CN110938697A

CN110938697A - 一种肺癌gnaq突变基因及其检测引物和应用

Info

Publication number: CN110938697A
Application number: CN201911367949.4A
Authority: CN
Inventors: 潘世扬; 徐建; 王琳; 谢而付; 张世昌; 陶剑锋
Original assignee: Jiangsu Kede Biological Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kede Biological Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-03-31

Abstract

本发明公开了一种肺癌GNAQ突变基因及其检测引物和应用。一种肺癌GNAQ突变基因，该突变位于GNAQ基因的5号外显子上，CDS序列第680位碱基T突变为C，对应第227位的氨基酸由甲硫氨酸突变为苏氨酸。检测所述的肺癌GNAQ突变基因的试剂在制备肺癌辅助诊断试剂中的应用。所述的检测肺癌GNAQ突变基因的试剂优选检测肺癌GNAQ突变基因的PCR引物。本发明公布了一种新的肺癌GNAQ基因突变，并验证了该突变具有高度致病性可能。本发明提供了检测该突变的引物序列及相关反应体系，通过PCR扩增测序实现该突变位点检测，可用于制备肺癌辅助诊断试剂，比NGS更加快速、简便、低成本。

Description

一种肺癌GNAQ突变基因及其检测引物和应用

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，涉及一种肺癌GNAQ突变基因及其检测引物和应用。

背景技术

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的首位死因。在我国，其发病率和死亡率亦居首位。但由于缺乏有效的早期诊断方法，导致70％-80％的患者在确诊时已处于晚期，预后不佳，5年生存率仅15％。近年来随着基因分析和分子诊断技术的不断发展及测序技术的应用，越来越多的肺癌基因靶点被陆续发现，解析肺癌的遗传特征谱以及找到更多新型的肺癌驱动基因不仅可以使肺癌分子诊断的方法更加简单、快速，而且可以为肺癌的靶向治疗提供更多潜在药物靶点，以提高患者的预后及远期生存率，为肺癌患者长期生存带来新的希望。

G蛋白，又称鸟苷酸结合调节蛋白，是位于细胞膜内侧的一类重要的信号转导蛋白，它能接受多种激素及神经递质的跨膜转导，主要通过与GTP(激活态)结合和与GDP(失活态)结合导致信号的转导和终止，继而引发细胞代谢、分泌、增殖、分化、病变、死亡等一系列生理效应。G蛋白属于一个庞大的三体蛋白家族，由α、β、γ三个亚单位组成异源三聚体，每种亚基都由不同基因编码。目前，已发现的G蛋白α亚单位就有20多种。G蛋白的α亚基都具有GTP水解酶(GTPase)活性，能够使结合的GTP水解成GDP并释放出磷酸基团。

GNAQ(G protein subunit alpha q)被证明是一种癌基因，该基因位于染色体9q21.2，由8个外显子组成，该基因编码G蛋白α亚基。最常见的突变位点是5号外显子的Q209和4号外显子的R183。2009年，Van Raamsdonk和他的同事首先发现了GNAQ在肿瘤发展中的作用。他们报道了83％的葡萄膜黑色素瘤中含有该基因的突变，其中95％的突变发生在Q209，5％的突变发生在R183。突变是互斥的。GNAQ发挥GTPase活性需要位于5号外显子编码的开关II区Q209位置的谷氨酰胺，但是GNAQ基因Q209位的错义突变导致了Gα蛋白的GTPase功能的消失及下游信号的持续激活，并促进细胞增殖，从而导致肿瘤的发生。后续研究证实了GNAQ突变还可以见于蓝痣，皮肤黑色素瘤及脑膜肿瘤等。

GNAQ突变与肿瘤分期、染色体畸变或其他临床表现不相关，但由于GNAQ参与于肿瘤进展的各个阶段，表明GNAQ突变很可能是肿瘤的始动因素或早期事件。然而目前对GNAQ突变的研究并不多，大多数报道显示该基因突变与非皮肤性黑色素瘤相关，而在其他肿瘤中罕见报道。由于相关数据的缺乏，GNAQ还有很多未发现的突变位点，其与肿瘤之间的相关性及病理机制也还不明确。GNAQ基因新突变的发现有助于揭示信号转导异常与恶性肿瘤的关联，并为新疗法和新药物的设计提供思路与靶点。

