CN117551707A - S-取代半胱氨酸的制备方法、ama衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种S‑取代半胱氨酸的制备方法、AMA衍生物及其制备方法，S‑取代半胱氨酸的制备方法包括以下步骤：在缓冲液中加入硫醇或硫酚、O‑磷酸‑L‑丝氨酸与AMA合成酶，室温静置反应，经阴离子交换色谱法纯化得到产物。本发明提供的产物具有特定的立体构型，提供的酶促合成方法具有高度立体和位点选择性，补充了现有含硫非蛋白源氨基酸的酶促合成催化工具，可以用于含硫AMA衍生物及其它氨基多羧酸类化合物的酶促模块化合成。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术与生物催化领域，尤其涉及一种S-取代半胱氨酸的制备方法、AMA衍生物及其制备方法。
背景技术
产生β-内酰氨酶是革兰氏阴性致病菌的主要耐药机制之一。β-内酰氨酶通过水解β-内酰氨抗生素致使其丧失抗菌活力，主要分为丝氨酸-β-内酰氨酶和金属-β-内酰氨酶两大类。Aspergillomarasmine A（AMA）是一种真菌天然产物，在2014年被重新鉴定为一种金属-β-内酰氨酶抑制剂。AMA通过螯合游离Zn2+，进而移除金属-β-内酰氨酶活性中心的催化关键Zn2+，并致使其降解发挥抑制作用。AMA对金属-β-内酰氨酶NDM-1和VIM-2具有低至微摩尔浓度级的抑制活性(IC50分别为4.0 μM和9.6 μM)，在使用临床分离的耐药革兰氏阴性菌为模型的体外与体内实验中，AMA能够恢复碳青霉烯抗生素对多种耐药菌的抗菌活力，因此展现出作为潜在的β-内酰氨抗生素佐剂的开发潜力。
AMA合成酶（AMAS）是真菌表达的负责合成AMA的天然酶。AMAS以 L 天冬氨酸（LAsp）和O-磷酸-L-丝氨酸（OPS）为底物，经由中间体toxin A，经连续两步反应合成AMA，具有高度立体与位点选择性。AMAS不仅为AMA的合成提供了一种高选择性的单酶两步生物催化合成路线，还用于以其他天然氨基酸及胺替代L 天冬氨酸，合成AMA和toxinA衍生物，展现出良好的生物催化应用前景。
S-取代半胱氨酸是L-半胱氨酸侧链巯基被基团取代的衍生物，是一类在医药领域用途广泛的非蛋白源氨基酸。许多S-取代半胱氨酸是重要的植物天然代谢产物和生物活性分子，具有抗氧化、抗癌、抗炎、神经保护等多种生物学功能。例如，S-烯丙基-L-半胱氨酸是一种神经保护剂和神经营养剂，S-羧甲基-L-半胱氨酸又名羧甲司坦，是一种粘液溶解剂，临床用于治疗呼吸系统疾病的辅助疗法。相比于S-取代半胱氨酸的化学合成，生物催化合成可为该类化合物提供了步骤精简、绿色温和替代方法。目前用于合成S-取代半胱氨酸的催化酶主要为PLP依赖酶，包括半胱氨酸合成酶（OASS）、色氨酸合成酶（TrpS）、色氨酸酶TnaA等，但报道数量及产物种类有限。因此，开发用于制备S-取代半胱氨酸的新型生物催化剂具有重要应用价值。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种S-取代半胱氨酸的制备方法；本发明的第二目的是提供一种含硫AMA衍生物；本发明的第三目的是提供一种含硫AMA衍生物的制备方法。
技术方案：本发明的一种S-取代半胱氨酸的制备方法，所述S-取代半胱氨酸具有如下化学结构：
其中R代表正丙基、烯丙基、羧甲基、羧乙基、羟甲基、羟乙基、苄基、邻氨基苯基、间氨基苯基或对氨基苯基；(R)代表相应位置手性碳的立体构型为R；
所述S-取代半胱氨酸的制备方法，包括以下步骤：
（1）向缓冲液中加入硫醇或硫酚化合物、O-磷酸-L-丝氨酸与AMA合成酶，配制得到反应体系：
（2）将步骤（1）所得的反应体系调节pH至中性，于20-25 ℃下静置反应；反应完成后，水浴使酶失活，过滤、纯化后得到产物，即为S-取代半胱氨酸。
上述技术方案中，除了AMA合成酶最后加入之外，各试剂的加入顺序为任意随机次序，无严格要求。
进一步地，步骤（1）中，硫醇或硫酚化合物、O-磷酸-L-丝氨酸与AMA合成酶的摩尔比为1：5-7：0.0015。
