CN110887966A - 一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110887966A
CN110887966A CN201911305157.4A CN201911305157A CN110887966A CN 110887966 A CN110887966 A CN 110887966A CN 201911305157 A CN201911305157 A CN 201911305157A CN 110887966 A CN110887966 A CN 110887966A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
kit
aspergillus
galactomannan
biotin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911305157.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110887966B (zh
Inventor
刘春龙
张舟
翟栓柱
付成华
盛长忠
周泽奇
粟艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Original Assignee
Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd filed Critical Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Priority to CN201911305157.4A priority Critical patent/CN110887966B/zh
Publication of CN110887966A publication Critical patent/CN110887966A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110887966B publication Critical patent/CN110887966B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G01N21/763—Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56961—Plant cells or fungi

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括捕获抗体和信号抗体，所述捕获抗体和所述信号抗体为抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明的抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体为兔源单克隆抗体，特异性好、稳定性好，与曲霉菌半乳甘露聚糖的亲和力强，可以快速与曲霉菌半乳甘露聚糖进行结合，缩短了检测时间；在进行半乳甘露聚糖的检测过程中，通过调整试剂的添加顺序，克服了待测样本中的生物素对结果造成的干扰。

Description

一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域，涉及一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用。
背景技术
侵袭性真菌病(invasive fungal disease，IFD)指真菌侵入人体后，在组织、器官或血液中生长繁殖，导致炎症反应和组织损伤的感染性疾病。近年来由于抗生素的滥用，侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)的发病率逐年升高，临床表现为咳嗽、咳痰、咯血、胸痛和呼吸困难等肺部感染症状，慢性阻塞性肺病、AIDS、粒细胞缺乏、器官移植和血液病/恶性肿瘤患者是侵袭性曲霉病的高危人群。其中，IA在血液病和造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplants，HSCT)患者中的死亡率高达70％～90％，造成高死亡率的主要原因在于不能在病程早期对IA进行检测诊断，以至患者得不到及时有效的治疗，因此，对IA进行早期诊断具有重要的意义。
半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM)是曲霉菌细胞壁的主要成分，被认为是感染曲霉后最早释放入血的标志性抗原，释放量与菌体量成正比，可以反映曲霉的感染程度。目前，GM试验是侵袭性曲霉感染的早期诊断方法，已被国内外专家共识并被指南推荐。侵袭性肺曲霉病的临床诊断方法主要包括影像学检查、组织病理学检查、培养及镜检、血清G试验/GM试验和分子生物学检测方法。
截至2019年1月，针对曲霉的检测产品已有多种，具有代表性的产品如表1所示。目前，曲霉检测的主要方法为免疫分析方法，但是存在检测时间长、准确性低的问题；分子诊断技术由于受到检测环境和样本前处理步骤的影响，对结果的准确性具有一定的干扰，应用范围有限；胶体金法具有检测时间短的优势，但是存在检测限高、灵敏度差、诊断结果依赖肉眼判断的缺陷。
