CN110881463A - 一种利用表面活性剂防治红球藻培养中真菌感染的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用表面活性剂控制红球藻培养过程中真菌类节壶菌感染的方法。针对红球藻规模培养过程中被类节壶菌感染而严重减产的技术难题，本发明通过向藻液中加入表面活性剂十二烷基苯磺酸、十二烷基苯磺酸钠、椰油酸二乙醇胺、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的至少一种，或含有上述表面活性剂的洗涤剂，可以迅速杀死真菌，控制真菌感染。在适宜浓度范围内使用，既能杀死真菌，又对红球藻的生长不产生明显的影响或影响不大，从而保持红球藻培养的正常进行。与现有技术相比，本发明具有可完全控制类节壶菌感染，对红球藻没有明显影响或影响不大，操作简便，成本低廉的优点。

Description

一种利用表面活性剂防治红球藻培养中真菌感染的方法
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一种预防和控制红球藻规模培养过程中真菌感染的方法。
背景技术
红球藻(Haematococcus)是一种单细胞绿藻，其细胞内所含有的虾青素(Astaxanthin)是类胡萝卜素的一种，是目前发现的抗氧化活性最强的天然抗氧化剂(天然虾青素的超级抗氧化活性及其应用.中国海洋药物.2001,20(4):45-50；雨生红球藻及虾青素的生产.微藻生物技术.1999，中国轻工业出版社，北京，174-213)。规模培养红球藻生产天然虾青素是国际上新兴的微藻生物技术产业，虾青素被广泛应用于人类保健食品和珍贵水产动物养殖的饲料添加剂(大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的研究进展和产业化现状.中国海洋药物.2001,20(5):4-8；Haematococcus astaxanthin:applications forhuman health and nutrition.Trends in Biotechnology,2003.21(5):210-216；Industrial production of micralga cell-mass and secondary products-species ofhigh potential:Haematococcus,In Amos Richmond(Ed),Handbook of microalgalculture:Biotechnology and applied phycology,2004,Blackwell science Ltd aBlackwell publishing Company,Oxford)。
红球藻的规模培养是红球藻生物资源利用中最关键的环节，然而不论是开放式跑道池，还是封闭式光生物反应器中，生物污染源都不可避免的通过水体或气体进入红球藻培养液，生物污染难以避免。生物污染问题在小规模微藻培养中并不突出，但随着培养规模的逐步扩大，污染更易发生，其危害愈发严重。红球藻培养过程中不仅发生敌害生物的污染，还会发生病原真菌的感染。敌害生物包括轮虫、纤毛虫、变形虫等，这些敌害生物能吞噬红球藻细胞，特别是红球藻的绿色游动细胞，使藻细胞数量减少，造成减产(我国微藻资源开发30年蝉变之路.生物学杂志，2017,34(2):9-15；雨生红球藻的紫外诱变、抗铵品系筛选及培养条件优化.青岛科技大学，2010，硕士学位论文)。2008年，Hoffman第一次发现并报道了寄生在雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)细胞表面的类节壶菌Paraphysodermasedebokerense，一旦暴发其危害是毁灭性的。感染初期，无固定形态的病原真菌游动孢子吸附在雨生红球藻细胞表面并形成孢囊，孢囊伸出假根穿透细胞壁深入到细胞内，真菌孢囊利用假根吸取红球藻细胞质的营养成分。感染后期，雨生红球藻孢子颜色由红色逐渐变成黄色，最终降解为一团松散的细胞残体(Isolation and characterization of a novelchytrid species(phylum Blastocladiomycota),parasitic on the green algaHaematococcus.Mycological Research,2008,112:70–81)。发明人在国内开展规模培养红球藻生产虾青素的技术研发及其产业化过程中发现，类节壶菌Paraphysodermasedebokerense感染红球藻细胞的情况很普遍。与敌害生物污染相比，寄生性真菌感染往往在短时间内造成整个培养的崩溃，危害尤其严重。如何有效地预防、控制真菌感染的发生，是红球藻规模培养的关键技术。