更进一步地，步骤（1）中，硫醇或硫酚化合物浓度为5mM，O-磷酸-L-丝氨酸与硫醇化合物摩尔比为5-7:1，AMA合成酶的物质量为2.5-7.5 μM，反应体系为3-45 mL。
优选地，缓冲液为pH=7.0的KH2PO4-K2HPO4缓冲液。更优选地，所述缓冲液为pH=7.0的100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液。
进一步地，步骤（2）中，于20-25 ℃下静置反应的反应时间为24-48小时。
优选地，步骤（2）中，纯化方法为阴离子交换色谱法。
优选地，步骤（2）中，用盐酸或氢氧化钠溶液调节反应体系溶液pH至中性。
进一步地，纯化方法具体包括以下步骤：
（1）使用氯型阴离子交换树脂，溶胀装柱，利用氢氧化钠溶液转型为羟基型阴离子交换树脂，再用去离子水冲洗至中性。
（2）将反应液上样色谱柱，依次用去离子水、醋酸、盐酸进行梯度洗脱，将产物所在洗脱液进行汇总、旋蒸和冻干，获得产物。
优选地，氯型阴离子交换树脂为Dowex 1X8，100-200目。
另一方面，本发明提供一种含硫AMA衍生物，所述含硫AMA衍生物具有如下任一化学结构：
XX9、XX10。
本发明所述各化学式中，(S)或(R)代表相应位置手性碳的立体构型为S或R。
另一方面，本发明提供一种含硫AMA衍生物的制备方法，所述含硫AMA衍生物的制备方法为以下任一方法：
方法一：
(1)以间氨基苯硫酚与O-磷酸-L-丝氨酸为初始反应物，AMA合成酶为催化剂，在缓冲液中反应一段时间，分离获得中间产物X9；
(2)以X9和富马酸为初始反应物，EDDS裂解酶为催化剂，在缓冲液中配制得到反应体系，在室温条件下反应合成产物，即为XX9；
方法二：
(1)以对氨基苯硫酚与O-磷酸-L-丝氨酸为初始反应物，AMA合成酶为催化剂，在缓冲液中反应一段时间，分离获得中间产物X10；
(2)以X10和富马酸为初始反应物，EDDS裂解酶为催化剂，在缓冲液中配制得到反应体系，在室温条件下反应合成产物，即为XX10。
优选地，方法一中，步骤（1）中，硫醇或硫酚化合物、O-磷酸-L-丝氨酸与AMA合成酶的摩尔比为1：5-7：0.0015。
更优选地，O-磷酸-L-丝氨酸与间氨基苯硫酚的摩尔比为5-7:1，初始底物浓度为5-35mM，AMA合成酶的质量4.5-13.5 mg(2.5-7.5 μM)，反应体系为30-45 mL, 反应温度为20-25 ℃，反应时间为24-48小时。
优选地，方法一中，步骤（2）中，X9、富马酸、EDDS裂解酶的摩尔比为1:5-7：0.005。
更优选地，X9与富马酸的浓度比为1:5，初始底物浓度为10-50 mM，EDDS裂解酶的质量为0.84-5.6 mg（5 μM），反应体系为3-20 mL，反应温度为20-25 ℃，反应时间为24-48小时。
优选地，方法二中，步骤（1）中，硫醇或硫酚化合物、O-磷酸-L-丝氨酸与AMA合成酶的摩尔比为1：5-7：0.0015。
更优选地， O-磷酸-L-丝氨酸与对氨基苯硫酚的摩尔比为5-7:1，初始底物浓度为5-35mM，AMA合成酶的质量4.5-13.5 mg(2.5-7.5 μM)，反应体系为30-45 mL, 反应温度为20-25 ℃，反应时间为24-48小时。
优选地，方法二中，步骤（2）中，X10、富马酸、EDDS裂解酶的摩尔比为1:5-7：0.0005。
更优选地，步骤（2）中，X10与富马酸的浓度比为1:5，初始底物浓度为10-50 mM，EDDS裂解酶的质量为0.84-5.6 mg（5 μM），反应体系为3-30 mL，反应温度为20-25 ℃，反应时间为24-48小时。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：1、本发明提供一种绿色生物合成路线，以商业可得的硫醇化合物作为原料通过体外酶学手段催化C-S键连接获得10种S-取代半胱氨酸，其转化率为56-99％，总收率为44-83％。本方法不但绿色环保、条件温和，且具有高度立体和位点选择性，获得的产物具有特定的立体构型，补充了现有含硫非蛋白源氨基酸的酶促合成催化工具，可以用于含硫AMA衍生物及其它氨基多羧酸类化合物的酶促模块化合成。
