CN110904120A - 一种胚胎发育调控基因drr1及其编码的蛋白质和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种胚胎发育调控基因DRR1及其编码的蛋白质和应用，属于基因工程技术领域，所述胚胎发育调控基因DRR1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的胚胎发育调控基因DRR1能够调控植物胚胎发育，上调胚胎发育调控基因DRR1能够提高植物胚胎正常发育。

Description

一种胚胎发育调控基因DRR1及其编码的蛋白质和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种胚胎发育调控基因DRR1及其编码的蛋白质和应用。
背景技术
种子作为高等植物有性生殖的产物，它不仅是植物繁育的最重要形式，更是人类赖以生存的粮食的最主要来源。目前全球经济发展形势下，人口不断增加，而耕地面积减少，水资源匮乏，人们消费需求增加和经济全球化发展，我国粮食供需与粮食安全面临严峻的挑战。提高作物产量及品质为解决这一问题的关键。目前作物育种的主要目标为增加种子大小、数量和营养物质积累。虽然过去传统的研究中，针对株型，穗粒数，抗逆性和抗病性等农艺性状的改良，结合农药化肥的有效使用，大幅度的提高了农作物产量。但面对持续增长的粮食需求，仍然存在一定的供需缺口。因此，进一步研发新的手段提高育种策略是必要的。通过生物学研究，提高粮食单产以增加作物产量为解决我国粮食安全等问题提供了一条可能的育种策略。
种子正常发育是高品质种子形成的前提。研究表明，胚胎发育是种子发育过程中至关重要的环节，分子生物学研究发现，植物胚胎发育的异常可以导致种子育性降低甚至种子的败育。另外，自然生长条件下，许多植物中存在自然的种胚败育，对粮油作物而言，种胚败育导致的种子育性的降低大大降低了种子的产量及品质。近年来许多生物学研究发现，植物胚胎发育过程中存在多条复杂的信号途径与调控网络，大量基因逐渐被发现参与胚胎发育的调控功能，但是，鉴于胚胎发育过程的复杂性，对其调控解析并不完全清楚。因此，对胚胎发育调控的新基因的探索有助于进一步明晰植物胚胎发育和种子形成过程，也将为农作物产量和品质提高提供新的手段。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胚胎发育调控基因DRR1及其编码的蛋白质和应用，本发明提供的胚胎发育调控基因DRR1能够调控植物胚胎发育，上调胚胎发育调控基因DRR1能够提高植物胚胎正常发育。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种胚胎发育调控基因DRR1，所述胚胎发育调控基因DRR1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述胚胎包括植物的胚胎。
优选的，所述植物包括禾本科植物、豆科植物、木棉科植物、胡麻科植物、十字花科植物、茄科植物、蔷薇科植物和锦葵科植物中的一种或几种。
优选的，所述蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的胚胎发育调控基因DRR1在植物胚胎发育调控中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的胚胎发育调控基因DRR1在提高植物胚胎正常发育中的应用。
优选的，将上述技术方案所述的胚胎发育调控基因DRR1在植物中进行上调，以获得DRR1高表达的转基因植物材料。
本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白质在植物胚胎发育调控中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白质在提高植物胚胎正常发育中的应用。
优选的，将上述技术方案所述的蛋白质在植物中过表达。
本发明提供了一种胚胎发育调控基因DRR1及其编码的蛋白质和应用，本发明提供的胚胎发育调控基因DRR1能够调控植物胚胎发育，上调胚胎发育调控基因DRR1能够提高植物胚胎正常发育。
附图说明
图1为拟南芥drr1突变体鉴定图，其中A为drr1-1和drr1-2突变体的T-DNA在DRR1基因上的插入位点，B为三引物法鉴定drr1-1与drr1-2突变体，C为drr1-1/+和drr1-2/+突变体后代分离统计；
图2为拟南芥drr1突变体植株种子形态及胚胎发育情况图，其中A为drr1-1/+和drr1-2/+突变体种子形态发育图，B为drr1-1/+和drr1-2/+突变体各时期胚胎发育图；
图3为DRR1基因表达模式及亚细胞定位图，其中A为转录水平分析DRR1基因表达模式图，B为DRR1-GFP融合蛋白的亚细胞定位图；
图4为DRR1蛋白序列在作物中的保守性分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种胚胎发育调控基因DRR1，所述胚胎发育调控基因DRR1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
