CN110964802B - ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及预后评估中的应用 - Google Patents

ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及预后评估中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110964802B
CN110964802B CN201911095166.5A CN201911095166A CN110964802B CN 110964802 B CN110964802 B CN 110964802B CN 201911095166 A CN201911095166 A CN 201911095166A CN 110964802 B CN110964802 B CN 110964802B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cerebral hemorrhage
epsilon
hematoma
expansion
apoe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911095166.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110964802A (zh
Inventor
郭建文
张琪欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine filed Critical Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN201911095166.5A priority Critical patent/CN110964802B/zh
Publication of CN110964802A publication Critical patent/CN110964802A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110964802B publication Critical patent/CN110964802B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/775—Apolipopeptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及脑出血预后评估中的应用，并公开了检测ApoE基因型和/或检测ApoEε2等位基因的产品在制备用于脑出血急性期血肿再扩大和/或脑出血预后评估产品中的应用。ApoE基因的基因型、等位基因型与中国人群脑出血患者尤其是深部脑出血患者发病24小时时的颅内血肿再扩大相关，可作为中国人群脑出血患者尤其是深部脑出血患者急性期血肿再扩大相关的基因标志物，对脑出血患者的不良预后进行早期预警，避免严重不良预后。

Description

ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及预后评估中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及预后评估中的应用。
背景技术
脑出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是脑卒中的一种重要类型，其发病急促、病情进展快、致死致残率高，并发症多，临床预后欠佳。脑出血患者急性期颅内血肿再扩大是导致脑出血患者病情急剧恶化且预后不良的主要原因，积极有效的早期预警、早期干预防止血肿再扩大对降低脑出血病死率和致残率具有重要意义。国际上CT判断血肿再扩大标准规定，24小时后复查CT血肿体积V2较首次发病CT血肿体积V1增加量((V2-V1)/V1)超过33％，或血肿绝对增加量(V2-V1)不小于6mL，可认为血肿再扩大。
常规临床上以颅脑CT出血征象、各神经功能评分量表评分、临床症状等作为脑出血患者预后的参考信息，但标准难以完全统一、临床实际情况差异较大。已有研究表明，基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、细胞纤维连接蛋白(cellularfibronectin，c-Fn)、白细胞介素-6(IL-6)等血清分子标志物，以及血管性血友病因子(vonWillebrand factor)的单核苷酸多态性等均与脑出血后血肿再扩大具有相关性，但其于临床上对脑出血后血肿再扩大的预警作用仍颇具争议。目前仍缺少一种可以预测脑出血患者急性期血肿再扩大风险的可靠的检测方法。
