CN110946208A - 一步发酵虾蟹壳生产甲壳素及饲用复合微生态制剂的清洁生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一步发酵虾蟹壳生产甲壳素及饲用复合微生态制剂的清洁生产方法，属于微生物发酵领域。本发明使用凝结芽孢杆菌发酵虾蟹壳粉，不仅获得了优质的甲壳素产品，而且还制备出了富含益生菌活菌体、氨基酸（肽）、有机钙等成分的饲用复合微生态制剂，实现了甲壳废弃物资源的高值化。

Description

一步发酵虾蟹壳生产甲壳素及饲用复合微生态制剂的清洁生 产方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用虾蟹壳为原料，采用凝结芽孢杆菌一步法固态发酵制备甲壳素及富含益生菌活菌体、氨基酸（肽）、有机钙等成分的饲用复合微生态制剂的方法。

背景技术

甲壳素是地球上仅次于纤维素的第二大生物多糖，每年甲壳素的生物合成量约为100多亿吨，是地球上唯一的天然碱性多糖。甲壳素的衍生物在医药、食品、功能材料、化妆品、农业、环保及生物技术等领域显示出广阔的应用前景。

虾蟹壳成分包括甲壳素、蛋白质、碳酸钙及少量的脂肪和色素。工业上常采用酸、碱在一定温度下处理虾蟹制备甲壳素，这种方法不仅酸、碱耗量大，环境污染严重，而且产品特性不稳定，蛋白质和碳酸钙等资源导致浪费。比如中国专利CN101003581A公开了一种提取高分子量甲壳素的新技术,其以虾身壳为原料, 将虾壳洗净甩干，用柠檬酸溶液浸泡，搅拌反应12-22h并过滤后，再将其置于氢氧化钠溶液中浸泡，沸腾搅拌并过滤，然后用柠檬酸溶液常温浸泡12-22h，从而达到脱钙的目的。还有中国专利CN101659711A公开了一种从虾蟹壳中提取甲壳素的工艺,通过在脱钙釜内洗涤并曝气、与稀盐酸反应并曝气、再经煮碱釜加入碱液加热曝气和洗涤曝气脱蛋白,从而制备出甲壳素。

为了减少污染，实现副产物的回收利用，中国专利CN 1526739A公开了采用酶法降解去除蛋白质的工艺，其方案是：以虾蟹壳为原料，先采用低浓度的盐酸喷洒虾蟹壳，使虾蟹壳软化，然后再用A.S1.398中性蛋白酶水解软化虾蟹壳中的蛋白质，滤出蛋白水解液后的固形物用3-5mol/L的盐酸于40-50℃浸泡1h-2h，彻底脱去钙等矿物质，经自来水清洗、晒干获得甲壳素产品。但在使用该方法的过程中由于酶促反应是非均相反应，蛋白质去除率低，同时碳酸钙等矿物质还是需要用酸处理。在蛋白质和虾青素制备方面，中国专利CN1463988A公开了采用有机酸、有机溶剂萃取制备甲壳素同时获得蛋白质和虾青素的方法，该方法可回收碳酸钙，但蛋白质的去除率低，甲壳素中蛋白质含量高，同时采用了有机溶剂，给环境和产品带来新的污染。在脂肪去除方面，目前的工艺大多采用碱法处理，也会产生废水污染。在色素去除方面，大多采用高锰酸钾或亚硫酸氢钠或草酸脱色，给环境带来新的污染，且会影响甲壳素产品的质量。

