CN110917173B - 一种主动趋炎抗炎工程化外泌体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种主动趋炎抗炎工程化外泌体及其制备方法，属于生物医学技术领域。所述外泌体以基于M2型巨噬细胞衍生的外泌体为载体，并将HAL以电穿孔的方式载入所述载体内，所述外泌体的平均粒径为120nm～250nm。将HAL与所述载体充分混匀于缓冲液中并放置于电穿孔容器中，使用电穿孔法使HAL进入所述载体内，电转15s，以上步骤均在‑5℃～5℃完成，离心去除多余的HAL，得到所述外泌体。所述外泌体利用所述载体的抗炎与趋炎特性，可主动靶向到炎症部位处，同时可以逃避单核吞噬系统等多种生物屏障，靶向效果优于现有技术。

Description

一种主动趋炎抗炎工程化外泌体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种主动趋炎抗炎工程化外泌体及其制备方法，属于生物医学技术领域。
背景技术
动脉粥样硬化作为一种慢性炎症疾病，是诱发心血管疾病的重要因素。在动脉粥样硬化引起严重的并发症之前，其进程可达十年，因此对于早期动脉粥样硬化的治疗显得尤为重要。当前，临床上用于动脉粥样硬化疾病的药物存在着较大的缺陷，例如靶向性差、半衰期短以及副作用大等问题。
由于动脉粥样硬化部位表现出类似于实体瘤的高通透性和滞留效应，此种效应能够使纳米颗粒渗透到动脉粥样硬化斑块处，因此纳米技术的应用为动脉粥样硬化治疗提供了一种新的思路。然而，基于纳米颗粒的药物递送系统仍然存在着固有的缺陷，比如载体本身的免疫原性和毒性，快速被免疫识别并清除以及生物相容性差等。因此，开发更有效合理的治疗方法仍然是一个挑战。外泌体作为一种30nm～150nm细胞外囊泡，它自身具有良好的生物相容性，并具备了体内长循环、病灶靶向等特点，从而可作为良好的药物递送载体。目前尚未在心血管疾病治疗方面得到应用。虽然文献中报道将一些生物靶向分子修饰到外泌体表面，但这种修饰后的外泌体的趋炎效果仍旧一般。此外，外泌体本身含有丰富的RNA、DNA、蛋白质等分子，这些可以直接用来治疗炎症等相关疾病。
由于M2巨噬细胞分泌的外泌体内含有大量的抗炎因子，同时其表面表达了一些趋化因子受体，可表现出优异的趋炎性与抗炎性，进而有效的解决现有外泌体靶向性差等问题。
发明内容
针对现有技术中，虽然文献中报道将一些生物靶向分子修饰到外泌体表面，但这种修饰后的外泌体靶向效果仍旧一般的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种主动趋炎抗炎工程化外泌体。
本发明的目的之二在于提供一种主动趋炎抗炎工程化外泌体的制备方法。
为实现本发明的目的，提供以下技术方案。
一种主动趋炎抗炎工程化外泌体，所述外泌体以基于M2型巨噬细胞衍生的外泌体(简称为M2 Exo)为载体，并将戊氨基酮戊酸己酯盐酸盐(hexyl5-aminolevulinatehydrochloride，HAL)以电穿孔的方式载入所述载体内，所述外泌体的平均粒径为120nm～250nm。
优选所述M2型巨噬细胞的前身为巨噬细胞RAW264.7。
优选所述外泌体的平均粒径为150nm～200nm。
一种主动趋炎抗炎工程化外泌体的制备方法，所述制备方法步骤如下：
将HAL与M2 Exo充分混匀于缓冲液中并放置于电穿孔容器中，使用电穿孔法使HAL进入M2 Exo内，电转15s，以上步骤均在-5℃～5℃完成，离心去除多余的HAL，得到本发明所述的一种主动趋炎抗炎工程化外泌体(简称为HAL@M2 Exo)。
优选M2 Exo的制备方法为超速离心法。
HAL的质量为0.25μg～128μg，优选HAL的质量为32μg。
M2 Exo的质量为5μg～15μg，优选M2 Exo的质量为10μg。
电穿孔电压为50～150V，电阻为200Ω，电容为100μF；优选电压为100V。
优选离心条件为：5000g～15000g，5min～15min；更优选离心条件为：10000g，10min。
有益效果
本发明提供了一种主动趋炎抗炎工程化外泌体及其制备方法，所述外泌体基于M2巨噬细胞外泌体的抗炎与趋炎特性，可使载有HAL的M2 Exo主动靶向到炎症部位处，同时可以逃避单核吞噬系统(MPS)等多种生物屏障；当巨噬细胞进入炎症细胞后，可以导致内源的抗炎因子和外源性的HAL的释放，HAL可发生内源性代谢反应，生成中间体原卟啉原(PpIX)；在下游的生物合成过程中，PpIX被转化为血红素，血红素又被高效地转化为一氧化碳(CO)和胆红素，成为细胞内最终的分解代谢产物；CO具有抗炎、抗血管增生和血管扩张作用，胆红素具有抗氧化的功能；M2 Exo本身所具有的内源的抗炎因子、CO和胆红素三者共同用于动脉粥样硬化疾病早期的治疗。
附图说明
图1为实施例1中M2 Exo的透射电子显微镜(TEM)图。
图2为实施例1中HAL@M2 Exo的TEM图。
图3为实施例1中HAL、M2 Exo和HAL@M2 Exo的高效液相色谱(HPLC)图。