ApoE(Apolipoprotein E)，即载脂蛋白E，为含有299个氨基酸的单链碱性多肽，主要存在于乳糜颗粒、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白中，维持胆固醇平衡以及血脂代谢，参与糖代谢并与神经元的生理活动相关。ApoE具有蛋白、基因多态性，人ApoE基因位于第19号染色体上，长臂13区2带，存在两个单核苷酸多态性，分别是rs429358和rs7412，含4个外显子和3个内含子，有3个等位基因ε2、ε3和ε4，六种基因型组合ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4和ε4/ε4，AopEε3型又称为野生型，三种基因型的不同之处主要在于基因第112位和第158位上，ε2型第112位和第158位上是半胱氨酸而ε4型第112位和第158位上是精氨酸，ε3型第112位上是半胱氨酸，第158位上是精氨酸，不同的AopE基因型代表着不同的多肽，作用也具有差异。
目前已有ApoE基因型与脑出血的发生的相关性研究，如：Biffi等人通过检测363名非脑叶出血的非裔美国人患者的ApoE基因型、血脂水平并随访是否出现复发非脑叶出血事件进行了人群遗传学研究，结果表明ε4型与复发性脑叶出血明显相关(P＝0.038)，但该项研究未结合饮酒情况进行分析，而非裔美国人人群饮酒习惯明显且酒精是脑出血发生的关键因素，因此该项研究的结果有待进一步研究和确认(Raffeld M.R.，Biffi A.，BatteyT.W.，et al.APOE epsilon4 and lipid levels affect risk of recurrent nonlobarintracerebral hemorrhage[J].Neurology，2015,85(4)：349-356)。林思宁检测了55例高血压性脑出血患者及20例高血压患者的ApoE基因型，结果表明ApoE基因型为ε2/ε4的中国人群为高血压性脑出血的高危人群(32.7％)，ε2、ε4等位基因与中国人群高血压性脑出血的发生相关，且ε4等位基因对年轻发病可能有促进作用(林思宁.APOE基因多态性与高血压脑出血的相关性研究[D].华北理工大学，2018:58.)。
脑出血的易发部位有脑叶、基底节、丘脑、脑干和脑室，深部脑出血一般是指出血部位发生在基底节、丘脑、小脑、中脑、脑桥，包括合并破入脑室者(不含单纯性脑室出血)。不同部位的脑出血的病因不同，基底节、丘脑、脑干等深部脑出血主要为高血压引起，而脑叶出血主要与脑淀粉样血管病有关。H.Bart Brouwers等以245名深部脑出血患者以及265名脑叶脑出血患者为研究对象对血肿再扩大的相关因素进行了研究，结果表明ApoEε2等位基因与脑叶脑出血患者的血肿再扩大相关(P＝0.009)，但对深部脑出血患者的血肿再扩大无影响(P＝0.37)；ApoEε4等位基因与脑叶出血患者、深部脑出血患者的血肿再扩大均无关(H.Bart Brouwers,Alessandro Biffi,et al.APOE Genotype Predicts HematomaExpansion in Lobar Intracerebral Hemorrhage.Stroke.2012；43(6):1490-1495.)。但上述研究的研究对象为欧美人群，而ApoE基因型因种族、地区不同而基因亚型分布差异较大，迄今为止，尚未发现有关于ApoE基因型作为中国人群脑出血患者急性期血肿再扩大预警基因的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及脑出血预后评估中的应用。
本发明发明人通过实验研究意外发现ApoE基因的基因型、等位基因型与中国人群脑出血患者急性期血肿再扩大相关，具体为，ApoEε2等位基因与中国人群脑出血患者急性期血肿再扩大相关(P＝0.021)，尤其是与中国人群深部脑出血患者急性期血肿再扩大相关(P＝0.011)，因此，ApoE基因的基因型、ApoEε2等位基因可作为中国人群脑出血患者急性期血肿再扩大相关的基因标志物，用于评估中国人群脑出血患者尤其是深部脑出血患者急性期血肿再扩大的发生风险。而脑出血患者发病早期的血肿再扩大已证实与临床不良预后相关，因此，临床上通过检测急性期脑出血患者的ApoE基因型或ε2等位基因型可对脑出血患者的不良预后进行早期预警，若存在ε2等位基因携带特别是ε2/ε2纯合子的患者，应密切关注其血肿扩大情况，必要时积极控制血压、颅内压等，避免严重不良预后。基于上述发现，从而完成本发明。
根据本发明的第一个方面，提供了检测ApoE基因型的产品在制备用于脑出血急性期血肿再扩大和/或脑出血预后评估的产品中的应用。
根据本发明的第二个方面，提供了检测ApoE基因型的产品在制备用于中国人群脑出血急性期血肿再扩大和/或脑出血预后评估的产品中的应用。
根据本发明的第三个方面，提供了检测ApoE基因型的产品在制备用于中国人群深部脑出血急性期血肿再扩大和/或脑出血预后评估的产品中的应用。
本发明中，检测ApoE基因型的产品可为本领域已知的任一种可以检测ApoE基因型的产品。在一些实施方式中，检测ApoE基因型的产品可以为通过下述至少一种方法检测样本中ApoE基因型的试剂、试剂盒、芯片和/或仪器：核酸测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或蛋白免疫技术。
本发明中，“样本”是指包含细胞或细胞物质的可以从中获取核酸的物质，如：全血、血清、外周血单个核细胞、痰、体液、分泌物(如乳汁)、拭子(如口腔拭子)、组织等。在一些实施方式中，样本可以为外周血全血。