中国专利CN101215595A公开了一种利用微生物从虾壳中提取虾青素、蛋白质以及甲壳素的方法，是利用革兰氏阴性杆菌邻单胞杆菌(PLESIOMONAS)在37℃的条件下进行降解发酵,降解物经离心分离,液体经浓缩、干燥得蛋白粉；固体用溶剂浸泡，再经离心，液体除去溶剂得虾青素；沉淀中下层为粗品甲壳素；沉淀中上层为菌体以及少量蛋白,用作生物肥料，(但专利CN101215595A没有解决虾壳中存在的30-40%钙盐的问题，由于钙盐的存在使虾壳坚硬，在没有去除钙盐的前提下采用革兰氏阴性杆菌邻单胞杆菌(PLESIOMONAS)在37℃的条件下进行降解发酵高效去除蛋白质的过程是很困难的，其专利文件没有反映出蛋白质的去除率，无法衡量其效果，同时虾壳中的主要钙盐没有得到利用，也没有体现虾壳中脂肪的去除问题；虽然利用溶剂萃取获得了虾青素，但溶剂的残留会影响甲壳素的质量，且溶剂的使用不可避免的产生安全隐患和污染)。中国专利CN101579132A公开了一种从虾头和虾壳中提取蛋白质和甲壳素的方法,该方法是利用乳酸菌发酵将虾头、虾壳中的蛋白质液化分离出来,经干燥得到蛋白质；发酵产生的乳酸还可将虾头、虾壳中的无机钙盐溶解，转移到发酵液中，剩余的残渣经脱色处理可得到甲壳素，该方法包括如下步骤:(1)将虾头和虾壳粉碎后,加水;(2)向上述粉碎的虾头和虾壳中加入葡萄糖或蔗糖;(3)接种乳酸菌;(4)保温发酵;(5)发酵结束后将发酵液与发酵残渣分离,发酵液经中和、干燥后得到蛋白质,发酵残渣经稀酸浸泡和脱色处理后得到甲壳素(该专利CN101579132A与本申请专利最接近，但专利CN101579132A采用嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中任意一种或三种的混合菌发酵虾头和虾壳提取蛋白质和甲壳素，由于这些菌株多为异型乳酸发酵，产酸率不高，发酵完毕后钙盐的去除率低，发酵完毕后的残渣需要用稀酸（0.6mol/L）处理才能完全去除钙盐得到甲壳素，这不仅导致钙盐的损失，也会产生环境污染，且靠发酵产生的乳酸（所谓高酸环境）在现有发酵条件下导致蛋白质自溶得到充分水解蛋白质的可能性极小，本申请专利不采用任何酸碱；专利CN101579132A发酵周期长（5-7天），其成本高，发酵过程难以控制，本申请专利发酵总时间不超过4天；其专利文件没有反映出钙盐、蛋白质的去除率，无法衡量其效果)。中国专利CN101962666A公开了一种通过微生物发酵虾蟹等甲壳废弃物制备甲壳素、L-乳酸钙和复合氨基酸或肽的方法，具体为甲壳废弃物在鼠李糖乳杆菌CICC6003和枯草芽孢杆菌CICC23579种子液中发酵后获得L-乳酸钙，然后在米曲霉CICC41477种子液中发酵获得复合氨基酸或肽和甲壳素，该方法包括如下步骤：（1）采用鼠李糖乳杆菌 CICC6003和枯草芽孢杆菌CICC23579于37 ℃下液态发酵36-40小时脱钙及脱脂肪；（2）将第一步发酵液离心后收集脱钙脱脂产物沉淀，液体浓缩干燥得L-乳酸钙。取干燥脱钙脱脂产物采用米曲霉CICC41477于30℃条件下液态发酵36-48小时脱蛋白；（3）将第二步发酵液离心后收集脱蛋白产物，去除菌丝体、微生物细胞和孢子，收集固形物，加入双氧水脱色，所得固形物干燥后即得甲壳素；离心所得液体浓缩干燥得复合氨基酸或肽(该专利CN101962666A能很好的实现甲壳素、L-乳酸钙和复合氨基酸或肽产品的清洁生产，但存在工艺过程复杂、液态发酵生产效率低、能耗大、投资大等一系列问题)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过凝结芽孢杆菌一步法固态发酵虾蟹壳制备甲壳素及富含益生菌活菌体、氨基酸（肽）、有机钙等成分的饲用复合微生态制剂的方法。利用本发明的方法，本领域技术人员可以获得虾蟹壳的脱钙、脱脂肪及脱蛋白质的甲壳素清洁生产工艺，同时获得富含益生菌活菌体、氨基酸（肽）、有机钙等成分的饲用复合微生态制剂。

为了实现本发明，发明人通过大量试验反复研究，并终于获得了如下制备甲壳素、富含益生菌活菌体、氨基酸（肽）、有机钙等成分的饲用复合微生态制剂的方法：

一步发酵虾蟹壳生产甲壳素及饲用复合微生态制剂的清洁生产方法，其步骤为：

1）取清洗并粉碎粒度为60-100目的虾蟹壳100重量份，加入40-46重量份的淀粉水解糖、0.02-0.04重量份的磷酸二氢钾、0.01-0.03重量份的氯化钠、0.002-0.004重量份的氯化镁、0.002-0.004重量份的氯化锰，加自来水调节水分含量，使其水分达到60-70%（W/W），上甑蒸40分钟，卸料置入消毒后的发酵床，收集冷凝水加入到料中拌匀，用无菌水调整料的水分至70-80%（W/W）；