图4为实施例1中transwell小室模型对基底侧上清液或炎症细胞中M2 Exo或HAL@M2 Exo的时变定量折线图。
图5为实施例1中不同处理后细胞PpIX的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图6为实施例1中不同处理后细胞中CO的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图7为实施例1中炎症细胞中ROS经不同处理后的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图8为实施例1中炎症细胞中iNOS经不同处理后的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图9为实施例1中泡沫细胞oxLDL经不同处理后的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图10为实施例1中经ORO染色的主动脉切面照片及相应斑块面积的定量分析；ORO染色主动脉瓣冰冻切片照片及相应斑块面积定量分析。
图11为实施例2中M2 Exo的TEM图。
图12为实施例2中HAL@M2 Exo的TEM图。
图13为实施例2中HAL、M2 Exo和HAL@M2 Exo的HPLC图。
图14为实施例2中不同处理后细胞PpIX的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图15为实施例2中不同处理后细胞中CO的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图16为实施例2中炎症细胞中ROS经不同处理后激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图17为实施例2中炎症细胞中iNOS经不同处理后的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图18为实施例3中M2 Exo的TEM图。
图19为实施例3中HAL@M2 Exo的TEM图。
图20为实施例3中HAL、M2 Exo和HAL@M2 Exo的HPLC图。
图21为实施例3中不同处理后细胞PpIX的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图22为实施例3中不同处理后细胞中CO的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图23为实施例3中炎症细胞中ROS经不同处理后的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
图24为实施例3中炎症细胞中iNOS经不同处理后的激光共聚焦显微镜荧光成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来详述本发明，但不作为对本发明专利的限定以下实施例中：
RAW264.7巨噬细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自北京协和医院；
戊氨基酮戊酸己酯盐酸盐(hexyl 5-aminolevulinate hydrochloride，HAL)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；
磷酸缓冲盐溶液(1X PBS)购自中科迈晨(北京)科技有限公司；
RIPA裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；
ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司；
氧化低密度脂蛋白(oxLDL)和DiI标记氧化型低密度脂蛋白(DiI-oxLDL)购自广州奕元生物技术有限公司；
DMEM(dulbecco's modified eagle medium)和胎牛血清(FBS)购自Gibco；
脂多糖(LPS)购自赛默飞世尔科技公司；
一氧化氮合酶((iNOS))抗体和荧光标记的二抗Alexa
Figure BDA0002299082270000041
594购自艾博抗(上海)贸易有限公司；
Hoechst33342(CD052)购自中科迈晨(北京)科技有限公司；
Oil Red O(ORO)购自西格玛公司；
ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠，～20g，6-8周，雄性)以及高脂饲料购自卡文斯动物有限公司；
细胞培养完全培养基为：含体积分数为10％胎牛血清，60μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基；
无血清培养基为：含体积分数为0胎牛血清，60μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基；