2、本发明使用了简单易得的前体，特别包括前手性化合物富马酸，与S-取代半胱氨酸反应合成了两种含硫AMA衍生物。本发明实现了含硫AMA衍生物的合成，且合成工艺简单，为抗生素佐剂及其他生理金属酶抑制剂的开发提供了新思路。
3、本发明获得化合物XX9和XX10，该化合物未见文献报道，是全新的化合物。
附图说明
图1为实施例1的AMA合成酶的纯化过程SDS PAGE电泳图；
图2为实施例2的EDDS裂解酶的纯化过程SDS PAGE电泳图；
图3为实施例4所述化合物S-(丙基)-L-半胱氨酸(X1)的1H NMR谱图；
图4为实施例6所述化合物S-(2-丙烯基)-L-半胱氨酸(X2)的1H NMR谱图；
图5为实施例8所述化合物S-(羧基甲基)-L-半胱氨酸(X3)的1H NMR谱图；
图6为实施例10所述化合物S-(羧基乙基)-L-半胱氨酸(X4)的1H NMR谱图；
图7为实施例12所述化合物S-(羟基甲基)-L-半胱氨酸(X5)的1H NMR谱图；
图8为实施例14所述化合物S-(羟基乙基)-L-半胱氨酸(X6)的1H NMR谱图；
图9为实施例16所述化合物S-(苄基)-L-半胱氨酸(X7)的1H NMR谱图；
图10为实施例18所述化合物S-(2-氨基苯基)-L-半胱氨酸(X8)的1H NM谱图；
图11为实施例20所述化合物S-(3-氨基苯基)-L-半胱氨酸(X9)的1H NMR谱图；
图12为实施例22所述化合物S-(4-氨基苯基)-L-半胱氨酸(X10)的1H NMR谱图。
具体实施方式
实施例中的分子生物学操作如大肠杆菌的转化方法全部按照《分子克隆实验室手册》第二版(“Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition"，ManiatisCold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)实施。
实施例1：AMA合成酶的表达与纯化
本实验使用的AMA合成酶来自Pyrenophora teresf.teres0-1 (PteAMAS)，其基因克隆至pET28a质粒并转化大肠杆菌，构建得PteAMAS表达菌株。取PteAMAS表达菌，按1%接种量，将接种于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，作为种子液于37 ℃，220 rpm培养12 h以上。按1％接种量，将种子液转接至200 mL的LB液体培养基中，于37 ℃，220 rpm培养2 h，测定菌液OD600= 0.8±0.1，加入诱导剂IPTG至终浓度0.3 mM，将菌液置于20 ℃，220 rpm继续培养18h。菌液在4 ℃条件下经5000 rpm离心10 min以获得菌体，并用50 mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤两次。最终每1 L培养基可获得6.2 g菌体。
收获的菌体用缓冲液A1(50 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 8 .0) 重悬(按3mL/g菌体比例)，冰浴超声破碎细胞。将细胞裂解液在4 ℃，15000rpm条件下离心15min，取上清液，重复3次。最后，所得上清液过0.22 μm水系滤膜后，置于冰上备用。
取2 mLNi SepharoseTM6 Fast Flow填料置于12 mL层析空柱管中，用10倍柱填料体积(10 CV，20 mL)去离子水冲洗柱材，用10 CV 缓冲液A1平衡柱材；将平衡好的镍柱转移至粗提液中，4 ℃旋转孵育2 h。将孵育后的柱材悬浊液重新倒入12 mL层析空柱管中，装柱并收集流穿液；依次使用10 CV 缓冲液A1和10 CV的缓冲液B1(50 mM Tris-HCl，100 mMNaCl，40 mM咪唑)冲洗镍柱，收集洗脱液(含杂蛋白)；最终使用2.5 CV 缓冲液C1(50 mMTris- HCl，100 mM NaCl，300 mM咪唑)冲洗镍柱，洗脱并收集目的蛋白，置于冰上保存。随后使用PD-10脱盐柱进行脱盐处理，获得纯酶，立即使用或经液氮速冻后于-20 ℃保存。上述所有洗脱液进行SDS-PAGE验证，结果见图1。