aaatcgagcgattgagagcacttcgcaaaatcagagcgacaaaaaaaaataaaaaccaatcctttcgattccaaattttttgttactcactcgcacgagttttatttggtcgttagttatctctttcgttgaataacggttttaatttaaaccgttactttttatcaatggcgacttcgtcaccgtctctgagtaacaatggtctttcctccgtcgtcacgcctcccaaaactctccgtggtctcaataagcctaagtgtattcaatgcggcaatgtagctcgctccaggtattgcttctacgcattgtttcatcgaaggacttaggttttttacatctggggtttcgatttatggattgttcttgggtttttgatctgaaaggattcgaatttgtcttgtatagtactttttcgttttgatttagggttcataggtttgtgggtttgggtttttattcatgatttggtgattaatctgttggagattgtttaaagttttgagctttagtatcgaaagatcagttttttgagattattggtgaagtaattgtaattgtattgcttggatttgataaatgcaggtgcccttttcaatcttgtaagggttgttgttcaagagcagagaatccctgcccgattcacggtatgtttgccctgtcaaatctcaacttcataattagctaaagtgatcagttttagagtttagtgttgataactttgattggagagttctattctttcacttggtaagtttagagtttagtattcttgacttctatagggttcgtttggttgtctcgggacaaaaaaacctataaagaaccataagactgattcttggaatgtgcttgtgattagctgagagatatagagatgttatcatggactgttttgtgtttcttcttatgtgttttatttcgctgcagttcttaaagtagcttcaacgtctggtgagaagacgcaggcgccaagtactccatcttcagagcagaaagcaaccgagggcactcccgggtacatatatataaactaattttctgttttgtttgtgcttccatgggcaagtgaatcttagatgataaaccggtgtttgcttactaatactttgataggagattcttcagctttcttgttttattgcacgtagttgatagtgagatgatatattggtcttgtggaactaaaatatggcgctttatgttgacgttttcttcttttggaaattgtttcaggagtaccactagagtttcgtcaatccggcaactttctagcaactttgctcagtttaataacctgaatgcttcttcccgccagagaaaacctttgacgataaaggtatactaattaagacgtctttcattgactttagtactctatgaaaaatctccatttagttgttttcctcttatcagtttttgttctgtctatattctataggatgctcaagctttaaacgagtggcggtttacaaagctaaaagagtacagagacagaaacattgaagtagaaaatgaagcttttgatcggtacatgagtaatgtgaatttactcgaagaagcattttcatttacatctgttcctgatgaagagagtcatggaacagcagctcctgagcaaaacaaagaggaaaatattgtttcagagcttaaactgaggctgagatcgaactctgcaagaacagagagctttaagaagcggatcgcggagacagtcaaagccggtttggtgaagcttaagagactggatttaggcagttcttcagatgatcaagatgatatcaaaaggcgggtcaaaagaaagaaatgggaagagaaaggttcagctttgaatgaaataatcgataaactgaacaaagcaagaaccgaagaggatctcaaatcttgcttagagatgaaatcaaagctctgtggtcaagtttctcccactgctgcttccgagaagaacaagatctttccgggtgtagtccgaaaagttgagatgagtgaagaagcacttcaaaaaatcgctgagaatctccaatcttttgacaaagttggaatgttgtgaagtcgagaacatcctgtggatgaactgaaaagtttgagtggcaagaaaatttctagatccttcgtgaccacggtattgtacaatgatcaaacatccctcaaaactgatcctgaagactccaaagactcaagagattcttgtaaagtagtgttgagcatcatttagatattagaactcagccatggataaagctgttgattctatctcattggatttttttcactgtgtgttgttgctttgttagatttgaaattgctcattggattacctttgacttaataaatagttggtttggtttggtattggataaccgctcagtctaattagaccggtttgtttttttggaaaaaaa。
在本发明中，所述胚胎发育调控基因DRR1为DNA replication related factor1。
本发明利用正向遗传学方法从拟南芥突变体库中筛选到突变体drr1(drr1-1:SALK_152644和drr1-2:WiscDsLoxHs084_01H)，通过分子鉴定，克隆得到胚胎发育调控基因DRR1，位于拟南芥1号染色体上，基因座位号为LOC_AT1G32730(TAIR登录号)。在本发明中，所述胚胎发育调控基因DRR1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，全长984bp，编码327个氨基酸，具体序列如下：
