CN110973014B - 一种蔗糖悬浮法计数刺激隐核虫包囊的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明首次采用蔗糖悬浮法对刺激隐核虫包囊进行计数，不仅操作简单、使用方便，而且计数结果准确可靠，大大方便了鱼类刺激隐核虫病的免疫研究。通过向包囊烧杯中添加质量分数为37.5％的蔗糖溶液，搅匀后用移液枪从烧杯中取出20份1ml的蔗糖溶液，最终计算出包囊总量。
Description
技术领域
本发明属于鱼病防治领域，具体涉及一种蔗糖悬浮法计数刺激隐核虫包囊的方法。
背景技术
刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是一种原生纤毛虫，主要寄生于海水硬骨鱼类的皮肤、鳃和鳍条等部位，大量感染时常引起海水养殖鱼类严重死亡，造成重大经济损失(Colorni，1987；Dickerson，1995；李言伟等，2019)。近年来，由于我国海水养殖的超负荷发展，养殖环境的恶化，刺激隐核虫病已经成为大范围、经常性爆发的烈性传染病，给海水渔业造成重大经济损失。由于海水养殖的开放性特征，很难杜绝刺激隐核虫对鱼体的感染，加之尚无有效的治疗药物和处理方法，使得该病的防治异常困难。目前，主要采用药物和物理防治方法(Colorni and Burgess，1997；蔡泽平等，2001；黄玮等，2004；Yanong，2009)，然而，这些方法存在效果不稳定、危害食品安全等诸多缺陷，且很难达到理想的效果。
研究证实：鱼类对刺激隐核虫感染会产生获得性免疫保护，疫苗接种可能成为防治刺激隐核虫病的有效方法(Yoshinaga et al，1997；Yambot et al，2006；Luo et al，2007；Hatanaka and Hirazawa，2008)。我们课题组展开了刺激隐核虫免疫防治的基础研究和应用研究，研发出了刺激隐核虫幼虫灭活疫苗，该疫苗可给予海水鱼很好的免疫保护(Luo et al，2007；Bai et al，2008；但学明等，2008；Dan et al，2013)。疫苗免疫保护效果评价常用的方法之一是：用非致死剂量刺激隐核虫攻毒，计数免疫组和对照组鱼身体某些部位(如单侧皮肤、胸鳍、鳃等)寄生滋养体的数量，通过比较两组鱼滋养体数量的差异来反映疫苗效果(但学明等，2008；Misumi et al.，2011；Josepriya et al.，2015)。然而，研究发现刺激隐核虫在同一尾鱼不同部位的感染量存在差异，所以该方法不能全面反映整条鱼的感染情况。因此，计数整条鱼身上的刺激隐核虫量更为合理，但实际操作中非常费时费力、极难实现。现常用的方法是：刺激隐核虫感染后，均匀放置几个平皿在桶底，通过计数平皿中收取的包囊量反映感染量。然而，包囊从鱼体脱落后并非均匀分布于桶底，所以该方法也不准确。因此，我们课题组采用感染后将鱼体转移到100L养殖桶内，滋养体脱落完全后收集桶底全部包囊进行计数的方法。每尾鱼脱落包囊的数量成千上万个，计数非常耗时。我们希望通过随机计数多份1ml包囊液中的包囊量来反映总虫量。但包囊较大，密度比海水大，因此在水中很快沉降，很难获得均匀的包囊溶液进行计数。蔗糖是很好的悬浮剂，常用于密度梯度离心分离细胞等。基于此，本研究建立了一种用蔗糖悬浮包囊用以计数的方法。
发明内容
本发明旨在解决从鱼体脱落的刺激隐核虫包囊计数难的问题，提供了一种蔗糖悬浮法计数刺激隐核虫包囊的方法，采用独特的蔗糖悬浮法对刺激隐核虫包囊进行计数，不仅操作简单、使用方便，而且计数结果准确可靠。
本发明首创性的采用蔗糖悬浮法来计数刺激隐核虫包囊，获得了准确的实验结果。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种蔗糖悬浮法计数刺激隐核虫包囊的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将感染刺激隐核虫后的鱼体转移到100L养殖桶内，养殖桶内水面高度为60cm。
(2)待滋养体脱落完全后，将鱼体从养殖桶内移出，同时将养殖桶内的水倒出，最终保留约2L水体；用毛刷将包囊轻轻从桶底扫下，并转移到2L烧杯里，待包囊全部沉到杯底后，将水体全部去除，并向烧杯内加入100ml质量分数为37.5％的蔗糖溶液，将包囊和蔗糖溶液全部转移到150ml烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀。
