CN110964642B - 一种控制小球藻规模化培养污染菌的方法及制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种控制小球藻规模化培养污染菌的方法，其通过将植物提取液加入到小球藻培养体系中，以控制和/或减少其它污染杂菌数量，进而促进小球藻的生长。植物提取液包括虎杖提取物和沉香提取液，虎杖提取物与沉香提取液的重量份数比为1:8‑20。本发明采用虎杖提取物与沉香提取液在小球藻的培养体系中，不仅清除了杂菌，而且增加了小球藻的抗污染性能，虎杖提取物对小球藻的生长和抗菌性具有促进作用，沉香提取液对小球藻的生长没有抑制作用。

Description

一种控制小球藻规模化培养污染菌的方法及制剂
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用生物方法控制小球藻规模化培养中其它污染菌，进而促进小球藻生长的方法。
背景技术
作为最简单的光合作用有机体之一，小球藻是人类最早能够培养的微藻，其不仅生长快，而且富含蛋白质、多糖和维生素及小球藻生长因子等多种营养和生物活性成分，已受到国内外的普遍关注，在人类保健食品、生物能源和环境治理等方面均有广泛应用。
一般来说小球藻培养有光照自养、混养和无光照异养培养3种方式，但无论是实验室还是产业化大规模培养均不可避免地存在不同程度的细菌污染情况。因为细菌可通过与小球藻竞争营养、分泌抑藻物质和溶解藻细胞等方式抑制小球藻的生长，因此会对小球藻的培养生产造成巨大损失。目前，小球藻培养中控制杂菌的方法主要有物理法和化学法，物理法主要包括离心和过滤，化学法主要包括添加杀菌剂和抗生素。无论是物理还是化学方法均造成使用效果不明显、杀菌剂和抗生素污染环境且影响藻细胞蛋白质量等一系列问题，至今小球藻培养细菌污染尚未有一种很好的解决办法，是制约小球藻产业化生产的科研难题。自然植物产品控制法或生物制剂来控制杂菌污染的方式尚未有任何报导。
发明内容
本发明目的是针对制约小球藻产业化生产的难题，提供一种利用生物或生物制剂控制小球藻培养中细菌污染的方法。该方法通过在小球藻培养过程中同时用特殊方法培养来控制小球藻培养中其它细菌的数量，从而提高小球藻的生长。该方法性能稳定，能够应用于产业化。
为达以上目的，本发明提供一种控制小球藻规模化培养污染菌的方法，其通过将植物提取液加入到小球藻培养体系中，以控制和/或减少其它污染杂菌数量，进而促进小球藻的生长。
所述植物提取液包括虎杖提取物和沉香提取液，虎杖提取物与沉香提取液的重量份数比为1:8-20。
虎杖提取物和沉香提取液的总重量与小球藻的培养体系的重量比为1:20-80。
所述虎杖提取物的制备方法为：a)绿植前处理：虎杖在400-900nm强度为2100lex的强度下照射30-50小时；b)粉碎前处理：将虎杖烘干作为原料粉碎；c)提取：将破碎后的原料置于原料重量13倍的35％乙醇中提取2次，温度为60-80℃；d)浓缩、过滤：将提取液浓缩、过滤；e)将d)用AB-8型号树脂进行吸附，用去离子水清洗树脂至流出液为无色，然后依次用10％醇、20％醇、40％醇、60％醇、100％不同浓度的乙醇溶液分次进行洗脱分离，将40％醇部分减压浓缩喷雾至粉末状，其中虎杖苷的重量含量为30-35％；白藜芦醇重量含量之和为2-5％。
所述沉香提取液的制备方法为：a)原料处理：将沉香木采用超微粉碎设备进行粉碎处理制备得到粒度为70目的超微沉香木粉末；b)提取：将甘油、丙二醇、80％乙醇水溶液按质量比2：2：1混合作为提取溶剂，将原料与溶剂按照质量比1:5-8混合，进行提取，提取温度为60-80℃、提取时间为50-90min，得到提取初液；c)浓缩：将初提液转移至真空旋转蒸发仪中，控制真空度30mbar、浓缩温度70℃，旋转速度50rad/min进行浓缩，得到折光度为52-57.0％的浓缩液，即沉香提取液。
