CN110882212B - 一种临床注射用细胞制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种临床注射用细胞制剂,所述细胞制剂包括活细胞以及药用辅料,以药用辅料总量为基准计,所述药用辅料含有:丙二醇,体积分数为10%‑90%;海藻糖0.06‑0.15g/ml;人血白蛋白0.1‑0.2g/ml;与血浆等渗的电解质溶液,补足体积至100%。本发明采用一次制剂制备,全过程监控,解决了长期二次制剂制备对场地设施的依赖,以及二次操作和应用实效导致的质量控制风险。大大降低了细胞储存、运输成本,提高了细胞运输和存储过程安全性,大大延长了细胞应用时效,更方便医疗机构多方式,跨地域、即时、及时、便利、安全可靠使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医疗领域,特别是涉及一种临床注射用细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术
临床用细胞制剂制备和应用技术作为一种按照药物标准化的临床用活细胞制剂制备、储存、运输、应用的有效方法,在生物学领域已有深入广泛的应用。如图1所示,前期由于关键技术限制,导致细胞制剂制备、存储、运输和使用的多方面无法按照一般生物制品药物制剂实施标准化、规范化管理和质量控制,过程操作和应用存在不可避免质量控制缺失,过程操作和应用流程上存在较多不可控风险或无法预知的潜在危害,从而造成临床应用造成巨大的不安全隐患,甚至导致患者遭受二次伤害或死亡。
目前采用的活细胞存储且直接于静脉滴注的主要采用二甲基亚砜(DMSO)、人血白蛋白、复方电解质注射液,储存和运输过程必须采用-196℃(液氮存储)才能维持稳定,对存储和运输要求较高,成本高,不易操作,且无法批量作业。细胞复苏后,DMSO对细胞毒活性影响较大,导致细胞质量稳定性受到较大影响,人体直接回输存在心脏毒性和肝肾毒性较大,过内外均未正式批准作为制剂辅料。
如CN102301992A公开的用于冻存单个核细胞的冻存液,其包含血浆和二甲基亚砜,但不仅限于此,还可以包含动物血清和培养基等成分。采用该冻存液虽然细胞-196℃保存时间较长,但科研用冻存液中含有的动物血清引入了外源蛋白,同时增加了动物病原污染的可能性,DMSO本身对细胞的毒活性作用,直接影响细胞复苏后的应用,以及DMSO产生对人体的毒副作用,需在应用前进行多次洗涤操作后,进行二次制剂制备,直接会影响细胞质量稳定性,用于临床会对人体过继免疫治疗产生较大安全风险,二次制剂制备给后续临床应用增加和更大应用风险和不确定性。
目前也有一些采用冻存液中不含动物血清的文献,例如,CN104026118A公开的免疫细胞冻存液,其包含二甲基亚砜(DMSO)、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。采用该冷冻液的优点在于不会引入外源蛋白,降低了动物病原污染的可能性,然而该冷冻液冻存细胞的存活率以及细胞活性仍较低。
Car-T细胞临床应用报道了以DMSO、人血白蛋白、勃脉力A、葡萄糖、葡聚糖为主要辅料的一次性应用冻存制剂(袋装),由于内含DMSO,复苏后严格要求在0.5h内使用。导致临床应用管理上有较大难题。质量控制过程存在较大风险。
临床用活细胞制剂技术则成了细胞类药物实现标准化生产、质量控制、存储、物流运输和应用的关键技术难题。为细胞类产品向实现新药转化奠定了关键技术基础,为细胞类药物实现临床上稳定,安全、可靠简便应用提供新的工艺支撑和技术保障,无论对临床应用还是基础研究均具有重要意义,尤其是免疫细胞用于回顾性研究时更为重要。冷冻保存免疫细胞不仅可以解决现有免疫细胞诱导时间较长,需要多次诱导和患者多次采血的问题,还可以把人健康状态最好或战斗力最强时期的免疫细胞保存下来,用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗等。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的提供一种临床注射用细胞制剂及其制备方法和应用。
为实现上述目的及其他相关目的,第一方面,本发明提供一种临床注射用细胞制剂,包括活细胞以及药用辅料,以药用辅料总量为基准计,所述药用辅料含有:
丙二醇 体积分数为10%-90%;
海藻糖 0.06-0.15g/ml;
人血白蛋白 0.1-0.2g/ml;
与血浆等渗的电解质溶液 补足体积至100%;
本发明的细胞制剂中不含动物血清和二甲基亚砜。
第二方面,本发明提供一种细胞制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)将细胞存储回输液中的各组分混合制成细胞存储回输液;
(2)将细胞存储回输液过滤除菌后加入活细胞,混合后获得所述细胞制剂。
第三方面,本发明提供一种临床用细胞注射方式,所述注射方式为向施用对象静脉滴注射、静脉推注,局部注射、腹腔或胸腔灌注或皮下注射本发明的细胞制剂。施用对象可以为动物,较佳的,可以为哺乳动物,具体的,可以是灵长类动物,如人、猴等。
如上所述,本发明的一种临床注射用细胞制剂及其制备方法和应用,具有以下有益效果:
(1)保质期长,制备出的成品制剂可2-8℃稳定存储72小时以上;-80℃稳定存储至少6个月,-196℃稳定存储大于1年。细胞制剂低温储存后在2-8℃融化后可在72小时内稳定存储和应用。
(2)不含DMSO、动物源蛋白等存在安全风险的物质。
(3)如图2所示,本发明的细胞制剂不需要再在符合要求的净化车间或制剂室内经过洗涤、离心,制剂二次制备。直接采用注射器抽取注入生理盐水、葡萄糖或血浆替代物直接进行回输应用,完全按照医院输液流程操作,可实现门、急诊无缝对接,操作方便、可靠。解决了二次制剂对基础设施的配套问题,避免了二次制剂制备导致的细胞活性和数量影响,二次操作导致的应用质量问题,以及二次制剂制备到应用时效导致的质量控制“真空”的问题。
本发明有效解决了细胞类产品药物化批次制剂制备、检验、储存、运输到应用全过程有效监控的问题,是由个性化向规范化的跨越。采用一次制剂制备,全过程监控,解决了长期二次制剂制备对场地设施的依赖,以及二次操作和应用实效导致的质量控制风险。大大降低了细胞储存、运输成本,提高了细胞运输和存储过程安全性,大大延长了细胞应用时效,更方便医疗机构多方式,跨地域、即时、及时、便利、安全可靠使用。
附图说明
图1显示为现有技术中的免疫细胞或/和干细胞(含DMSO)的临床应用流程图。
图2显示为本发明所述细胞制剂的临床应用流程图。
具体实施方式
本发明提供的临床注射用细胞制剂,包括活细胞以及药用辅料,以药用辅料总量为基准计,所述药用辅料含有:
丙二醇 体积分数为10%-90%;
海藻糖 0.06-0.15g/ml;
人血白蛋白 0.1-0.2g/ml;
与血浆等渗的电解质溶液 补足体积至100%。
本发明的细胞制剂中不含动物血清和二甲基亚砜。
所述补足体积至100%对应于与血浆等渗的电解质溶液在药用辅料中的含量,具体是指:以药用辅料总量为基准计,将与血浆等渗的电解质溶液与其他药用辅料混合后,为了使药用辅料总体积达到100%,与血浆等渗的电解质溶液所对应的含量。其中所述其他辅料并不限于丙二醇、海藻糖及人血白蛋白,还可以存在其它药用辅料,比如注射用水或血浆替代物等。
以药用辅料总量为基准计,所述丙二醇的体积分数一般为10%-90%,优选为10-40%,更优选,20%-30%,最优选30%。例如可以是10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%,31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%。
以药用辅料总量为基准计,所述海藻糖的含量一般为0.06-0.15g/ml,优选为0.06-0.1g/ml。例如可以为0.06g/ml、0.07g/ml、0.08g/ml、0.09g/ml、0.10g/ml、0.11g/ml、0.12g/ml、0.13g/ml、0.14g/ml、0.15g/ml。
所述海藻糖优选为二水合海藻糖。
以药用辅料总量为基准计,所述人血白蛋白的含量一般为0.1-0.2g/ml。例如可以为0.11g/ml、0.12g/ml、0.13g/ml、0.14g/ml、0.15g/ml、0.16g/ml、0.17g/ml、0.18g/ml、0.19g/ml、0.2g/ml。
本发明采用丙二醇、海藻糖组合,替代现用的二甲基亚砜(DMSO)为基础的储存液,有效降低细胞应用风险。不含动物血清因此不会引入外源蛋白,降低了动物病原污染的可能性。解决了含DMSO细胞制剂复苏后30分钟内必须使用的限制,以及二次制备细胞制剂12小时内必须使用的限制。
所述电解质溶液为氯化钠注射液、复方氯化钠注射液、复方电解质注射液和乳酸林格氏液中的任一种;或者所述电解质溶液为生理盐水、氯化钾注射液、葡萄糖酸钙注射液的混合溶液。
所述活细胞包括免疫细胞和/或干细胞。所述免疫细胞包括NK细胞和T细胞中的一种或多种,所述干细胞包括间充质干细胞、神经干细胞中的一种或多种。所述NK细胞即自然杀伤细胞(natural killer cell)。
所述细胞制剂中,活细胞的含量可以根据需要添加,没有特别限制。例如,所述活细胞在细胞制剂中的终浓度可以1.0×1011个/ml以下,较佳的,所述活细胞在细胞制剂中的终浓度为1.0×106-1.0×108个/ml。进一步地,所述活细胞为免疫细胞时,终浓度较佳为1.0×106-1.0×108个/ml。所述活细胞为干细胞时,终浓度较佳为1.0×106-2.0×107个/ml。
细胞制剂存储用容器优选为药品用中性硼硅玻璃管制瓶、丁基胶塞和铝盖组合瓶如西林瓶,或安瓿瓶。采用规范的药用包装形式,有助于细胞制剂的储存,有效提高了临床应用的安全性。
本发明所述细胞制剂能在2-8℃存储72小时,细胞仍保持90%活率。细胞制剂能在-80℃稳定存储至少6个月。在-196℃条件下能长期存储,至少能稳定存储一年。所述细胞制剂自-80℃或-196℃取出冻融后,在2-8℃下稳定期达到72小时。可保持90%活率。
所述稳定存储是指在一定存储条件下存储的细胞制剂中,活细胞数占细胞总数的90%以上。
所述细胞试剂应用前无需再洗涤或再培养。
本发明提供的细胞制剂制备方法,包括以下步骤:
(1)将各药用辅料成分混合制成混合液;
(2)将(1)获得的混合液过滤除菌后加入活细胞混合后获得细胞制剂。