Transwell小室(插入式细胞培养皿，孔径为0.30μm)购自康宁公司；
荧光探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)购自北京索莱宝科技有限公司；
细胞膜绿色荧光探针(DIO)，来自上海翊圣生物科技有限公司；
Malvern ZEN 3600Zetasizer来自英国马尔文仪器有限公司；
透射电子显微镜(TEM)采用赛默飞世尔科技公司的Tecnai Spirit；
高效液相色谱(HPLC)来自日本岛津公司的LC-10a；
流式细胞仪CytoFlex LX购自贝克曼库尔特公司；
普迈精医纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)来自德国Particle Metrix；
激光共聚焦显微镜A1来自尼康公司。
实施例1
一种主动趋炎抗炎工程化外泌体的制备方法，所述方法具体步骤如下：
步骤一、基于M2巨噬细胞衍生的M2 Exo的制备
(1)将RAW264.7巨噬细胞按照2.0×106/皿的接种量接种于培养皿中，加入浓度为100ng/mL的白细胞介素4(IL-4)，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用无血清培养基培养24h，收集所述培养基；
(2)先将步骤一(1)收集到的培养基500ml以300g离心15in以除去杂质；然后以10,000g离心15min以去除细胞碎片；最后以100,000g离心120min，收集上清，然后重悬于0.5mL的1X PBS中，得到M2 Exo溶液。
步骤二、电穿孔HAL
将32μg的HAL与含有10μg M2 Exo的M2 Exo溶液加入200μL1X PBS中充分混合，然后将其放于电击杯中，电穿孔的参数为：电压为100V，电阻为200Ω，电容为100μF，以上操作均在冰上完成，电转15s，最后以10,000g离心10min去除游离的HAL，得到沉淀为本发明所述的一种主动趋炎抗炎工程化外泌体(简称为HAL@M2 Exo)。
制备M0型巨噬细胞衍生的外泌体(M0 Exo)：无须加入IL-4，其余同步骤一、基于M2巨噬细胞衍生的M2 Exo的制备，制备得到M0 Exo溶液。
制备M1型巨噬细胞衍生的外泌体(M1 Exo)：将100ng/mL的IL-4替换为1μg/mL的LPS，其余同步骤一、基于M2巨噬细胞衍生的M2 Exo的制备，制备得到M1 Exo溶液。
测试表征实验：
1.对本实施例制备得到的M2 Exo溶液、M0 Exo溶液和M1 Exo溶液进行测试表征实验如下：
取含有10μg M2 Exo的M2 Exo溶液，分散在1mL去离子水中，得到稀释后的M2 Exo溶液，取10μL稀释后的M2 Exo溶液滴在无定形碳膜铜网载体，干燥后，通过TEM进行观察，结果如图1所示，M2 Exo的形状为杯状。
使用Malvern ZEN 3600Zetasizer仪器对M2 Exo进行水合粒径和表面Zeta电位的测量，测得M2 Exo的平均粒径为180nm，表面Zeta电位为-22.85mV。
将含有20μg M2 Exo的M2 Exo溶液、含有20μg M0 Exo的M0 Exo溶液和含有20μgM1 Exo的M1 Exo溶液各分别用200μl的RIPA裂解液裂解之后，使用ELISA试剂盒分别测定其中的内抗炎因子(IL-10，TGF-β和IL-Ra)与促炎因子(IL-6，TNF-α和MMP-10)的含量。测试结果表明，M0 Exo、M1 Exo和M2 Exo中，M2 Exo的抗炎因子含量较高，抗炎因子IL-10，TGF-β和IL-Ra的含量依次为1176.33pg/mL、36.77pg/mL和211.33pg/mL；M2 Exo中促炎因子的含量最低，促炎因子IL-6，TNF-α和MMP-10的含量依次为44.37pg/mL、111.67pg/mL和69.77pg/mL；以上结果均表明M2 Exo具有优异的抗炎作用。
2.对本实施例制备得到的HAL@M2 Exo进行测试表征实验如下：
将10μg的HAL@M2 Exo分散在1mL去离子水中，得到稀释后的HAL@M2 Exo溶液，取10μL稀释后的HAL@M2 Exo溶液滴在无定形碳膜铜网载体，干燥后，通过透射电子显微镜进行观察，结果如图2所示，HAL@M2 Exo的形状为杯状；使用Malvern ZEN 3600Zetasizer仪器测得HAL@M2 Exo的平均粒径为180nm，表面Zeta电位是-25.87mV，与M2 Exo参数相似，由此可以看出HAL的装载并不会对M2 Exo的性质有较大的影响。通过HPLC对HAL、M2 Exo和HAL@M2Exo的特征峰进行分析，结果如图3所示，HAL@M2 Exo与HAL的特征峰出现的时间一致；以上结果表明HAL成功装载进入M2 Exo。通过如下计算公式(1)和(2)，计算得到HAL的装载率和包封率分别为25.14％和19.34％。
LE(％)＝MHAL/(MM2 Exo+MHAL)×100％(1)；
EE(％)＝MHAL/Madded×100％(2)；