atggcgacttcgtcaccgtctctgagtaacaatggtctttcctccgtcgtcacgcctcccaaaactctccgtggtctcaataagcctaagtgtattcaatgcggcaatgtagctcgctccaggtgcccttttcaatcttgtaagggttgttgttcaagagcagagaatccctgcccgattcacgttcttaaagtagcttcaacgtctggtgagaagacgcaggcgccaagtactccatcttcagagcagaaagcaaccgagggcactcccgggagtaccactagagtttcgtcaatccggcaactttctagcaactttgctcagtttaataacctgaatgcttcttcccgccagagaaaacctttgacgataaaggatgctcaagctttaaacgagtggcggtttacaaagctaaaagagtacagagacagaaacattgaagtagaaaatgaagcttttgatcggtacatgagtaatgtgaatttactcgaagaagcattttcatttacatctgttcctgatgaagagagtcatggaacagcagctcctgagcaaaacaaagaggaaaatattgtttcagagcttaaactgaggctgagatcgaactctgcaagaacagagagctttaagaagcggatcgcggagacagtcaaagccggtttggtgaagcttaagagactggatttaggcagttcttcagatgatcaagatgatatcaaaaggcgggtcaaaagaaagaaatgggaagagaaaggttcagctttgaatgaaataatcgataaactgaacaaagcaagaaccgaagaggatctcaaatcttgcttagagatgaaatcaaagctctgtggtcaagtttctcccactgctgcttccgagaagaacaagatctttccgggtgtagtccgaaaagttgagatgagtgaagaagcacttcaaaaaatcgctgagaatctccaatcttttgacaaagttggaatgttgtga。
在本发明中，所述胚胎发育调控基因DRR1在植物中上调，能够提高植物胚胎正常发育，避免植物胚胎异常发育，若植物中缺失胚胎发育调控基因DRR1会导致植物部分胚胎发育异常，进而出现种子败育情况。
在本发明中，所述胚胎优选包括植物的胚胎，所述植物优选包括禾本科植物、豆科植物、木棉科植物、胡麻科植物、十字花科植物、茄科植物、蔷薇科植物或锦葵科植物。
本发明还提供了上述技术方案所述的胚胎发育调控基因DRR1编码的蛋白质，所述蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，具体如下：
MATSSPSLSNNGLSSVVTPPKTLRGLNKPKCIQCGNVARSRCPFQSCKGCCSRAENPCPIHVLKVASTSGEKTQAPSTPSSEQKATEGTPGSTTRVSSIRQLSSNFAQFNNLNASSRQRKPLTIKDAQALNEWRFTKLKEYRDRNIEVENEAFDRYMSNVNLLEEAFSFTSVPDEESHGTAAPEQNKEENIVSELKLRLRSNSARTESFKKRIAETVKAGLVKLKRLDLGSSSDDQDDIKRRVKRKKWEEKGSALNEIIDKLNKARTEEDLKSCLEMKSKLCGQVSPTAASEKNKIFPGVVRKVEMSEEALQKIAENLQSFDKVGML。
本发明还提供了上述技术方案所述的胚胎发育调控基因DRR1在植物胚胎发育调控中的应用。在本发明中，所述应用优选将上述技术方案所述的胚胎发育调控基因DRR1在植物中进行上调。本发明对将胚胎发育调控基因DRR1在植物中进行上调的方法没有特殊限定，采用常规即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的胚胎发育调控基因DRR1在提高植物胚胎正常发育中的应用。在本发明中，所述应用优选将上述技术方案所述的胚胎发育调控基因DRR1在植物中进行上调。本发明对将胚胎发育调控基因DRR1在植物中进行上调的方法没有特殊限定，采用常规即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白质在植物胚胎发育调控中的应用。在本发明中，所述应用优选包括将上述技术方案所述的蛋白质在植物中过表达。本发明对将上述技术方案所述的蛋白质在植物中过表达的方法没有特殊限定，采用常规即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白质在提高植物胚胎正常发育中的应用。在本发明中，所述应用优选包括将上述技术方案所述的蛋白质在植物中过表达。本发明对将上述技术方案所述的蛋白质在植物中过表达的方法没有特殊限定，采用常规即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
拟南芥DRR1突变体的纯合性鉴定
1.拟南芥总DNA的提取：
⑴称取0.01g三周龄拟南芥野生型(Col-0)和drr1突变体(drr1-1和drr1-2)植株顶端嫩叶片(2片)加入EP管中，依次加入400μL的2×CTAB，磁珠。于震荡仪中振荡30s，重复两次。
⑵将破碎后的材料置于65℃烘箱中温浴30min，期间每隔10min上下颠倒混匀2～3次，冰上或4℃，5min冷却。
⑶加入400μL的氯仿:异戊醇(24:1)，上下颠倒混匀，静置2min。
⑷常温8000g离心10min，取上清300μL移至新的1.5mLEP管中，注意不要吸到沉淀。
⑸加入预冷的300μL的异丙醇，轻轻上下摇动混匀。-20℃放置30min沉淀DNA。
⑹12000g离心10min，弃上清。
⑺加1mL 75％乙醇洗涤沉淀，轻微振荡，12000g离心5min，弃上清，重复此步骤一次吸出多余的乙醇，超净台中吹干或烘箱烘干。
⑻无色透明胶状物附在管壁时，加入30μL灭菌水溶解沉淀的DNA。
