CN110878348A - 一种具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物及其检测方法和应用，所述的生物标志物为lnc RNA‑B和lnc RNA‑C，lnc RNA‑B和lnc RNA‑C的表达量与均与心衰发展程度具有相关性，lncRNA‑B和‑C的表达量定量来诊断受试者是否患有心衰，或者是否具有更高的发生心衰的风险。所述的lncRNA‑B的序列为SEQ NO 1，所述的lncRNA‑C的序列为SEQ NO 2。所述的lnc RNA‑B和lnc RNA‑C均分离自外周静脉血血浆；所述的lnc RNA生物标志物能用于制备心衰诊断试剂或生物芯片；采用实时荧光定量PCR分别检测lnc RNA‑B和lnc RNA‑C的表达水平。本发明中的心衰生物标志物弥补一些其他生物标志物的不适用性，为诊断心力衰竭提供帮助以及反映心衰的不同进程，比其他现有的心力衰竭生物标志物更加灵敏、准确，具有重大的理论意义及潜在的使用价值。

Description

一种具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物及其检测方 法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物及其检测方法和应用，具有较高特异性的心衰生物标志物作为一种新型生物指标评估心力衰竭。

背景技术

心力衰竭是一种复杂的临床症候群，是各种心脏病的严重阶段，也是心血管疾病最主要的死亡原因。2003年我国的心衰患病率0.9％，有超过400万的心衰患者，由于我国高血压、冠心病、糖尿病等发病率呈上升趋势，加之人口老龄化严重，心力衰竭患病率继续上升难以避免，心力衰竭患者五年存活率和恶性肿瘤相仿。心力衰竭患者早期表现为乏力、胸闷、憋气等，随着疾病的发展，很多患者会出现气短、呼吸困难、夜间不能平卧、端坐呼吸等严重症状。心力衰竭一旦确诊，对于患者和家庭都会带来很大的经济负担和精神压力，并造成社会大量资源的消耗。目前根据症状和物理检查来确诊心力衰竭经常不是很敏感，难以精确进行诊断，虽然超声检查可以作为金标准，但它耗时、花费较高，有时受某些条件的限制。

近年来的研究表明某些心力衰竭相关生物学生物标志物在心力衰竭的诊断、预后诊断和指导治疗中都起着非常重要的作用。其中脑肽素(BNP)、N端脑钠肽前体(NT-proBNP)在临床上应用最为广泛，大量的研究表明心力衰竭时血浆BNP和NT-proBNP水平明显升高，并与心力衰竭症状的严重程度呈一致性，但其并不是特异性的心力衰竭诊断指标，血浆中BNP和NT-proBNP水平不仅存在生物个体间差异，并且在某些肺部、神经内分泌疾病以及器官衰竭(肝、肾衰竭)和某些急症(败血症、烧伤)等情况下会升高(Ibrahim N1,JanuzziJL.Expert Rev Cardiovasc Ther.2015；13(9):1017-30.)，因此应用BNP和NT-proBNP对心力衰竭进行诊断时需要结合患者的病史、症状、体征和心脏超声等进行综合判断。

长链非编码RNA(lncRNA)，一类新的非编码RNA，定义为长度超过200nt且缺乏蛋白质编码能力的转录本。LncRNAs在染色质修饰，印记，细胞分化和增殖，转录，翻译和其他重要的生物过程中起着至关重要的作用。尽管如今对lncRNA在循环中的起源和功能了解甚少，但它们在心血管疾病患者和健康人的血液中敏感而稳定的差异表达使其成为潜在的生物标志物(Busch A,Eken SM,Maegdefessel L.Prospective and therapeutic screeningvalue of non-coding RNA as biomarkers in cardiovascular disease.Ann TranslMed.2016；4:236–46.)。现有大量的研究表明，lncRNA与心力衰竭的严重程度呈显著一致性，相比于之前的蛋白生物标志物总体上具有更加稳定、更易在血液样品中检测等优势(Lina Xuan,Lihua Sun,Ying Zhang,Yuechao Huang,Yan Hou,Qingqi Li,Ying Guo,Bingbing Feng,Lina Cui,Xiaoxue Wang,Zhiguo Wang,Ye Tian,,Bo Yu,Shu Wang,Chaoqian Xu,Mingyu Zhang,Zhimin Du,Yanjie Lu,and Bao Feng Yang,J Cell MolMed.2017Sep；21(9):1803–1814.)，能够及时检测迅速反映心脏功能变化，能够预测心衰患者未来的死亡(KumarswamyR1,Bauters C,Volkmann I,Maury F,Fetisch J,Holzmann A,Lemesle G,de Groote P,Pinet F,ThumT.Circ Res.2014May 9；114(10):1569-75.)。很多miRNA在血浆中普遍存在，miRNA的主要是白细胞来源。虽然各种研究结果表明联合多种miRNA能够改善预测效能，但是不同研究者结果的重复性较差，由于miRNA参与了绝大多数基因的表达调节，心衰时观察到的不同miRNA表达谱仅部分反映了心衰相关的分子病理，特异性相对较差。