所述的沉香木从植株上取下后用混合溶液浸泡，然后晾干，再烘干粉碎，烘干的温度为80-120℃，混合溶液的配制方法为：0.3～0.8mg/L的6-苄氨基嘌呤，浓度为0.5～0.9mg/L的萘乙酸，0.1mg/L的赤霉素，按照重量份数比1:3:1配制成混合溶液。
一种控制小球藻规模化培养污染菌的制剂，包括白藜芦醇和沉香螺萜醇，重量份数比为3-8:1，制剂在小球藻培养体系的占比为：30-50ppm。
优选地，还包括可以促进小球藻生长的虎杖苷，虎杖苷与白藜芦醇的重量比为16-6:1。
优选地，虎杖苷与白藜芦醇的重量比为16-6:1
优选地，虎杖苷、白藜芦醇和沉香螺萜醇的重量比为66:7:1。
本发明与现有技术不同之处在于本发明取得了如下技术效果：
1、本发明采用虎杖提取物与沉香提取液在小球藻的培养体系中，不仅清除了杂菌，而且增加了小球藻的抗污染性能，虎杖提取物对小球藻的生长和抗菌性具有促进作用，沉香提取液对小球藻的生长没有抑制作用。
2、本发明的原材料虎杖通过特殊的处理，虎杖苷和白藜芦醇的含量与现有的虎杖不同，这一比例更好的促进小球藻在培养体系中的生长。
3、本发明的原材料沉香木也经过特殊处理，处理后的沉香螺萜醇含量会提高15％左右，更好的实现培养体系内控制污染菌的功能。
4、经过试验发现，白藜芦醇和沉香螺萜醇对小球藻的培养体系污染菌控制具有很好的效果，然而按照配方将虎杖苷、白藜芦醇和沉香螺萜醇按照特定比例混合，得到的小球藻规模化培养过程中具有持续的抗菌能力。
附图说明
图1为实施例1和实施例2小球藻细胞浓度变化示意图；
图2为实施例1和实施例2杂菌细胞浓度变化示意图；
图3为实施例3小球藻细胞浓度和杂菌细胞浓度变化示意图；
图4为实施例2和实施例4杂菌细胞浓度变化示意图；
图5为实施例2和实施例4小球藻细胞浓度变化示意图
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对分发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
制备虎杖提取物：a)绿植前处理：虎杖在400-900nm强度为2100lex的强度下照射30-50小时；b)粉碎前处理：将虎杖烘干作为原料粉碎；c)提取：将破碎后的原料置于原料重量13倍的35％乙醇中提取2次，温度为60-80℃；d)浓缩、过滤：将提取液浓缩、过滤；e)将d)用AB-8型号树脂进行吸附，用去离子水清洗树脂至流出液为无色，然后依次用10％醇、20％醇、40％醇、60％醇、100％不同浓度的乙醇溶液分次进行洗脱分离，将40％醇部分减压浓缩喷雾至粉末状，其中虎杖苷的重量含量为30-35％；白藜芦醇重量含量之和为2-5％。
制备用于沉香木处理的混合溶液：0.3～0.8mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.5～0.9mg/L的萘乙酸，0.1mg/L的赤霉素，按照重量份数比1:3:1配制成混合溶液。
制备沉香提取液：a)原料处理：将混合液处理的沉香木采用超微粉碎设备进行粉碎处理制备得到粒度为70目的超微沉香木粉末；b)提取：将甘油、丙二醇、80％乙醇水溶液按质量比2：2：1混合作为提取溶剂，将原料与溶剂按照质量比1:5-8混合，进行提取，提取温度为60-80℃、提取时间为50-90min，得到提取初液；c)浓缩：将初提液转移至真空旋转蒸发仪中，控制真空度30mbar、浓缩温度70℃，旋转速度50rad/min进行浓缩，得到折光度为52-57.0％的浓缩液，即沉香提取液。