目前，微藻培养中生物污染的控制方法主要包括以下几种：
(1)通过物理方法除去污染生物；如专利(WO2012/129031 A2)对培养液施加一定强度的电场来杀灭污染生物；澳大利亚学者Borowitzka等采用过滤的方法去除污染生物(Borowitzka,M.A.,2005.Culturing microalgae in outdoor ponds.In:Andersen,R.A.(Ed.),Algal Culturing Techniques.Academic Press,New York,pp.205-217)；
(2)利用微藻细胞与污染生物对生理环境耐受度的差异，通过诸如提高温度(专利申请CN 104593263A)、pH快速变化(Becher,E.W.,1994.Microalgae:Biotechnology andMicrobiology.Cambridge University Press,Cambridge.)控制生物污染的发生、发展；
(3)通过添加额外的化学药剂杀灭污染生物，如中国授权权专利：ZL98113428.9向螺旋藻培养液中添加不超过3M的NH4 +来杀灭轮虫、丝状真菌等；专利(CN201210404147.8)利用印楝、川楝、苦皮藤等植物提取物杀灭污染生物；西班牙学者Moreno-Garrido I.及Canavate J.P.报道利用10mg/L的奎宁(Quinine)杀灭盐藻培养过程中出现的纤毛虫(Moreno-Garrido,I.,Canavate,J.P.,2001.Assessing chemical compounds forcontrolling predator ciliates in outdoor masscultures of the green algae Dunaliellasalina.Aquacult.Eng.24,107–114.)；专利(CN 104069521 A)公开了一种利用二氧化氯气体治理微藻培养过程中生物污染的方法；
(4)通过生态环境调节来控制污染生物的数量，如专利申请(CN 104630067 A)公开了一种微藻养殖污染防治方法，当培养液中污染生物细胞密度达到一定值时，对培养液进行稀释/采收操作，从而降低污染生物种群密度，增加目标微藻的生态竞争优势。
以上方法对于控制以吞食方式危害藻类的敌害动物有一些效果，可以在一定程度上缓减敌害生物污染的影响，但是仍然存在以下问题：污染生物去除、杀灭不彻底、污染很快再次发生；或在杀灭敌害生物的同时，培养的微藻也受到明显伤害；或操作困难，不便于大规模使用；或处理方法成本高，不适合大规模使用等。由于类节壶菌P.sedebokerense是一种病原真菌，通过感染细胞致死红球藻，已有的针对敌害生物的处理方法对这种病原真菌感染基本没有效果。如何建立一种对病原真菌杀灭彻底、同时对红球藻没有影响或影响不大，操作简便、经济适用的生物污染控制方法，是红球藻生物技术产业亟待解决的技术难题。
发明内容
针对红球藻培养中真菌感染控制方法的缺乏，本发明提供了一种利用表面活性剂控制红球藻培养过程中真菌感染的方法。该方法能够有效杀灭寄生性真菌类节壶菌P.sedebokerense，对红球藻的正常生长无不良影响或影响不大，能够保持红球藻培养的正常进行，可以有效预防和控制开放式、封闭式培养系统中红球藻被寄生性真菌类节壶菌P.sedebokerense感染。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的技术构思：表面活性剂对生物的细胞膜具有破坏作用，不同生物细胞对表面活性剂的耐受能力不同。本发明利用真菌细胞对表面活性剂耐受能力较差、而红球藻细胞对表面活性剂耐受能力比真菌细胞强这一特点，选择性杀灭病原真菌，对红球藻的正常生长不产生负面影响，或影响不大。通过以下步骤确定不同表面活性剂的使用浓度：
(1)在实验室内培养红球藻，向藻液中加入不同浓度的各种表面活性剂、表面活性剂组合物和含有表面活性剂的洗涤剂，掌握其对红球藻生长的影响，以加入处理剂培养48小时后红球藻的光密度不低于对照光密度的50％为判定标准，确定各种处理剂使用浓度的上限；