本发明中，“核酸测序技术”是以基因碱基互补配对为理论基础，测定基因即DNA序列的技术，是进一步研究和改造目的基因的基础，主要包括Sanger法(双脱氧链末端终止法)和Maxam-Gilbert法(化学降解法)。
本发明中，“核酸杂交技术”是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)分子的特定序列(靶序列)，包括DNA杂交和RNA杂交技术。具体过程为DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。
本发明中，“核酸扩增技术”是一大类核酸扩增技术总称，包括常规PCR(聚合酶链式反应)、实时荧光PCR、等温核酸扩增、免疫PCR、原位PCR、毛细管PCR、巢式PCR、不对称PCR及复合PCR等技术。
本发明中，“蛋白免疫技术”是蛋白免疫印迹技术，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某特定种类蛋白的技术。
在一些实施方式中，检测样本中ApoE基因型的方法可以为核酸测序技术、实时荧光定量PCR、基因芯片技术及其他种类的PCR技术。
本发明中，“实时荧光定量PCR”是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法，是通过内参或外参法对待测样品中特定DNA序列进行定量分析的方法。
本发明中，“基因芯片技术”是基于杂交测序的理论基础及方法，通过一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一片基片表面固定了序列已知的靶核苷酸探针，与标记的样品分子进行杂交，通过检测探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，又称为DNA芯片技术或生物芯片技术。
在一些实施方式中，检测样本中ApoE基因型的方法可以为实时荧光定量PCR，样本为外周血全血，具体的，检测ApoE基因型的产品可以为ApoE实时荧光PCR分型试剂盒(苏州旷远生物分子技术有限公司，30人份/盒)。
在一些实施方式中，检测ApoE基因型的试剂盒可以包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒；其中，基因检测试剂盒包括检测ApoE不同基因型的引物、探针或基因芯片；蛋白质免疫检测试剂盒包括特异性结合ApoE不同基因型编码的蛋白的抗体、配体或蛋白质芯片。上述试剂盒可以为现有的商品化的用于检测ApoE基因型的试剂盒，如苏州旷远生物分子技术有限公司生产的ApoE实时荧光PCR分型试剂盒；也可以自行制备，试剂盒中的包含的引物、探针、芯片、抗体等均可以使用本领域技术人员已知的方法制备。
在一些实施方式中，检测ApoE基因型的芯片可以包括基因芯片、蛋白质芯片；其中，基因芯片包括针对ApoE不同基因型的引物或探针；蛋白质芯片包括特异性结合ApoE不同基因型编码的蛋白的抗体或配体。
根据本发明的第四个方面，提供了检测ApoEε2等位基因的产品在制备用于脑出血急性期血肿再扩大和/或脑出血预后评估的产品中的应用。
根据本发明的第五个方面，提供了检测ApoEε2等位基因的产品在制备用于中国人群脑出血急性期血肿再扩大和/或脑出血预后评估的产品中的应用。
根据本发明的第六个方面，提供了检测ApoEε2等位基因的产品在制备用于中国人群深部脑出血急性期血肿再扩大和/或脑出血预后评估的产品中的应用。
在一些实施方式中，检测ApoEε2等位基因的产品为通过下述至少一种方法确定ApoEε2等位基因存在的试剂、试剂盒、芯片和/或仪器：核酸测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或蛋白免疫技术。
在一些实施方式中，检测样本中ApoEε2等位基因的方法可以为核酸测序技术、实时荧光定量PCR、基因芯片技术及其他种类的PCR技术。
在一些实施方式中，检测样本中ApoE基因型的方法可以为实时荧光定量PCR。
本发明中，用于脑出血预后评估产品包括但不限于用于脑出血尤其是深部脑出血急性期颅内血肿再扩大和/或脑出血预后评估的试剂、试剂盒、芯片、仪器以及用于显示、分析脑出血急性期颅内血肿再扩大及预后评估结果和/或对评估结果进行预警的电子信息产品，如脑出血急性期血肿再扩大、不良预后预警系统、软件、APP等。
与现有技术相比，本申请的有益效果在于：提供了ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及脑出血预后评估中的应用，ApoEε2等位基因与中国人群脑出血患者急性期血肿再扩大相关(P＝0.021)，尤其是与中国人群深部脑出血患者急性期血肿再扩大相关(P＝0.011)，因此，ApoE基因的基因型、ApoEε2等位基因可作为中国人群脑出血患者急性期血肿再扩大相关的基因标志物，用于评估中国人群脑出血患者尤其是深部脑出血患者急性期血肿再扩大的发生风险。脑出血患者急性期的血肿再扩大与临床不良预后密切相关，临床上可使用检测ApoE基因型的产品制备用于中国人群脑出血尤其是深部脑出血急性期血肿再扩大和/或脑出血预后评估的产品，即通过使用检测ApoE基因型的产品(如ApoE实时荧光PCR分型试剂盒)检测急性期脑出血患者ApoE基因型或ε2等位基因型，对脑出血患者尤其是深部脑出血患者急性期血肿再扩大及不良预后进行早期预警，对于携带ε2等位基因、ε2/ε2纯合子的中国人群急性期脑出血患者，尤其是深部脑出血患者，应密切关注其血肿扩大情况，必要时积极控制血压、颅内压等，避免严重不良预后。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR法检测ApoE基因分型时的阳性扩增曲线参考图；