实施例2：EDDS裂解酶表达与纯化
取EDDS裂解酶表达菌株，按1%接种量接种于50 mL含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，作为种子液置于37 ℃，220 rpm培养12 h以上。按1％接种量，将种子液转接至200 mL的LB液体培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），于37 ℃，220 rpm摇床培养3 h，测定菌液OD600= 0.8±0.1，加入诱导剂L-阿拉伯糖至终浓度0.5 mg/mL，将菌液置于20 ℃，220rpm继续培养18 h。菌液在4 ℃条件下经5000 rpm离心10 min以获得菌体沉淀，并用50 mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤2次后。
向收获的菌体加入缓冲液A2 (50 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，20 mM咪唑，pH 8.0) 重悬(按5mL/g菌体比例)，冰浴超声破碎细胞。将细胞裂解液转移至50 ml离心管中，在4℃，15000 rpm条件下离心15 min，取上清液再次离心，共重复3次。最后一次上清液过0.22μm水系滤膜后，置于冰上备用。
取2 mL Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料置于12 mL层析空柱管中，用10 CV去离子水冲洗柱材，用10 CV 缓冲液A2平衡柱材；将平衡好的镍柱转移至粗提液中，4 ℃旋转孵育2 h。将孵育后的柱材悬浊液重新倒入12 mL层析空柱管中，收集流穿液；依次使用10 CV缓冲液A2和10 CV的缓冲液B2(50 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，30 mM咪唑)冲洗镍柱，收集洗脱液(含杂蛋白)；最终使用2.5 CV 缓冲液C1(50 mM Tris- HCl，300 mM NaCl，500 mM咪唑)冲洗镍柱，洗脱并收集目的蛋白，置于冰上保存，随后使用PD-10脱盐柱进行脱盐处理，获得纯酶，立即使用或经液氮速冻后于-20 ℃保存。上述所有洗脱液进行SDS-PAGE蛋白验证，结果见图2。
实施例3：AMA合成酶催化合成S-丙基-L-半胱氨酸（X1）
采用实施例1获得的PteAMAS，称取OPS (1.05 mmol)与丙基-1-硫醇(0.21 mmol)固体于50 mL圆底烧瓶中，加入100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.0)约20mL，调整体系pH至7.0左右。再向体系加入7.5 μM PteAMAS，并用100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.0)定容至30 mL，放置于25 ℃恒温培养箱中静置反应24小时。70 ℃水浴10 min终止反应。产物命名为X1，使用核磁氢谱监测反应转化率，具体方法为取500 μL反应液，70℃水浴10 min，离心取上清液进行冻干后，加入500 μL重水复溶，进行1H NMR谱分析，使用1 mM TSP为内参计算得转化率为73.5％。
其中，将上述合成方法中，OPS的加入量调整为1.47 mmol，其他步骤相同。同样能够制得S-丙基-L-半胱氨酸（X1）。
实施例4: X1的纯化
采用实施例3的反应液，通过0 .45 μm水系滤膜过滤后，利用阴离子交换柱去除未反应的OPS与丙基-1-硫醇：称量15 g氯型阴离子交换树脂(Dowex 1X8, 氯型, 100-200目)，在水中充分溶胀；倒入干净的玻璃层析柱中装柱，柱体积约为20 mL，先用5 CV的去离子水清洗柱材，再加入5 CV的2 M NaOH将柱材转换为羟基型；再加入5 CV的去离子水冲洗直至流出溶液pH为7.0，转型完毕。将反应液上样，先用5 CV去离子水洗脱丙基-1-硫醇，再用2 M醋酸洗脱直至产物流出，最后用2 M盐酸洗脱OPS组分。将收集的组分点硅胶板，用茚三酮试剂加热显色监测化合物的洗脱。收集茚三酮阳性的醋酸洗脱组份，旋蒸及冷冻干燥除去水份，得到固体共15.1 mg (收率61.6％)。X1核磁谱如图3。