实施例第一部分：为了更好的测试控制小球藻规模化培养污染菌的方法和现有的杀菌剂对小球藻培养体系的处理效果，实施例第一部分将控制小球藻规模化培养污染菌的方法和杀菌剂处理效果进行对比，具体如下：
实施例1：在小球藻培养过程中未添加任何处理液体的条件下，培养13天后椭圆小球藻细胞浓度从6.0×106个/mL增加到3.6×107个/mL(参考附图1)，与此同时椭圆小球藻培养物中污染杂菌细胞浓度从初始的5.6×106个/mL增加到7.8×107个/mL(参考附图 2)。此结果说明在小球藻培养过程中，伴随着小球藻的生长，污染杂菌也在进一步生长。
统计细胞数量的污染杂菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和大肠杆菌。
实施例2：
在小球藻培养过程中加入制备的虎杖提取物和沉香提取液，其中虎杖提取物和沉香提取液的原材料经过说明书中描述的特殊处理，虎杖提取物与沉香提取液的重量份数比为1:10，虎杖提取物和沉香提取液的总重量与小球藻的培养体系的重量比为1:30；培养 13天后椭圆小球藻细胞浓度从6.0×106个/mL增加到4.8×108个/mL(参考附图1)，与此同时椭圆小球藻培养物中污染杂菌细胞浓度从初始的5.6×106个/mL减少到4.8×104个/mL(参考附图2)。此结果说明在小球藻培养过程中，伴随着小球藻的生长，污染杂菌得到了有效的控制。
Figure BDA0002285038360000041
Figure BDA0002285038360000042
实施例3：
在小球藻培养过程中加入现有的杀菌剂代森锰锌，培养11天后椭圆小球藻细胞浓度从6.0×106个/mL增加到5.2×107个/mL，与此同时椭圆小球藻培养物中污染杂菌细胞浓度从初始的5.6×106个/mL在第三天减少到6.2×105个/mL，然后开始增加在第11天时浓度达到3.6×107个/mL(参考附图3)。此结果说明在实施例3的小球藻培养过程中，伴随着小球藻的生长，污染杂菌最初得到抑制，但随后污染杂菌的浓度反弹。
通过实施例1-3的试验数据可以得出，本发明的控制污染菌的方法与现有杀菌剂相比具有明显的优势，污染杂菌不反弹。
实施例第二部分：本发明中原料虎杖和沉香不经过特殊处理的控制小球藻规模化培养污染菌的方法与现有技术中采用用噬菌蛭弧菌控制小球藻培养中细菌污染的方法进行对比，具体如下：
实施例4：采用本案权利人在2018年1月份申请的201810030528.1方法进行。
将实施例2和实施例4的小球藻细胞浓度和污染杂菌的浓度进行统计，结果见下表及附图4
Figure BDA0002285038360000051
通过以上数据可以看出，实施例2实施例与实施例4相比，在小球藻细胞生长速度以及杂菌控制效率方面有了很大的提升。
实施例第三部分：本发明中采用没有特殊处理的原材料的控制小球藻规模化培养污染菌的方法进行处理的具体数据：
实施例5：在小球藻培养过程中加入制备的虎杖提取物和沉香提取液，其中虎杖提取物和沉香提取液的原材料均没有经过说明书中描述的特殊处理，虎杖提取物与沉香提取液的重量份数比为1:10，虎杖提取物和沉香提取液的总重量与小球藻的培养体系的重量比为1:30。
Figure BDA0002285038360000052
Figure BDA0002285038360000061
培养11天后椭圆小球藻细胞浓度从6.0×106个/mL增加到6.8×107个/mL(参考附图1)，与此同时椭圆小球藻培养物中污染杂菌细胞浓度从初始的5.6×106个/mL减少到2.1×105个/mL。此结果说明在小球藻培养过程中，伴随着小球藻的生长，污染杂菌得到了控制，但与实施例2相比，控制杂菌的效率较低。
实施例6：在小球藻培养过程中加入制备的虎杖提取物和沉香提取液，其中虎杖提取物为实施例2中特殊处理过得原材料制得，沉香提取液的原材料没有经过说明书中描述的特殊处理，虎杖提取物与沉香提取液的重量份数比为1:10，虎杖提取物和沉香提取液的总重量与小球藻的培养体系的重量比为1:30。
Figure BDA0002285038360000062
培养11天后椭圆小球藻细胞浓度从6.0×106个/mL增加到7.6×107个/mL(参考附图1)，与此同时椭圆小球藻培养物中污染杂菌细胞浓度从初始的5.6×106个/mL减少到2.1×105个/mL。此结果说明在小球藻培养过程中，伴随着小球藻的生长，污染杂菌得到了控制，通过后期继续的试验，实施例6和实施例5数据接近，但与实施例2相比，控制杂菌的效率较低。
实施例7：实施例6：在小球藻培养过程中加入制备的虎杖提取物和沉香提取液，其中沉香提取液为实施例2中特殊处理过得原材料制得，虎杖提取物的原材料没有经过说明书中描述的特殊处理，虎杖提取物与沉香提取液的重量份数比为1:10，虎杖提取物和沉香提取液的总重量与小球藻的培养体系的重量比为1:30。
Figure BDA0002285038360000071
培养11天后椭圆小球藻细胞浓度从6.0×106个/mL增加到1.1×108个/mL(参考附图1)，与此同时椭圆小球藻培养物中污染杂菌细胞浓度从初始的5.6×106个/mL减少到6.0×104个/mL。此结果说明在小球藻培养过程中，伴随着小球藻的生长，污染杂菌得到了较为有效的控制，通过后期继续的试验，实施例7比实施例5和6的对杂菌控制以及促进小球藻生长效果明显，但与实施例2相比，控制杂菌的效率较低。
实施例第四部分：本发明中不同比例配方的制剂进行控制得到的数据：
实施例8：在小球藻培养体系中加入白藜芦醇和沉香螺萜醇组成的制剂，白藜芦醇和沉香螺萜醇重量份数比为3:1，制剂在小球藻培养体系的占比为：50ppm。培养20天后统计小球藻细胞浓度和污染杂菌细胞浓度。
实施例9：在小球藻培养体系中加入白藜芦醇和沉香螺萜醇组成的制剂，白藜芦醇和沉香螺萜醇重量份数比为5:1，制剂在小球藻培养体系的占比为：45ppm。培养20天后统计小球藻细胞浓度和污染杂菌细胞浓度。
实施例10：在小球藻培养体系中加入白藜芦醇和沉香螺萜醇组成的制剂，白藜芦醇和沉香螺萜醇重量份数比为8:1，制剂在小球藻培养体系的占比为：35ppm。培养20天后统计小球藻细胞浓度和污染杂菌细胞浓度。
实施例11：在小球藻培养体系中加入白藜芦醇、沉香螺萜醇和虎杖苷组成的制剂，虎杖苷、白藜芦醇和沉香螺萜醇的重量比为66:7:1，制剂在小球藻培养体系的占比为：40ppm。培养20天后统计小球藻细胞浓度和污染杂菌细胞浓度。
实施例12：在小球藻培养体系中加入白藜芦醇、沉香螺萜醇和虎杖苷组成的制剂，虎杖苷、白藜芦醇和沉香螺萜醇的重量比为90:10:1，制剂在小球藻培养体系的占比为：40ppm。培养20天后统计小球藻细胞浓度和污染杂菌细胞浓度。
实施例13：在小球藻培养体系中加入白藜芦醇、沉香螺萜醇和虎杖苷组成的制剂，虎杖苷、白藜芦醇和沉香螺萜醇的重量比为110:14:1，制剂在小球藻培养体系的占比为：40ppm。培养20天后统计小球藻细胞浓度和污染杂菌细胞浓度。
实施例14：在小球藻培养体系中加入白藜芦醇、沉香螺萜醇和虎杖苷组成的制剂，虎杖苷、白藜芦醇和沉香螺萜醇的重量比为150:10:1，制剂在小球藻培养体系的占比为：40ppm。培养20天后统计小球藻细胞浓度和污染杂菌细胞浓度。
实施例15：在小球藻培养体系中加入白藜芦醇、沉香螺萜醇和虎杖苷组成的制剂，虎杖苷、白藜芦醇和沉香螺萜醇的重量比为50:6:1，制剂在小球藻培养体系的占比为：40ppm。培养20天后统计小球藻细胞浓度和污染杂菌细胞浓度。
实施例16：在小球藻培养体系中加入白藜芦醇、沉香螺萜醇和虎杖苷组成的制剂，虎杖苷、白藜芦醇和沉香螺萜醇的重量比为30:4:1，制剂在小球藻培养体系的占比为：40ppm。培养20天后统计小球藻细胞浓度和污染杂菌细胞浓度。
将实施例8-16处理的汉麻结果进行统计，结果如下：
Figure BDA0002285038360000081
通过以上实施例可以得出，实施例11的小球藻细胞浓度增长倍数明显高于实施例8-10和实施例12-16，污染杂菌细胞增长率方面，实施例11的控制效果最好，实施例8-10 和实施例12-16也有很好的控制效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种控制小球藻规模化培养污染菌的方法，通过将植物提取液加入到小球藻培养体系中，以控制和/或减少污染杂菌数量，进而促进小球藻的生长；所述植物提取液包括虎杖提取物和沉香提取液，虎杖提取物与沉香提取液的重量份数比为1:8-20；其特征在于：所述虎杖提取物的制备方法为：a)绿植前处理：虎杖在400-900nm强度为2100lux 的强度下照射30-50小时；b)粉碎前处理：将虎杖烘干作为原料粉碎；c)提取：将破碎后的原料置于原料重量13倍的35％乙醇中提取2次，温度为60-80℃；d)浓缩、过滤：将提取液浓缩、过滤；e)将d)用AB-8型号树脂进行吸附，用去离子水清洗树脂至流出液为无色，然后依次用10％醇、20％醇、40％醇、60％醇、100％不同浓度的乙醇溶液分次进行洗脱分离，将40％醇部分减压浓缩喷雾至粉末状，其中虎杖苷的重量含量为30-35％；白藜芦醇重量含量之和为2-5％；所述沉香提取液的制备方法为：a)原料处理：将沉香木采用超微粉碎设备进行粉碎处理制备得到粒度为70目的超微沉香木粉末；b)提取：将甘油、丙二醇、80％乙醇水溶液按质量比2：2：1混合作为提取溶剂，将原料与溶剂按照质量比1:5-8混合，进行提取，提取温度为60-80℃、提取时间为50-90min，得到提取初液；c)浓缩：将初提液转移至真空旋转蒸发仪中，控制真空度30mbar、浓缩温度70℃，旋转速度50rad/min进行浓缩，得到折光度为52-57.0％的浓缩液，即沉香提取液；所述的沉香木从植株上取下后用混合溶液浸泡，然后晾干，再烘干粉碎，混合溶液的配制方法为：0.3～0.8mg/L的6-苄氨基嘌呤，浓度为0.5～0.9mg/L的萘乙酸，0.1mg/L的赤霉素，按照重量份数比1:3:1配制成混合溶液。
2.一种控制小球藻规模化培养污染菌的制剂，其特征在于：包括白藜芦醇和沉香螺萜醇，重量份数比为3-8:1；制剂在小球藻培养体系的占比为：30-50ppm。
3.根据权利要求2所述的制小球藻规模化培养污染菌的制剂，其特征在于：还包括可以促进小球藻生长的虎杖苷，虎杖苷与白藜芦醇的重量比为16-6:1。
4.根据权利要求2所述的制小球藻规模化培养污染菌的制剂，其特征在于：虎杖苷与白藜芦醇的重量比为12-8:1。
5.根据权利要求2所述的制小球藻规模化培养污染菌的制剂，其特征在于：虎杖苷、白藜芦醇和沉香螺萜醇的重量比为66:7:1。
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