其中：LE代表装载率，EE代表包封率，MHAL代表HAL@M2 Exo中HAL的量，MM2 Exo代表HAL@M2 Exo中M2 Exo的量，Madded代表加入的HAL的量。
3.对本实施例制备得到的HAL@M2 Exo的抗炎能力进行测试表征实验如下：
Ⅰ、检测HAL@M2 Exo的体外趋炎性
准备4个直径为0.30μm的Transwell小室，分别标记为1号～4号，将HUVECs以105/孔分别接种于4个Transwell小室的上室中，将J774A.1巨噬细胞以105/孔接种于4个Transwell小室的下室中并加入1μg/mL 500μL的LPS刺激为炎症细胞，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h；其中，1号和2号Transwell小室的上室加入1μg/mL的LPS 500μL培养12h刺激HUVECs，将5μM的DIO溶液5μL溶于1mL含有108个HAL@M2 Exo的DMEM中，于37℃孵育0.5h，使用100K的超滤管在12000g离心15min，去除染料后，得到DIO标记的HAL@M2 Exo，下述DIO标记的方法与本方法相同。随后将DIO标记的HAL@M2 Exo(108个/孔)加入1号Transwell小室的上室，得到HAL@M2 Exo+LPS组，将DIO标记的M2 Exo(108个/孔)加入2号Transwell小室的上室，得到M2 Exo+LPS组，3号和4号Transwell小室的上室不加入LPS，随后将DIO标记的HAL@M2 Exo(108个/孔)加入3号Transwell小室的上室，得到HAL@M2 Exo组，将DIO标记的M2 Exo(108个/孔)加入4号Transwell小室的上室，得到M2Exo组；4个Transwell小室均在培养6h、12h、24h和36h时，收集下室中的上清，对M2 Exo进行定量，同时对下室的炎症细胞用流式细胞仪进行流式分析，结果如图4所示，M2 Exo+LPS组和HAL@M2 Exo+LPS组随时间的延长，渗漏到基底层M2 Exo的数量和炎症细胞的平均荧光强度均大幅度上升，表明通过LPS刺激后，在LPS引起的炎症环境中，M2 Exo和HAL@M2 Exo均可有效的向基底层上清迁移和向炎症细胞积累。
Ⅱ、检测HAL@M2 Exo的体外抗炎能力
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 1μL刺激为炎症细胞，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有3.36μg HAL的1X PBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有3.36μg HAL)的1X PBS，4组在同样条件下继续共培养24h，用激光共聚焦显微镜观察，结果如图5所示，HAL和HAL@M2 Exo共培养组具有较强的红色荧光(PpIX自发荧光)，而M2 Exo和PBS共培养组荧光(PpIX自发荧光)信号较弱，表明PpIX可以成功地在炎症细胞内由HAL底物生物合成。
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 1μL，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有3.36μg HAL的1XPBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有3.36μg HAL)的1X PBS，4组在同样条件下继续共培养24h，向4组中分别加入浓度为1μM的氯甲酸丙烯酯功能化荧光素(FL-CO-1)100μL作为一氧化碳荧光探针，37℃下孵育30min，孵育完成后用1X PBS洗3次，加入1mL的1X PBS于共聚焦小皿中，使用激光共聚焦显微镜进行观察，结果如图6所示。图6显示，通过激光共聚焦显微镜检测CO的生成，含有HAL的组别(HAL，HAL@M2 Exo)产生明显的绿色荧光信号，表明有CO的生成。
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 10μL，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有3.36μg HAL的1XPBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有3.36μg HAL)的1X PBS，4组在同样条件下继续共培养24h，弃掉培养液，用1X PBS洗涤2次，之后加入10μM的DCFH-DA染料5μL，37℃孵育1h后，去除未结合的染料，再用1X PBS洗涤2次，加入1X PBS 1mL获得样品溶液，进行激光共聚焦荧光成像和流式细胞仪表征荧光强度检测。激光共聚焦荧光成像检测结果如图7所示(绿色:DCFH-DA标记的ROS)，经过含有HAL@M2 Exo继续培养24h后获得的样品溶液进行激光共聚焦荧光成像检测结果绿色荧光最弱，表明该组ROS水平明显降低；流式细胞仪表征荧光强度检测结果显示经过HAL@M2 Exo组的荧光信号较弱；以上结果均表明加入HAL@M2 Exo起到了良好的抗炎效果。