表1曲霉检测现有的部分产品信息
Figure BDA0002322873510000021
化学发光免疫技术由于具有高灵敏度、检测时间短和自动化等特点，逐渐应用于曲霉菌的检测。然而现有的化学发光诊断试剂盒，为了缩短反应时间，大多采用一步法操作，由于生物素标记抗体与样品和亲和素磁珠同时进行反应，样品中的生物素必然会干扰生物素标记抗体与亲和素磁珠的结合，影响结果的准确性。
因此，有必要提供一种新的化学发光检测试剂盒，应用于曲霉检测领域。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用，所述试剂盒具有检测速度快、灵敏度高、准确性好、自动化程度高的优势，有利于为侵袭性曲霉病的快速临床诊断提供有力依据。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括捕获抗体和信号抗体，所述捕获抗体和所述信号抗体为抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEEVSGFSLSSYITNYYYVRQAPGKSGGRLTGLEYIGMISGANTGYANWTSPTTEDTANGRFDMNWVTYVTPGTPLTLTCFCARTISKTSTTVDLKMYGMDLWGPGTLVTVSS；
SEQ ID NO:2：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAIVMTQSEACAGYKYTGTWYQFTLTISDGSVPVCDQDAATYYTPSSTIDSQKPGSTLASGVPSRFKGSGSGTQVGDTVPPKLLIYQSVYSNNRLANCQAVIAFGGGTEVVVK。
本发明中，所述抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体为兔源单克隆抗体，特异性好、稳定性好，解离常数相对于鼠源单克隆抗体小，与曲霉菌半乳甘露聚糖的亲和力强，可以快速与曲霉菌半乳甘露聚糖进行结合，有利于缩短检测时间。
优选地，所述捕获抗体上修饰有生物素或荧光基团。
优选地，所述荧光基团包括FITC、ALEX-350、Alexa Fluor 488、Cy3、Cy5、FAM、VIC、TET、JOE、HEX或ROX中的任意一种或至少两种的组合，优选为FITC。
优选地，所述捕获抗体的浓度为0.5～3μg/mL，例如可以是0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、3.5μg/mL或3μg/mL。
优选地，所述信号抗体上修饰有化学发光基团。
优选地，所述化学发光基团包括吖啶酯、鲁米诺、(金钢烷)-1,2-二氧乙烷或碱性磷酸酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为吖啶酯。
优选地，所述信号抗体的浓度为0.5～3μg/mL，例如可以是0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、3.5μg/mL或3μg/mL。
优选地，所述试剂盒还包括固相载体。
优选地，所述固相载体包括磁微粒、酶标板、微球、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合，优选为磁微粒。
优选地，所述固相载体表面修饰有链霉亲和素和/或荧光基团的特异性抗体。
本发明中，采用捕获抗体和固相载体的连接方式包括生物素-链霉亲和素、荧光基团-荧光基团抗体，当采用荧光基团-荧光基团抗体连接捕获抗体和固相载体时，彻底消除了待测样本中的生物素对结果造成的干扰。
优选地，所述磁微粒的浓度为100～1000μg/mL，例如可以是100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL或1000μg/mL。
优选地，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品为曲霉菌半乳甘露聚糖。
优选地，所述校准品的浓度分别为0.2～25.0ng/mL，例如可以是0.2ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL，优选为0.2～1.0ng/mL或5.0～25.0ng/mL。
第二方面，本发明提供了一种半乳甘露聚糖的检测方法，所述检测方法采用如第一方面所述的试剂盒。
优选地，所述检测方法包括抗原结合的步骤；
优选地，所述抗原结合的步骤包括(a)～(c)中的任意一种；
(a)将生物素标记捕获抗体和链霉亲和素标记固相载体共孵育，加入待测样本和信号抗体，混合孵育后去上清；
(b)将待测样本采用链霉亲和素标记固相载体进行预处理，去除待测样本中的生物素；加入生物素标记捕获抗体、链霉亲和素标记固相载体和信号抗体，混合孵育后去上清；
(c)向待测样本中加入FITC标记捕获抗体、信号抗体、FITC抗体标记固相载体，混合孵育后去上清。
