CN110934867A

CN110934867A - Hao1抑制剂在制备抑制肿瘤肺转移前微环境形成及防治肿瘤肺转移的药物中的应用

Info

Publication number: CN110934867A
Application number: CN201911357493.3A
Authority: CN
Inventors: 梁莉; 曾志诚; 徐少婉
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN110934867B

Abstract

本发明公开了一种Hao1抑制剂在制备抑制肿瘤肺转移前微环境形成及防治肿瘤肺转移的药物中的应用。本发明通过构建乳腺癌脂肪垫种植模型，发现负瘤小鼠在转移前阶段肺组织Hao1存在显著上调。申请人利用Hao1抑制剂CCPST处理小鼠，检测CCPST对负瘤小鼠转移前阶段肺组织草酸浓度、炎症因子和促转移相关因子表达的影响及乳腺癌肺转移能力的影响，从而为CCPST应用于制备防治乳腺癌肺转移的药物提供依据。化合物CCPST能显著抑制负瘤小鼠转移前阶段肺组织草酸浓度、炎症因子和促转移相关因子表达，抑制乳腺癌肺转移，且无明显毒副作用，因此可用于制备有效抑制乳腺癌肺转移的药物。

Description

Hao1抑制剂在制备抑制肿瘤肺转移前微环境形成及防治肿瘤肺转移的药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物的药物新应用，具体涉及一种Hao1抑制剂在制备抑制肿瘤肺转移前微环境形成及防治肿瘤肺转移的药物中的应用。

背景技术

肿瘤转移是乳腺癌病人死亡的主要原因，其发生的主要环节包括原位肿瘤细胞侵袭周围间质进入循环系统并播散至转移器官及定植肿瘤细胞适应转移器官微环境。而近来的研究发现肿瘤细胞在转移至远端器官之前便能改造其微环境，使之更有利于肿瘤定植及生存，即转移前微环境(Pre-metastatic niche)。靶向转移前微环境的治疗方案已被证实是一种有前景的肿瘤转移干涉手段。因此，寻找转移前微环境形成相关靶点对防治肿瘤转移有重大意义。

草酸是一类二元羧酸，是细胞代谢过程中产生的代谢物终产物，产生于多种类型的细胞如肝细胞、上皮细胞等并可被分泌至细胞外基质，通过循环系统、泌尿系统排出体外。当组织中草酸产生过多时可以诱导组织氧化损伤和炎症。Hao1(醇酸氧化酶1，Hydroxyacid oxidase1)主要表达于细胞的过氧化物酶体中，其主要功能是将细胞中的乙醇酸(glycolate)转化为乙醛酸(glyoxylate)，而后者可以进一步在Hao1或乳酸脱氢酶(LDH)的催化下被进一步氧化为草酸(oxalate)。因此，Hao1是草酸代谢中重要的代谢酶之一，研究显示通过CRISPR/CAS9或RNAi技术下调Hao1表达后可以显著降低细胞草酸生成，表明Hao1可以作为干预细胞草酸生成的靶点。但Hao1介导的草酸代谢在乳腺癌细胞诱导的肺转移前微环境形成中的作用则尚不清楚。

化合物CCPST(4-carboxy-5-[(4-chlorophenyl)sulfanyl]-1,2,3-thiadiazole)是一种Hao1的非竞争性抑制剂，能够有效阻断Hao1功能，抑制草酸生成，因此有文献报道其可以有效治疗小鼠肾草酸钙结石形成及高草酸尿症。但化合物CCPST在乳腺癌肺转移中的治疗作用尚未见报道。

发明内容

针对上述问题，本发明的其中一个目的在于提供Hao1抑制剂的药物新应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