实施例5: AMA合成酶合成S-2-丙烯基-L-半胱氨酸（X2）
采用实施例1获得的PteAMAS，在100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.0)中配置包含OPS（1.05 mmol）、烯丙硫醇（0.21 mmol）和PteAMAS（7.5 μM）的反应液（30 mL），在25 ℃下反应24小时。反应条件及检测方法均同实施例3。产物命名为X2，1H NMR谱显示转化率为>99%。
实施例6:X2的纯化
采用实施例5获得的反应液，采用与实施例4一致的纯化方法对X2进行纯化，最终收率70.3%。X2核磁谱图如图4。
实施例7:AMA合成酶合成S-羧基甲基-L-半胱氨酸（X3）
采用实施例1获得的PteAMAS，在100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.0)中配置包含OPS（1.05 mmol）、硫代乙醇酸（0.21 mmol）和PteAMAS（7.5 μM）的反应液（30 mL），在25℃下反应24小时。反应条件及检测方法均同实施例3。产物命名为X3，1H NMR谱显示转化率为96.2%。
实施例8:X3的纯化
采用实施例7获得的反应液，采用与实施例4一致的纯化方法对X3进行纯化，最终收率85.3%。X3核磁谱图如图5。
实施例9:AMA合成酶合成S-羧基乙基-L-半胱氨酸（X4）
采用实施例1获得的PteAMAS，在100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.0)中配置包含OPS（1.05 mmol）、3-巯基丙酸（0.21 mmol）和PteAMAS（7.5 μM）的反应液（30 mL），在25℃下反应24小时。反应条件及检测方法均同实施例3。产物命名为X4，1H NMR谱显示转化率为86.6%。
实施例10:X4的纯化
采用实施例9获得的反应液，采用与实施例4一致的纯化方法对X4进行纯化，最终收率89.0%。X4核磁谱图如图6。
实施例11:AMA合成酶合成S-羟基甲基-L-半胱氨酸（X5）
采用实施例1获得的PteAMAS，在100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.0)中配置包含OPS（1.05 mmol）、2-巯基乙醇（0.21 mmol）和PteAMAS（7.5 μM）的反应液（30 mL），在25℃下反应24小时。反应条件及检测方法均同实施例3。产物命名为X5，1H NMR谱显示转化率为85.1%。
实施例12:X5的纯化
采用实施例11获得的反应液，采用与实施例4一致的纯化方法对X5进行纯化，最终收率84.3%。X5核磁谱图如图7。
实施例13:AMA合成酶合成S-羟基乙基-L-半胱氨酸（X6）
采用实施例1获得的PteAMAS，在100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.0)中配置包含OPS（1.05 mmol）、3-巯基-1-丙醇（0.21 mmol）和PteAMAS（7.5 μM）的反应液（30 mL），在25 ℃下反应24小时。反应条件及检测方法均同实施例3。产物命名为X6，1H NMR谱显示转化率为98.3%。
实施例14:X6的纯化
采用实施例13获得的反应液，采用与实施例4一致的纯化方法对X6进行纯化，最终收率93.0%。X6核磁谱图如图8。
实施例15:AMA合成酶合成S-苄基-L-半胱氨酸（X7）
采用实施例1获得的PteAMAS，在100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.0)中配置包含OPS（1.05 mmol）、苄硫醇（0.21 mmol）和PteAMAS（7.5 μM）的反应液（30 mL），在25 ℃下反应24小时。反应条件及检测方法均同实施例3。产物命名为X7，1H NMR谱显示转化率为83.7%。