其中所述2×CTAB提取液配方：2％(w/v)CTAB、20mM EDTA(pH 8.0)、100mM Tris-HCl(pH 8.0)、1.4MNaCl和2％(w/v)PVP-40。
2.拟南芥DRR1突变体纯合性鉴定
利用三引物法鉴定DRR1纯合突变体，设计引物(引物作用位置如图1)
SALK_152644-F：tttgccctgtcaaatctcaa(SEQ ID No.4)；
SALK_152644-R：cccatttctttcttttgaccc(SEQ ID No.5)；
中间引物LBa1：5'-tggttcacgtagtgggccatcg-3'(SEQ ID No.6)；
WiscDsLoxHs084_01H-F：cccatttctttcttttgaccc(SEQ ID No.7)；
WiscDsLoxHs084_01H-R：tttgccctgtcaaatctcaac(SEQ ID No.8)；
中间引物WIS-T-DNA间引物tgatccatgtagatttcccggacatgaag(SEQ ID No.9)。
按以下PCR反应体系：DNA 1μL，引物F、R及LBa1各0.3μL，2×Taq Mix 5μL和3.1μL无菌去离子水。PCR反应程序：预变性95℃5min，95℃30s、58℃30s、72℃1min，32Cycles，再延伸72℃7min。反应结束后，于1％的琼脂糖凝胶电泳中分离并拍照，结果如图1中的B。
图1中的A表示drr1-1和drr1-2突变体的T-DNA在DRR1基因上的插入位点，图1中的B显示的为突变体鉴定结果图，相较于野生型Col-0，提取多株F1代drr1突变体DNA，drr1-1扩增条带大小出现2条条带，一条条带与野生型植株中扩增条带大小一致，另一条条带明显小于野生型植株，表明drr1-1突变体一条染色体有T-DNA插入，另外一条染色体无T-DNA插入，说明F1代drr1突变体为杂合突变体(drr1-2突变体扩增条带大小出现3条条带，条带5与野生型条带大小一致，条带7为中间引物与F端扩增产物，6为非特异扩增条带或者可变剪接条带，表明drr1-2 F1代突变体亦为杂合突变体)。F1代drr1杂合植株后代分离统计发现，F2代植株中一半比例的植株出现杂合突变体，另一半为野生型植株。综合两种drr1突变体分析均未能得到纯合植株。
综上突变体鉴定结果与统计后代分离情况，表明胚胎发育调控基因DRR1的两个突变体无法得到纯合突变体植株，而drr1-1/+和drr1-2/+为杂合突变体植株。
实施例2
拟南芥DRR1突变体种子形态及胚胎发育观察
1.拟南芥DRR1突变体种子形态观察
取6周龄生长时期的拟南芥野生型(Col-0)和实施例1的DRR1杂合突变体(drr1-1/+和drr1-2/+)植株角果，用针轻轻划开果荚，体视显微镜(ZEISS，SteREO Lumar.V12)下观察种子发育情况并拍照记录，结果见图2。
图2中的A表明两种突变体中均出现约25％的种子白色透明的异常发育情况。
2.拟南芥DRR1突变体胚胎发育观察
取6周龄生长时期的拟南芥野生型(Col-0)和实施例1的drr1杂合突变体(drr1-1/+和drr1-2/+)植株角果，用针划开，刮出未成熟的种子，放入透明液中，静止30min后用微分干涉(DIC)显微镜(OLYMPUS BX51)观察，结果如图2。
图2中的A表明结合突变体鉴定结果及胚胎发育观察，说明drr1突变体出现胚胎纯合致死。
其中所用透明液配方为：20g水合氯醛(C8383，sigma)；1mL甘油(G6279，sigma)；1.5g阿拉伯树胶(G9752，sigma)和去离子水12mL室温搅拌混匀3-5h或过夜。
实施例3
DRR1基因表达模式分析
1.拟南芥总RNA的提取
利用植物RNA提取试剂盒(Magen，R4151，中国)提取植物总RNA，取三周龄拟南芥野生型(Col-0)和实施例1的drr1(drr1-1/+，drr1-2/+)突变体材料50mg，置于1.5mL EP管中液氮速冻后研磨成粉状，按照Magen试剂盒中的方案进行RNA提取，超微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度及纯度。检测RNA的完整性及纯度符合要求后，进行下一步实验或于-80℃超低温冰箱保存备用。
材料选取时期及状态：悬浮细胞：4天龄悬浮细胞；根：2周龄根；幼苗：2周龄整株幼苗；茎尖分生组织：用解剖显微镜下取3周龄可见茎端分生组织和叶原基；正在生长的叶片：4周龄植株中0.5到1cm长度的叶片；成熟叶片：4周龄植株中完全伸展但未出现衰老表型的叶片；衰老叶片：5周龄大部分呈现绿色但小部分开始变黄的叶片；果荚叶片：6周龄大小植株中花序最底端1.5cm长度左右的叶片；花：6周龄完全开放的花；果荚：8周龄已完全形成但仍然呈绿色的果荚；种子：10周龄待成熟但不坚硬状态的种子。
2.DRR1基因的实时荧光定量PCR表达分析：
根据Takara逆转录试剂盒进行cDNA链的合成，按照操作说明书进行反应。
(1)cDNA第一链的合成
第一步，去除基因组，以下所用试剂均包含在Takara逆转录试剂盒中，体系为RNA2μg，gDNA 1μL，5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL，RNase Free去离子水补足到10μL，42℃2min进行DNA去除试验并得到反应液1。再采用20μL体系进行反转录反应，体系为反应液110μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL，Primer Mix 1.0μL，5×PrimeScript Buffer2 4.0μL，RNase Free dH2O 4.0μL。按程序37℃15min；85℃5s进行反转录反应，生成的cDNA第一链-20℃保存。
(2)DRR1基因检测用引物如下
DRR1-F:atccctgcccgattcacg(SEQ ID No.10)