(3)用移液枪从烧杯中取出20份1ml的蔗糖溶液，在解剖镜下对其中的包囊进行计数，取其平均数，从而得出1ml蔗糖溶液中的包囊数。
(4)根据上一步骤得出的1ml蔗糖溶液中的包囊数以及烧杯内的总水量，计算出包囊总量。
本发明的优点和效果：首次采用独特的蔗糖悬浮法来计数刺激隐核虫包囊，简单易行，计数结果准确可靠，大大方便了鱼类刺激隐核虫病的免疫研究。
具体实施方式
本发明具体实施方式如下：
一、蔗糖悬浮法计数刺激隐核虫包囊中蔗糖浓度的优化
1、刺激隐核虫虫株
本试验使用的刺激隐核虫虫株采自广东省惠州市大亚湾某卵形鲳鲹养殖场，通过临床症状、虫体形态学和分子生物学方法鉴定为刺激隐核虫。从患病卵形鲳鲹体表和鳃上刮取滋养体，清洗干净后待用。
2、刺激隐核虫传代
根据Dan等(Dan et al.，2006)方法进行刺激隐核虫的人工传代。首先将上步采集的滋养体放于500L养殖桶内，同时放入5尾健康的卵形鲳鲹，进行低换水量的流水养殖。3天后，每天检查鱼体表是否出现白点，发现白点后，将鱼体转移至特制的刺激隐核虫收虫器，次日早晨收集脱落的包囊，连续收集两天。
将收集的包囊置于灭菌海水中充气培养60小时左右，可孵化出新的幼虫。用刚孵化2小时内的幼虫以10000虫体/尾的剂量定量感染10尾卵形鲳鲹，感染2天后将鱼体转移至收虫器，再次收集包囊，重复以上步骤建立稳定的刺激隐核虫传代系统。
3、蔗糖悬浮计数包囊方法的建立
(1)用步骤2的方法收集包囊。
(2)实验分9组，按表1在10ml海水中加入相应质量的蔗糖，用玻璃棒搅拌使蔗糖完全溶解。每组各取10ml蔗糖溶液加到新的离心管中，再加入100个包囊。
表1.实验分组
(3)用玻璃棒搅拌均匀，观察并计时包囊维持均匀分布的时长，并在处于包囊均匀分布时，随机取5份1ml包囊蔗糖悬浮液，计数包囊数量并计算包囊总量；
(4)比较各组包囊均匀分布时长、以及包囊总数量，确定最佳蔗糖悬浮浓度。
4、结果
结果如表2所示，随着蔗糖溶液质量分数的上升，包囊能够在溶液中悬浮并维持均匀分布的时间越长。悬浮时间的长短则直接影响到取样计数的便捷和准确性。在蔗糖溶液质量分数低于37.5％时，包囊悬浮时间较短，所以取样的样本结果随着时间推移误差愈来愈大；当蔗糖溶液质量分数大于37.5％时，虽然包囊悬浮时间较长，但部分个体微小的包囊会集中在溶液上层，导致包囊不能均匀分布，亦会导致计数结果出现较大误差。所以，相比较而言，质量分数为37.5％的蔗糖溶液作为包囊悬浮剂，能保证充分的包囊悬浮时间；并且，在该蔗糖质量分数时，计数的包囊总量更贴近真实的包囊数量。
表2.不同蔗糖溶液质量分数下包囊的计数结果
二、蔗糖悬浮法计数刺激隐核虫包囊的应用
(1)用上面步骤2的方法感染5尾石斑鱼。
(2)感染后第2天，将鱼体转移到100L养殖桶内，养殖桶内水面高度为60cm。
(3)待滋养体完全脱落后，将鱼体从桶内移出，同时将养殖桶内的水体倒出，最终保留约2L水体；用毛刷将包囊轻轻从桶底扫下，并转移到2L烧杯里，待包囊全部沉到杯底后，将水体全部去除，并向烧杯里加入100ml质量分数为37.5％的蔗糖溶液，将包囊和蔗糖溶液全部转移到150ml烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀。
(4)用移液枪从烧杯中取出20份1ml的蔗糖溶液，在解剖镜下对其中的包囊进行计数，取其平均数，从而得出1ml蔗糖溶液中的包囊数。
(5)根据上一步骤得出的1ml蔗糖溶液中的包囊数以及烧杯内的总水量，计算出包囊总量。
为核实蔗糖悬浮法计数包囊的准确率，在解剖镜下直接计数所收集的所有包囊数量。通过蔗糖悬浮法计数5尾鱼脱落的包囊数量为8500个，直接计数所有包囊数量为8637个。
Claims (1)
1.一种蔗糖悬浮法计数刺激隐核虫包囊的方法，其特征在于，包括以下歩骤：
(1)将感染刺激隐核虫后的鱼体转移到100L养殖桶内，养殖桶内水面高度为60cm；
(2)待滋养体脱落完全后，将鱼体从养殖桶内移出，同时将养殖桶内的水倒出，最终保留约2L水体；用毛刷将包囊轻轻从桶底扫下，并转移到2L烧杯里，待包囊全部沉到杯底后，将水体全部去除，并向烧杯内加入100ml质量分数为37.5％的蔗糖溶液，将包囊和蔗糖溶液全部转移到150ml烧杯中，搅拌均匀；
(3)用移液枪从烧杯中取出20份1ml的蔗糖溶液，在解剖镜下对其中的包囊进行计数，取其平均数，从而得出1ml蔗糖溶液中的包囊数；
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