实施例16:X7的纯化
采用实施例15获得的反应液，采用与实施例4一致的纯化方法对X7进行纯化，最终收率77.8%。X7核磁谱图如图9。
实施例17:AMA合成酶合成S-2-氨基苯基-L-半胱氨酸（X8）
采用实施例1获得的PteAMAS，在100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.0)中配置包含OPS（1.05 mmol）、邻氨基苯硫酚（0.21 mmol）和PteAMAS（7.5 μM）的反应液（30 mL），在25℃下反应24小时。反应条件及检测方法均同实施例3。产物命名为X8，1H NMR谱显示转化率为93.4%。
实施例18:X8的纯化
采用实施例17获得的反应液，采用与实施例4一致的纯化方法对X8进行纯化，最终收率79.8%。X8核磁谱图如图10。
实施例19:AMA合成酶合成S-3-氨基苯基-L-半胱氨酸（X9）
采用实施例1获得的PteAMAS，在100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.0)中配置包含OPS（1.05 mmol）、间氨基苯硫酚（0.21 mmol）和PteAMAS（7.5 μM）的反应液（30 mL），在25℃下反应24小时。反应条件及检测方法均同实施例3。产物命名为X9，1H NMR谱显示转化率为82.9%。
实施例20:X9的纯化
采用实施例19获得的反应液，采用与实施例4一致的纯化方法对X9进行纯化，最终收率43.6%。X9核磁谱图如图11。
实施例21:AMA合成酶合成S-4-氨基苯基-L-半胱氨酸（X10）
采用实施例1获得的PteAMAS，在100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.0)中配置包含OPS（1.05 mmol）、对氨基苯硫酚（0.21 mmol）和PteAMAS（7.5 μM）的反应液（30 mL），在25℃下反应24小时。反应条件及检测方法均同实施例3。产物命名为X10，1H NMR谱显示转化率为56.4%。
实施例22:X10的纯化
采用实施例21获得的反应液，采用与实施例4一致的纯化方法对X10进行纯化，最终收率53.4%。X10核磁谱图如图12。
实施例23:EDDS裂解酶催化合成XX9
在50 mL圆底烧瓶中加入实施例20获得的X9(0.2 mmol)与富马酸 (1 mmol)，再加入100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 8.5)约20 mL，调整体系pH至8.5左右。再向体系加入实施例2获得的EDDS裂解酶（5 μM），并用100 mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 8.5)补齐至30 mL，于25 ℃静置反应24小时。反应结束后，70 ℃水浴10分钟终止反应。取500 μL反应上清液，冷冻干燥除水后，用500 μL重水复溶后进行1H NMR谱分析。1H NMR谱图显示转化率为95％。产物XX9的表征信息具体为：
1H NMR (500 MHz,100 mM KD2PO4-K2DPO4, pD=8.5) δ 7.27 (t,J= 7.9 Hz, 1H),6.91 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.68 (d,J= 9.2 Hz, 1H), 4.17 (dd,J=10.3, 3.7 Hz, 1H), 3.82 (dd,J= 8.7, 4.0 Hz, 1H), 3.62 (dd,J= 14.6, 4.0 Hz,1H), 3.27 (dd,J= 14.6, 8.7 Hz, 1H), 2.77 (dd,J= 14.9, 3.7 Hz, 1H), 2.49 (dd,J= 14.9, 10.3 Hz, 1H).