DRR1-R:aaagttgccggattgacg(SEQ ID No.11)
qPCR反应体系：配制RT-PCR反应液(预混液1：5μL
Figure BDA0002319937300000091
Premix Ex TaqTM(2×)、引物各0.3μL)，预混液2：cDNA模板1μL和超纯水共3.4μL，分别加入反应样板中。将加好样品的加样板2500g水平离心5min，放入LightCycler480仪器中，设置qPCR检测程序进行检测，待程序结束后分析数据并计算基因相对表达量，结果如图3。
图3中的A说明，DRR1基因在不同组织中的相对表达量，在茎尖分生组织，表达量最高，果荚叶，成熟叶片及正在生长的叶片组织中表达量次之。
实施例4
DRR1蛋白在细胞中的定位分析
1.DRR1-GFP融合蛋白表达载体的构建
DRR1-GFP载体构建所用引物：
DRR1-GFP-F:cgccactagtggatccatggcgacttcgtcaccg(SEQ ID No.12)
DRR1-GFP-R:gagcggtaccctcgagcaacattccaactttgtcaaaaga(SEQ ID No.13)
PCR反应体系为：cDNA模板1μL、引物DRR1-GFP-F 0.5μL、引物DRR1-GFP-R 0.5μL、2×PCR Mix 12.5μL、H2O 10.5μL。
扩增条件为：94℃变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，32个循环；72℃延伸5min，PCR产物在1％琼脂糖胶中分离并拍照。
以野生型拟南芥(Col-0)cDNA为模板，利用特异性引物扩增相应的基因片段，利用In-Fusion酶通过酶切位点BamH I和EcoR I酶切连接将其装入瞬时表达载体pUC-GFP中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆提取质粒DNA，进行酶切鉴定，鉴定的阳性克隆送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序，测序正确即得到35S启动子驱动下瞬时转化融合蛋白表达载体DRR1-GFP。
2拟南芥原生质体分离及瞬时转化表达DRR1-GFP融合蛋白
(1)原生质体的分离
①取15mLTVL溶液加入无菌平皿中，用刀片将拟南芥小苗从培养基上剪下立即放入TVL溶液中，快速切小苗。
②向①加入20mL酶液，并轻轻转移至烧杯，混匀。
③烧杯口用封口膜封闭，水平摇床中70rpm的速度黑暗酶解6h。
④待酶解液变绿时，轻晃烧杯释放原生质体细胞，55μm的尼龙网过滤原生质体除去残渣，收集至50mL离心管中。
⑤再加入适量的W5溶液清洗，收集至50mL离心管中。
⑥100g，水平离心7min，弃上清，收集沉淀中的原生质体。
⑦加入一定体积的W5溶液，100g水平离心5min，弃去上清。
⑧重复上述步骤2次直至原生质体中无残渣。
⑨将原生质体放在冰上静置30min，100g，水平离心7min，弃上清，用MMg溶液重悬原生质体，使原生质体细胞浓度1-2×105/mL。
(2)质粒转化原生质体
①将提前准备的顺时转化载体DRR1-GFP，转化原生质体。加入构建好的10μLDNA至2mL离心管中。100μl原生质体，轻混。110μLPEG溶液，轻轻完全混匀。
②黑暗23℃孵育15min。
③1mLW5稀释溶液，轻微颠倒混匀。离心3min，110g，除去上清。
④300μLW5重悬原生质体。黑暗23℃孵育12～16h。
⑤重悬原生质体，离心5min，80g。
⑥荧光显微镜观察。
原生质体制备和转化所需试剂：
(1)原生质体母液(均需要0.22μm滤器过滤除菌)：0.8M甘露醇，0.2MMES(用KOH调节pH 5.7)，1M CaCl2，1M MgCl2和2M KCl。
(2)原生质体工作液：
①TVL：50mM CaCl2和0.3M山梨醇，0.22μm滤器过滤除菌，现配现用。
②酶液：10mM MES(pH 5.7)、20mM CaCl2、40mM KCl、0.5M蔗糖、1％(w/v)Cellulase R-10和1％(w/v)Macerozyme R-10，过滤除菌，现配现用。
③W5溶液：0.08％(w/v)KCl、0.9％(w/v)NaCl、1.84％(w/v)CaCl2、2mM MES(pH5.7)和0.1％(w/v)葡萄糖。室温存放。
④MMG：4mM MES(pH 5.7)、15mM MgCl2和0.4M Mannitol。
⑤PEG转化液：提前配制，40％(w/v)PEG 4000、0.1M CaCl2、0.2M Mannitol。先加入少许超纯水充分溶解，溶解后再定容。
其中，载体构建所用试剂：基因扩增用酶：2×PrimestarMix(Takara，日本)，载体构建连接酶In-Fusion(Takara，日本)。
3融合蛋白表达载体DRR1-GFP定位观察分析
激光共聚焦显微镜观察拍照荧光蛋白标记的目的蛋白在原生质体中表达，利用激光共聚焦显微镜观察荧光信号，GFP激发光433nm，500-530nm波长收集GFP信号。叶绿体自发荧光激发光488nm，发射光738nm到793nm。mcherry激发光561nm，发射光610nm，结果见图3。
图3中的B表明，DRR1-GFP融合蛋白与叶绿体自发荧光和mCher标记的细胞核marker基因重合，表明DRR1特异性定位于细胞核与叶绿体。
实施例5
DRR1的生物信息学分析
NCBI blast中寻找拟南芥DRR1蛋白在其他物种中同源序列较高的蛋白(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，利用软件ClustalX进行DRR1蛋白在其他物种中的同源性分析，包括油菜，木本棉，可可，芝麻，花生，大豆，大麦和水稻等。