本发明中，在进行半乳甘露聚糖的检测过程中，为避免待测样本中的生物素对结果造成的影响，采用(a)～(c)中的任意一种方案实现待测样本中半乳甘露聚糖与抗体的结合，其中，方案(a)采用两步法，生物素标记捕获抗体先与链霉亲和素标记固相载体结合后，再加入样本和信号抗体，生物素标记捕获抗体与链霉亲和素标记固相载体结合后很难解离，从而避免了样本中生物素的干扰；方案(b)采用一步法，首先将待测样本采用链霉亲和素标记固相载体进行预处理，吸附去除待测样本中的生物素后，再加入生物素标记捕获抗体、链霉亲和素标记固相载体和信号抗体，完成抗原抗体的结合反应；方案(c)不引入生物素，而是采用荧光基团-荧光基团抗体连接捕获抗体和固相载体，彻底消除了待测样本中的生物素对结果造成的干扰。
本发明中，采用(a)～(c)中的任意一种方案待测样本中半乳甘露聚糖与抗体的结合，显著降低了待测样本中的生物素对结果造成的干扰，对检测浓度的影响小于10％。
优选地，(a)中所述共孵育的时间为1～10min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min，所述混合孵育的时间为1～10min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。
优选地，(b)中所述预处理的时间为1～10min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min，所述混合孵育的时间为1～20min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min。
优选地，(c)中所述混合孵育的时间为1～20min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min。
优选地，所述检测方法在抗原结合后还包括化学发光检测的步骤。
优选地，所述化学发光检测包括加入底物，测定化学发光强度；根据标准曲线，计算得到所述待测样本中曲霉菌半乳甘露聚糖的浓度。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的试剂盒在制备曲霉菌感染疾病检测试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的试剂盒采用兔源抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体作为捕获抗体和信号抗体，特异性好、稳定性好，与曲霉菌半乳甘露聚糖的亲和力强，可以快速与曲霉菌半乳甘露聚糖进行结合，有利于将检测时间缩短至15min以内；
(2)本发明在进行半乳甘露聚糖的检测过程中，通过调整试剂的添加顺序，克服了待测样本中的生物素对结果造成的干扰；
(3)本发明的试剂盒特异性强，临床符合率达94％，灵敏度高，检测限达0.05ng/mL，优于市场上现有的试剂盒，在侵袭性曲霉病的早期快速临床诊断方面具有广阔的应用前景。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体的制备
(1)曲霉菌半乳甘露聚糖(GM)的制备
将烟曲霉接种于沙氏液体培养基(每升培养基含1％蛋白胨和4％D-葡萄糖)中，30℃培养约46h，摇床转速为200rpm/min，当培养液的pH值降至4.2～4.5时停止培养；采用121℃湿热灭菌40min，杀死菌体和可能存在的芽孢，将得到的菌液在室温下经定性滤纸过滤后，采用0.22μm滤膜过滤去除菌体；
将滤液转移至新的离心管中，加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜；4℃、16,000g离心15min，将沉淀溶于去离子水中，加入4倍体积无水乙醇，静置1h；
离心，将沉淀用无水乙醇洗涤三次，4℃、16,000g离心15min，弃上清；将沉淀溶于去离子水中，再加入活性炭粉末，室温搅拌2h；滤液采用0.22μm滤膜过滤，转移至10KD离心超滤管，5000g离心10min，即得到半乳甘露聚糖纯品。
(2)动物免疫
挑选适龄、重量在1.5公斤左右的新西兰大耳白兔，在标准动物房饲养3天，如无异常情况则开始进行免疫：
将30μg GM抗原加入到0.5mL高压灭菌的生理盐水中，用微型漩涡震荡器充分混匀，加入0.5mL弗氏完全佐剂，用注射器相互推拉进行充分混合乳化，对新西兰大耳兔进行背部皮下多点注射免疫；
两周后进行加强免疫，此后每隔一周加强免疫一次，共免疫六次，并且从第三次免疫开始，免疫一周后取大耳白兔耳缘静脉血200～500μL，测定效价和亲和性；
在最后一次免疫后，取脾脏进行细胞融合，用于制备杂交瘤细胞。
(3)杂交瘤细胞的制备和筛选
将免疫完成的新西兰大耳兔处死，无菌条件下取出脾脏，用细胞培养液清洗1次后研碎，过不锈钢筛网，将得到的细胞离心并用细胞培养液清洗2次；
取对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞混合，用不含胎牛血清的细胞培养液清洗一次后离心、弃上清，加入聚乙二醇溶液，37℃恒温处理90s左右；
用不含胎牛血清的细胞培养液终止反应后离心，用含20％胎牛血清的HAT选择培养液重悬细胞，将细胞加入到96孔板中，37℃、5.0％CO2中培养；
将96孔板内生长状态良好的细胞用细胞培养液稀释至1-3个细胞/mL，加入到96孔板内，放入细胞培养箱中在37℃、5.0％CO2条件下培养，每个细胞株进行编号，选取培养液上清呈阳性的细胞株进行扩大培养，最终得到杂交瘤细胞株；