上述合成方法中，将富马酸的加入量调整为1.4 mmol，其余步骤不变，同样能够制得XX9。
实施例24: EDDS裂解酶催化合成XX10
在50 mL圆底烧瓶中加入实施例22获得的X10(0.2 mmol)与富马酸 (1 mmol)，再加入100 mM NaH2PO4-NaOH缓冲液(pH 8.5)约20 mL，调整体系pH至8.5左右。再向体系加入实施例2获得的EDDS裂解酶（15 μM），并用100mM NaH2PO4-NaOH缓冲液(pH 8.5)补齐至30mL，于25 ℃静置反应24小时。反应结束后，70 ℃水浴10分钟终止反应。取500 μL反应上清液，冷冻干燥除水后，用500 μL重水复溶后进行1H NMR谱分析。1H NMR谱图显示转化率为89％。产物XX10的表征信息具体为：
1H NMR (500 MHz,100 mM KD2PO4-K2DPO4, pD=8.5) δ 7.43 (d,J= 8.7 Hz, 2H),6.74 (d,J= 8.7 Hz, 2H), 4.16 (dd,J= 10.4, 3.7 Hz, 1H), 3.72 (dd,J= 8.6, 4.0Hz, 1H), 3.42 (dd,J= 14.4, 4.0 Hz, 1H), 3.15 (dd,J= 14.4, 8.7 Hz, 1H), 2.77(dd,J= 14.9, 3.7 Hz, 1H), 2.49 (dd,J= 14.9, 10.4 Hz, 1H).
上述合成方法中，将富马酸的加入量调整为1.4 mmol，其余步骤不变，同样能够制得XX9。
Claims (10)
1.一种S-取代半胱氨酸的制备方法，其特征在于，所述S-取代半胱氨酸具有如下化学结构：其中R代表正丙基、烯丙基、羧甲基、羧乙基、羟甲基、羟乙基、苄基、邻氨基苯基、间氨基苯基或对氨基苯基；(R)代表相应位置手性碳的立体构型为R；
所述S-取代半胱氨酸的制备方法，包括以下步骤：
（1）向缓冲液中加入硫醇或硫酚化合物、O-磷酸-L-丝氨酸与AMA合成酶，配制得到反应体系：
（2）将步骤（1）所得的反应体系调节pH至中性，于20-25 ℃下静置反应；反应完成后，水浴使酶失活，过滤、纯化后得到产物，即为S-取代半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的S-取代半胱氨酸的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，硫醇或硫酚化合物、O-磷酸-L-丝氨酸与AMA合成酶的摩尔比为1：5-7：0.0015。
3.根据权利要求1所述的S-取代半胱氨酸的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，缓冲液为pH=7.0的KH2PO4-K2HPO4缓冲液。
4. 根据权利要求1所述的S-取代半胱氨酸的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，于20-25 ℃下静置反应的反应时间为24-48小时。
5.根据权利要求1所述的S-取代半胱氨酸的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，纯化方法为阴离子交换色谱法。
6.根据权利要求5所述的S-取代半胱氨酸的制备方法，其特征在于，纯化方法具体包括以下步骤：
（1）使用氯型阴离子交换树脂，溶胀装柱，利用氢氧化钠溶液转型为羟基型阴离子交换树脂，再用去离子水冲洗至中性；
（2）将反应液上样色谱柱，依次用去离子水、醋酸、盐酸进行梯度洗脱，将产物所在洗脱液进行汇总、旋蒸和冻干，获得产物。
7.一种含硫AMA衍生物，其特征在于，所述含硫AMA衍生物具有如下任一化学结构：
XX9、XX10。
8.一种含硫AMA衍生物的制备方法，其特征在于，所述含硫AMA衍生物的制备方法为以下任一方法：
方法一：
(1)以间氨基苯硫酚与O-磷酸-L-丝氨酸为初始反应物，AMA合成酶为催化剂，在缓冲液中反应一段时间，分离获得中间产物X9；
(2)以X9和富马酸为初始反应物，EDDS裂解酶为催化剂，在缓冲液中配制得到反应体系，在室温条件下反应合成产物，即为XX9；
方法二：
(1)以对氨基苯硫酚与O-磷酸-L-丝氨酸为初始反应物，AMA合成酶为催化剂，在缓冲液中反应一段时间，分离获得中间产物X10；
(2)以X10和富马酸为初始反应物，EDDS裂解酶为催化剂，在缓冲液中配制得到反应体系，在室温条件下反应合成产物，即为XX10。
9.根据权利要求8所述的含硫AMA衍生物的制备方法，其特征在于，方法一中，步骤（1）中，X9、富马酸、EDDS裂解酶的摩尔比为1:5-7：0.0005；和/或，方法二中，步骤（1）中，X10、富马酸、EDDS裂解酶的摩尔比为1:5-7：0.0005。