(2)在室外自然条件下培养红球藻，发现病害真菌感染后，分别向藻液中加入不同浓度的各种表面活性剂、表面活性剂组合物和含有表面活性剂的洗涤剂，掌握其对病害真菌的控制效果，找到能够完全杀灭病害真菌的最低浓度，确定各种处理剂完全控制病害真菌感染的使用浓度下限；
(3)根据各种处理剂使用浓度的下限和上限，确定其完全控制病害真菌感染的使用浓度范围。
一种利用表面活性剂防治红球藻培养中真菌感染的方法：每天取藻液并用显微镜观察真菌感染的发生、发展情况，在未观察到真菌感染时加入表面活性剂或含有表面活性剂的洗涤剂，用于真菌感染的预防，或者观察到真菌感染后，加入表面活性剂或含有表面活性剂的洗涤剂，用于感染的控制，所述的表面活性剂是十二烷基苯磺酸、十二烷基苯磺酸钠、椰油酸二乙醇胺、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的至少一种。
进一步地，所述表面活性剂为十二烷基苯磺酸、十二烷基苯磺酸钠、椰油酸二乙醇胺、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的任意一种，使用浓度分别如下：
Figure BDA0001792680180000041
进一步地，所述的表面活性剂为十二烷基苯磺酸或十二烷基苯磺酸钠、椰油酸二乙醇胺、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚四种的组合，质量百分比如下：
Figure BDA0001792680180000042
进一步地，上述组合物1-17的使用浓度分别如下：
Figure BDA0001792680180000051
进一步地，所述的含有表面活性剂的洗涤剂包括洗洁精或洗衣液，使用浓度如下：
洗涤剂 浓度范围mg/L
洗洁精 10-20
洗衣液 7.5-15
进一步地，所述的红球藻规模培养包括开放式反应器培养或封闭式反应器培养，或开放式反应器培养和封闭式反应器培养的组合培养方式。
进一步地，所述的真菌为类节壶菌。
上述方法中，确定各种表面活性剂、表面活性剂组合物和含有表面活性剂的洗涤剂控制病害真菌感染的使用浓度范围是关键。利用表面活性剂控制红球藻培养中的真菌感染是一种全新的技术方法，克服了已有技术存在的诸多不足，包括污染生物去除、杀灭不彻底、污染很快再次发生；或在杀灭敌害生物的同时，培养的微藻也受到明显伤害；或操作困难，不便于大规模使用；或处理方法成本高，不适合大规模使用等。经过表面活性剂处理，病原真菌被彻底杀灭，红球藻不受影响或影响不明显，仍然能够正常生长，保持培养的正常进行。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、对病原真菌杀灭彻底，不易重复发生感染；对红球藻的生长繁殖和虾青素的积累没有明显影响或影响不大；
2、操作简便，成本低廉。将所需质量的表面活性剂，或表面活性剂的组合物，或含有表面活性剂的洗涤剂加入藻液中，溶解完全，搅拌均匀即可继续培养，操作省时省力；以十二烷基苯磺酸为例，3mg L-1就能完全控制类节壶菌P.sedebokerense的感染，处理1000L藻液，处理费用仅为0.03元。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法及该方法所达到的效果作进一步详细说明。
实施例1：表面活性剂对红球藻生长的影响
利用表面活性剂预防、控制红球藻培养中的真菌感染，需要了解各种表面活性剂对红球藻生长的影响。测定各种表面活性剂(十二烷基苯磺酸、十二烷基苯磺酸钠、椰油酸二乙醇胺、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠)对红球藻生长的影响，利用三角瓶培养雨生红球藻，培养基组分及含量如下：硝酸钠150mg/L，三水磷酸氢二钾40mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁6mg/L，乙二胺四乙酸二钠5mg/L，碳酸氢钠40mg/L，硼酸2.86mg/L，四水氯化锰1.8mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，二水钼酸钠0.391mg/L，六水硝酸钴0.0494mg/L。其中硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠可直接称量药品并逐个加入并充分溶解，其余组份首先配制成浓缩液，再将浓缩液逐个加入培养基中。