目前高通量测序是唯一可以明确未知突变位点的检测手段,然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。因此，针对新发现的致病突变位点设计特异性的PCR引物进行PCR扩增并测序，是准确、便捷、经济的方法，对于肿瘤基因诊断和靶向治疗的选择具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术，提供一种肺癌GNAQ突变基因。

本发明的另一目的是提供该肺癌GNAQ突变基因的检测引物。

本发明的又一目的是提供一种肺癌辅助诊断试剂盒。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种肺癌GNAQ突变基因，GNAQ野生型基因在Genbank中的登录号为NM_002072.5，该突变位于GNAQ基因的5号外显子上，CDS序列第680位碱基T突变为C，对应第227位的氨基酸由甲硫氨酸突变为苏氨酸。

本发明所述的肺癌GNAQ突变基因作为检测靶点在制备肺癌辅助诊断试剂中的应用。

检测所述的肺癌GNAQ突变基因的试剂在制备肺癌辅助诊断试剂中的应用。

所述的检测肺癌GNAQ突变基因的试剂优选检测肺癌GNAQ突变基因的PCR引物。

所述的检测肺癌GNAQ突变基因的PCR引物优选SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

一种检测肺癌GNAQ突变基因的PCR引物，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

一种肺癌辅助诊断试剂盒，包含检测肺癌GNAQ突变基因的PCR引物。

所述的肺癌辅助诊断试剂盒，优选包含如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的PCR引物。

所述的试剂盒进一步优选还包含常规的PCR反应试剂。

有益效果：

本发明公布了一种新的肺癌GNAQ基因突变，并验证了该突变具有高度致病性可能。本发明提供了检测该突变的引物序列及相关反应体系，通过PCR扩增并测序实现该突变位点检测，可用于制备肺癌辅助诊断试剂，比NGS更加快速、简便、低成本。

附图说明

图1GNAQ基因突变阳性患者的DNA样本PCR扩增结果，1、3、5泳道分别为3例该突变阳性患者的DNA样本，2、4、6泳道为对应复孔。

图2GNAQ基因突变阳性患者目的基因PCR扩增产物的Sanger测序结果图

图3该突变的蛋白结构预测

具体实施方式

实施例1

1病例收集

从南京医科大学第一附属医院收集确诊为肺癌的患者肿瘤组织样本100例。准备后续提取DNA测序并筛选突变位点。

2基因组DNA提取

基因组DNA提取采用天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒，具体操作按照试剂说明书。

3高通量测序(NGS)

采用Ion Torrent PGM系统及相关配套试剂对上述DNA样本进行高通量测序，具体步骤包括文库制备、微球富集、上机测序、生物信息分析。

4结果分析

利用Ion Reporter(IR)系统，对测序数据结果进行注释分析。重点关注无rs编号、未经文献报道，DrugBank、ClinVar无相关信息的错义突变。经筛选，发现一个未知的错义突变，该突变位于人GNAQ基因的5号外显子上，CDS序列第680位碱基T突变为C(c.680T>C)，对应第227位的氨基酸由甲硫氨酸突变为苏氨酸(p.Met227Thr)，该突变未经文献报道，临床意义不明确，经验证，具有较高致病性可能。

5引物设计及Sanger测序验证

针对本发明找到的新的错义突变位点设计引物。遵循引物设计原则，引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度在15bp-30bp之间，引物GC含量在40％～60％之间，退火温度最好接近72℃,引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增条带单一特异。扩增产物不宜过长，尽量控制在100-300bp。采用Primer5引物设计软件，经过多次调试和验证，最终设计上游引物序列为AGAATGGTCGATGTAGGG(SEQ ID NO.1)，下游引物序列为CAGAATAACCGAGGAGTT(SEQ ID NO.2)，理论扩增产物长210bp，扩增产物的全部序列如下：