结果如图4所示，DRR1蛋白序列在其他陆生植物中有较高的保守性，可以预见，DRR1基因在其它陆生植物中极有可能存在相同的作用，通过调控DRR1基因，可以获得相应的育性增加植物，尤其对农作物产量的提升具有重要作用。
由以上实施例可以得出，本发明从拟南芥突变体库中筛选到突变体drr1，通过分子鉴定，克隆到一个胚胎发育调控基因DRR1(AT1G32730)。分析发现DRR1基因纯合突变致死，表明DRR1参与拟南芥胚胎发育功能调控。
DRR1蛋白在其他作物中具有序列保守性，功能也存在保守性。保障胚胎发育调控的新基因DRR1的表达，有助于获得育性增加的种子。通过基因工程手段实现DRR1基因上调或者DRR1蛋白过表达，保证种子胚胎正常发育，这有望为农作物产量提高提供新的手段。
所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州中医药大学（广州中医药研究院）
<120> 一种胚胎发育调控基因DRR1及其编码的蛋白质和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaatcgagcg attgagagca cttcgcaaaa tcagagcgac aaaaaaaaat aaaaaccaat 60
cctttcgatt ccaaattttt tgttactcac tcgcacgagt tttatttggt cgttagttat 120
ctctttcgtt gaataacggt tttaatttaa accgttactt tttatcaatg gcgacttcgt 180
caccgtctct gagtaacaat ggtctttcct ccgtcgtcac gcctcccaaa actctccgtg 240
gtctcaataa gcctaagtgt attcaatgcg gcaatgtagc tcgctccagg tattgcttct 300
acgcattgtt tcatcgaagg acttaggttt tttacatctg gggtttcgat ttatggattg 360
ttcttgggtt tttgatctga aaggattcga atttgtcttg tatagtactt tttcgttttg 420
atttagggtt cataggtttg tgggtttggg tttttattca tgatttggtg attaatctgt 480
tggagattgt ttaaagtttt gagctttagt atcgaaagat cagttttttg agattattgg 540
tgaagtaatt gtaattgtat tgcttggatt tgataaatgc aggtgccctt ttcaatcttg 600
taagggttgt tgttcaagag cagagaatcc ctgcccgatt cacggtatgt ttgccctgtc 660
aaatctcaac ttcataatta gctaaagtga tcagttttag agtttagtgt tgataacttt 720
gattggagag ttctattctt tcacttggta agtttagagt ttagtattct tgacttctat 780
agggttcgtt tggttgtctc gggacaaaaa aacctataaa gaaccataag actgattctt 840
ggaatgtgct tgtgattagc tgagagatat agagatgtta tcatggactg ttttgtgttt 900
cttcttatgt gttttatttc gctgcagttc ttaaagtagc ttcaacgtct ggtgagaaga 960
cgcaggcgcc aagtactcca tcttcagagc agaaagcaac cgagggcact cccgggtaca 1020
tatatataaa ctaattttct gttttgtttg tgcttccatg ggcaagtgaa tcttagatga 1080
taaaccggtg tttgcttact aatactttga taggagattc ttcagctttc ttgttttatt 1140
gcacgtagtt gatagtgaga tgatatattg gtcttgtgga actaaaatat ggcgctttat 1200
gttgacgttt tcttcttttg gaaattgttt caggagtacc actagagttt cgtcaatccg 1260
gcaactttct agcaactttg ctcagtttaa taacctgaat gcttcttccc gccagagaaa 1320
acctttgacg ataaaggtat actaattaag acgtctttca ttgactttag tactctatga 1380
aaaatctcca tttagttgtt ttcctcttat cagtttttgt tctgtctata ttctatagga 1440
tgctcaagct ttaaacgagt ggcggtttac aaagctaaaa gagtacagag acagaaacat 1500
tgaagtagaa aatgaagctt ttgatcggta catgagtaat gtgaatttac tcgaagaagc 1560
attttcattt acatctgttc ctgatgaaga gagtcatgga acagcagctc ctgagcaaaa 1620
caaagaggaa aatattgttt cagagcttaa actgaggctg agatcgaact ctgcaagaac 1680
agagagcttt aagaagcgga tcgcggagac agtcaaagcc ggtttggtga agcttaagag 1740