图2为实时荧光定量PCR法检测ApoE基因分型时的阴性扩增曲线参考图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或参照制造厂商所建议的条件；实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1ApoE基因型与脑出血患者急性期血肿再扩大的相关性
一、样本
收集218例中国急性期脑出血患者的病例资料及静脉全血标本，所有静脉全血使用EDTA试管抽取保存，冷链运输存放于广东省中医院生物资源中心实验室-20℃冰箱，冻融次数大于等于3次。纳入急性期脑出血病例的诊断均符合1995年中国全国第四届脑血管病学术会议修订的标准，并经过头颅CT平扫确诊。标准如下(中华神经科杂志,1996；29(6):376～38)：入院后6h内均经头颅CT证实为幕上出血(包括壳核、脑叶、丘脑出血)或幕下出血(包括中脑、脑桥、延髓、小脑出血)，并于入院后24h、10天后复查头颅CT，以第二次CT血肿量比第一次增加33％定义为血肿扩大。
将218例患者随机分成A、B、C共3组，其中，A组69例，B组72例，C组77例。试验期间，C组患者在西医常规基础治疗的基础上加用破血逐瘀中药颗粒，破血逐瘀中药颗粒由长春中医药大学国家临床研究基地提供；A组患者在西医常规基础治疗的基础上加用安慰剂，安慰剂用等剂量糊精、淀粉、苦味素等模拟成与破血逐瘀中药颗粒的外观、味道和重量等一致；B组患者在西医常规基础治疗的基础上加用去破血逐瘀中药颗粒，去破血逐瘀中药颗粒为在破血逐瘀中药方基础上去除水蛭、虻虫，不足药量用安慰剂补不足制得的颗粒剂。
对三组患者的性别、年龄、基础病史资料进行统计学分析，结果如表1～3所示，三组间性别、年龄、基础病史资料均无统计学差异，三组基线齐，具有可比性。
表1 A组、B组和C组性别比较
Figure BDA0002268100520000061
表2 A组、B组和C组年龄比较
Figure BDA0002268100520000062
Figure BDA0002268100520000063
Figure BDA0002268100520000071
表3 A组、B组和C组基础病史比较
Figure BDA0002268100520000072
注：*表示采用Fisher确切概率法。
二、方法
1、柱状法提取全血核酸DNA
利用血细胞基因组DNA提取试剂盒(上海百傲科技有限公司，12人份/盒)提取患者静脉全血标本的基因组DNA，提取时，考虑全血标本质量较差，标本需冻融后充分混匀再提取，提取过程中采用含蛋白酶K的裂解溶液裂解血细胞，释放出的DNA可特异性结合到硅基吸附柱上，通过洗脱去除杂质，获得高纯度的基因组DNA；此外，通过预实验证明，最后往吸附柱中加入洗脱液进行洗脱过程中，缩小洗脱液的用量，即洗脱液的用量由试剂盒说明书要求的60μL缩小为50μL，可以提高样品中DNA的浓度，使之适用于进行实时荧光PCR检测要求；其余提取步骤按照试剂盒说明书进行。提取到的DNA于-80℃储存备用，提取后2周内进行基因分型。
2、实时荧光PCR法检测ApoE基因分型
(1)实验原理：利用ApoE实时荧光PCR分型试剂盒(苏州旷远生物分子技术有限公司，30人份/盒)，ApoE基因分型采用荧光PCR法，原理分析采用Hixson方法。从人类外周全血中提取基因DNA后，用两段引物扩增ApoE外显子(引物采用试剂盒提供的引物)，片段长244bp。ApoE基因的112位和158位存在两个多态性酶切位点，分别为112位T/C，158位T/C，片段合成后使用限制性内切酶Hha I进行位点酶切消化(酶切位点5'-GCG↓C-3')，最后获得不同长度DNA片段。
(2)PCR体系配制：
按下表4反应体系所示配制ε2、ε3、ε4的PCR反应体系，试剂盒中试剂开盖前解冻后混匀，充分离心使泡沫小时，每次检测均保证质控品与空白品的对照设置，作为试剂的外部质量控制，空白对照为不加任何扩增模板，除空白对照以外的每份样本均要有内参基因扩增线才可视为扩增成功而进行分型读数。
检测样本类型为人类基因组DNA，即由患者静脉全血标本提取得到的基因组DNA；样本浓度为10ng/μL≤DNA浓度≤100ng/μL；样本纯度为1.7≤DNA OD260/OD280≤2.0。
表4 PCR体系配制
Figure BDA0002268100520000081
(3)PCR反应体系条件设置：