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 10μL，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有3.36μg HAL的1XPBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有3.36μg HAL)的1X PBS，在同样条件下继续共培养24h，弃掉培养液，用1X PBS洗涤2次；将浓度为0.2mg/mL的兔抗小鼠的一氧化氮合酶(iNOS)抗体，按照1:500的体积比用1X PBS进行稀释，将稀释后的iNOS抗体1mL与不同处理组的样品在4℃条件下进行过夜共孵育，此后使用浓度为50μg/mL荧光标记的二抗Alexa
Figure BDA0002299082270000091
594，按照1:50的体积比用1X PBS稀释，在37℃下用稀释后荧光标记的二抗Alexa
Figure BDA0002299082270000092
594溶液1mL染色1h，1X PBS洗3次，然后使用浓度为10mg/mL的Hoechst33342，按照1:1000的体积比用1X PBS稀释，每组中加入100μL，室温下孵育15min，用1X PBS洗3次，加入1mL的1X PBS重悬，使用激光共聚焦进行观察。结果如图8所示(红色表示iNOS；蓝色表示细胞核)，激光共聚焦荧光成像检测加入HAL@M2 Exo处理的实验组红色荧光信号最弱。
将J774A.1巨噬细胞接种于24孔板(3×104/孔)中，6h后加入1μg/mL的LPS 1μL，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，然后分别加入1mL1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有3.36μg HAL的1X PBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有3.36μg HAL)的1X PBS成为4组，4组在同样条件下继续共培养24h，24h后收集每孔中的上清，用ELISA试剂盒进行分析，测定每组中促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的含量。加入HAL@M2 Exo处理的实验组与加入PBS处理的实验组相比，IL-6因子的含量由6463.3pg/mL降低到1107.84pg/mL，TNF-α因子的含量由1067pg/mL降低到92.84pg/mL，IL-1β因子的含量由749.13pg/mL降低到114.1pg/mL，由此表明HAL@M2 Exo可以起到良好的抗炎效果。
将J774A.1巨噬细胞接种于24孔板(3×104/孔)中，加入1μg/mL的LPS 5μL和100μg/mL的DiI标记氧化型低密度脂蛋白(DiI-oxLDL)，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，得到泡沫细胞，然后分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有3.36μg HAL的1X PBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有3.36μgHAL)的1X PBS在同样条件下继续共培养24h，结果如图9所示(红色表示DiI标记的氧化低密度脂蛋白；蓝色表示细胞核；绿色表示细胞膜)，激光共聚焦荧光成像检测加入HAL@M2 Exo处理的实验组可显著降低泡沫细胞内oxLDL的含量。
Ⅲ、检测HAL@M2 Exo的体内抗炎能力：
选用6周～8周的ApoE deficient(ApoE-/-)雄性小鼠使用高脂饲料喂养12周，建立早期动脉粥样硬化小鼠模型，将所述小鼠随机分成4组，每组6只，分别静脉注射100μL 1XPBS、100μL溶解有M2 Exo的1X PBS(M2 Exo加入量为9mg/Kg)、100μL溶解有HAL的1X PBS(HAL加入量为5.5mg/Kg)、100μL溶解有HAL@M2 Exo(HAL加入量为5.5mg/Kg)，连续给药5周后，将所述小鼠处理，切除全主动脉和主动脉瓣进行油红O(ORO)染色，用于检测动脉粥样硬化斑块中的脂质沉积情况。结果如图10所示，与注射1X PBS的对照组相比，注射HAL@M2 Exo的治疗组抗动脉粥样硬化效果最佳，使用ImageJ1.8.0软件(National Institutes ofHealth)计算斑块面积，可以得到炎症性主动脉病变面积减少75.2％，主动脉瓣病变减少73.9％。
实施例2
一种主动趋炎抗炎工程化外泌体的制备方法，所述方法具体步骤如下：