10. 根据权利要求8所述的含硫AMA衍生物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中/或步骤（2），反应温度为20-25 ℃，反应时间为24-48小时。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160319248A1 (en) * | 2013-12-27 | 2016-11-03 | Ningbo Medical System Biotechnology Co., Ltd. | Fructose amino acid oxidase, preparation method and enzyme-containing kit for detecting glycated albumin |
| CN110982796A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-04-10 | 北京大学 | 一种ama合成酶及其在合成ama或其衍生物中的应用 |
| CN113348181A (zh) * | 2018-10-31 | 2021-09-03 | 诺华股份有限公司 | 包含sting激动剂的dc-sign抗体缀合物 |
| CN116426491A (zh) * | 2023-01-18 | 2023-07-14 | 中国药科大学 | 一种双酶联用合成ama及其衍生物的制备方法 |
-
2024
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160319248A1 (en) * | 2013-12-27 | 2016-11-03 | Ningbo Medical System Biotechnology Co., Ltd. | Fructose amino acid oxidase, preparation method and enzyme-containing kit for detecting glycated albumin |
| CN113348181A (zh) * | 2018-10-31 | 2021-09-03 | 诺华股份有限公司 | 包含sting激动剂的dc-sign抗体缀合物 |
| CN110982796A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-04-10 | 北京大学 | 一种ama合成酶及其在合成ama或其衍生物中的应用 |
| CN116426491A (zh) * | 2023-01-18 | 2023-07-14 | 中国药科大学 | 一种双酶联用合成ama及其衍生物的制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JIELIN ZHANG等: "Engineered C–N Lyase: Enantioselective Synthesis of Chiral Synthons for Artificial Dipeptide Sweeteners", ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 59, 31 December 2020 (2020-12-31), pages 429 - 435, XP072087747, DOI: 10.1002/anie.201910704 * |
| NATHAN A. WYATT等: "Reference Assembly and Annotation of the Pyrenophora teres f. teres Isolate 0-1", GENES|GENOMES|GENETICS, vol. 8, 31 January 2018 (2018-01-31), pages 1 - 8 * |
| QIANQIAN GUO等: "Identification of the AMA Synthase from the Aspergillomarasmine A Biosynthesis and Evaluation of Its Biocatalytic Potential", ACS CATAL., vol. 10, 11 May 2020 (2020-05-11), pages 6291 - 6298 * |
| 朱致熹等: "螯合剂类金属β-内酰胺酶抑制剂的研究进展", 中国药科大学学报, vol. 53, no. 4, 31 December 2022 (2022-12-31), pages 410 - 422 * |
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