对获得的杂交瘤细胞采用ELISA法进行筛选，融合后第5天观察细胞的生长情况，第10～14天采用间接ELISA法检测细胞培养上清的效价，将效价最强的阳性杂交瘤细胞扩大培养至细胞阳性率达100％，定株得到杂交瘤细胞株DNK-GM2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.18891，保藏日期为2019年11月25日，对杂交瘤细胞株进行重组表达得到单克隆抗体54C4，所述单克隆抗体的重链可变区如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区如SEQ IDNO:2所示。
兔源单克隆抗体54C4、与市售的鼠源单克隆抗体的解离常数KD见表2，相比于鼠源单克隆抗体，本发明的兔源单克隆抗体与曲霉菌半乳甘露聚糖的亲和力强，可以快速与曲霉菌半乳甘露聚糖进行结合，可以将检测时间缩短至15min以内。
表2不同曲霉半乳甘露聚糖单克隆抗体的解离常数
Figure BDA0002322873510000091
实施例2试剂盒的制备
(1)生物素标记捕获抗体的制备
长链活化生物素按浓度为1mg/mL溶解于二甲基亚砜中；将待偶联且已经纯化的抗体54C4按浓度为1mg/mL溶解于0.1mol/L pH＝9.0的碳酸氢纳溶液中；将活化生物素液与待偶联的抗体溶液按1:8混合，在室温下温育4h；在4℃下在0.05mol/L pH＝7.2的PBS缓冲液中透析24h，其中换液4次，以除去未结合的游离生物素，得到生物素标记捕获抗体。
(2)链霉亲和素标记的磁微粒的制备
将磁微粒用2-吗啉乙磺酸缓冲液(MES)重悬，使磁微粒的浓度适宜，将链霉亲和素加入上述磁微粒溶液中，在37℃混悬60min，其中磁微粒与链霉亲和素的质量比为25:1；加入新鲜配制的碳二亚胺水溶液，在37℃下混悬6h，其中2-吗啉乙磺酸缓冲液(MES)与碳二亚胺水溶液的体积比为15:1，孵育结束后，磁分离；用2％牛血清白蛋白的封闭液封闭，混合，37℃孵育1h，磁分离，去上清，用含1％BSA的Tris-HCl缓冲液(0.01mol/L，pH＝7～7.5)重悬偶联有链霉亲和素的磁微粒，置4℃备用。
(3)吖啶酯标记信号抗体的制备
向吖啶酯溶液中依次加入等体积的12.8mg/mL高碘酸钠溶液和1％乙二醇溶液，2-8℃避光反应1h；按吖啶酯溶液:抗体的摩尔比为(0.5-2):1向混合液中加入单克隆抗体54C4，置于0.05M碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜；取出混合液，向混合液中按照每毫克抗体加入20μL硼氢化钠溶液的比例加入5mg/mL硼氢化钠溶液，2-8℃避光反应2h；加入等体积的饱和硫酸铵溶液，2-8℃避光反应1h；在2-8℃下，8000rpm离心30min，弃上清，用适量0.01M磷酸盐缓冲液溶解沉淀，2-8℃透析过夜；采用0.05M 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝6.0)稀释吖啶酯标记的单克隆抗体54C4。
实施例3试剂盒的制备
(1)FITC标记捕获抗体的制备
活化FITC按浓度为1mg/mL溶解于二甲基亚砜中；将待偶联且已经纯化的抗体54C4按浓度为1mg/mL溶解于0.1mol/L pH＝9.0的碳酸氢纳溶液中；将活化FITC液与待偶联的抗体溶液按1:15混合，在室温下温育4h；在4℃下在0.05mol/L pH＝7.2的PBS缓冲液中透析24h，其中换液4次，以除去未结合的游离FITC，得到FITC标记捕获抗体。
(2)FITC抗体标记的磁微粒的制备
向1.5mL EP管中加入100μL空载微球(1mg)和400μL MES缓冲液，混匀，离心20min，弃上清；向微球沉淀中加入500μL MES缓冲液，移液器吹吸混匀，再用超声破碎机超声分散1min；微球溶液一边振荡一边逐滴加入30μL 10mg/mL EDC溶液(现配)，再一边振荡一边逐滴加入10μL 10mg/mL Sulfo-NHS溶液(现配)，锡箔纸包裹避光，室温旋转仪40r/min活化15min；继续离心20min，弃上清，向微球沉淀中加入500μL HEPES缓冲液，移液器吹吸混匀，再用超声破碎机超声分散1min；将微球溶液一边振荡一边逐滴加入0.1mg抗体，锡箔纸包裹避光，室温旋转仪反应120min；向微球中加入55μL封闭液，锡箔纸包裹避光，室温旋转仪反应120min，接着离心20min，弃上清，向微球沉淀中加入1mL HEPES缓冲液，移液器吹吸混匀，再重复上述洗涤操作，共洗涤两遍，最后沉淀重悬在200μL偶联储存液中，用超声破碎机超声分散1min，置于4℃冰箱避光保存。
实施例4曲霉菌半乳甘露聚糖的两步法检测
本实施例采用两步法进行曲霉菌半乳甘露聚糖的检测，步骤如下：
(1)将150μL浓度为0.3mg/mL的生物素标记捕获抗体和150μL浓度为0.3mg/mL的链霉亲和素标记磁微粒室温下共孵育10min；
(2)加入10μL浓度为10IU/mL的半乳甘露聚糖，37℃下孵育10min，磁分离1min，去上清，采用洗涤液清洗5次；
(2)加入150μL浓度为0.3μg/mL的吖啶酯标记信号抗体，充分混合，37℃下孵育10min，磁分离1min，去上清，采用洗涤液清洗5次；
(3)加入200μL激发液，充分混合后采用全自动化学发光仪Lumiray系列，测定溶液的化学发光强度。