接种后藻液光密度OD540约为0.05，藻液分装于300ml三角瓶中，每个三角瓶中放200ml藻液。向藻液中分别添加3mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L表面活性剂，以不添加表面活性剂的培养为对照(CK)，对照和每种浓度的处理同时做3个重复，置光照摇床上培养。每天14小时光照，10小时黑暗，光照时向藻液中连续通入二氧化碳与空气的混合气体(二氧化碳与空气的体积比为1:99)搅动藻液，并为微藻的光合作用提供碳源。黑暗时向藻液中连续通入空气搅动藻液。培养48小时后测定培养液光密度(OD540)，测定3个重复的光密度OD540，用平均值表示对照和各种处理的藻液光密度。培养前后藻液光密度的变化表示藻的生长情况，藻液光密度OD540增长越多，表示藻生长得越快，说明表面活性剂对藻生长的抑制作用越小；反之，表示藻生长得越慢，说明表面活性剂对藻生长的抑制作用越大。结果如表1所示。
表1表面活性剂对红球藻生长的影响
Figure BDA0001792680180000061
Figure BDA0001792680180000071
从表1可以看出，6种表面活性剂对红球藻生长的影响程度各有不同，十二烷基硫酸钠对红球藻生长的影响最小，浓度达到20mg/L，红球藻的光密度OD540只比对照低了约20％，表明这对红球藻生长的影响不大。脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠的浓度不高于15mg/L，红球藻的光密度高于对照的50％，浓度达到20mg/L，红球藻的光密度显著低于对照的50％。十二烷基苯磺酸、十二烷基苯磺酸钠和椰油酸二乙醇胺三种表面活性的浓度不超过10mg/L，红球藻的光密度均高于对照的50％；当浓度进一步增高，光密度大幅度下降，表示对红球藻生长的影响明显增大。脂肪醇聚氧乙烯醚的浓度为10mg/L时，红球藻的光密度稍低于对照光密度的50％；随着浓度增高，红球藻藻液光密度急剧降低，表示对生长影响极大。
比较十二烷基苯磺酸与十二烷基苯磺酸钠对红球藻生长的影响，可见在5-20mg/浓度范围内，十二烷基苯磺酸和十二烷基苯磺酸钠对红球藻生长的影响相同。
利用表面活性剂控制红球藻培养中的真菌感染，虽然会对红球藻的生长产生一定的影响，但是，只要选择合适的处理浓度，对红球藻的生长不产生太大的影响，以牺牲一些产量为代价换来培养的继续进行，还是值得的。以加入表面活性剂培养48小时后红球藻的光密度不低于(个别情况稍低于)对照光密度的50％为判定标准，各种表面活性剂适合使用的浓度范围如表2所示。
表2表面活性剂适合使用的浓度范围
表面活性剂 适宜浓度mg/L
十二烷基苯磺酸 ≤10
十二烷基苯磺酸钠 ≤10
椰油酸二乙醇胺 ≤10
十二烷基硫酸钠 ≤20
脂肪醇聚氧乙烯醚 ≤10
脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠 ≤15
实施例2：表面活性剂控制雨生红球藻培养中的真菌感染
5m2开放池培养雨生红球藻，培养基组分及含量如下：硝酸钠150mg/L，三水磷酸氢二钾40mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁6mg/L，乙二胺四乙酸二钠5mg/L，碳酸钠40mg/L，硼酸2.86mg/L，四水氯化锰1.8mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，二水钼酸钠0.391mg/L，六水硝酸钴0.0494mg/L，其中硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠可直接称量药品并逐个加入并充分溶解，其余组份首先配制成浓缩液，再将浓缩液逐个加入培养基中。培养基配制好之后，向池中加入无污染的红球藻种子培养液，使得培养池中藻液密度(OD540)达到约0.02，在自然光温条件下进行培养。培养过程中向藻液中通入二氧化碳(钢瓶装商品二氧化碳)为微藻的光合作用提供碳源并控制藻液的pH(pH7.0-8.0)。采用pH控制仪在线控制二氧化碳的通入，当藻液pH达到控制范围的上限，pH控制仪开通电磁阀，二氧化碳通入藻液中，当pH降低到控制范围的下限，pH控制仪关闭电磁阀，二氧化碳停止通入藻液。如此循环，藻液pH被控制在设定的范围内。每天早晚各一次从培养池中取藻液进行显微镜观察，在藻液中会观察到自然发生的类节壶菌P.sedebokerense感染红球藻细胞。发现真菌感染后，每天早晚各一次取样观察真菌感染情况，并测定红球藻细胞受到真菌感染的感染率。