发明内容

本发明的目的在于提供新的具有较高特异性的心衰生物标志物，弥补一些其他生物标志物的不适用性，为诊断心力衰竭提供帮助以及反映心衰的不同进程，与其他现有的心力衰竭生物标志物为临床治疗、预后等提供有力依据，使得诊断、治疗更加及时、准确。

本发明通过下列方案实现：取外周血并提取血浆中外泌体，再对提取物检测验证是否为外泌体并裂解外泌体提取RNA，测定lncRNA表达量并筛选高差异表达的lncRNA

一种具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物，所述的lnc RNA生物标志物为lnc RNA-B和lnc RNA-C，lnc RNA-B和lnc RNA-C的表达量与均与心衰发展程度具有相关性，lncRNA-B和-C的表达量定量来诊断受试者是否患有心衰，或者是否具有更高的发生心衰的风险。

进一步地，所述的lncRNA-B的序列为SEQ NO 1:CUCUCUCACGUGCAGGCAACUUCCUAGGCAGGAAACGGACACAAGGGAGCUACAUCUGCGGCCCUUGGAUAAGCAUCCACUUCCCGACCCAGCACACGCCCCUCGGCAGGGGGGUGAGGUGGGGCACAACAUAGAGAAGCCAGCUCUAUGAAGCCAUG，其在诊断心衰疾病早期、进程及预后的效果明显。

进一步地，所述的lncRNA-C的序列为SEQ NO 2：CAGAUACCAACCUCCCAAGUCAGUGUGAGGCUAUCAAAGACUUCCGUAGGUUUGCGUCUGGCUAACCUACCAUCGGAAAG。

进一步地，所述的lnc RNA-B和lnc RNA-C均分离自外周静脉血血浆。

进一步地，所述的lnc RNA生物标志物能用于制备心衰诊断试剂或生物芯片。

进一步地，采用实时荧光定量PCR分别检测lnc RNA-B和lnc RNA-C的表达水平，检测lnc RNA-B的表达水平所用的上游引物为：F16192：CTTGTCACCAGTCAAGTCTCTC；下游引物为：R16192：TGTCTCCCAAATTCTCCTTATCC；

检测lnc RNA-C的表达水平所用的上游引物为：F17041：CACGGGTGGTTTTGACTGAC；下游引物为：R17041：CTACAGAAGATGCCGGAGGG。

本发明的有益效果为：本发明中检测了具有较高特异性的心衰生物标志物lncRNA-B和lnc RNA-C，弥补一些其他生物标志物的不适用性，为诊断心力衰竭提供帮助以及反映心衰的不同进程，比其他现有的心力衰竭生物标志物更加灵敏、准确，具有重大的理论意义及潜在的使用价值，能用于制备心衰诊断试剂或生物芯片。