2）冷却后接入5-8%（V/W）的凝结芽孢杆菌 (Bacillus coagulans)种子液，于45-50 ℃下发酵24-36小时待淀粉水解糖耗尽，发酵产物加一倍重量的水充分搅拌后于板框压滤机上压滤，分别收集固形物及上清液，固形物加入其1倍体积的去离子水洗涤，于板框压滤机上压滤，重复三次，固形物中再加入其1.5-2倍体积的双氧水，在室温下搅拌2-3小时，用80目筛网过滤并用其1倍体积的水清洗，所得固形物在40-45℃下干燥后即得甲壳素；

3）将步骤2）的上清液混合后，经真空浓缩后, 再喷雾干燥,即得富含益生菌活菌体、氨基酸（肽）、有机钙等成分的复合饲用微生态制剂，所述真空浓缩的真空度0.8Mpa，温度50℃。

上述一步发酵虾蟹壳生产甲壳素及饲用复合微生态制剂的清洁生产方法，所述接种的凝结芽孢杆菌种子液的细胞数为3-8×108cfu/mL。

优选地，如上所述一步发酵虾蟹壳生产甲壳素及饲用复合微生态制剂的清洁生产方法，在步骤（2）的发酵过程中，发酵0-12小时期间每隔6小时翻料一次，发酵12-30小时期间每隔2-3小时翻料一次,发酵30小时以后每隔6小时翻料一次。

在虾蟹壳综合利用的过程中，发明人创造性地实现了一步法单一微生物发酵生产甲壳素及富含益生菌活菌体、氨基酸（肽）、有机钙等成分的饲用复合微生态制剂，实现了甲壳废弃物资源的高值化，具体如下：

与现有技术相比，本发明一步发酵虾蟹壳生产甲壳素及饲用复合微生态制剂的清洁生产的方法具有如下显著的进步性：

1）通过一步生物发酵技术对虾蟹等甲壳废弃物的处理，不仅获得了优质的甲壳素产品，而且还制备出了富含益生菌活菌体、氨基酸（肽）、有机钙等成分的饲用复合微生态制剂，实现了甲壳废弃物资源的高值化。

2）利用本发明的工艺方法制备的产品纯度高：具体为，甲壳素产品的灰分含量≤0.5%，甲壳素制备壳聚糖的得率≥50%，水分含量≤10%；富含益生菌活菌体、氨基酸（肽）、有机钙等成分的饲用微生态制剂产品中凝结芽孢杆菌 (Bacillus coagulans)的活细胞数≥3×109cfu/g，L-乳酸钙含量≥45%，蛋白质含量≥35%。

3）本发明工艺不采用任何酸、碱和有机溶剂，避免了工业上常采用酸、碱、有机溶剂处理来制备甲壳素所带来的酸、碱、有机溶剂耗量大，环境污染严重，而且产品特性不稳定，蛋白质和碳酸钙等资源导致浪费的问题，同时也避免了微生物菌体的浪费。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1 凝结芽孢杆菌液体种子的培养

1、培养基

（1）菌种活化培养基：葡萄糖2%，酵母浸粉1%，蛋白胨2%，pH6.0-7.0；

（2）液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，pH5.0-6.0。

2、种子的培养

1）菌种的活化：将保存在甘油管中的凝结芽孢杆菌接种于装有50mL菌种活化培养基的300mL三角瓶中,在培养温度40-50℃的条件下培养18-24h，用稀释涂布平板法测量凝结芽孢杆菌活菌数为2×108-2×109 CFU/mL。

2）种子的培养：取活化后的菌液接种于装有100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，接种量为0.5%-5%（V/V）,在45-55℃的条件下培养8-18h，用稀释涂布平板法测量凝结芽孢杆菌活菌数为3-8×108cfu/mL。