步骤一、基于M2巨噬细胞衍生的M2 Exo的制备
所述步骤一具体同实施例1。
步骤二、电穿孔HAL
将128μg的HAL与含有10μg M2 Exo的M2 Exo溶液加入200μL的1X PBS中充分混合，然后将其放于电击杯中，电穿孔的参数为：电压为100V，电阻为200Ω，电容为100μF，以上操作均在冰上完成，电转15s，最后以10,000g离心10min去除游离的HAL，得到沉淀为本发明所述的一种主动趋炎抗炎工程化外泌体(简称为HAL@M2 Exo)。
测试表征实验：
1.对本实施例制得的M2 Exo进行测试表征实验如下：
将含有10μg M2 Exo的M2 Exo溶液分散在1mL去离子水中，得到稀释后的M2 Exo溶液，取10μL稀释后的M2 Exo溶液滴在无定形碳膜铜网载体，经干燥后，通过TEM进行观察，结果如图11所示，M2 Exo的形状为杯状。
2.对本实施例制得的HAL@M2 Exo进行测试表征实验如下：
将10μg的HAL@M2 Exo分散在1mL去离子水中，得到稀释后的HAL@M2 Exo溶液，取10μL稀释后的HAL@M2 Exo溶液滴在无定形碳膜铜网载体，干燥后，通过透射电子显微镜进行观察，结果如图12所示，HAL@M2 Exo的形状为杯状，表明HAL的装载并不会对M2 Exo的性质有较大的影响。通过HPLC对HAL、M2 Exo和HAL@M2 Exo的特征峰进行分析，如图13所示，HAL@M2 Exo与HAL的特征峰出现的时间一致。以上结果表明HAL成功装载进入M2 Exo。
通过实施例1计算公式(1)和(2)，计算得到HAL@M2 Exo中HAL的装载率和包封率分别为24.48％和4.73％。
3.对本实施例制得的HAL@M2 Exo的体外抗炎能力进行测试表征实验如下：
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 10μL刺激为炎症细胞，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有2.85μg HAL的1X PBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有2.85μg HAL)的1X PBS，4组在同样条件下继续共培养24h，用激光共聚焦显微镜观察，结果如图14所示，HAL和HAL@M2 Exo共培养组具有较强的红色荧光，而M2 Exo和PBS共培养组荧光信号较弱，表明PpIX可以成功地在炎症细胞内由HAL底物生物合成。
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 10μL，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有2.85μg HAL的1XPBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有2.85μg HAL)的1X PBS在同样条件下继续共培养24h，每组加入浓度为1μM氯甲酸丙烯酯功能化荧光素(FL-CO-1)100μL作为一氧化碳荧光探针，37℃下孵育30min，孵育完成后用1X PBS洗3次，加入1mL 1X PBS于每组中，使用激光共聚焦显微镜进行观察，结果如图15所示。图15显示，通过激光共聚焦显微镜检测CO的生成，含有HAL的组别(HAL，HAL@M2 Exo)产生明显的绿色荧光信号，表明有CO的生成。
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 10μL，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有2.85μg HAL的1XPBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有2.85μg HAL)的1X PBS在同样条件下继续共培养24h，弃掉培养液，用1X PBS洗涤2次，之后加入10μM的DCFH-DA染料5μL，37℃孵育1h后，去除未结合的染料，再用1X PBS洗涤2次，加入1X PBS 1mL获得样品溶液，进行激光共聚焦荧光成像和流式细胞仪表征荧光强度检测。其中，加入PBS为对照组，其余为实验组。激光共聚焦荧光成像检测结果如图16所示(绿色表示DCFH-DA标记的ROS)，经过含有HAL@M2 Exo继续培养24h后获得的样品溶液进行激光共聚焦荧光成像检测结果绿色荧光最弱，表明该实验组ROS水平明显降低；流式细胞仪表征荧光强度检测结果显示经过加入HAL@M2 Exo的实验组荧光信号较弱；以上结果均表明HAL@M2 Exo组起到了良好的抗炎效果。