使用ABI 7500型号实时荧光定量PCR仪，设置FAM和VIC双通道采集荧光信号，结合参比信号选“None”。PCR反应体系条件设置如表5所示，PCR反应结束后，观察扩增曲线，分析Ct/Cp值数据。
阳性扩增曲线参考图如图1所示，图1表示内参基因和目的基因具有扩增，表明该等位基因型阳性。
阴性扩增曲线参考图如图2所示，图2表示内参基因扩增而等位基因无扩增，表明该等位基因型阴性。
表5 PCR反应体系条件设置
Figure BDA0002268100520000082
Figure BDA0002268100520000091
三、结果
1、三组合并共218例急性期脑出血患者ApoE基因型频率分布如表6所示，其中，ε3/ε3型所占比例最高，为69.3％，其次为ε2/ε3型，占比率最低的为ε2/ε2型，占0.5％。
表6三组整体ApoE基因型频率
ε2/ε2 ε2/ε3 ε2/ε4 ε3/ε3 ε3/ε4 ε4/ε4 总计
频数 1 34 2 151 28 2 218
频率％ 0.5％ 15.6％ 0.9％ 69.3％ 12.8％ 0.9％ 100％
由表6的结果可知，中国人群急性期脑出血人群的ApoE基因型占比(比率应当考虑允许的约5％波动范围)为：ε2/ε2＝0.5％，ε2/ε3＝15.6％，ε2/ε4＝0.9％，ε3/ε3＝69.3％，ε3/ε4＝12.8％，ε4/ε4＝0.9％。
2、三组各自基因型频数及频率分布如表7所示，三组均以ε3/ε3型数量最多，其中，B组基因型为ε2/ε2、ε2/ε4、ε4/ε4的数量为0，C组基因型为ε2/ε2、ε2/ε4、ε4/ε4的数量为1，A组没有ε2/ε2基因型。
表7各组ApoE基因型频率
Figure BDA0002268100520000092
3、三组急性期脑出血患者ApoE等位基因频率分布如表8所示，其中，等位基因频率＝该等位基因纯合子频率+1/2杂合子频率，故ε2等位基因频率＝ε2/ε2+1/2(ε2/ε3+ε2/ε4)，ε3等位基因频率＝ε3/ε3+1/2(ε2/ε3+ε3/ε4)，ε4等位基因频率＝ε4/ε4+1/2(ε3/ε4+ε2/ε4)，三组间以等位基因频数为加权系数，进行卡方检验，P值＝0.456>0.05，三组间等位基因频率无统计学差异，具有可比性。
表8急性期脑出血患者ApoE等位基因频率
Figure BDA0002268100520000101
由表8的结果可知，中国人群急性期脑出血人群的ApoE等位基因占比(比率应当考虑允许的约5％到10％波动范围)为，ε2＝8.72％，ε3＝83.49％，ε4＝7.80％。
4、以发病24小时颅脑CT与纳入基线CT对比，颅内血肿体积扩大33％，或绝对值>6mL定义为血肿再扩大，24小时后血肿扩大一共25例(n＝218，其中2病例未有记录，故共分析216例)。25例发病24小时后颅内血肿再扩大患者颅脑CT出血部位统计情况如表9所示，25例中脑叶出血病例为0，最多为基底节区出血，共17例，其次为丘脑出血，共5例，小脑出血为2例，脑桥出血为1例，25例发病24小时后颅内血肿再扩大患者均为深部脑出血患者。
表9 25例发病24小时后颅内血肿再扩大患者颅脑CT出血部位统计情况
Figure BDA0002268100520000102
5、各组急性期脑出血患者24小时血肿再扩大情况如表10所示。
表10各组急性期脑出血患者24小时血肿再扩大情况
24小时血肿 A组(％) B组(％) C组(％)
扩大 8(11.594) 8(11.268) 9(11.842)
未扩大 61(88.406) 63(88.732) 67(88.158)
由表10的结果可知，三组各自的急性期脑出血患者的24小时血肿再扩大率差不多，三组间急性期脑出血患者的血肿扩大率无统计学差异。
6、急性期脑出血患者ApoE基因型与24小时血肿再扩大关系如表11所示。表11为所有病例血肿是否扩大与基因型的关系，各基因分型与血肿是否扩大采用Fisher确切概率法，P值＝0.125>0.05，无统计学意义。
表11急性期脑出血患者ApoE基因型与24小时血肿再扩大关系
Figure BDA0002268100520000111
注：*表示采用Fisher确切概率法。
由表11的内容可知，中国人群急性期脑出血人群24小时血肿再扩大病例的ApoE基因型占比(比率应当考虑允许的约5％波动范围)为：ε2/ε3＝20.59％，ε3/ε3＝10％，ε3/ε4＝7.41％。ε2/ε2、ε2/ε4和ε4/ε4基因型患者基数较少，数据不具代表性。
7、急性期脑出血患者ApoE等位基因频数与24小时血肿再扩大关系见表12。表12为ApoE三个等位基因ε2、ε3、ε4频率与发病24小时颅脑CT血肿是否再扩大关系分析，由表12的结果可知，等位基因ε2的频率与24小时血肿是否扩大的相关性分析采用Fisher确切概率法，P值＝0.021<0.05，差异有统计学意义，说明脑出血急性期血肿是否扩大与ApoEε2等位基因相关；等位基因ε3频率与24小时血肿是否扩大的相关性分析采用卡方检验，ε4频率与24小时血肿是否扩大的相关性分析采用Fisher确切概率法，P值均>0.05，差异无统计学意义，脑出血患者急性期24小时血肿是否扩大与ε3、ε4等位基因未见相关性。
表12急性期脑出血患者ApoE等位基因频数与24小时血肿再扩大关系