红球藻细胞受到真菌感染的感染率测定方法：取藻液样品，加入血球计数板中，在显微镜下观察，分别对受到真菌感染的藻细胞和藻细胞总数进行计数，按照以下公式计算藻细胞的感染率：
藻细胞感染率＝(真菌感染的藻细胞数÷藻细胞总数)×100％
等真菌感染发展到一定程度，红球藻细胞受到真菌的感染率达到5％左右，从培养池中取出藻液，放入50L培养箱中，每个培养箱放40L藻液。根据藻液体积和表面活性剂的浓度计算处理剂的使用量，准确称量所需数量的处理剂，加入藻液中。充分搅动藻液使处理剂溶解完全并分布均匀。不加入表面活性剂的培养箱作为对照(CK)，对照和每个处理都同时做3个重复。培养箱放在温室内，在自然光温条件下进行通气培养。8:00-20:00培养箱连续通入CO2与空气的混合气体(CO2与空气的体积比是1：99)对藻液进行搅动，同时为红球藻的光合作用提供碳源；20:00-次日8:00，培养箱连续通入空气。培养72小时后观察红球藻细胞数和病原真菌感染情况。三个重复处理均未观察到真菌感染细胞，则认定该处理浓度可彻底杀灭真菌，“真菌感染”计为0。三个重复中，只要有一个发现有真菌感染，即使数量极少，也认定该处理浓度对真菌的控制不彻底，“真菌感染”计为1。
6种表面活性剂控制真菌P.sedebokerense感染的效果如表3所示。
表3表面活性剂控制类节壶菌P.sedebokerense感染的效果
Figure BDA0001792680180000091
相同浓度的十二烷基苯磺酸和十二烷基苯磺酸钠对真菌的控制效果相同。十二烷基苯磺酸、十二烷基苯磺酸钠和椰油酸二乙醇酰胺的浓度达到3mg/L及以上即可杀死病原真菌，继续培养72h，藻液中观察不到病原真菌感染的情况，病原真菌感染得到完全控制。
十二烷基硫酸钠的浓度达到15mg/L及以上即可杀死病原真菌，继续培养72h，藻液中观察不到病原真菌感染的情况，病原真菌的感染得到完全控制。
脂肪醇聚氧乙烯醚的浓度达到10mg/L及以上可杀死病原真菌，继续培养72h，藻液中观察不到病原真菌感染的情况，病原真菌的感染得到完全控制。
脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠的浓度达到30mg/L还不能杀灭真菌，即使再加大浓度，仍没有显著效果(数据未显示)。所以，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠不能有效控制红球藻培养中类节壶菌P.sedebokerense的感染。
综合考虑不同浓度的表面活性剂对病原真菌感染的控制效果和对红球藻生长的影响(实施例1，表2)，6种表面活性剂用于控制红球藻培养中真菌感染的适宜浓度范围如表4所示。
表4表面活性剂用于控制红球藻培养中真菌P.sedebokerense感染的适宜浓度范围
表面活性剂 浓度范围mg/L
十二烷基苯磺酸 3-10
十二烷基苯磺酸钠 3-10
椰油酸二乙醇胺 3-10
十二烷基硫酸钠 15-20
脂肪醇聚氧乙烯醚 10
脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠 不适用
实施例3：表面活性剂组合物对红球藻生长的影响
利用表面活性剂组合物预防、控制红球藻培养中的真菌感染，需要了解各种表面活性剂组合物对红球藻生长的影响。利用实施例1所述方法，测试不同的表面活性剂组合物对红球藻生长的影响，红球藻的培养方法、表面活性剂组合物的处理方法、藻液光密度OD540的测量方法均与实施例1相同。
表面活性剂组合物的成分和配比见表5。组合物对红球藻生长的影响如表6所示。
表5表面活性剂组合物的成分及其配比
Figure BDA0001792680180000101
Figure BDA0001792680180000111
17种组合物中，每种表面活性剂比例(质量百分比)的变化范围是5％～85％。需要指出，十二烷基苯磺酸和十二烷基苯磺酸钠二种表面活性剂，对红球藻生长的影响相同(实施例1)，对类节壶菌P.sedebokerense感染的控制效果也相同(实施例2)，所以，无论单独使用，还是作为组合物的一种成分，相同质量的十二烷基苯磺酸和十二烷基苯磺酸钠可以相互替代，产生的效果完全一样。本发明中用“十二烷基苯磺酸/十二烷基苯磺酸钠”表示十二烷基苯磺酸或者十二烷基苯磺酸钠，二者具有相同的效果，可以相互替代。