实施例5曲霉菌半乳甘露聚糖的一步法检测
本实施例采用一步法进行曲霉菌半乳甘露聚糖的检测，步骤如下：
(1)10μL浓度为10IU/mL的半乳甘露聚糖与150μL浓度为0.3mg/mL的链霉亲和素标记磁微粒室温下共孵育10min，磁分离1min，保留上清；
(2)向上清液中加入150μL浓度为0.3mg/mL的生物素标记捕获抗体、150μL浓度为0.3mg/mL的链霉亲和素标记磁微粒和150μL浓度为0.3μg/mL的吖啶酯标记信号抗体，充分混合，37℃下孵育10min，磁分离1min，去上清，采用洗涤液清洗5次；
(3)加入200μL激发液，充分混合后采用全自动化学发光仪Lumiray系列，测定溶液的化学发光强度。
实施例6曲霉菌半乳甘露聚糖的一步法检测
与实施例5相比，磁微粒采用FITC抗体进行标记，捕获抗体采用FITC进行标记，其他条件与实施例5相同。
实施例7灵敏度实验
对曲霉菌半乳甘露聚糖进行梯度稀释后，进行灵敏度检测。结果发现，随着半乳甘露聚糖浓度的上升，信号值也随之上升；检测限(LOD)达到0.05ng/mL，与市售试剂盒的比较如表3所示。
表3不同曲霉半乳甘露聚糖试剂盒的检出限
Figure BDA0002322873510000131
实施例8特异性实验
与鼠源单克隆抗体相比，兔源单克隆抗体具有识别位点多、亲和性强和特异性好等优点，本发明的试剂盒与市售试剂盒的测试数据见表4，本发明的试剂盒的特异性优于市场上现有的曲霉检测试剂盒。
表4不同曲霉半乳甘露聚糖试剂盒的临床符合率
检测试剂盒厂家 DNK(本发明) IMMY BioRad
方法学 化学发光法 胶体金法 ELISA法
临床符合率 94％(159/165) 87％(144/165) 91％(151/165)
实施例9抗生物素干扰能力实验
现有的化学发光诊断试剂盒，为了缩短反应时间，大多采用一步法操作，由于生物素标记抗体与样品和亲和素磁珠同时进行反应，样品中的生物素必然会干扰生物素标记抗体与亲和素磁珠的结合，影响结果的准确性。
本发明中，在进行半乳甘露聚糖的检测过程中，为避免待测样本中的生物素对结果造成的影响，采用实施例4～6中的任意一种方案实现待测样本中半乳甘露聚糖与抗体的结合，其中，实施例4采用两步法，生物素标记捕获抗体先与链霉亲和素标记固相载体结合后，再加入样本和信号抗体，生物素标记捕获抗体与链霉亲和素标记固相载体结合后很难解离，从而避免了样本中生物素的干扰；实施例5采用一步法，首先将待测样本采用链霉亲和素标记固相载体进行预处理，吸附去除待测样本中的生物素后，再加入生物素标记捕获抗体、链霉亲和素标记固相载体和信号抗体，完成抗原抗体的结合反应；实施例6不引入生物素，而是采用荧光基团-荧光基团抗体连接捕获抗体和固相载体，彻底消除了待测样本中的生物素对结果造成的干扰。结果见表5。
表5实施例的抗生物素干扰能力对比
Figure BDA0002322873510000141
综上所述，本发明的试剂盒采用兔源抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体作为捕获抗体和信号抗体，特异性好、稳定性好，与曲霉菌半乳甘露聚糖的亲和力强，可以快速与曲霉菌半乳甘露聚糖进行结合，有利于将检测时间缩短至15min以内；本发明在进行半乳甘露聚糖的检测过程中，通过调整试剂的添加顺序，克服了待测样本中的生物素对结果造成的干扰；本发明的试剂盒特异性强，临床符合率达94％，灵敏度高，检测限达0.05ng/mL，优于市场上现有的试剂盒，在侵袭性曲霉病的早期快速临床诊断方面具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 丹娜（天津）生物科技有限公司
<120> 一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用
<130> 20191217
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 134
<212> PRT
<213> 兔源
<400> 1
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser
20 25 30
Tyr Ile Thr Asn Tyr Tyr Tyr Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Gly
35 40 45
Gly Arg Leu Thr Gly Leu Glu Tyr Ile Gly Met Ile Ser Gly Ala Asn
50 55 60
Thr Gly Tyr Ala Asn Trp Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Asn
65 70 75 80
Gly Arg Phe Asp Met Asn Trp Val Thr Tyr Val Thr Pro Gly Thr Pro
85 90 95
Leu Thr Leu Thr Cys Phe Cys Ala Arg Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr
100 105 110