本发明提供的临床用注射方式,为向施用对象静脉滴注射、静脉推注,局部注射、腹腔或胸腔灌注或皮下注射本发明的细胞制剂。施用对象可以为动物,较佳的,可以为哺乳动物,具体的,可以是灵长类动物,如人、猴等。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
各种原料和试剂均购自商业供应商,未经进一步纯化,除非另有说明。易受潮的原料和试剂均存放于全密封瓶中,并直接使用,均未经过特殊处理。
如整个说明书中所使用的,下述缩写具有下述含义,除非文中明显另有所指:(单位缩写):g=克;ml=毫升;℃=摄氏度;v/v=体积比;(专业名词缩写):DMSO=二甲基亚砜。
表1细胞储存回输液中各注射液的配比
实施例1NK细胞制剂的制备
1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白0.1g/ml;1,2-丙二醇30%(v/v);二水合海藻糖0.08g/ml;复方电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入NK细胞至终浓度为1.0×108个/ml,制成细胞制剂。
实施例2NK细胞制剂的制备
1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白0.1g/ml;1,2-丙二醇20%(v/v);二水合海藻糖0.1g/ml;复方电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入1.0×108个NK细胞/ml,制成细胞制剂。
实施例3间充质干细胞制剂的制备
1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白0.1g/ml;1,2-丙二醇30%(v/v);二水合海藻糖0.08g/ml;复方电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入间充质干细胞至终浓度为5.0×106个/ml,制成细胞制剂。
实施例4间充质干细胞制剂的制备
1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白0.1g/ml;1,2-丙二醇20%(v/v);二水合海藻糖0.1g/ml;复方电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入间充质干细胞5.0×106个/ml,制成细胞制剂。
实施例5T细胞制剂的制备
1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白0.2g/ml;1,2-丙二醇10%(v/v);二水合海藻糖0.15/ml;复方电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入T细胞至终浓度为1.0×106个/ml,制成细胞制剂。
实施例6T细胞制剂的制备
1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白0.2g/ml;1,2-丙二醇90%(v/v);二水合海藻糖0.06g/ml;复方电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入T细胞至终浓度为1.0×108个/ml,制成细胞制剂。
实施例7神经干细胞制剂的制备
1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白0.1g/ml;1,2-丙二醇10%(v/v);二水合海藻糖0.15g/ml;复方电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入神经干细胞至终浓度为1.0×106个/ml,制成细胞制剂。
实施例8神经干细胞制剂的制备
1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白0.2g/ml;1,2-丙二醇90%(v/v);二水合海藻糖0.06g/ml;复方电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入神经干细胞至终浓度为1.0×108个/ml,制成细胞制剂。
实施例9NK细胞制剂稳定性试验
实施例1组:将实施例1中的细胞制剂灌装入清洁、除热源的西林瓶中,胶塞封口,打铝盖。放入程序降温盒,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。测试其稳定性。
实施例2组:将实施例2中的细胞制剂装入聚丙烯安瓿瓶中,旋盖密封,放入程序降温盒,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。测试其稳定性。
对照1组:1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白0.1g/ml;1,2-丙二醇30%(v/v);复方电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入NK细胞至终浓度为1.0×108个/ml,制成细胞制剂。