每种表面活性剂所占的比例(质量百分比)在5％～85％范围内变化时，17种组合物的浓度不超过7.5mg/L，对红球藻生长的抑制作用都很小。虽然部分组合物在浓度较高(≥10mg/L)时对红球藻的生长产生一定的影响，但是，对应组合物完全控制真菌感染的最低浓度均不高于10mg/L(见实施例4)，所以，17种表面活性剂组合物都可以用于预防、控制真菌感染。随着组合物处理浓度的增加，对红球藻生长的影响越来越大(表6)，当红球藻的生长受到的影响太大时，对应的处理浓度已经不适合用于红球藻真菌感染的控制。以加入组合物培养48小时后红球藻的光密度不低于(个别情况稍低于)对照光密度的50％为判定标准，各种组合物适合使用的浓度范围如表7所示。
表6表面活性剂组合物对红球藻生长(OD540)的影响
Figure BDA0001792680180000112
Figure BDA0001792680180000121
Figure BDA0001792680180000131
表7表面活性剂组合物适合使用的浓度范围
Figure BDA0001792680180000132
实施例4：表面活性剂组合物控制真菌感染
利用表面活性剂组合物控制真菌感染，表面活性剂组合物的成分及配比如表5所示，红球藻的培养方法、表面活性剂组合物的用量计算方法、称量和加入方法、藻细胞受真菌感染率的测定方法、真菌感染控制效果的判定方法均与实施例2相同。
表面活性剂组合物控制真菌感染的效果如表8所示。
表8表面活性剂组合物控制真菌P.sedebokerense感染的效果
Figure BDA0001792680180000133
Figure BDA0001792680180000141
表8数据表明，表面活性剂组合物对类节壶菌P.sedebokerense具有明显的杀灭效果，依据不同组合中各种表面活性剂含量的不同，能够完全控制真菌感染的浓度也各有不同。其中组合物5、组合物13在3mg/L时即可完全杀灭真菌，组合物8、组合物9则在10mg/L时能完全控制真菌感染，而大部分组合物都能够在5-7.5mg/L的浓度范围内完全杀灭真菌。综合考虑不同浓度的组合物对病原真菌感染的控制效果(表8)和对红球藻生长的影响(实施例3，表7)，各种组合物用于控制红球藻培养中真菌P.sedebokerense感染的适宜浓度范围如表9所示。
表9表面活性剂组合物用于控制红球藻培养中真菌P.sedebokerense感染的适宜浓度范围
Figure BDA0001792680180000142
Figure BDA0001792680180000151
实施例5：洗涤剂对红球藻生长的影响
市场上出售的洗涤产品，例如洗洁精、洗衣液，其主要有效成分就是表面活性剂，一般是几种表面活性剂的组合(高效液相色谱串联质谱法检测18种表面活性剂的应用研究.中国海洋大学硕士学论文，2014；表面活性剂在液体洗涤剂中的应用.广东化工，2013，40(16)：251)，所以，本发明也使用洗涤剂控制真菌的感染。
使用洗涤剂预防和控制红球藻被真菌感染，需要了解洗涤剂对红球藻生长的影响。按照实施例1所述的方法，测试不同的洗涤剂对红球藻生长的影响，红球藻的培养方法、洗涤剂的处理方法、藻液光密度OD540的测量方法均与实施例1相同。结果如表10所示。
表10洗涤剂对红球藻生长的影响
Figure BDA0001792680180000152
红球藻藻液中加入雕牌洗洁精和立白洗洁精10mg/L，蓝月亮洗衣液7.5mg/L，培养48小时后，红球藻的光密度与对照差异很小，表明对红球藻生长的影响很小。雕牌洗洁精和立白洗洁精20mg/L，蓝月亮洗衣液15mg/L，红球藻的光密度比对照明显降低，但是，均高于对照光密度的50％。雕牌洗洁精和立白洗洁精的浓度达到30mg/L，蓝月亮洗衣液的浓度达到20mg/L，红球藻的光密度均不足对照光密度的50％，表明红球藻的生长受到了很大的影响。
考虑洗涤剂对红球藻生长的影响，以加入洗涤剂培养48小时后红球藻的光密度不低于对照光密度的50％为判定标准，三种洗涤剂适合使用的浓度范围如表11所示。
表11洗涤剂适合使用的浓度范围
洗涤剂 适合浓度mg/L
雕牌洗洁精 ≤20
立白洗洁精 ≤20
蓝月亮洗衣液 ≤15
实施例6：洗涤剂控制红球藻培养中的真菌感染
