CN110873762A - Hplc法测定西酞普兰中间体及其有关物质的方法 - Google Patents

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贾少华
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Abstract

本发明属分析化学领域，本发明公开了一种HPLC法分离检测草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的方法，该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以磷酸缓冲盐溶液‑有机溶剂流动相体系，采用梯度洗脱的方法分离检测草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质，从而有效控制草酸艾司西酞普兰中间体化学纯度，最终实现草酸艾司西酞普兰的质量可控。本发明方法专属性强，灵敏度高，操作简便。

Description

HPLC法测定西酞普兰中间体及其有关物质的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及液相色谱法分离测定草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的方法。
背景技术
草酸艾司西酞普兰有增进中枢神经系统5-羟色胺（5-HT）能的作用，抑制5-羟色胺的再摄取，临床主要用于抑郁症和抗焦虑的治疗，具有抗焦虑抗抑郁作用起效快，不良反应少，患者服药的依从性好的特点。草酸艾司西酞普兰中间体的化学名为(-)-4-[4-二甲氨基-1-(4-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟甲基苯腈D-(+)-二对甲苯甲酰酒石酸盐(2:1)，分子式C60H64F2N4O12。其化学结构式为：
Figure 488793DEST_PATH_IMAGE001
。
对草酸艾司西酞普兰中间体化学纯度的有效控制，可减少草酸艾司西酞普兰合成中副反应的发生和杂质的生成，从而提高产物收率和纯度。草酸艾司西酞普兰中间体主要控制的有关物质有9个，化学名和结构见下表：
有关物质 名称 结构式
有关物质1 5-氰基苯酞
有关物质2 4-（4-氟苯甲酰基）-3-羟甲基苯甲氰
Figure 194581DEST_PATH_IMAGE002
有关物质3 5-（氨基甲酰基）苯酞
有关物质4 4-氨基甲酰基-2-羟甲基苯甲酸
有关物质5 （Z）-4-（4-（二甲氨基）-1-（4-氟苯基）丁-1-烯-1-基）-3-羟甲基苯甲氰
有关物质6 4-（双（4-氟苯基）（羟基）甲基）-3-羟甲基苯甲氰
有关物质7 4-（1，7-双（二甲氨基）-4-羟庚烷-4-基）-3-羟甲基苯甲氰
有关物质8 4-（4-（二甲氨基）-1-（4-氟苯基）-1-羟丁基）-3-羟甲基苯甲酰胺
有关物质9 1-（3-（二甲氨基）丙基）-1-羟基-1，3二氢异苯并呋喃-5-腈
Figure 529748DEST_PATH_IMAGE003
发明内容
本发明的目的在于提供一种分析草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的方法。从而实现草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的分离和测定，最终保证草酸艾司西酞普兰中间体的质量可控。
本发明所述的用液相色谱法分析草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的方法，是采
用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，缓冲盐溶液为流动相A，有机相为流动相B，采用梯度洗脱的方法分离检测草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质。
本发明所采用的色谱柱品牌为Kromasil、Apollo或YMC等。
上述所说的有机相选自以下溶剂中的一种或几种：甲醇、乙腈、丙醇，优选甲醇或乙腈。
上述所说的缓冲盐溶液中包含的盐选自以下无机盐中的一种：磷酸、碳酸、甲酸、乙酸，优选磷酸。
其中缓冲盐溶液中包含的磷酸盐浓度为10～50mM，优选浓度为25mM。
本发明所述的分离测定方法，可按照以下方法实现：
1）分别取草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质（除有关物质4）适量，用甲醇适量溶解。取有关物质4适量，加少量DMSO助溶，加甲醇适量溶解。分别配成每1mL含草酸艾司西酞普兰中间体2~10mg的样品贮备液和含各有关物质1~5mg的贮备液。分别量取草酸艾司西酞普兰中间体样品贮备液和各有关物质贮备液适量，用25mM磷酸盐缓冲溶液-甲醇（90：10）稀释，配制成每1mL含草酸艾司西酞普兰中间体0.2~1.0mg，含各有关物质1~10μg的样品溶液；
2）设置流动相流速为1.0~1.5mL/min，检测波长为230~250nm，柱温箱温度为25~30℃；
3）取1）的样品溶液10~20μL，注入液相色谱仪，完成草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的分离测定；其中：