Thr Val Asp Leu Lys Met Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 2
<211> 134
<212> PRT
<213> 兔源
<400> 2
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Ser Glu Ala Cys
20 25 30
Ala Gly Tyr Lys Tyr Thr Gly Thr Trp Tyr Gln Phe Thr Leu Thr Ile
35 40 45
Ser Asp Gly Ser Val Pro Val Cys Asp Gln Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
50 55 60
Thr Pro Ser Ser Thr Ile Asp Ser Gln Lys Pro Gly Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Val
85 90 95
Gly Asp Thr Val Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ser Val Tyr Ser
100 105 110
Asn Asn Arg Leu Ala Asn Cys Gln Ala Val Ile Ala Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Glu Val Val Val Lys
130

Claims (10)

1.一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括捕获抗体和信号抗体，所述捕获抗体和所述信号抗体为抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体上修饰有生物素或荧光基团；
优选地，所述荧光基团包括FITC、ALEX-350、Alexa Fluor 488、Cy3、Cy5、FAM、VIC、TET、JOE、HEX或ROX中的任意一种或至少两种的组合，优选为FITC；
优选地，所述捕获抗体的浓度为0.5～3μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述信号抗体上修饰有化学发光基团；
优选地，所述化学发光基团包括吖啶酯、鲁米诺、(金钢烷)-1,2-二氧乙烷或碱性磷酸酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为吖啶酯；
优选地，所述信号抗体的浓度为0.5～3μg/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括固相载体；
优选地，所述固相载体包括磁微粒、酶标板、微球、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合，优选为磁微粒；
优选地，所述固相载体表面修饰有链霉亲和素和/或荧光基团的特异性抗体；
优选地，所述磁微粒的浓度为100～1000μg/mL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品为曲霉菌半乳甘露聚糖；
优选地，所述校准品的浓度分别为0.2～25.0ng/mL。
6.一种半乳甘露聚糖的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用如权利要求1-5任一项所述的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括抗原结合的步骤；
优选地，所述抗原结合的步骤包括(a)～(c)中的任意一种；
(a)将生物素标记捕获抗体和链霉亲和素标记固相载体共孵育，加入待测样本和信号抗体，混合孵育后去上清；
(b)将待测样本采用链霉亲和素标记固相载体进行预处理，去除待测样本中的生物素；加入生物素标记捕获抗体、链霉亲和素标记固相载体和信号抗体，混合孵育后去上清；
(c)向待测样本中加入FITC标记捕获抗体、信号抗体、FITC抗体标记固相载体，混合孵育后去上清。
8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，(a)中所述共孵育的时间为1～10min，所述混合孵育的时间为1～10min；
优选地，(b)中所述预处理的时间为1～10min，所述混合孵育的时间为1～20min；
优选地，(c)中所述混合孵育的时间为1～20min。
9.根据权利要求6-8任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法在抗原结合后还包括化学发光检测的步骤；
优选地，所述化学发光检测包括加入底物，测定化学发光强度；根据标准曲线，计算得到所述待测样本中曲霉菌半乳甘露聚糖的浓度。
10.一种如权利要求1-5任一项所述的试剂盒在制备曲霉菌感染疾病检测试剂中的应用。