3)灌装入清洁、除热源的西林瓶中,胶塞封口,打铝盖。放入程序降温盒,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。
即与实施例1组的唯一区别是不含二水合海藻糖,测试其稳定性。
对照2组:1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白0.1g/ml;二水合海藻糖0.08g/ml;
复方电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入NK细胞至终浓度为1.0×108个/ml,制成细胞制剂。
3)灌装入清洁、除热源的西林瓶中,胶塞封口,打铝盖。放入程序降温盒,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。
即与实施例1组的唯一区别是不含丙二醇,测试其稳定性。
表2NK细胞制剂质量标准
表3实施例1组中的NK细胞制剂稳定性实验
表4实施例2组中的NK细胞制剂稳定性实验
表5对照1组NK细胞制剂稳定性实验
表6对照2组NK细胞制剂稳定性实验
对照1组,放入零下80℃的冰箱的第2个月已不符合标准,对照2组,放入零下80℃的冰箱的第1个月已不符合标准,故7个月后放入零下196℃存储的数据不再列出。
实施例10间充质干细胞制剂稳定性试验
实施例3组:将实施例3中的细胞制剂灌装入清洁、除热源的西林瓶中,胶塞封口,打铝盖。放入程序降温盒,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。测试其稳定性。
实施例4组:将实施例4中的细胞制剂装入聚丙烯安瓿瓶中,旋盖密封,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。测试其稳定性。
对照3组:1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白1.0g/ml;1,2-丙二醇30%(v/v);复方电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入间充质干细胞至终浓度为5.0×106个/ml,制成细胞制剂。
3)灌装入清洁、除热源的西林瓶中,胶塞封口,打铝盖。放入程序降温盒,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。
即与实施例3组的唯一区别是不含二水合海藻糖,测试其稳定性。
对照4组:1)按如下配方配制混合液:人血白蛋白0.1g/ml;二水合海藻糖0.08g/ml;复方
电解质注射液补足体积余量;
2)将1)制得的混合液经0.22um除菌过滤,加入间充质干细胞至终浓度为5.0×106个/ml,制成细胞制剂。
3)灌装入清洁、除热源的西林瓶中,胶塞封口,打铝盖。放入程序降温盒,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。
即与实施例3组的唯一区别是不含丙二醇,测试其稳定性。
表7实施例3组中的充质干细胞制剂稳定性实验
表8实施例4组中的间充质干细胞制剂稳定性实验
表9对照3组中的间充质干细胞制剂稳定性实验
表10对照4组中的充质干细胞制剂稳定性实验
对照3组,放入零下80℃的冰箱的第4个月已不符合标准,对照4组,放入零下80℃的冰箱的第3个月已不符合标准,故7个月后放入零下196℃存储的数据不再列出。
实施例11T细胞制剂稳定性试验
实施例5组:将实施例5中的细胞制剂灌装入清洁、除热源的西林瓶中,胶塞封口,打铝盖。放入程序降温盒,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。测试其稳定性。
实施例6组:将实施例6中的细胞制剂装入聚丙烯安瓿瓶中,旋盖密封,放入程序降温盒,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。测试其稳定性。
表11实施例5组中的T细胞制剂稳定性实验
表12实施例6组中的T细胞制剂稳定性实验
实施例12神经干细胞制剂稳定性试验
实施例7组:将实施例7中的细胞制剂灌装入清洁、除热源的西林瓶中,胶塞封口,打铝盖。放入程序降温盒,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。测试其稳定性。
实施例8组:将实施例8中的细胞制剂装入聚丙烯安瓿瓶中,旋盖密封,放入程序降温盒,放入-80℃深低温冰箱存储,第7个月放入液氮(-196℃)存储。测试其稳定性。
表13实施例7组中的神经干细胞制剂稳定性实验
表14实施例8组中的神经干细胞制剂稳定性实验
实施例13 4℃72小时稳定实验
将实施例1-8中的细胞制剂从零下80℃的冰箱中取出,放置于4℃72小时进行稳定性测试。
表15 -80℃实施例1-8取出放置于4℃72小时稳定实验
