caaggcagct ggtaccttgt ccgaaattgc 960

aggacctgat ggttccattc attgtgtctt cctatgctgt gacctacctt atcaatacat 1020

tggagagtat ttccagaagt tgggagctga caaattccac cctatccaga atgaagtaag 1080

ttctggccca ttgactctca ttgcctcatt tactaacgca ccgccagaga cttaccaaag 1140

ttgatctata tcgatacgac gaaagctggg agcgaagtcc agtagtcctt ttcactcatt 1200

tttacaatac ccccaacgtt ttgtcggaat gtctcctaag tgacatcaag ctgaggcccc 1260

tgtgctgtgt tctagacctg agaacaacgg cggacttcgc ctcatggcat cttcctggct 1320

cggtcaatat tcccttgcgg agtctcgact cacacactgt gaagccgttc tcggaccccg 1380

gtgtactaga ggcacagtgg tcagagttag aagcaatgtt caaggatccg agcgtgatca 1440

ccaagttgga ttcccaccat gtgttagtga tttgctacaa tggagacaca gcgcgagtgg 1500

ccactagcgt gctgcgagcc aagggcatcg aggctgacag ccttcgggga ggataccaag 1560

ctctgaaaga ccacgggtta tggggtagca gtggagttga gtcggtggag aaaaacacat 1620

atccaacaac aaccacgaca gaactgtccg tatcgactaa ttaa 1664

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggaattcca tatggccaat ctcaatgaac g 31

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagctta ttagtcgata cggacagtt 29

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggagata tacatatggc caatctcaat gaacgcaatg 40

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caaggcgaac gaggctgggc ccggaacacg atcgccag 38

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgttccggg cccagcctcg ttcgccttga tgaaacccg 39

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagtgcggcc gcaagcttat tagtcgatac ggacagtt 38

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aatactatca tcgagagtag ttccggatcc acg 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgtggatccg gaactactct cgatgatagt att 33

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

actatcatcg agtacacgtc cggatccacg gtg 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caccgtggat ccggacgtgt actcgatgat agt 33

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaaggagata tacatatggc caatctcaat gaacgcaatg 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcactttgga tacctcgtcg ctcgtcatac ggttcaggtt 40

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaaccgtatg acgagcgacg aggtatccaa agtgcccgga g 41

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gagtgcggcc gcaagcttat tagtcgatac ggacagtt 38

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaaggagata tacatatggc caatctcaat gaacgcaatg 40

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acgggtttca tcaacctgaa cgaccttggg cccgga 36

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tccgggccca aggtcgttca ggttgatgaa acccgt 36

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gagtgcggcc gcaagcttat tagtcgatac ggacagtt 38

Claims

1.AMA合成酶，其特征在于，其来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)具有：

1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

2.编码权利要求1所述AMA合成酶的基因，其具有：

1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

3.一种权利要求1所述AMA合成酶的突变体，其特征在于，其为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第234的R突变为A；或第84位的Y突变为S，或第85位的S突变为T，或第145位的G突变为R，或第237位A突变为R。

4.含有权利要求2所述基因或权利要求3所述突变体编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒、载体、微生物、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞。

5.权利要求1所述AMA合成酶或其编码基因或权利要求3所述的突变体或权利要求4所述的生物材料在催化合成Toxin A或其衍生物、或提高Toxin A或其衍生物产量中的应用。

6.权利要求1所述AMA合成酶或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在催化合成AMA或其衍生物、或提高AMA或其衍生物产量中的应用。

7.一种催化合成AMA和/或其衍生物的方法，其特征在于，以A和B化合物为初始反应物，所述A为丝氨酸供体，优选氧乙酰丝氨酸和/或氧磷酸丝氨酸，所述B为除赖氨酸、精氨酸外的天然氨基酸和/或其对映异构体，优选除碱性L-氨基酸外的L-氨基酸；以权利要求1所述AMA合成酶或权利要求3所述的突变体或含有权利要求4所述的生物材料为催化剂，进行反应合成AMA和/或其衍生物。

8.AMA酶突变体在识别底物催化相关反应中的应用，所述的底物包括赖氨酸、精氨酸、甲胺、乙胺、环己胺、乙醇胺、苯甲胺中的一种或多种，所述AMA酶突变体是如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第234的R突变为A。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述O-磷酸丝氨酸或O-乙酰丝氨酸在反应体系中的初始浓度为

优选

所述L-氨基酸在反应体系中的初始浓度为

优选

10.如权利要求7～9任一所述的方法，其特征在于，反应条件为pH值

温度为15℃-35℃，优选25℃，一边搅拌一边反应

小时，合成AMA和/或其衍生物。