附图说明

图1为小鼠lncRNA表达差异在TAC模型不同时期的变化图。

图2为心肌肥大与心脏衰竭患者外周血lncRNA表达差异图。

图3为LncRNA-B的诊断ROC曲线。

图4为LncRNA-C的诊断ROC曲线。

具体实施方式：

为了加深对本发明的理解，下面结合附图对本发明的实施例做详细的说明。

须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

实施例一

采用荧光定量PCR方法，检测雄性C57BL心衰小鼠模型中检测lncRBA-B与lncRNA-C的含量，具体步骤如下：

步骤一，提取lncRBA-B与lncRNA-C

1.皮下注射异丙肾上腺素(40mg/kg/天)持续1周可诱发急性HF小鼠模型。

2.通过眶静脉收集外周血全血。

3.使用全血RNA提取试剂盒，按照说明方法步骤用苯酚提取方法提取全血样品的总RNA。通过将EDTA-血液在1600g下离心10分钟获得血浆，并将上清液在4℃下以12000g离心5分钟。将干净血浆通过0.22μm过滤器过滤，然后与2mL TRIZOL试剂和0.4mL氯仿混合。将混合物在4℃下于12000g离心5分钟，然后将水层转移至新试管中，加入1.5mL 70％乙醇，然后根据制造商的建议应用于RNeasy微型色谱柱。DNase消化后，总RNA用20μL不含RNase的水洗脱。

步骤二，荧光定量PCR方法测定lncRBA-B与lncRNA-C的含量

1.在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl，轻轻混匀、离心；

2.70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；

3.取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2μl；上游引物(10pM)2μl；下游引物(10pM)2μl；dNTP(2mM)4μl；10×PCR buffer 5μl；Taq酶(2u/μl)1μl。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min；

4.加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃水浴中孵育50min；

5.于70℃加热15min以终止反应；

6.将管插入冰中，加入RNase H 1μl，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。

7.取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2μl；上游引物(10pM)2μl；下游引物(10pM)2μl；dNTP(2mM)4μl；10×PCR buffer5μl；Taq酶(2u/μl)1μl；对应引物序列如下：

8.加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心；设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参(如G3PD)的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；

10.电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；

11.密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

荧光定量PCR结果如如图1所示，表明，LncRNA-B与lncRNA-C为人鼠同源lncRNA，LncRNA-B在心力衰竭小鼠外周血中的表达明显上调，lncRNA-C表达在心肌肥大及心梗中明显不同。*p<0.01vs正常组和疾病对照组。

通过实验，检测到lncRNA-B的序列为SEQ NO 1，其在诊断心衰疾病早期、进程及预后的效果明显:CUCUCUCACGUGCAGGCAACUUCCUAGGCAGGAAACGGACACAAGGGAGCUACAUCUGCGGCCCUUGGAUAAGCAUCCACUUCCCGACCCAGCACACGCCCCUCGGCAGGGGGGUGAGGUGGGGCACAACAUAGAGAAGCCAGCUCUAUGAAGCCAUG；

检测到lncRNA-C的序列为SEQ NO 2:CAGAUACCAACCUCCCAAGUCAGUGUGAGGCUAUCAAAGACUUCCGUAGGUUUGCGUCUGGCUAACCUACCAUCGGAAAG。

实施例二

在患有心力衰竭的冠心病患者中检测lncRBA-B与lncRNA-C的含量

具体步骤如下：

步骤一，血清提取总RNA

1.血清10000×g离心30min，取上清用低温超高速离心机L-80XP110000×g离心70min得到沉淀,加入PBS重悬混匀后重复超高速离心一次沉淀即为外泌体,以100μl PBS重悬沉淀。

2.取20-40μl外泌体重悬液滴于电镜专用铜网上,20μl 2％磷钨酸负染10min置于透射电子显微镜H-7650下观察外泌体形态并拍照。

3.配合超高速离心法使用取750μl TRIzol-LS裂解250μl外泌体悬液,然后用氯仿使裂解液相分离,取上层液体加入异丙醇沉淀其中的RNA。

4.4℃，离心12000g，10分钟。弃上清，加冰预冷的75％乙醇(用DEPC水配)1ml。

5.4℃离心7500g，5分钟。弃上清，空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)，溶于DEPC水中至20μl(可在55-60℃水中，<10分钟助溶)，紫外分光光度计测总RNA浓度。

步骤二，采取荧光定量PCR方法，检测并分析相关lncRNA的含量，具体步骤同实施例一中的步骤二中的荧光定量PCR操作。

图2中，荧光定量PCR检测结果表明，在患病人群中lncRNA-B与lncRNA-C表达明显上升，并且其表达量与心衰发展程度具有相关性。因此我们可以通过将lncRNA-B和-C的表达量定量来诊断受试者是否患有心衰，或者是否具有更高的发生心衰的风险。