Hao1抑制剂在制备抑制肿瘤肺转移前微环境形成的药物中的应用。

Hao1抑制剂在制备防治肿瘤肺转移的药物中的应用。

进一步地，所述Hao1抑制剂为化合物CCPST。所述化合物CCPST的结构如式(I)所示：

进一步地，所述肿瘤为乳腺癌。

进一步地，所述乳腺癌为4T1细胞。

在其中一些实施例中，负瘤小鼠为脂肪垫接种了乳腺癌细胞株4T1的Balb/c小鼠。

在其中一些实施例中，转移前阶段为Balb/c小鼠脂肪垫接种乳腺癌细胞株4T1后2周。

本发明的另一目的在于提供一种抑制肿瘤肺转移前微环境形成以及防治肿瘤肺转移的药物，具体技术方案如下：

一种抑制肿瘤肺转移前微环境形成的药物组合物，其活性成分包括Hao1抑制剂，所述Hao1抑制剂为化合物CCPST。

一种防治肿瘤肺转移的药物组合物，其活性成分包括Hao1抑制剂，所述Hao1抑制剂为化合物CCPST。

本发明具有以下有益效果：

本发明构建乳腺癌细胞脂肪垫种植模型，检测转移前阶段肺组织Hao1表达水平，采用化合物CCPST进行药物处理，检测化合物CCPST对转移前阶段小鼠肺组织草酸浓度、炎症因子和促转移相关因子表达的影响及对乳腺癌肺转移的影响，从而为CCPST应用于制备防治乳腺癌肺转移的药物提供依据。化合物CCPST具有显著抑制转移前阶段肺组织草酸堆积、炎症因子和促转移相关因子表达的能力及抑制乳腺癌细胞肺转移的能力，且无明显毒副作用，因此可用于制备有效抑制乳腺癌肺转移的药物。

附图说明

图1是通过荧光定量PCR和Western blot检测负瘤小鼠转移前阶段肺组织Hao1表达水平变化，其中图1A是荧光定量PCR检测了乳腺癌负瘤小鼠转移前阶段Hao1的表达情况。图1B是Western blot检测了乳腺癌负瘤小鼠转移前阶段Hao1的表达情况；

图2是通过检测小鼠支气管肺泡灌洗液草酸浓度评估化合物CCPST对负瘤小鼠转移前阶段肺组织草酸堆积的抑制作用；

图3是通过荧光定量PCR检测化合物CCPST对负瘤小鼠转移前阶段肺组织炎症因子和促转移相关因子表达的抑制作用；

图4是通过乳腺癌脂肪垫种植模型检测化合物CCPST对乳腺癌细胞肺转移能力的抑制作用。

具体实施方式

本发明提供了Hao1抑制剂的药物新应用。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明实施例中所使用的化合物CCPST购自keyorganic公司，cas号为：S5233。其结构式如下：

实施例1负瘤小鼠转移前阶段肺组织Hao1表达水平变化

1、构建乳腺癌脂肪垫种植模型：首先37℃水浴复苏4T1细胞，然后接种于细胞培养瓶中。细胞培养使用含10％胎牛血清的DMEM培养基(FBS，Gibco，澳大利亚)。培养箱条件为37℃，5％CO₂。待细胞长至90％密度时常规利用胰酶进行消化，加入完全培养基终止消化，并以1000rpm离心5min，弃去上清，并以PBS清洗沉淀两次，最后以PBS重悬细胞沉淀并进行细胞计数。用75％的酒精对小鼠接种部位的皮肤进行消毒后，用1ml的注射器将含有10⁵个4T1细胞的细胞悬液注入小鼠左侧第四对乳腺脂肪垫处。

2、转移前阶段肺组织Hao1表达检测：

(1)提取细胞总RNA：小鼠脂肪垫种植4T1细胞后2周，将小鼠处死，以组织剪快速分离出肺组织，并将肺组织粗剪为约1mm³大小的组织块，并置于研钵中研磨，直至组织呈匀浆状。之后加入1ml TRIzol，将组织匀浆充分重悬，并移入1.5ml去酶EP管中，于冰上静置裂解30min，加入200μl三氯甲烷后剧烈震荡15s，使RNA纯化，静置分层，4℃，12000rpm离心5min，小心吸取上清转移到新的EP管，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，往EP管加入1ml DEPC水配制的75％乙醇，洗涤上述所得沉淀，然后4℃，12000rpm离心5min后弃上清，晾干后加入适量DEPC水溶解沉淀，利用紫外分光光度仪测定RNA浓度及A260/280值，将RNA冻存于-80℃备用。