AGAATGGTCGATGTAGGGGGCCAAAGGTCAGAGAGAAGAAAATGGATACACTGCTTTGAAAATGTCACCTCTATCATGTTTCTAGTAGCGCTTAGTGAATATGATCAAGTTCTCGTGGAGTCAGACAATGAGAACCGAATGGAGGAAAGCAAGGCTCTCTTTAGAACAATTATCACATACCCCTGGTTCCAGAACTCCTCGGTTATTCTG(SEQ IDNO.3)。

将NGS检测到的该突变阳性患者的标本使用我们的引物进行验证。

所用PCR反应体系(25μL体系)为：2×Taq Master Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA 2μL，ddH₂O 8.5μL。使用Thermo Fisher的appliedbiosystems PCR扩增仪，反应条件如下：Stagel：95℃，3min；Stage2：95℃，15s，58℃，15s；Stage4:72℃60s，共35个循环。将扩增后的产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，可见一条单一特异的条带(图1)。同时将产物进行Sanger测序，测序结果见图(图2)，证明本发明设计的引物可成功扩增出目的基因片段，条带单一、特异。

6临床病例检测我们收集50例确诊为肺癌的肿瘤组织和癌旁组织，30例肺良性结节组织，30例健康人血液样本，使用本发明的引物进行检测，检测方法同上。结果：50例肺癌患者中有4例患者检测出该突变，而肺结节患者和健康人中均未检测出该突变，证明本项目设计的引物特异性高且该突变与肺癌致病存在显著相关性。

7突变的致病性及功能学研究

7.1保守性分析：

采用NCBI HomoloGene数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene)对所筛选得到的突变在多个物种中进行保守性预测，结果显示该位点在鱼、鼠、牛、狼、鸡、猕猴等多个物种中高度保守，证明该位点可能会引起较严重的病理现象。

7.2突变治病能力评估：

使用SIFT(http://sift.bii.a-star.edu.sg/)和PolyPhen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)两款在线预测软件对该错义突变对蛋白水平的影响进行评估，SIFT值为0，PolyPhen值为0.973，表示其拥有较大的致病可能性。

7.3蛋白晶体结构改变：

采用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在线同源建模，Swiss-PdbViewer分析氨基酸改变对蛋白结构的影响，结果表明该突变可以引起蛋白结构发生改变(图3)。

序列表

<110> 江苏科德生物医药科技有限公司

<120> 一种肺癌GNAQ 突变基因及其检测引物和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaatggtcg atgtaggg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagaataacc gaggagtt 18

<210> 3

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agaatggtcg atgtaggggg ccaaaggtca gagagaagaa aatggataca ctgctttgaa 60

aatgtcacct ctatcatgtt tctagtagcg cttagtgaat atgatcaagt tctcgtggag 120

tcagacaatg agaaccgaat ggaggaaagc aaggctctct ttagaacaat tatcacatac 180

ccctggttcc agaactcctc ggttattctg 210

Claims

1.一种肺癌GNAQ突变基因，其特征在于该突变位于GNAQ基因的5号外显子上，CDS序列第680位碱基T突变为C，对应第227位的氨基酸由甲硫氨酸突变为苏氨酸。

2.权利要求1所述的肺癌GNAQ突变基因作为检测靶点在制备肺癌辅助诊断试剂中的应用。

3.检测权利要求1所述的肺癌GNAQ突变基因的试剂在制备肺癌辅助诊断试剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的检测权利要求1所述的肺癌GNAQ突变基因的试剂为检测肺癌GNAQ突变基因的PCR引物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的检测肺癌GNAQ突变基因的PCR引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

6.一种检测肺癌GNAQ突变基因的PCR引物，其特征在于如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。

7.一种肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于包含检测肺癌GNAQ突变基因的PCR引物。

8.根据权利要求7所述的肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于包含如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的PCR引物。

9.根据权利要求8所述的肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含常规的PCR反应试剂。