实施例2 投料100Kg虾蟹壳的发酵工艺

1、虾蟹壳原料预处理

1）虾蟹等甲壳废弃物清洗：用自来水将虾蟹等甲壳废弃物上的泥土等脏物清洗干净，干燥后粉碎；

2）粉碎细度：60-100目。

2、发酵工艺

取清洗并粉碎粒度为60-100目的虾蟹壳100Kg，加入43g糖含量90%（以葡萄糖计）的固体淀粉水解糖、30g磷酸二氢钾、15g氯化钠、3g氯化镁、3氯化锰，加自来水调节水分到65%（W/W），上甑采用直接蒸汽蒸40分钟，卸料置入消毒后的发酵床，收集冷凝水加入到料中拌匀，用无菌水调整料的水分至75%（W/W），冷却后接入6%（V/W）的凝结芽孢杆菌 (Bacilluscoagulans)种子液，于45-50℃发酵24-36小时待淀粉水解糖耗尽。

发酵过程中，发酵0-12小时期间每隔6小时翻料一次，发酵12-30小时期间每隔2-3小时翻料一次,发酵30小时以后每隔6小时翻料一次。

实施例3 甲壳素及饲用复合微生态制剂的制备工艺

取实施例2的发酵产物加一倍重量的水充分搅拌后于板框压滤机上压滤，分别收集固形物及上清液。固形物加入一倍体积的去离子水洗涤，于板框压滤机上压滤，重复三次，固形物加入2倍体积的双氧水，在室温下搅拌3小时，用80目筛网过滤并用1倍体积的水清洗，所述固形物在45℃下干燥后即得甲壳素。上述各步的上清液混合后，经真空浓缩（真空度0.8Mpa，温度50oC）后, 再喷雾干燥,得富含益生菌活菌体、氨基酸（肽）、有机钙等成分的饲用复合微生态制剂。

甲壳素产品的灰分含量≤0.5%，甲壳素制备壳聚糖的得率≥50%，水分含量≤10%；富含益生菌活菌体、氨基酸（肽）、有机钙等成分的饲用复合微生态制剂产品中凝结芽孢杆菌 (Bacillus coagulans)的活细胞数≥3×109cfu/g，L-乳酸钙含量≥45%，蛋白质含量≥35%。

Claims (4)

1.一步发酵虾蟹壳生产甲壳素及饲用复合微生态制剂的清洁生产方法，其特征在于：该发酵方法为：

1）虾蟹壳粉中加入淀粉水解糖、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化镁、氯化锰后混合均匀得混合料，然后加水调节混合料的水分含量至60-70%，上甑蒸40分钟，卸料置入消毒后的发酵床，收集冷凝水加入到料中拌匀，用无菌水再次调整混合料的水分至70-80%；

2）步骤（1）的混合料冷却后接入5-8%的凝结芽孢杆菌种子液，于45-50 ℃下发酵24-36小时待淀粉水解糖耗尽，发酵产物加混合料一倍重量的水充分搅拌后于板框压滤机上压滤，分别收集固形物及上清液，固形物加入其1倍体积的去离子水洗涤，于板框压滤机上压滤，重复三次，固形物中再加入其1.5-2倍体积的双氧水，在室温下搅拌2-3小时，用筛网过滤并用其1倍体积的水清洗，所得固形物在40-45℃下干燥后即得甲壳素；

3）将步骤2）的上清液混合后，经真空浓缩后, 再喷雾干燥,即得饲用复合微生态制剂，所述真空浓缩的真空度0.8Mpa，温度50℃。

2.如权利要求1所述的一步发酵虾蟹壳生产甲壳素及饲用复合微生态制剂的清洁生产方法，其特征在于：混合料中各组分的重量份为：虾蟹壳粉100份、淀粉水解糖40-46份、磷酸二氢钾0.02-0.04份、氯化钠0.01-0.03份、氯化镁0.002-0.004份、氯化锰0.002-0.004。

3.如权利要求1所述的一步发酵虾蟹壳生产甲壳素及饲用复合微生态制剂的清洁生产方法，其特征在于：所述步骤（2）中接种的凝结芽孢杆菌种子液的细胞数为3-8×10⁸cfu/mL。

4.如权利要求1所述的一步发酵虾蟹壳生产甲壳素及饲用复合微生态制剂的清洁生产方法，其特征在于：在步骤（2）的发酵过程中，发酵0-12小时期间每隔6小时翻料一次，发酵12-30小时期间每隔2-3小时翻料一次,发酵30小时以后每隔6小时翻料一次。