(2)逆转录反应：从-20℃取出逆转录酶融解，上下轻轻颠倒混匀，短暂离心之后放置于冰上待用。再按照TaKaRa逆转录的试剂盒说明书冰上向200μl去酶EP管中加入下列试剂：5×PrimeScript^TMRT enzyme Mix：2μl，Total RNA：500ng，最后加入DEPC处理水将总液量补至10μl，混匀配制的反应系，短暂离心之后将EP管置于PCR仪中，进行如下反应：37℃反应15min，85℃灭活5s，4℃保存。之后，将逆转录所得cDNA用DEPC处理水稀释5倍后-20℃保存，备用。

(3)荧光定量PCR反应：引物的序列如下：

Hao1上游引物：5，GACCGTGAGATCAGCAGACA 3，SEQ ID NO：1

Hao1下游引物：5，GTTCCGCACGTCATCAATGC 3，SEQ ID NO：2

Gapdh上游引物：5，AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3，SEQ ID NO：3

Gapdh下游引物：5，TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3，SEQ ID NO：4

按照TaKaRaQPCR试剂说明书配制如下反应体系:SYBR Premix Ex Taq^TM:10μl，上游引物(10μM):0.4μl，下游引物(10μM):0.4μl，ROX Reference DyeⅡ:0.4μl，cDNA：2μl，最后以双蒸水将总液量补齐至20μl。

反应条件：95℃预变性10min、95℃15s、60℃30s、72℃34s，共40个循环。7500FastReal-Time PCR仪取得各模板的Ct值。以Folds＝2-ΔΔCt来表示未经处理小鼠肺组织和负瘤小鼠转移前阶段肺组织中目的基因表达关系。实验重复3次。

3、Western blot：小鼠脂肪垫种植4T1细胞后2周，将小鼠处死，以组织剪快速分离出肺组织，并将肺组织粗剪为约1mm³大小的组织块，并置于研钵中研磨，直至组织呈匀浆状。之后通过全蛋白提取试剂盒(杭州弗德生物有限公司)提取总蛋白，使用Bio-Rad公司BCA Protein Assay Reagengt Kit进行蛋白定量，煮沸变性。

SDS-PAGE电泳：浓缩胶恒定电压在80V，分离胶恒定电压在120V，至跑出目的蛋白。

转膜：Tenon微型电转系统200MA进行转膜。

封闭：5％脱脂牛奶室温孵育30min。

敷一抗：Hao1鼠单克隆抗体(1:1000，Immunoway)，Gapdh鼠单克隆抗体(1:5000，Proteintech)，4℃孵育过夜。

敷二抗：HRP标记的抗鼠二抗(1:10000，杭州弗德生物有限公司)室温孵育1h。

ECL超敏化学发光试剂(南京凯基生物科技发展有限公司)对条带进行检测。

结果发现，脂肪垫乳腺癌细胞4T1可以在转移前阶段显著促进肺组织Hao1表达。

结果如图1A、B所示，图1A是荧光定量PCR检测了乳腺癌负瘤小鼠转移前阶段Hao1的表达情况。图1B是Western blot检测了乳腺癌负瘤小鼠转移前阶段Hao1的表达情况。该图显示负瘤小鼠转移前阶段Hao1表达水平(4T1组)显著高于未负瘤小鼠(Blank组)。

实施例2化合物CCPST对负瘤小鼠转移前阶段肺组织草酸堆积的抑制作用

1、按实施例1所述构建乳腺癌脂肪垫种植模型。

2、CCPST给药：在精细电子秤上称取25mg CCPST，并溶于1ml无水乙醇中，充分吹打混匀至CCPST粉末完全溶解；在超净台中将上述1ml含CCPST无水乙醇慢慢滴加入49ml PBS中，一边滴加一边搅拌(防止局部药物浓度过高析出)，从而得到CCPST工作液(药物浓度为0.5mg/ml)，同时配置等量2％乙醇PBS作为安慰剂。之后将CCPST工作液及安慰剂置于4℃保存待用。在小鼠接种了4T1细胞的第二天开始给予CCPST处理。将负瘤小鼠随机分为两组。实验组按照0.5mg/kg/day的剂量给予CCPST工作液腹腔注射，对照组给予等体积安慰剂。