市场上出售的洗涤产品，例如洗洁精、洗衣液，其主要有效成分就是表面活性剂，一般是几种表面活性剂的组合(高效液相色谱串联质谱法检测18种表面活性剂的应用研究.中国海洋大学硕士学论文，2014；表面活性剂在液体洗涤剂中的应用.广东化工，2013，40(16)：251)，所以本发明也使用洗涤液控制真菌的感染。
利用洗涤剂控制真菌感染，红球藻的培养方法、洗涤剂的用量计算方法、称量和加入方法、藻细胞受真菌感染率的测定方法、真菌感染控制效果的判定方法均与实施例2相同。结果如表12所示。
表12洗涤剂控制真菌P.sedebokerense感染的效果
Figure BDA0001792680180000161
表12数据表明，雕牌洗洁精及立白洗洁精在浓度达到10mg/L时即可完全杀灭真菌，而蓝月亮洗衣液在7.5mg/L的浓度时即可完全控制真菌感染。综合考虑各种洗涤剂对病原真菌感染的控制效果和对红球藻生长的影响(实施例5，表10)，各种洗涤剂用于控制红球藻培养中真菌P.sedebokerense感染的适宜浓度范围如表13所示。
表13洗涤剂用于控制红球藻培养中真菌P.sedebokerense感染的适宜浓度范围
洗涤剂 适宜浓度范围mg/L
雕牌洗洁精 10-20
立白洗洁精 10-20
蓝月亮洗衣液 7.5-15
实施例7：表面活性剂控制红球藻开放池培养中的真菌感染
5m2开放池培养红球藻，培养基组分及含量如下：硝酸钠150mg/L，三水磷酸氢二钾40mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁6mg/L，乙二胺四乙酸二钠1mg/L，碳酸氢钠20mg/L，硼酸2.86mg/L，四水氯化锰1.8mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，二水钼酸钠0.391mg/L，六水硝酸钴0.0494mg/L，其中硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠可直接称量药品干粉并逐个加入并充分溶解，其余组份首先配制成浓缩液，再将浓缩液逐个加入培养池中。培养基配制好之后，向池中加入无污染的红球藻种子培养液，使得培养池中藻液密度(OD540)达到约0.02，在自然光温条件下进行培养。培养过程中向藻液中通入二氧化碳(钢瓶装商品二氧化碳)为微藻的光合作用提供碳源并控制藻液的pH(pH7.0-8.0)。采用pH控制仪在线控制二氧化碳的通入，当藻液pH达到控制范围的上限，pH控制仪开通电磁阀，二氧化碳通入藻液中，当pH降低到控制范围的下限，pH控制仪关闭电磁阀，二氧化碳停止通入藻液。如此循环，藻液pH被控制在设定的范围内。每天早晚各一次从培养池中取藻液进行显微镜观察，培养一段时间后，在藻液中会观察到自然发生的类节壶菌P.sedebokerense感染。发现真菌感染后，每天早晚各一次取样观察真菌感染情况，并测定红球藻细胞受到真菌感染的感染率。
红球藻细胞受到真菌感染的感染率测定方法：取藻液样品，加入血球计数板中，在显微镜下观察，分别对受到真菌感染的藻细胞和藻细胞总数进行计数，按照以下公式计算藻细胞的感染率：
藻细胞感染率＝(真菌感染的藻细胞数÷藻细胞总数)×100％
等真菌感染发展到一定程度，红球藻细胞受到真菌的感染率达到5％左右，即可向培养池中加入表面活性剂进行处理，每种表面活性剂都采用其可完全控制真菌感染的最低浓度(表4)进行处理。准确测量培养池中藻液的深度，根据藻液深度和培养池面积计算培养液体积，根据藻液体积和每种表面活性剂的处理浓度计算用量：表面活性剂用量(g)＝培养池面积(m2)×藻液深度(cm)×最适浓度(mg/L)÷100。准确称量所需的表面活性剂，加入培养池。培养池的叶轮搅拌器驱动藻液流动，在流动的藻液中，表面活性剂很快溶解完全并分布均匀。培养72小时后，连续三次从培养池中取藻液在显微镜下观察真菌情况，三次取样均未观察到受真菌感染的红球藻细胞，则认定真菌感染得到完全控制，“真菌感染”计为0。连续三次取样，只要一次发现受真菌感染的红球藻细胞，即使其数量极少，也认定真菌感染没有得到完全控制，“真菌感染”计为1。
培养池面积、藻液深度、表面活性剂浓度和用量，处理后继续培养72小时后真菌感染情况如表14所示。
表14表面活性剂控制红球藻开放池培养中真菌P.sedebokerense感染的效果
Figure BDA0001792680180000181
处理效果：处理72小时后，多次取藻液观察，均未看到真菌感染红球藻的情况。继续培养6-9天，红球藻藻液经历了绿色-黄绿色-褐色-棕红色-红色的变化，藻细胞成为富含虾青素的红色厚壁孢子。