综上所述,根据本发明制得的细胞制剂可在-80℃稳定存储至少6个月,在-196℃稳定存储至少12个月。在4℃放置2-3min融化后,细胞的活性和活率均可保持较高水平。细胞制剂融化后4℃存储72h细胞活率与启初融化时减少不超过5%。所以,本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种临床注射用细胞制剂,其特征在于,所述细胞制剂包括活细胞以及药用辅料,以药用辅料总量为基准计,所述药用辅料含有:
丙二醇 体积分数为10-40%;
海藻糖 0.06-0.15g/ml;
人血白蛋白 0.1-0.2g/ml;
与血浆等渗的电解质溶液 补足体积至100%;
所述活细胞为免疫细胞;所述免疫细胞包括NK细胞和T细胞中的一种或多种,所述活细胞在细胞制剂中的浓度为1.0×106-1.0×108个/ml;
所述细胞制剂中不含动物血清和二甲基亚砜。
2.根据权利要求1所述的细胞制剂,其特征在于,所述丙二醇的体积分数为:20%-30%。
3.根据权利要求1所述的细胞制剂,其特征在于,所述海藻糖的含量为0.06-0.1g/ml。
4.根据权利要求1所述的细胞制剂,其特征在于,所述细胞制剂储存在中性硼硅玻璃管制瓶或安瓿瓶中。
5.根据权利要求1-4任一所述的细胞制剂,其特征在于,所述细胞制剂在-80℃条件下能稳定存储至少6个月,和/或,所述细胞制剂在-196℃能稳定存储至少一年。
6.根据权利要求1-4任一所述的细胞制剂,其特征在于,所述细胞制剂自-80℃或-196℃取出冻融后,在2-8℃下稳定期达到72小时。
7.根据权利要求1所述的细胞制剂,其特征在于,所述细胞制剂适用的注射方式选自:静脉滴注射、静脉推注,腹腔或胸腔灌注或皮下注射。
8.根据权利要求1至7任一所述的细胞制剂的制备方法,包括以下步骤:
将细胞存储回输液中的各组分混合制成细胞存储回输液;
将细胞存储回输液过滤除菌后加入活细胞,混合后获得所述细胞制剂。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106332869A (zh) * | 2016-11-01 | 2017-01-18 | 浙江译美生物科技有限公司 | 脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法 |
CN107094753A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-08-29 | 东莞市保莱生物科技有限公司 | 一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法 |
WO2017156235A1 (en) * | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Emory University | Methods of preserving mesenchymal stem cells |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9458424B2 (en) * | 2013-12-19 | 2016-10-04 | FertiPro N.V. | Methods for cryopreservation of stem cells via slow-freezing |
-
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- 2018-10-16 CN CN201811204011.6A patent/CN110882212B/zh active Active
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2019
- 2019-06-17 WO PCT/CN2019/091562 patent/WO2020078025A1/zh active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017156235A1 (en) * | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Emory University | Methods of preserving mesenchymal stem cells |
CN106332869A (zh) * | 2016-11-01 | 2017-01-18 | 浙江译美生物科技有限公司 | 脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法 |
CN107094753A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-08-29 | 东莞市保莱生物科技有限公司 | 一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法 |
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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