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 10μL，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有2.85μg HAL的1XPBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有2.85μg HAL)的1X PBS在同样条件下继续共培养24h，弃掉培养液，用1X PBS洗涤2次，将浓度为0.2mg/mL的兔抗小鼠的一氧化氮合酶(iNOS)抗体，按照1:500的体积比用1X PBS进行稀释，将稀释后的抗体与不同处理组的样品在4℃条件下进行过夜共孵育，此后使用浓度为50μg/mL荧光标记的二抗Alexa
Figure BDA0002299082270000121
594，按照1:50的体积比用1X PBS稀释，在37℃下用稀释的荧光标记的二抗Alexa
Figure BDA0002299082270000122
594溶液1mL染色1h，1X PBS洗3次，然后使用浓度为10mg/mL的Hoechst33342，按照1:1000的体积比用1X PBS稀释后，再向每组中加入100μL，室温下孵育15min，用1X PBS洗3次，加入1mL 1X PBS重悬，使用激光共聚焦进行观察。结果如图17所示(红色表示iNOS；蓝色表示细胞核)，激光共聚焦荧光成像检测到加入HAL@M2 Exo的实验组红色荧光信号最弱。
实施例3
一种主动趋炎抗炎工程化外泌体的制备方法，所述方法具体步骤如下：
步骤一、基于M2巨噬细胞衍生的M2 Exo的制备
所述步骤一具体同实施例1。
步骤二、电穿孔HAL
将32μg的HAL与含有10μg M2 Exo的M2 Exo溶液加入200μL1X PBS中充分混合，然后将其放于电击杯中，电穿孔的参数为：电压为150V，电阻为200Ω，电容为100μF，以上操作均在冰上完成，电转15s，最后以10,000g离心10min去除游离的HAL，得到沉淀为本发明所述的一种主动趋炎抗炎工程化外泌体(简称为HAL@M2 Exo)。
测试表征实验：
1.对本实施例制得的M2 Exo进行测试表征实验如下：
将含有10μg M2 Exo的M2 Exo溶液分散在1mL去离子水中，得到稀释后的M2 Exo溶液，取10μL稀释后的M2 Exo溶液滴在无定形碳膜铜网载体，经干燥后，通过TEM进行观察，如图18所示，M2 Exo的形状为杯状。
2.对本实施例制得的HAL@M2 Exo进行测试表征实验如下：
将10μg HAL@M2 Exo分散在1mL去离子水中，得到稀释后的HAL@M2Exo溶液，取10μL稀释后的HAL@M2 Exo溶液滴在无定形碳膜铜网载体，经干燥后，通过透射电子显微镜进行观察，如图19所示，HAL@M2 Exo的形状为杯状，表明HAL的装载并不会对M2 Exo的性质有较大的影响。通过HPLC对HAL、M2 Exo和HAL@M2 Exo的特征峰进行分析，如图20所示，HAL@M2Exo与HAL的特征峰出现的时间一致；以上结果表明HAL成功装载进入M2 Exo。
3.对本实施例制得的HAL@M2 Exo的体外抗炎能力进行测试表征实验如下：
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 10μL刺激为炎症细胞，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有3.11μg HAL的1X PBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有3.11μg HAL)的1X PBS，在同样条件下继续共培养24h，用激光共聚焦显微镜观察，结果如图21所示，HAL和HAL@M2 Exo共培养组具有较强的红色荧光，而M2 Exo和PBS共培养组荧光信号较弱，表明PpIX可以成功地在炎症细胞内由HAL底物生物合成。
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 10μL，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有3.11μg HAL的1XPBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有3.11μg HAL)的1X PBS在同样条件下继续共培养24h，每组加入浓度为1μM氯甲酸丙烯酯功能化荧光素(FL-CO-1)100μL作为一氧化碳荧光探针，37℃下孵育30min，孵育完成后用1X PBS洗3次，每组加入1mL 1X PBS，使用激光共聚焦显微镜进行观察，结果如图22所示。图22显示，通过激光共聚焦显微镜检测CO的生成，含有HAL的组别(HAL，HAL@M2 Exo)产生明显的绿色荧光信号，表明有CO的生成。