actggattta ggcagttctt cagatgatca agatgatatc aaaaggcggg tcaaaagaaa 1800
gaaatgggaa gagaaaggtt cagctttgaa tgaaataatc gataaactga acaaagcaag 1860
aaccgaagag gatctcaaat cttgcttaga gatgaaatca aagctctgtg gtcaagtttc 1920
tcccactgct gcttccgaga agaacaagat ctttccgggt gtagtccgaa aagttgagat 1980
gagtgaagaa gcacttcaaa aaatcgctga gaatctccaa tcttttgaca aagttggaat 2040
gttgtgaagt cgagaacatc ctgtggatga actgaaaagt ttgagtggca agaaaatttc 2100
tagatccttc gtgaccacgg tattgtacaa tgatcaaaca tccctcaaaa ctgatcctga 2160
agactccaaa gactcaagag attcttgtaa agtagtgttg agcatcattt agatattaga 2220
actcagccat ggataaagct gttgattcta tctcattgga tttttttcac tgtgtgttgt 2280
tgctttgtta gatttgaaat tgctcattgg attacctttg acttaataaa tagttggttt 2340
ggtttggtat tggataaccg ctcagtctaa ttagaccggt ttgttttttt ggaaaaaaa 2399
<210> 2
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Thr Ser Ser Pro Ser Leu Ser Asn Asn Gly Leu Ser Ser Val
1 5 10 15
Val Thr Pro Pro Lys Thr Leu Arg Gly Leu Asn Lys Pro Lys Cys Ile
20 25 30
Gln Cys Gly Asn Val Ala Arg Ser Arg Cys Pro Phe Gln Ser Cys Lys
35 40 45
Gly Cys Cys Ser Arg Ala Glu Asn Pro Cys Pro Ile His Val Leu Lys
50 55 60
Val Ala Ser Thr Ser Gly Glu Lys Thr Gln Ala Pro Ser Thr Pro Ser
65 70 75 80
Ser Glu Gln Lys Ala Thr Glu Gly Thr Pro Gly Ser Thr Thr Arg Val
85 90 95
Ser Ser Ile Arg Gln Leu Ser Ser Asn Phe Ala Gln Phe Asn Asn Leu
100 105 110
Asn Ala Ser Ser Arg Gln Arg Lys Pro Leu Thr Ile Lys Asp Ala Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Glu Trp Arg Phe Thr Lys Leu Lys Glu Tyr Arg Asp Arg
130 135 140
Asn Ile Glu Val Glu Asn Glu Ala Phe Asp Arg Tyr Met Ser Asn Val
145 150 155 160
Asn Leu Leu Glu Glu Ala Phe Ser Phe Thr Ser Val Pro Asp Glu Glu
165 170 175
Ser His Gly Thr Ala Ala Pro Glu Gln Asn Lys Glu Glu Asn Ile Val
180 185 190
Ser Glu Leu Lys Leu Arg Leu Arg Ser Asn Ser Ala Arg Thr Glu Ser
195 200 205
Phe Lys Lys Arg Ile Ala Glu Thr Val Lys Ala Gly Leu Val Lys Leu
210 215 220
Lys Arg Leu Asp Leu Gly Ser Ser Ser Asp Asp Gln Asp Asp Ile Lys
225 230 235 240
Arg Arg Val Lys Arg Lys Lys Trp Glu Glu Lys Gly Ser Ala Leu Asn
245 250 255
Glu Ile Ile Asp Lys Leu Asn Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Leu Lys
260 265 270
Ser Cys Leu Glu Met Lys Ser Lys Leu Cys Gly Gln Val Ser Pro Thr
275 280 285
Ala Ala Ser Glu Lys Asn Lys Ile Phe Pro Gly Val Val Arg Lys Val
290 295 300
Glu Met Ser Glu Glu Ala Leu Gln Lys Ile Ala Glu Asn Leu Gln Ser
305 310 315 320
Phe Asp Lys Val Gly Met Leu
325
<210> 3
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcgactt cgtcaccgtc tctgagtaac aatggtcttt cctccgtcgt cacgcctccc 60