24小时血肿 ε2(％) ε3(％) ε4(％)
扩大 9(23.684) 39(10.803) 2(6.061)
未扩大 29(76.316) 322(89.197) 31(93.939)
<![CDATA[χ<sup>2</sup>]]> 1.275
P <![CDATA[0.021<sup>*</sup>]]> 0.259 <![CDATA[0.237<sup>*</sup>]]>
注：*表示采用Fisher确切概率法。等位基因频数＝该等位基因纯合子数×2+含该等位基因杂合子数，百分比为24小时血肿扩大/未扩大的等位基因在该等位基因整体中所占比率。
由表12的结果可知，中国人群急性期脑出血患者ApoE等位基因在发病24小时血肿扩大率(比率应当考虑允许的约5％波动范围)为：ε2＝23.68％，ε3＝10.80％，ε4＝5.71％；其中，扩大率＝24小时颅脑CT血肿扩大总人数/纳入总人数。
8、在剔除17例急性期非深部脑出血患者后(剔除类型包括脑叶出血)，对一共199例急性期深部脑出血患者的ApoE基因型与24小时血肿再扩大关系进行分析，急性期深部脑出血患者ApoE基因型与24小时血肿再扩大关系如表13所示，采用Fisher确切概率法，P值＝0.092>0.05，无统计学意义。
表13急性期深部脑出血患者ApoE基因型与24小时血肿再扩大关系
Figure BDA0002268100520000121
注：*表示采用Fisher确切概率法。
由表13的内容可知，中国人群急性期深部脑出血人群24小时血肿再扩大病例的ApoE基因型占比(比率应当考虑允许的约5％波动范围)为：ε2/ε3＝24.14％，ε3/ε3＝10.56％，ε3/ε4＝8.33％。ε2/ε2、ε2/ε4和ε4/ε4基因型患者基数较少，数据不具代表性。
9、199例急性期深部脑出血患者的ApoE等位基因频数与24小时血肿再扩大关系见表14。由表14的结果可知，等位基因ε2的频率与24小时血肿是否扩大的相关性分析采用Fisher确切概率法，P值＝0.011<0.05，差异有统计学意义，说明深部脑出血急性期血肿是否扩大与ApoEε2等位基因相关，等位基因ε3频率与24小时血肿是否扩大的相关性分析采用卡方检验，ε4频率与24小时血肿是否扩大的相关性分析采用Fisher确切概率法，P值均>0.05，差异无统计学意义，深部脑出血急性期24小时血肿是否扩大与ε3、ε4等位基因频率未见相关性。
表14急性期深部脑出血患者ApoE等位基因频数与24小时血肿再扩大关系
Figure BDA0002268100520000122
Figure BDA0002268100520000131
注：*表示采用Fisher确切概率法。等位基因频数＝该等位基因纯合子数×2+含该等位基因杂合子数，百分比为24小时血肿扩大/未扩大的等位基因在该等位基因整体中所占比率。
由表14结果可知，中国人群急性期深部脑出血患者ApoE等位基因在发病24小时血肿扩大率(比率应当考虑允许的约5％波动范围)为：ε2＝28.13％，ε3＝11.57％，ε4＝6.90％。
由表9～表14的结果可知：
(1)216例急性期脑出血患者中，脑叶出血患者17例，深部脑出血患者共199例，血肿再扩大的总例数是25例，总体扩大率约为11.57％，其中，25例血肿再扩大患者均为深部脑出血患者。
(2)在急性期深部脑出血患者中，ApoE基因型与24小时血肿是否扩大的分析结果未提示ApoE基因型与24小时血肿是否扩大具有统计学意义，但从构成比上可知，ε2/ε3型血肿扩大比例较ε3/ε3型(10.56％)和ε3/ε4(8.33％)型高，约为24.14％(ε2ε2、ε2ε4、ε4ε4基因型除外，病例数太少，不予统计其比例)。
(3)等位基因频率与急性期脑出血患者24小时血肿是否扩大的相关性分析结果表明ApoE各等位基因的差异与脑出血急性期血肿再扩大相关，其中，含有ε2等位基因的病例扩大率最高，约23.68％，等位基因ε2的频率与急性期脑出血患者24小时血肿是否扩大具有相关性(P＝0.021)；在急性期深部脑出血患者中，含有ε2等位基因的病例扩大率最高，为28.13％，等位基因ε2的频率与急性期深部脑出血患者24小时血肿是否扩大具有相关性(P＝0.011)。
因此，可以通过检测急性期脑出血患者ApoE基因型、ApoEε2等位基因对脑出血患者尤其是深部脑出血患者急性期血肿再扩大及不良预后进行早期预警。
此外，实验过程中，还分析了不同基因型患者在入组基线(发病6小时内)、24小时、10天及90天的NIHSS评分变化。其中，基因型为ε2/ε2的患者在C组有1例，入组时NIHSS评分为12分，24小时后明显升高为37分，治疗过程中，随访至90天，NIHSS评分仍然为37分。基因型为ε2/ε4的患者在A组和C组中各1例，A组中该基因型患者基线NIHSS评分较低，为2分，病情较轻，NIHSS评分稳定下降，24小时后降至0分，10天及90天时保持稳定水平未有升高；C组中该基因型患者NIHSS评分于24小时后即升高明显，由入组时的7分升高至13分，但10天及90天时保持稳定水平未有升高。基因型为ε4/ε4的患者在A组和C组中也各1例，A组的该基因型患者NIHSS评分明显升高，入组时为6分，24小时时为14分，10天时为18分，90天时较第10天下降，但仍为14分；C组中该基因型患者NIHSS评分在第10天时下降明显，由入组时和24小时时的12分下降为1分，90天时未见升高，为0分；但上述基因型患者但因例数太少，不能明确其统计学关系。A、B、C组中基因型分别为ε2/ε3、ε3/ε3、ε3/ε4的患者的NIHSS评分，各组内患者的NIHSS评分随时间节点的下降统计P均<0.05，具有统计学意义，而三组组间各时间节点比较采用秩和检验，P值均>0.05，差异无统计学意义。