CN201911305157.4A 2019-12-17 2019-12-17 一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用 Active CN110887966B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911305157.4A CN110887966B (zh) 2019-12-17 2019-12-17 一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911305157.4A CN110887966B (zh) 2019-12-17 2019-12-17 一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110887966A true CN110887966A (zh) 2020-03-17
CN110887966B CN110887966B (zh) 2021-02-12

Family

ID=69752246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911305157.4A Active CN110887966B (zh) 2019-12-17 2019-12-17 一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110887966B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111925993A (zh) * 2020-09-29 2020-11-13 天津喜诺生物医药有限公司 一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1709080B1 (en) * 2004-01-09 2011-03-09 Pfizer Inc. ANTIBODIES TO MAdCAM
CN102304183A (zh) * 2010-11-22 2012-01-04 天津市一瑞生物工程有限公司 一种曲霉半乳甘露聚糖单克隆抗体的制备及其产品
CN103204930A (zh) * 2012-01-16 2013-07-17 天津贻诺琦生物工程有限公司 一种烟曲霉菌多克隆抗体的制备方法
CN105866407A (zh) * 2016-04-22 2016-08-17 丹娜（天津）生物科技有限公司 一种曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
CN106220730A (zh) * 2016-08-15 2016-12-14 丹娜（天津）生物科技有限公司 一种烟曲霉菌半乳甘露聚糖多克隆抗体的制备方法
CN205941570U (zh) * 2016-08-03 2017-02-08 天津喜诺生物医药有限公司 一种同时检测曲霉菌和隐球菌的免疫胶体金试纸
CN107466319A (zh) * 2017-06-28 2017-12-12 丹娜（天津）生物科技有限公司 Gm杂交瘤细胞、单克隆抗体、试剂盒及其制备方法与应用
CN107688016A (zh) * 2017-08-23 2018-02-13 太原瑞盛生物科技有限公司 一种黄曲霉毒素m1的化学发光检测试剂盒及其制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1709080B1 (en) * 2004-01-09 2011-03-09 Pfizer Inc. ANTIBODIES TO MAdCAM
CN102304183A (zh) * 2010-11-22 2012-01-04 天津市一瑞生物工程有限公司 一种曲霉半乳甘露聚糖单克隆抗体的制备及其产品
CN103204930A (zh) * 2012-01-16 2013-07-17 天津贻诺琦生物工程有限公司 一种烟曲霉菌多克隆抗体的制备方法
CN105866407A (zh) * 2016-04-22 2016-08-17 丹娜（天津）生物科技有限公司 一种曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
CN205941570U (zh) * 2016-08-03 2017-02-08 天津喜诺生物医药有限公司 一种同时检测曲霉菌和隐球菌的免疫胶体金试纸
CN106220730A (zh) * 2016-08-15 2016-12-14 丹娜（天津）生物科技有限公司 一种烟曲霉菌半乳甘露聚糖多克隆抗体的制备方法
CN107466319A (zh) * 2017-06-28 2017-12-12 丹娜（天津）生物科技有限公司 Gm杂交瘤细胞、单克隆抗体、试剂盒及其制备方法与应用
CN107688016A (zh) * 2017-08-23 2018-02-13 太原瑞盛生物科技有限公司 一种黄曲霉毒素m1的化学发光检测试剂盒及其制备方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111925993A (zh) * 2020-09-29 2020-11-13 天津喜诺生物医药有限公司 一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110887966B (zh) 2021-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2022007304A1 (zh) 能够特异性识别RBD蛋白的IgA抗体以及试剂盒