aaaactctcc gtggtctcaa taagcctaag tgtattcaat gcggcaatgt agctcgctcc 120
aggtgccctt ttcaatcttg taagggttgt tgttcaagag cagagaatcc ctgcccgatt 180
cacgttctta aagtagcttc aacgtctggt gagaagacgc aggcgccaag tactccatct 240
tcagagcaga aagcaaccga gggcactccc gggagtacca ctagagtttc gtcaatccgg 300
caactttcta gcaactttgc tcagtttaat aacctgaatg cttcttcccg ccagagaaaa 360
cctttgacga taaaggatgc tcaagcttta aacgagtggc ggtttacaaa gctaaaagag 420
tacagagaca gaaacattga agtagaaaat gaagcttttg atcggtacat gagtaatgtg 480
aatttactcg aagaagcatt ttcatttaca tctgttcctg atgaagagag tcatggaaca 540
gcagctcctg agcaaaacaa agaggaaaat attgtttcag agcttaaact gaggctgaga 600
tcgaactctg caagaacaga gagctttaag aagcggatcg cggagacagt caaagccggt 660
ttggtgaagc ttaagagact ggatttaggc agttcttcag atgatcaaga tgatatcaaa 720
aggcgggtca aaagaaagaa atgggaagag aaaggttcag ctttgaatga aataatcgat 780
aaactgaaca aagcaagaac cgaagaggat ctcaaatctt gcttagagat gaaatcaaag 840
ctctgtggtc aagtttctcc cactgctgct tccgagaaga acaagatctt tccgggtgta 900
gtccgaaaag ttgagatgag tgaagaagca cttcaaaaaa tcgctgagaa tctccaatct 960
tttgacaaag ttggaatgtt gtga 984
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttgccctgt caaatctcaa 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccatttctt tcttttgacc c 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggttcacgt agtgggccat cg 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccatttctt tcttttgacc c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttgccctgt caaatctcaa c 21
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgatccatgt agatttcccg gacatgaag 29
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atccctgccc gattcacg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaagttgccg gattgacg 18
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgccactagt ggatccatgg cgacttcgtc accg 34
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagcggtacc ctcgagcaac attccaactt tgtcaaaaga 40

Claims (10)

1.一种胚胎发育调控基因DRR1，其特征在于，所述胚胎发育调控基因DRR1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的胚胎发育调控基因DRR1，其特征在于，所述胚胎包括植物的胚胎。
3.根据权利要求2所述的胚胎发育调控基因DRR1，其特征在于，所述植物包括禾本科植物、豆科植物、木棉科植物、胡麻科植物、十字花科植物、茄科植物、蔷薇科植物和锦葵科植物中的一种或几种。
4.权利要求1所述的胚胎发育调控基因DRR1编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
5.权利要求1所述的胚胎发育调控基因DRR1在植物胚胎发育调控中的应用。
6.权利要求1所述的胚胎发育调控基因DRR1在提高植物胚胎正常发育中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述的胚胎发育调控基因DRR1在植物中进行上调，以获得DRR1高表达的转基因植物材料。
8.权利要求4所述的蛋白质在植物胚胎发育调控中的应用。
9.权利要求4所述的蛋白质在提高植物胚胎正常发育中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，将权利要求4所述的蛋白质在植物中过表达。
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