上述结果结合上述(2)和(3)的结论可知，ε2等位基因型与中国人群急性期脑出血患者尤其是急性期深部脑出血患者发病24小时血肿再扩大明显相关，即ε2等位基因型与中国人群急性期脑出血患者尤其是急性期深部脑出血患者的不良预后明显相关，因此，临床上可通过检测急性期脑出血患者ApoE基因型或ε2等位基因型对脑出血患者尤其是深部脑出血患者急性期血肿再扩大及不良预后进行早期预警，对于携带ε2等位基因的中国人群急性期脑出血患者，临床上血压管理、颅内压调控、抗凝药物、活血化瘀、破血逐瘀中药或中成药等可能加大再出血风险的药物和治疗措施，都应当更加严谨，对于此类病例，应当密切关注其神经功能缺损情况，积极改善不良预后；对于基因型为ε2/ε2的患者，更要密切关注其血肿扩大情况，必要时积极控制血压、颅内压等，避免严重不良预后。
基于本发明的上述发现，可将ApoE基因应用于制备用于脑出血尤其是深部脑出血急性期血肿再扩大及脑出血预后评估的产品中，具体可以为将检测ApoE基因型和/或检测ApoEε2等位基因的产品应用于制备用于脑出血急性期血肿再扩大及脑出血预后评估的产品，其中，用于脑出血急性期血肿再扩大及脑出血预后评估的产品包括但不限于用于脑出血预后评估的试剂、试剂盒、芯片、仪器以及用于显示、分析脑出血急性期血肿再扩大及脑出血预后评估结果和/或对评估结果进行预警的电子信息产品，如脑出血急性期血肿再扩大、不良预后预警系统、软件、APP等。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.检测ApoEε2等位基因的产品在制备用于中国人群深部脑出血急性期血肿再扩大评估的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测ApoEε2等位基因的产品为通过下述至少一种方法确定ApoEε2等位基因存在的试剂、试剂盒、芯片和/或仪器：核酸测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或蛋白免疫技术。
CN201911095166.5A 2019-11-11 2019-11-11 ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及预后评估中的应用 Active CN110964802B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911095166.5A CN110964802B (zh) 2019-11-11 2019-11-11 ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及预后评估中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911095166.5A CN110964802B (zh) 2019-11-11 2019-11-11 ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及预后评估中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110964802A CN110964802A (zh) 2020-04-07
CN110964802B true CN110964802B (zh) 2023-05-02

Family

ID=70030358

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911095166.5A Active CN110964802B (zh) 2019-11-11 2019-11-11 ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及预后评估中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110964802B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105907881A (zh) * 2016-07-01 2016-08-31 北京泱深生物信息技术有限公司 基因标志物在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2555259A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-09 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with stroke, methods of detection and uses thereof