实施例8：表面活性剂组合物控制红球藻开放池培养中的真菌感染
利用表面活性剂组合物控制红球藻开放池培养中的真菌感染，表面活性剂组合物的成分及配比如表5所示，每种表面活性剂组合物都采用其可完全控制真菌感染的最低浓度(表9)进行处理。开放池培养红球藻的方法、真菌感染的观察方法、藻细胞受真菌感染率的测定方法、表面活性剂组合物的用量计算方法、称量和加入方法、真菌感染控制效果的判定方法均与实施例7相同。
培养池面积、藻液深度、表面活性剂组合物浓度和用量，处理后继续培养72小时后真菌感染情况如表15所示。
表15表面活性剂组合物控制红球藻开放池培养中真菌P.sedebokerense感染的效果
Figure BDA0001792680180000182
Figure BDA0001792680180000191
处理效果：处理72小时后，多次取藻液观察，均未看到真菌感染红球藻的情况。继续培养6-9天，红球藻藻液经历了绿色-黄绿色-褐色-棕红色-红色的变化，藻细胞成为富含虾青素的红色厚壁孢子。
实施例9：洗涤剂控制红球藻开放池培养中的真菌感染
洗涤剂控制红球藻开放池培养中的真菌感染，每种洗涤剂都采用其可完全控制真菌感染的最低浓度(表13)进行处理。开放池培养红球藻的方法、真菌感染的观察方法、藻细胞受真菌感染率的测定方法、洗涤剂的用量计算方法、称量和加入方法、真菌感染控制效果的判定方法均与实施例7相同。
培养池面积、藻液深度、表面活性剂组合物浓度和用量，处理后继续培养72小时后真菌感染情况如表16所示。
表16洗涤剂控制红球藻开放池培养中的真菌P.sedebokerense感染
Figure BDA0001792680180000192
处理效果：处理72小时后，多次取藻液观察，均未看到真菌感染红球藻的情况。继续培养6-9天，红球藻藻液经历了绿色-黄绿色-褐色-棕红色-红色的变化，藻细胞成为富含虾青素的红色厚壁孢子。

Claims (8)

1.一种利用表面活性剂防治红球藻培养中真菌感染的方法，其特征在于，在红球藻培养液中加入表面活性剂，或含有表面活性剂的洗涤剂用于防治真菌感染，所述的表面活性剂是十二烷基苯磺酸、十二烷基苯磺酸钠、椰油酸二乙醇胺、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的利用表面活性剂防治红球藻培养中真菌感染的方法，其特征在于，所述的表面活性剂或含有表面活性剂的洗涤剂，在培养接种后的第2-3天加入，用以预防真菌感染的发生；或在培养过程中显微镜镜检发现真菌感染时加入，用以控制真菌感染。
3.根据权利要求1所述的利用表面活性剂防治红球藻培养中真菌感染的方法，其特征在于，所述表面活性剂为十二烷基苯磺酸、十二烷基苯磺酸钠、椰油酸二乙醇胺、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的任意一种，使用浓度分别如下：
Figure FDA0001792680170000011
4.根据权利要求1所述的利用表面活性剂防治红球藻培养中真菌感染的方法，其特征在于，所述的表面活性剂为十二烷基苯磺酸或十二烷基苯磺酸钠、椰油酸二乙醇胺、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚四种的组合，质量百分比如下：
Figure FDA0001792680170000012
Figure FDA0001792680170000021
5.根据权利要求4所述的利用表面活性剂防治红球藻培养中真菌感染的方法，其特征在于，组合物1-17的使用浓度分别如下：
Figure FDA0001792680170000022
6.根据权利要求1所述的利用表面活性剂防治红球藻培养中真菌感染的方法，其特征在于，所述的含有表面活性剂的洗涤剂包括洗洁精或洗衣液，使用浓度如下：
洗涤剂 浓度范围mg/L
洗洁精 10-20
洗衣液 7.5-15。
7.根据权利要求1所述的利用表面活性剂防治红球藻培养中真菌感染的方法，其特征在于：所述的红球藻培养包括开放式反应器培养或封闭式反应器培养，或开放式反应器培养和封闭式反应器培养的组合培养方式。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的利用表面活性剂防治红球藻培养中真菌感染的方法，其特征在于，所述的真菌为类节壶菌。
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