CN110934893A - 一种单环刺螠粘液的收集方法 - Google Patents

一种单环刺螠粘液的收集方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种单环刺螠粘液的收集方法，所收集的粘液的应用。收集方法(1)单环刺螠活体的低温处理；(2)微电流刺激并收集体表粘液；(3)冻干。本发明提供的单环刺螠体表粘液具有抑菌功能，可应用于抑菌、抗菌相关的生物产品中。

Description

一种单环刺螠粘液的收集方法
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种单环刺螠粘液的收集方法，所收集的粘液的应用。
背景技术
单环刺螠(Urechis unicinctus)，属于螠虫动物门(Echiura)、螠纲(Echiurida)、无管螠目(Xenopneusta)、刺螠科(Urechidae)、刺螠属(Urechis)，是中国黄渤海沿岸潮间带和潮下带常见的底栖生物。单环刺螠成体体长10-25cm,宽15-30mm。体形为长圆筒状，体色为肉红色。体前端是其短吻,呈圆锥状，体表紧密排列颗粒突起,体后端为横裂形的肛门。单环刺螠身体前半部有腺体，可分泌黏液，在产卵或营造泥沙管时润泽用。单环刺螠浑身是宝，营养成分含量高，一般应用做食品、药用和研究用，但是针对单环刺螠的药用研究一直以来均体壁和体腔为研究对象，针对体表粘液在抗菌生物制品的应用研究很少。
夏玉秀等在《不同干露条件单环刺螠的耐受性及对体表黏液特性的影响》中的研究表明，单环刺螠体表黏液分泌量随温度升高而降低，且通过抑菌圈法比较发现单环刺螠其粘液对金黄色葡萄球菌、灿烂弧菌、奇艺变形杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、藤黄微球菌9种常见的水产动物病原菌无抗菌性，但是其研究中采用直接离心法收集单环刺螠粘液，收集量较少，而且未分析粘液对大肠杆菌、白色念球菌、溶血性链球菌等人类常见致病菌的抑菌效果，限制了其在抗菌、抑菌相关生物产品中的应用。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种单环刺螠粘液的收集方法，所收集的粘液的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种单环刺螠粘液的收集方法，在恒定电压下对单环刺螠进行多次刺激，而后收集单环刺螠粘液。
所述单环刺螠单环刺螠冲洗后擦干，称重后于低温环境下静置30-60min；
所述的单环刺螠粘液是指单环刺螠正常生活时，由体表粘液细胞产生的粘液。
所述将正负极分别接触单环刺螠的头和尾，在3V-12V恒定电压下对其进行3-6次电压刺激；其中，每次刺激15-30S，间隔60-90S。
优选的，所述的同一电压刺激多次为6V-9V电压刺激3-6次，每次刺激15-30S，间隔30-90S；
将单环刺螠置于为4℃-12℃下静置30-60min，低温处理后在恒定电压下对单环刺螠进行多次刺激，而后收集单环刺螠粘液。
所述低温为4℃-8℃。
所述收集的粘液离心收集上清液置于容器中，并用保鲜膜密封；密封膜上设孔，而后置于-60--71℃过夜冻干，冻干粉放入-20-4℃冰箱保存以备用。
一种制备所得单环刺螠粘液的应用，所述单环刺螠体表粘液冻干粉的应用在作为抗菌或抑菌、抗凝血相关生物产品中的应用。
所述单环刺螠体表粘液冻干粉主要成分为粘多糖或糖基化蛋白质，在作为大肠杆菌、溶血性链球菌、鲍氏不动杆菌或痤疮丙酸杆菌的抗菌制剂的应用；或，作为体外抗血液凝集制剂的应用。
所述的单环刺螠粘液是指单环刺螠正常生活时，由体表粘液细胞产生的粘液，主要成分为粘多糖或糖基化蛋白质或多肽。
本发明的优点及积极效果为：
在蚯蚓体表粘液的研究中，研究者利用电压和电流刺激的方法进行了蚯蚓体表粘液的收集。由于蚯蚓的体表粘液是通过其体表固定的分泌孔进行分泌，且蚯蚓对于电压电流的刺激具有较好的耐受性，因此粘液的连续收集选择直接在玻璃容器中进行，且电压和电流的选择存在较大可变化区间。
单环刺螠属于海洋底栖无脊椎生物，与蚯蚓类似但仍存在较大区别。表现在其粘液的分泌为周身分泌，迄今未发现其具有明确的分泌孔或分泌固定位置存在，同时，其对电压和电流的耐受力较弱，需要大量实验获得较为安全的连续收集方式。同时，由于粘液的周身分泌，使得粘液的收集变得异常困难，本发明采用带孔的平板或保鲜膜提取粘液的方法可大大提高单环刺螠粘液的提取效率，且通过冻干操作使其易于保存及使用。采用本发明方法收集的单环刺螠粘液对大肠杆菌、溶血性链球菌、鲍氏不动杆菌、痤疮丙酸杆菌等致病菌有抗菌作用，同时具有一定的抗血液凝集作用，进而可见扩大了其在抗菌相关生物产品中的应用，可进一步的应用于消毒用品、医疗器械、食品添加等抗菌相关生物产品中。
附图说明
图1为本发明实施例提供的采用本发明方法收集的单环刺螠粘液抗菌活性分析图。
图2为本发明实施例提供的采用本发明方法收集的单环刺螠粘液抗凝血活性分析图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。
实施例1：不同电压刺激对单环刺螠粘液收集的影响
(1)将采集的单环刺螠随机分为4组，每组4只，用无菌PBS冲洗后擦干，称重后于室温环境下静置30min；
(2)将变压器接通电源，正负极分别接触单环刺螠的头和尾，分别用3V、6V、9V、12V电压刺激3次，每次刺激30S，间隔30S；
(3)使用洁净的带孔的平板或保鲜膜收集粘液后离心，并将离心的粘液上清称重，置于平皿中并封上洁净的保鲜膜，在保鲜膜上戳上若干小孔放入冻干机中并于-71℃过夜冻干，将得到的冻干粉放入-20℃冰箱保存以备用(参见表1)；
表1：不同电压对单环刺螠粘液分泌得率的影响
Figure BDA0002302734980000031
由上述表1中不同电压对单环刺螠粘液分泌得率可知，在直流9V电压刺激下，粘液体重比(总粘液质量/总体重)为2.522％，收集效率较高。
实施例2：不同温度刺激对单环刺螠粘液收集的影响
(1)将采集的单环刺螠随机分为4组，每组4只，用无菌PBS冲洗后擦干，总体称重后，分别置于4℃、12℃、22℃、33℃，静置30min；
(2)将变压器接通电源，正负极分别接触单环刺螠的头和尾，用9V直流电压刺激3次，每次刺激30S，间隔30S；
(3)使用洁净的带孔的平板或保鲜膜收集粘液后离心，并将离心的粘液上清称重，置于平皿中并封上洁净的保鲜膜，在保鲜膜上戳上若干小孔放入冻干机中并于-71℃过夜冻干，将得到的冻干粉放入-20℃冰箱保存以备用(参见表2)；
表2不同温度处理对单环刺螠粘液分泌的影响
温度(℃) 海肠体重(g) 粘液质量(g) 质量比(％)
4 214.71 3.291 1.533
12 275.07 1.176 0.427
20 293.24 2.431 0.829
33 253.18 1.258 0.497
由上述表2中不同温度处理对单环刺螠进行处理，再经直流9V电压刺激下可见，4℃处理组的粘液体重比(总粘液质量/总体重)为1.533％，收集效率较高。
实施例3：单环刺螠体表粘液抗菌活性分析
(1)取实施例1所得到的冻干状态的单环刺螠粘液样品4.0g，溶于10ml的PBS后用0.2μm的滤膜过滤除菌，制备终浓度为0.4mg/ml和0.1mg/ml的单环刺螠粘液溶液备用，(PBS的组成为137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、10mmol/L Na2HPO4、2mmol/L KH2PO4，pH7.2-7.4)；
(2)将大肠杆菌、α-溶血性链球菌、β-溶血性链球菌、鲍氏不动杆菌、白色念球菌、甲型副伤寒沙门菌、金色葡萄球菌，七种致病菌的菌种分别取20μl于5ml的LB液体培养基中37℃，180rpm摇床培养至对数生长期(OD600nm＝0.6-0.8)然后稀释至OD600nm值为0.3备用；
(3)将步骤(2)所得到的六种菌液100ul分别与高压后冷却到40℃左右的15ml的LB固体培养基充分混合倒平板，每一个平板平均分为4个区域，并标号为1’、2’、3’、4’；
(4)用直径为0.5cm的无菌滤纸片分别浸泡在青霉素(1mg/ml)、无菌PBS、和步骤(1)所得到的单环刺螠粘液样品中，并按顺序放入步骤(3)中的4个区域中(其中1’为青霉素、2’为0.4mg/ml粘液、3’为PBS、4’为0.1mg/ml粘液)，并将其至于37℃培养箱中培养24h(参见图1)；
由图1实验结果显示，大肠杆菌、α-溶血性链球菌、β-溶血性链球菌、鲍氏不动杆菌培养皿中1’、2’、4’号区域即有浸泡单环刺螠粘液的滤纸片周围存在明显的抗菌环，白色念球菌、甲型副伤寒沙门菌、金色葡萄球菌培养皿中2’、4’号区域不存在抗菌环，说明单环刺螠体表黏液对大肠杆菌、ɑ-溶血性链球菌、β-溶血性链球菌、鲍氏不动杆菌有抗菌效果，对白色念球菌、甲型副伤寒沙门菌、金色葡萄球菌无抗菌效果。所以本实施例1所得的单环刺螠体表粘液可应用于针对大肠杆菌、溶血性链球菌、鲍氏不动杆菌等革兰氏阴性菌的抗菌、抑菌相关的生物产品中。
实施例4：单环刺螠体表粘液对新鲜血液的凝集活性分析
(1)红细胞悬液的制备：将由鸡的翅静脉采集的血，放入含有Alsever液的离心管中，用生理盐水轻轻洗涤后，3000rpm离心5min，吸出上清和白细胞等杂质后，加入生理盐水稀释，轻轻吹打，将红细胞吹散后，2000rpm离心5min，如此反复洗涤，用生理盐水配成1％的红细胞悬液待用(Alsever液的组成为，18.7g/L无水葡萄糖、8.0g/L柠檬酸钠、0.5g/L柠檬酸、4.2g/L氯化钠，pH5.9-6.3)；
(2)凝集活性的测定：在“V”型96孔微量血清稀释板的第1-6孔中分别加入25μL的0.9％的生理盐水，然后在第1-3孔内加入25μL实施例1中得到的单环刺螠粘液，终浓度分别为0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml，4-6孔添加等量的PBS做对照，最后每孔加入步骤(1)中得到的红细胞悬液25μL，微型振荡器振荡3min后，放入37℃的培养箱内培养10min。
实验结果如图2显示，步骤(2)得到的添加单环刺螠粘液的1-3孔中未出现血液凝集斑点，添加PBS对照的4-6孔出现底部红色斑点，说明单环刺螠粘液具有一定的抗血液凝集作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种单环刺螠粘液的收集方法，其特征在于：在恒定电压下对单环刺螠进行多次刺激，而后收集单环刺螠粘液。
2.按权利要求1所述的单环刺螠粘液的收集方法，其特征在于：所述将正负极分别接触单环刺螠的头和尾，在3V-12V恒定电压下对其进行3-6次电压刺激；其中，每次刺激15-30S，间隔60-90S。
3.按权利要求1或2所述的单环刺螠粘液的收集方法，其特征在于：将单环刺螠置于为4℃-12℃下静置30-60min，低温处理后在恒定电压下对单环刺螠进行多次刺激，而后收集单环刺螠粘液。
4.按权利要求3所述的单环刺螠粘液的收集方法，其特征在于：所述低温为4℃-8℃。
5.按权利要求3所述的单环刺螠粘液的收集方法，其特征在于：所述收集的粘液离心收集上清液置于容器中，并用保鲜膜密封；密封膜上设孔，而后置于-60--71℃过夜冻干，冻干粉放入-20-4℃冰箱保存以备用。
6.一种权利要求1所述制备所的单环刺螠粘液的应用，其特征在于：所述单环刺螠体表粘液冻干粉的应用在作为抗菌或抑菌、抗凝血相关生物产品中的应用。
7.按权利要求6所述的单环刺螠粘液的应用，其特征在于：所述单环刺螠体表粘液冻干粉，在作为大肠杆菌、溶血性链球菌、鲍氏不动杆菌或痤疮丙酸杆菌的抗菌制剂的应用；或，作为体外抗血液凝集制剂的应用。
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