US7799530B2 (en) * 2005-09-23 2010-09-21 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof
CN110066871A (zh) * 2019-06-04 2019-07-30 中国人民解放军联勤保障部队第九八0医院 高血压性脑出血的早期诊断标志物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105907881A (zh) * 2016-07-01 2016-08-31 北京泱深生物信息技术有限公司 基因标志物在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN110964802A (zh) 2020-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210108266A1 (en) Method for discovering pharmacogenomic biomarkers
US6140047A (en) Method and kit for predicting susceptibility to asthma
US9938579B2 (en) Biomarker panel for diagnosis and prediction of graft rejection
KR20100016525A (ko) 녹내장 진행 리스크의 판정 방법
CN102459651A (zh) 测定对免疫调节组合物治疗的应答的方法
US11339438B2 (en) Method for assessing the risk of complications in patients with systemic inflammatory response syndrome (sirs)
WO2006107031A1 (ja) 遺伝子一塩基多型解析によるアトピー性皮膚炎の相対罹患危険率の検出方法
CN101245392B (zh) 一种预测出血性脑卒中易感性的方法及试剂盒
JP2014511691A (ja) ベータセラセミア形質新規関連マーカー
CN110964802B (zh) ApoE基因在脑出血急性期血肿再扩大及预后评估中的应用
JP2014193155A (ja) アトピー性疾患の発症又は重症化リスクの評価法
US20130035240A1 (en) Markers for Obesity and Methods of Use Thereof
US6248533B1 (en) Gene diagnosis of diseases wherein TNF-α promotors participate
KR102158713B1 (ko) Gba 유전자의 단일염기다형성을 포함하는 뇌동맥류 진단용 snp 마커
WO2011066527A1 (en) Zinc status biomarker materials and related methods
Aung et al. Aminopeptidase A (ENPEP) gene polymorphisms and preeclampsia: Descriptive analysis
JP2016178898A (ja) 非アルコール性脂肪性肝疾患及び／又は非アルコール性脂肪肝炎の発症リスク及び／又は重症化リスクの判定方法、並びに該判定用オリゴヌクレオチドキット
US20220259661A1 (en) Kit for assessing the risk of complications in patients with systemic inflammatory response syndrome (sirs)
CN107446921B (zh) Thsd7a基因序列及表达改变检测及其在冠心病预测中的应用
KR102158725B1 (ko) Mink1 유전자의 단일염기다형성을 포함하는 뇌동맥류 진단용 snp 마커
KR101774996B1 (ko) 혈우병 치료제의 효능 예측 마커 및 이의 용도
KR102158716B1 (ko) Arhgap32 유전자의 단일염기다형성을 포함하는 뇌동맥류 진단용 snp 마커
Khin Sandar Association Between Angiotensinogen Gene M235T Polymorphism and Plasma Angiotensinogen Level in Essential Hypertension
JP4649181B2 (ja) 喘息の遺伝的素因検査方法
KR20230101467A (ko) 식습관에 따른 비만 위험도 예측용 단일 염기 다형성 바이오마커 및 이의 이용

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant