CN110951630A - 乳酸克鲁维酵母突变株xt82及其应用 - Google Patents

乳酸克鲁维酵母突变株xt82及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳酸克鲁维酵母突变株XT82及其应用，其是由常用的产乳糖酶的乳酸克鲁维酵母为出发菌株，对其进行复合诱变，得到的在75℃下酶活力高的突变株，命名为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XT82，并于2019年9月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019724。本发明的糖苷酶适用于工业生产，尤其是食品工业生产，并由此带来易于保存、反应效率提升、杂菌污染减少、降低能耗、原料可利用度高和节约成本等诸多优势。

Description

乳酸克鲁维酵母突变株XT82及其应用
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种乳酸克鲁维酵母突变株XT82及其应用。
背景技术
乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为其唯一的碳源和能源的酵母，具有营养要求极其简单、能够适应更广泛的碳源，如葡萄糖、半乳糖、乳糖或淀粉等、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广、分泌蛋白能力强，不产生内毒素和对人类安全等优点。在食品酶制剂领域中，乳酸克鲁维酵母得到了广泛的应用，其中工业化的乳糖酶(糖苷酶中的一种，能水解乳糖成为半乳糖和葡萄糖。) 的主要来源就是乳酸克鲁维酵母。
酶的本质是蛋白质，其反应条件较温(通常在40℃下反应)，而在实际工业应用中，不可避免的高温环境通常会导致酶迅速失活，反应速度变慢甚至停止，从而导致生产成本上升。嗜热酶或者耐热酶是是指一类在高温环境中能长时间保持酶活力的生物催化剂，它们在生物催化工业化生产中，特别在食品加工领域有着诸多优势：
第一，热稳定性提高，可在室温下分离、提纯和包装运输，同时可在高温环境下长时间保持活性；
第二，加快了酶促动力学反应，提高反应效率；
第三，对反应的冷却系统要求降低，因而降低了能耗，即降低成本，从而减少了冷却过程对环境的污染；
第四，由于催化反应温度高(大于60℃)，减少了杂菌的污染，从而减少了细菌的代谢产物对产品的污染，可提高产物的纯度，简化其提纯过程；
第五，酶催化过程在高温下进行，能增加难溶物质如淀粉、纤维素、脂类的溶解性和可利用性，降低有机化合物的黏度而利于物质的扩散和混合。
目前大部分乳糖酶无法耐受高温且底物谱窄，通常只能水解半乳糖苷键，少数可以水解葡萄糖苷键。从催化效率、底物范围、高温活性和稳定性、产量等方面远不能满足现代工业应用的需求，有必要进一步寻找一种新的、来源安全且热稳定性和底物谱广的乳糖酶，以满足工业生产，尤其是食品工业生产的需要。
发明内容
本发明针对野生乳酸克鲁维酵母产生的乳糖酶不耐受高温，而且底物谱窄，不适于工业生产需求的的缺陷，提供了一种乳酸克鲁维酵母突变株XT82，并将该乳酸克鲁维酵母突变株XT82应用于生产酶的过程中；从而解决野生酶热稳定性和底物谱的问题(即野生糖苷酶酶仅具有有水解半乳糖苷和微弱的水解葡萄糖苷的能力)；本发明乳酸克鲁维酵母突变株XT82生产的XT82糖苷酶在保持其原有特性的基础上，获得了包括但不限于水解木糖苷和阿拉伯糖苷的能力，底物谱明显拓宽，并且通过乳酸克鲁维酵母突变株 XT82制备得到的XT82糖苷酶的耐温提高30℃，且在高温下热稳定性极好。
为实现上述目的，本发明所设计一种乳酸克鲁维酵母突变株 XT82，所述一种乳酸克鲁维酵母突变株XT82是由常用的产乳糖酶的乳酸克鲁维酵母ATCC 8585为出发菌株，对其进行复合诱变，得到的在75℃下酶活力高的突变株，命名为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XT82，并于2019年9月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019724。
本发明还提供了一种上述乳酸克鲁维酵母突变株XT82在制备糖苷酶的方法中的应用。
利用上述乳酸克鲁维酵母突变株XT82制备XT82糖苷酶的方法，包括以下步骤：
1)将乳酸克鲁维酵母突变株XT82接种于液体YPD培养基培养活化；然后转接在含有YPD培养基的5L发酵罐中发酵，离心收集上细胞；
2)将收集细胞利用高压匀浆破碎后，离心收集上清液，得到蛋白粗液；
3)将蛋白粗液经硫酸铵分级沉淀，得到粗酶液；
4)粗酶液经阴离子交换层析和凝胶过滤纯化，冻干成酶粉，即为XT82糖苷酶。
本发明的有益效果：
1)本发明的乳酸克鲁维酵母突变株XT82突变自野生乳酸克鲁维酵母，所以其生产的XT82糖苷酶符合食品安全国家标准和食品添加剂使用标准，具有很高的安全性；
2)本发明的XT82糖苷酶最适反应温度为75℃且在75℃到 85℃间均能够保持90％以上的酶活性，最适pH为6.5且在pH5～7.5 之间均能保持90％以上的酶活，同时兼顾了高温下的稳定性、不易降解；
3)本发明的XT82糖苷酶兼有水解半乳糖苷、木糖苷、葡萄糖苷和阿拉伯糖苷的能力，底物谱广且催化效率高。
由于具备上述特性，本发明的XT82糖苷酶适用于工业生产，尤其是食品工业生产，并由此带来易于保存、反应效率提升、杂菌污染减少、降低能耗、原料可利用度高和节约成本等诸多优势。
附图说明
图1为蛋白纯化电泳图
图中，Lane M蛋白Marker，Lane1粗酶液，Lane 2硫酸铵沉淀30-85％饱和度蛋白，Lane 3离子交换层析纯化后酶液，Lane4凝胶过滤纯化后酶液；
图2为野生酶和XT82蛋白最适温度曲线；
图3为野生酶和XT82蛋白最适pH曲线；
图4为XT82蛋白热稳定性实验。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
1.野生乳酸克鲁维酵母菌株Kluyveromyces lactis的多重理化复合诱变
1.1单菌落乳酸克鲁维酵母制备
将市面上购买的乳酸克鲁维酵母ATCC 8585接种到YPD液体培养基中，28℃，200-280rpm连续培养48-72小时，用无菌水稀释发酵液到10-6浓度，分别涂布在YPD固体培养基平板上，28℃静止培养72天，待长出单菌落后，挑取一个单菌落转接到500ml 的YPD液体培养基中，28℃，250rpm连续培养48小时；其中
YPD固体培养基：
10克酵提取物、20克蛋白胨和20克琼脂粉于900ml去离子水中，121℃灭菌20min。待冷却到60℃左右，加入50ml经过过滤除菌的40％葡萄糖溶液，混匀。
YPD液体培养基：
10克酵提取物和20克蛋白胨于900ml去离子水中，121℃灭菌20min。待冷却到60℃左右，加入50ml经过过滤除菌的40％葡萄糖溶液，混匀；
1.2 60Co-γ射线和常压室温等离子(ARTP)体联合处理乳酸克鲁维酵母
1.1中酵母菌液加入无菌生理盐水稀释菌液，使得酵母细胞浓度约为106个/ml，用剂量为200、400、600、800、1000、1200、 1400和1600戈瑞的钴源进行辐照。照射完毕后，菌液在28℃，250 rpm复苏1小时。然后用ARTP中，距离2cm，气流速度为10ml/min，分别处理5s，15s，30s，45s和60s。处理完毕后菌液在28℃，250 rpm复苏1小时
1.3亚硝基甲基脲烷(NMU)和氯化锂联合处理乳酸克鲁维酵母
向实施例1的1.2中处理的菌液中加入终浓度为1mg/ml的 NMU，于25℃，200rpm分别处理10min、20min、30min、40min、 50min和60min。处理完毕后，在无菌条件下过滤掉NMU，分别取0.3ml涂布于在含不同浓度氯化锂(0.5％，1.0％，1.5％，和2％) 的YPD固体培养基上，于30℃下静置培养72小时，待完全长出菌落后，平板于4℃保藏。
2.乳酸克鲁维酵母菌突变株的筛选
2.1突变株的培养
挑去步骤实施例1的1.3中平板上突变到装有1ml培养基中的 96深孔板中。于30℃，250rpm震荡培养120小时；培养结束后，于5000rpm离心5min。将取100μl发酵液到96浅孔板中，于4℃保藏待用；
2.2突变株糖苷酶活性测定
将步骤实施例1的2.1中发酵液，于70℃保温30min，于10000 rpm离心10min，收集上清。以邻硝基苯酚β-D半乳糖苷(oNPG) 为底物进行测定。测活的体系为：磷酸钠缓冲液0.05ml(100mM, pH 7.0)+0.05ml待测酶溶液+15μl oNPG(100mM,溶于DMSO 中)，以不加酶液为空白对照，反应温度为95℃，反应时间1min。加入0.1ml浓度为1M Na2CO3终止反应；用酶标仪，在405nm下取吸光度值(OD)。OD值高的为酶活力高的突变株；
2.3菌种保藏
将实施例1的2.2中活性最高的突变株接种到YPD液体培养基中，28℃，250rpm连续培养48小时。蘸取少量菌液在YPD固体培养基平板上划线，于28℃静止培养72小时。利用显微镜观察无杂菌污染后，于4℃保藏，命名为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XT82，并于2019年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019724；并于-20℃保藏。
实施例2利用乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XT82 制备纯化XT82糖苷酶
1.嗜热糖苷酶的发酵生产
用100ml的液体YPD培养基，活化2.3中保藏的菌株 Kluyveromyces lactis XT82，28℃，250rpm连续培养2天。培养结束后，显微镜观察，无杂菌污染后转接到在含有YPD培养基的5L 发酵罐中，28℃，300rpm连续发酵5天。发酵结束后，5000rpm 离心10min，收集上细胞。将收集细胞利用高压匀浆破碎后，再次 5000rpm离心10min，收集上清液，于4℃保藏。蛋白纯度如图1 中泳道1所示。
2.硫酸铵分级沉淀发酵液
硫酸铵分级沉淀30-85％饱和度，冰浴，向上述上清液中缓缓加入磨碎的硫酸铵粉末，沉淀至30％后，离心8000rpm，25min，取上清抽滤，然后再进行85％沉淀，离心(8000rpm，20min)，收集沉淀，用磷酸缓冲液Na2HPO4/NaH2PO4(10mM,pH 7.0)溶解。膜过滤透析掉硫酸铵。酶液于4℃保藏待用。蛋白纯度如图1中泳道2 所示。
3.阴离子交换层析纯化酶液
二乙氨基乙基纤维素阴离子层析(床层体积200ml)，用2.2保藏酶液上样后用Na2HPO4/NaH2PO4(10-100mM,pH 7.0)缓冲液预洗 400-800ml，然后用含NaCl为30mM和60mM的 Na2HPO4/NaH2PO4(10-100mM,pH 7.0)缓冲液分别洗脱400-800 ml，含NaCl为85mM的Na2HPO4/NaH2PO4(10-100mM,pH 7.0)缓冲液洗脱300ml，含NaCl为的Na2HPO4/NaH2PO4(10-100mM,pH 7.0)缓冲液和含NaCl为140mM的Na2HPO4/NaH2PO4(10mM,pH 7.0)缓冲液梯度洗脱500-100ml，流速1.0-2.0ml·min-1。利用实施例1中2.2所示测酶活方法，检测洗脱液中的活性。收集有活性的洗脱液，低温透析除掉NaCl，并于4℃保藏待用。蛋白纯度如图1 中泳道3所示。
4.凝胶过滤纯化酶液
Sephadex G150(Φ1.6cm×100cm)，用基本缓冲液平衡过夜，实施例1的2.3中保藏酶液样品浓缩至1ml，上样后用基本缓冲液洗脱，流速0.6ml·min-1。利用实施例1的2.2所示测酶活方法，检测洗脱液中的活性。收集有活性的洗脱液，冻干成酶粉，即为XT82 糖苷酶；蛋白纯度如图1中泳道4所示。
同时，野生糖苷酶纯化制备方式同上述方法，制得野生糖苷酶粉。
实施例3野生糖苷酶和XT82糖苷酶的表征
1.酶的物理表征
从图1得知XT82的分子量约为5.5kD。
2.最适反应温度，最适pH和热稳定性
取实施例2保藏的酶粉，在pH6.0的50mM磷酸盐缓冲液中，分别以25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃， 70℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃下，按照上述方法测定酶活。以最高值为100％，比较各温度下酶活。实验表明，该酶的最适反应75℃。结果如图2所示：上述制备的XT82糖苷酶比野生糖苷酶的最适温度提高了30℃，具有更好的耐高温能力。
取实施例2保藏的酶粉，在75℃下，不同pH值(4.0-8.0,其中 3.5-6.0为柠檬酸缓冲液，6.0-8.5为磷酸盐缓冲液)下按照2.2中所示方法测定酶活。以最高值为100％，比较各pH体系下酶活。实验表明，该酶最适pH值5.5。结果如图3所示：XT82糖苷酶和野生糖苷酶的pH耐受性变化不大。
取实施例2保藏的酶粉，分别在75℃，85℃和95℃保温1-6小时，定时测定残余酶活。结果如图4所示：XT82糖苷酶在75℃下热稳定性极好，6小时内酶活损失仅为5％以内，而在95℃下稳定性不佳。
4.3酶的底物谱
酶活定义：1mg纯野生糖苷酶或XT82糖苷酶在75℃，pH 6.5 条件下，一分钟水解1μmol指定底物定义为1U。底物分别是对- 硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、邻-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、对 -硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、邻-硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷、邻 -硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷、对-硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷和乳糖。结果如表1所示。
表1野生糖苷酶和XT82糖苷酶底物谱
Figure RE-GDA0002376570680000071
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (3)

1.一株乳酸克鲁维酵母突变株XT82，其特征在于：其命名为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XT82，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019724。
2.一种权利要求1所述乳酸克鲁维酵母突变株XT82在制备糖苷酶的方法中的应用。
3.利用权利要求1所述乳酸克鲁维酵母突变株XT82制备XT82糖苷酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将乳酸克鲁维酵母突变株XT82接种于液体YPD培养基培养活化；然后转接在含有YPD培养基的5L发酵罐中发酵，离心收集上细胞；
2)将收集细胞利用高压匀浆破碎后，离心收集上清液，得到蛋白粗液；
3)将蛋白粗液经硫酸铵分级沉淀，得到粗酶液；
4)粗酶液经阴离子交换层析和凝胶过滤纯化，冻干成酶粉，即为XT82糖苷酶。
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