3、支气管肺泡灌洗液草酸浓度检测：在小鼠脂肪垫接种4T1细胞后两周处死小鼠，以注射器向小鼠气管中注入1ml 37℃预温的PBS，1分钟后吸出肺泡灌洗液并将其转移至1.5ml EP管中，置于冰上孵育10min后以4℃，12000rpm的条件离心5min，取上清待用；向96孔板中加入草酸标准品和支气管肺泡灌洗液各50μl，之后每孔加入2μl试剂OxalateConverter，充分混匀后置于37℃孵箱孵育1h；按每孔50μl的量配置反应混合液，即将试剂Oxalate Development Buffer、Oxalate Enzyme Mix、Oxalate Probe按23:1:1的比例混合；取出96孔板，每孔加入50μ配置好的反应混合液，充分混匀后置于37℃孵箱避光孵育1h；在酶标仪中测量在OD＝450nm处的吸光度值，并根据标准品浓度的OD值拟合标准曲线，换算样品草酸浓度。

结果发现，CCPST可以显著抑制脂肪垫4T1细胞诱导的转移前阶段肺组织草酸堆积。

结果如图2所示，图2是通过检测小鼠支气管肺泡灌洗液草酸浓度评估CCPST对负瘤小鼠转移前阶段肺组织草酸堆积的抑制作用。该图显示负瘤小鼠转移前阶段肺组织草酸浓度(NC组)显著高于未负瘤小鼠(Blank组)，而使用CCPST处理负瘤小鼠(CCPST组)可以显著抑制脂肪垫4T1细胞诱导的转移前阶段肺组织草酸堆积。

实施例3化合物CCPST对负瘤小鼠转移前阶段肺组织炎症因子和促转移相关因子表达的抑制作用

1、按实施例1、2所述构建乳腺癌脂肪垫种植模型并给予CCPST处理两周。

2、转移前阶段肺组织炎症因子表达检测：按实施例1所述提取肺组织RNA，并进行逆转录和荧光定量PCR。

引物的序列如下：

Il1b上游引物：5，GCAACTGTTCCTGAACTCAACT 3，SEQ ID NO：5

Il1b下游引物：5，ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT 3，SEQ ID NO：6

Tnfa上游引物：5，CCCTCACACTCAGATCATCTTCT 3，SEQ ID NO：7

Tnfa下游引物：5，GCTACGACGTGGGCTACAG 3，SEQ ID NO：8

Cox2上游引物：5，TGAGCAACTATTCCAAACCAGC 3，SEQ ID NO：9

Cox2下游引物：5，GCACGTAGTCTTCGATCACTATC 3，SEQ ID NO：10

Il6上游引物：5，TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC 3，SEQ ID NO：11

Il6下游引物：5，TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC 3，SEQ ID NO：12

Mmp9上游引物：5，CTGGACAGCCAGACACTAAAG 3，SEQ ID NO：13

Mmp9下游引物：5，CTCGCGGCAAGTCTTCAGAG 3，SEQ ID NO：14

S100a8上游引物：5，AAATCACCATGCCCTCTACAAG 3，SEQ ID NO：15

S100a8下游引物：5，CCCACTTTTATCACCATCGCAA 3，SEQ ID NO：16

S100a9上游引物：5，ATACTCTAGGAAGGAAGGACACC 3，SEQ ID NO：17

S100a9下游引物：5，TCCATGATGTCATTTATGAGGGC 3，SEQ ID NO：18

Bv8上游引物：5，GCCCCGCTACTGCTACTTC 3，SEQ ID NO：19

Bv8下游引物：5，CCCCGTGCAGACACTAACTTT 3，SEQ ID NO：20

Gapdh上游引物：5，AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3，SEQ ID NO：3

Gapdh下游引物：5，TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3，SEQ ID NO：4

结果发现，CCPST可以显著抑制脂肪垫4T1细胞诱导的转移前阶段肺组织炎症因子和促转移相关因子表达。

结果如图3所示，图3是荧光定量PCR检测CCPST对负瘤小鼠转移前阶段肺组织炎症因子和促转移相关因子表达的抑制作用。该图显示负瘤小鼠转移前阶段肺组织炎症因子和促转移相关因子表达(NC组)显著高于未负瘤小鼠(Blank组)，而使用CCPST处理负瘤小鼠(CCPST组)可以显著抑制脂肪垫4T1细胞诱导的转移前阶段肺组织炎症因子和促转移相关因子表达上调。

实施例4化合物CCPST对乳腺癌细胞肺转移能力的抑制作用

1、按实施例1、2所述构建乳腺癌脂肪垫种植模型并给予CCPST处理40天。

2、40天后，将小鼠处死，取出肺组织，放入包埋盒内，并将包埋盒放入4％多聚甲醛内固定24h。常规进行脱水、浸蜡、包埋及切片，并按以下操作对切片进行HE染色：

①烤片：将切片置于68℃烤箱中烤片1h；

②脱蜡及水化：常规二甲苯Ⅰ5min；二甲苯Ⅱ5min；100％乙醇2min；95％乙醇2min；80％乙醇2min；70％乙醇2min；流水冲洗；

③染色：切片置入苏木素中室温染色3min，流水冲洗，镜下观察染色情况。用1％盐酸乙醇分化3s，迅速用自来水冲洗切片，直至切片变蓝。

④脱水：切片经伊红染色3min；80％乙醇1min，95％乙醇1min；无水乙醇Ⅰ1min；无水乙醇Ⅱ1min；二甲苯1min；置于通风橱中晾干。

⑤中性树胶封片，显微镜观察、拍片，统计肺组织中转移灶数目。

结果发现，CCPST可以显著抑制乳腺癌肺转移能力。

结果如图4所示，图4是通过乳腺癌脂肪垫种植肺转移实验检测CCPST对乳腺癌细胞肺转移能力的抑制作用。该图显示经CCPST处理的负瘤小鼠乳腺癌肺转移灶数量(CCPST组)显著少于经安慰剂处理的负瘤小鼠(NC组)。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> Hao1抑制剂在制备抑制肿瘤肺转移前微环境形成及防治肿瘤肺转移的

药物中的应用

<130> CP119011251C

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaccgtgaga tcagcagaca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttccgcacg tcatcaatgc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aggtcggtgt gaacggattt g 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgtagaccat gtagttgagg tca 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcaactgttc ctgaactcaa ct 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcttttggg gtccgtcaac t 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccctcacact cagatcatct tct 23

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctacgacgt gggctacag 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgagcaacta ttccaaacca gc 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcacgtagtc ttcgatcact atc 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tagtccttcc taccccaatt tcc 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttggtcctta gccactcctt c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctggacagcc agacactaaa g 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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ctcgcggcaa gtcttcagag 20

<210> 15

<211> 22

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<213> 人工序列

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aaatcaccat gccctctaca ag 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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cccactttta tcaccatcgc aa 22

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atactctagg aaggaaggac acc 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tccatgatgt catttatgag ggc 23

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gccccgctac tgctacttc 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccccgtgcag acactaactt t 21

Claims

1.Hao1抑制剂在制备抑制肿瘤肺转移前微环境形成的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Hao1抑制剂为化合物CCPST。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为4T1细胞。

5.一种抑制肿瘤肺转移前微环境形成的药物组合物，其特征在于，其活性成分包括Hao1抑制剂，所述Hao1抑制剂为化合物CCPST。

6.Hao1抑制剂在制备防治肿瘤肺转移的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述Hao1抑制剂为化合物CCPST。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为4T1细胞。

10.一种防治肿瘤肺转移的药物组合物，其特征在于，其活性成分包括Hao1抑制剂，所述Hao1抑制剂为化合物CCPST。