CN111217907B (zh) 抗amh单克隆抗体及其应用
CN107523552B (zh) 分泌抗amh单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗amh单克隆抗体及应用
CN110954691B (zh) 一种样本前处理试剂及其应用
CN110887966B (zh) 一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用
CN113049818A (zh) 一种鉴别突变型抗原的方法及试剂
CN110305139B (zh) 用于间接检测米酵菌酸的毒黄素半抗原及其合成方法
CN116973574B (zh) 可溶性生长刺激表达基因2蛋白的测定试剂盒及其检测方法
CN110618270B (zh) 一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法
FI83669B (fi) Foerfarande foer specifik bestaemning av pankreas -amylas.
WO2020248317A1 (zh) 毒黄素半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用
JP2012082210A (ja) Ａｄａｍｔｓ１３活性検定用抗体及び活性検定方法
CN115754272A (zh) β2-GP1包被磁珠的制备方法及其制备的磁珠与应用
CN114624448B (zh) 一种用于检测胶质纤维酸性蛋白的试剂盒
CN114805586A (zh) 抗MxA单克隆抗体组合物及其应用
CN113637642A (zh) 一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN114778823A (zh) 人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂、试剂盒及定量方法
CN111217910B (zh) 单克隆抗体对及其在检测髓过氧化物酶蛋白中的应用
CN117089529B (zh) 杂交瘤细胞及其制备方法、单克隆抗体及试剂盒
CN111944773B (zh) 一种Jo-1抗原偶联磁微粒及其制备方法、应用和产品
CN106929477B (zh) 一株抗前列腺素F2α的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2及其应用
CN117143830A (zh) 杂交瘤细胞及其制备方法、单克隆抗体及试剂盒
CN113311155B (zh) 一种牛乳蛋白和水牛乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用
CN114563569B (zh) 一种信号放大技术在pgp9.5检测试剂盒中的应用
CN114524875B (zh) 偶联IL-1β单克隆抗体的纳米硅球及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 300467, 101, building 1, building 14, ecological science and Technology Park, eco Road, 2018, Tian Cheng Avenue, ecological town, Tianjin Binhai New Area,. -2

Applicant after: Dana (Tianjin) Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 300467, 101, building 1, building 14, ecological science and Technology Park, eco Road, 2018, Tian Cheng Avenue, ecological town, Tianjin Binhai New Area,. -2

Applicant before: DYNAMIKER BIOTECHNOLOGY (TIANJIN) Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 300467 Building 2, Rongzhi Industrial Park, 3667 Zhongbin Avenue, Zhongxin ecological city, Binhai New Area, Tianjin

Patentee after: Dana (Tianjin) Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: Room 101-2, 1/F, 14 (3B) 1/F, Office Building, Eco-Tech Park, No. 2018 Zhongtian Avenue, Binhai New Area, Tianjin

Patentee before: Dana (Tianjin) Biotechnology Co.,Ltd.