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 10μL，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有3.11μg HAL的1XPBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有3.11μg HAL)的1X PBS，在同样条件下继续共培养24h，弃掉培养液，用1X PBS洗涤2次，之后加入10μM的DCFH-DA染料5μL，37℃孵育1h后，去除未结合的染料，再用1X PBS洗涤2次，加入1X PBS 1mL获得样品溶液，进行激光共聚焦荧光成像和流式细胞仪表征荧光强度检测。其中，加入PBS为对照组，其余为实验组。激光共聚焦荧光成像检测结果如图23所示(绿色表示DCFH-DA标记的ROS)，加入HAL@M2 Exo的实验组进行激光共聚焦荧光成像检测结果绿色荧光最弱，表明所述实验组ROS水平明显降低；流式细胞仪表征荧光强度检测结果显示加入HAL@M2 Exo的实验组荧光信号较弱；以上结果均表明HAL@M2Exo组起到了良好的抗炎效果。
将J774A.1巨噬细胞以3×104/孔接种于共聚焦小皿中，6h后加入1μg/mL的LPS 10μL，置于37℃，CO2体积分数为5％的恒温培养箱中用细胞完全培养基培养24h，分为4组，然后每组分别加入1mL 1X PBS、1mL溶解有10μg M2 Exo的1X PBS、1mL溶解有3.11μg HAL的1XPBS、1mL溶解有HAL@M2 Exo(含有3.11μg HAL)的1X PBS在同样条件下继续共培养24h，弃掉培养液，用1X PBS洗涤2次，将浓度为0.2mg/mL的兔抗小鼠的一氧化氮合酶(iNOS)抗体，按照1:500的体积比用1X PBS进行稀释，将稀释后的抗体溶液与不同处理组的样品在4℃条件下进行过夜共孵育，此后使用浓度为50μg/mL的荧光标记的二抗Alexa
Figure BDA0002299082270000151
594，按照1:50的体积比用1X PBS稀释然后加入每组中1mL，在37℃下染色1h，用1X PBS洗3次，使用浓度为10mg/mL的Hoechst33342，按照1:1000的体积比用1X PBS进行稀释后向每组中分别加入100μL，室温下孵育15min，用1X PBS洗3次，加入1mL 1X PBS重悬，使用激光共聚焦进行观察。结果如图24所示(红色表示iNOS；蓝色表示细胞核)，激光共聚焦荧光成像检测加入HAL@M2 Exo处理的实验组红色荧光信号最弱。

Claims (9)

1.一种主动趋炎抗炎工程化外泌体，其特征在于：所述外泌体以基于M2型巨噬细胞衍生的外泌体为载体，并将5-氨基酮戊酸己酯盐酸盐以电穿孔的方式载入所述载体内，所述外泌体的平均粒径为120nm～250nm；所述M2型巨噬细胞的前身为巨噬细胞RAW264.7。
2.根据权利要求1所述的一种主动趋炎抗炎工程化外泌体，其特征在于：所述外泌体的平均粒径为150nm～200nm。
3.根据权利要求1所述的一种主动趋炎抗炎工程化外泌体，其特征在于：所述M2型巨噬细胞的前身为巨噬细胞RAW264.7；所述外泌体的平均粒径为150nm～200nm。
4.一种如权利要求1～3中任一项所述的主动趋炎抗炎工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述制备方法步骤如下：
将5-氨基酮戊酸己酯盐酸盐与M2型巨噬细胞衍生的外泌体充分混匀于缓冲液中并放置于电穿孔容器中，使用电穿孔法使5-氨基酮戊酸己酯盐酸盐进入M2型巨噬细胞衍生的外泌体内，电转15s，以上步骤均在-5℃～5℃完成，离心去除多余的5-氨基酮戊酸己酯盐酸盐，得到一种主动趋炎抗炎工程化外泌体。
5.根据权利要求4所述的一种主动趋炎抗炎工程化外泌体的制备方法，其特征在于：M2型巨噬细胞衍生的外泌体的制备方法为超速离心法。
6.根据权利要求4所述的一种主动趋炎抗炎工程化外泌体的制备方法，其特征在于：5-氨基酮戊酸己酯盐酸盐的质量为0.25μg～128μg，M2型巨噬细胞衍生的外泌体的质量为5μg～15μg；
电穿孔电压为50～150V，电阻为200Ω，电容为100μF；
离心条件为：5000g～15000g，5min～15min。
7.根据权利要求6所述的一种主动趋炎抗炎工程化外泌体的制备方法，其特征在于：5-氨基酮戊酸己酯盐酸盐的质量为32μg，M2型巨噬细胞衍生的外泌体的质量为10μg；
电穿孔电压为100V；
离心条件为：10000g，10min。
8.根据权利要求4所述的一种主动趋炎抗炎工程化外泌体的制备方法，其特征在于：M2型巨噬细胞衍生的外泌体的制备方法为超速离心法；
5-氨基酮戊酸己酯盐酸盐的质量为0.25μg～128μg，M2型巨噬细胞衍生的外泌体的质量为5μg～15μg；
电穿孔电压为50～150V，电阻为200Ω，电容为100μF；
离心条件为：5000g～15000g，5min～15min。
9.根据权利要求4所述的一种主动趋炎抗炎工程化外泌体的制备方法，其特征在于：M2型巨噬细胞衍生的外泌体的制备方法为超速离心法；
5-氨基酮戊酸己酯盐酸盐的质量为32μg，M2型巨噬细胞衍生的外泌体的质量为10μg；
电穿孔电压为100V；
离心条件为：10000g，10min。
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