从图3和图4可见lncRBA-B与lncRNA-C的预测准确率达到75％以上。

通过实验，检测到lncRNA-B的序列为SEQ NO 1，其在诊断心衰疾病早期、进程及预后的效果明显:CUCUCUCACGUGCAGGCAACUUCCUAGGCAGGAAACGGACACAAGGGAGCUACAUCUGCGGCCCUUGGAUAAGCAUCCACUUCCCGACCCAGCACACGCCCCUCGGCAGGGGGGUGAGGUGGGGCACAACAUAGAGAAGCCAGCUCUAUGAAGCCAUG；

检测到lncRNA-C的序列为SEQ NO 2:CAGAUACCAACCUCCCAAGUCAGUGUGAGGCUAUCAAAGACUUCCGUAGGUUUGCGUCUGGCUAACCUACCAUCGGAAAG。

由实施例1和实施例2可以看出在患有心衰的小鼠和患有心衰的人体中，生物标志物lncRBA-B与lncRNA-C均lncRNA-B与lncRNA-C表达明显上升，并且其表达量与心衰发展程度具有相关性。因此，可以将生物标志物lncRBA-B与lncRNA-C用于制备检测心衰的试剂盒或者诊断试剂，或生物芯片。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征等同替换所组成的技术方案。本发明的未尽事宜，属于本领域技术人员的公知常识。

序列表

<110> 南京启医科技有限公司

<120> 一种具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物及其检测方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 158

<212> RNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

cucucucacg ugcaggcaac uuccuaggca ggaaacggac acaagggagc uacaucugcg 60

gcccuuggau aagcauccac uucccgaccc agcacacgcc ccucggcagg ggggugaggu 120

ggggcacaac auagagaagc cagcucuaug aagccaug 158

<210> 2

<211> 80

<212> RNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

cagauaccaa ccucccaagu cagugugagg cuaucaaaga cuuccguagg uuugcgucug 60

gcuaaccuac caucggaaag 80

<210> 3

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttgtcacca gtcaagtctc tc 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtctcccaa attctcctta tcc 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacgggtggt tttgactgac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctacagaaga tgccggaggg 20

Claims (6)

1.一种具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物lnc RNA为lnc RNA-B和lnc RNA-C，lnc RNA-B和lnc RNA-C的表达量与均与心衰发展程度具有相关性，lncRNA-B和-C的表达量定量来诊断受试者是否患有心衰，或者是否具有更高的发生心衰的风险。

2.根据权利要求1所述的具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物，其特征在于，所述的lncRNA-B的序列为SEQ NO 1:CUCUCUCACGUGCAGGCAACUUCCUAGGCAGGAAACGGACACAAGGGAGCUACAUCUGCGGCCCUUGGAUAAGCAUCCACUUCCCGACCCAGCACACGCCCCUCGGCAGGGGGGUGAGGUGGGGCACAACAUAGAGAAGCCAGCUCUAUGAAGCCAUG，其在诊断心衰疾病早期、进程及预后的效果明显。

3.根据权利要求1所述的具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物，其特征在于，所述的lncRNA-C的序列为SEQ NO 2：CAGAUACCAACCUCCCAAGUCAGUGUGAGGCUAUCAAAGACUUCCGUAGGUUUGCGUCUGGCUAACCUACCAUCGGAAAG。

4.根据权利要求1所述的具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物，其特征在于，所述的lnc RNA-B和lnc RNA-C均分离自外周静脉血血浆。

5.根据权利要求1所述的具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物用于制备心衰诊断试剂或生物芯片。

6.一种如权利要求1所述的具有较高特异性的心衰lnc RNA生物标志物的检测方法，其特征在于，采用实时荧光定量PCR方法分别检测lnc RNA-B和lnc RNA-C的表达水平，检测lnc RNA-B的表达水平所用的上游引物为：F16192：CTTGTCACCAGTCAAGTCTCTC；下游引物为：R16192：TGTCTCCCAAATTCTCCTTATCC；

检测lnc RNA-C的表达水平所用的上游引物为：F17041：CACGGGTGGTTTTGACTGAC；下游引物为：R17041：CTACAGAAGATGCCGGAGGG。

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