高效液相色谱仪的型号，无特别要求，本发明采用的色谱仪为岛津高效液相色谱仪：LC-20AT泵，SPD-M20AC检测器，SIL-20AC自动进样器，CBM-20A控制器，CTO-10AS柱温箱，LCsolution工作站；
色谱柱：YMC-Pack-ODS-AQ（150×4.6 mm，S-3μm，12nm）；
流动相：A相：25mM磷酸盐缓冲溶液；B相：甲醇，洗脱梯度如下：
T（min） 0.01 40 50 55 75 75.01 85
B（%） 10 45 55 65 65 10 10
流速：1.0mL/min；
检测波长：240nm；
柱温：30℃；
托盘温度：4℃；
进样体积：20μL；
本发明能够有效的分离草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质，解决了草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的分离测定问题，从而确保了草酸艾司西酞普兰中间体的质量可控。
附图说明
图1为实施例1时的草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质HPLC图；
图2为实施例1时的空白溶剂HPLC图；
图3为实施例1时的草酸艾司西酞普兰中间体HPLC图；
图4为实施例2时的草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质HPLC图；
图5为实施例3时的草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质HPLC图。
具体实施方式：
以下实施例用于进一步理解本发明，但不限于本实施的范围。以下通过实例形式，对本发明涉及的草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质检测方法作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
仪器与条件
岛津高效液相色谱仪：LC-20AT泵，SPD-20MAC检测器，SIL-20AC自动进样器，CBM-20A控制器，CTO-10AS柱温箱，LC solution工作站；
色谱柱：YMC-Pack-ODS-AQ （150×4.6 mm，S-3μm，12nm）；
流动相：A相：25mM磷酸盐缓冲溶液；B相：甲醇；
洗脱梯度：
T（min） 0.01 40 50 55 75 75.01 85
B（%） 10 45 55 65 65 10 10
流速：1.0mL/min；
检测波长：240nm；
柱温：30℃；
进样体积：20μL；
实验步骤
分别取草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质适量，用磷酸盐缓冲液-甲醇（90：10）适量溶解，配制成每1mL含草酸艾司西酞普兰中间体0.5mg，含各有关物质5μg的样品溶液。按上述条件，将溶剂和样品溶液依次注入高效液相色谱，记录色谱图。结果见附图1~3，图1为草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质色谱图，图中保留时间35.121min和47.721min的色谱峰为草酸艾司西酞普兰中间体，其余为各有关物质色谱峰；图2为空白溶剂HPLC图，图3为草酸艾司西酞普兰中间体HPLC图。
实施例2
仪器与条件
岛津高效液相色谱仪：LC-20AT泵，SPD-20MAC检测器，SIL-20AC自动进样器，CBM-20A控制器，CTO-10AS柱温箱，LC solution工作站；
色谱柱：YMC-Pack-ODS-AQ （150×4.6 mm，S-3μm，12nm）；
流动相：A相：25mM磷酸盐缓冲溶液；B相：甲醇；
洗脱梯度：
T（min） 0.01 40 50 55 75 75.01 85
B（%） 10 45 55 65 65 10 10
流速：0.8mL/min；
检测波长：240nm；
柱温：25℃；
进样体积：20μL；
实验步骤
分别取草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质适量，用磷酸盐缓冲液-甲醇（90：10）适量溶解，配制成每1mL含草酸艾司西酞普兰中间体0.5mg，含各有关物质5μg的样品溶液；按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图4，图4为草酸艾司西酞普兰及其有关物质色谱图，图中保留时间36.077min和50.224min的色谱峰为草酸艾司西酞普兰中间体，其余为各有关物质色谱峰。
实施例3
仪器与条件
岛津高效液相色谱仪：LC-20AT泵，SPD-20MAC检测器，SIL-20AC自动进样器，CBM-20A控制器，CTO-10AS柱温箱，LC solution工作站；
色谱柱：C18（Thermo，150×4.6 mm，3μm）；
流动相：A相：25mM磷酸盐缓冲溶液；B相：甲醇；
洗脱梯度：
T（min） 0.01 40 50 55 75 75.01 85
B（%） 10 45 55 65 65 10 10
流速：1.0mL/min；
检测波长：240nm；
柱温：30℃；
进样体积：20μL；
实验步骤
分别取草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质适量，用磷酸盐缓冲液-甲醇（90：10）适量溶解，配制成每1mL含草酸艾司西酞普兰中间体0.5mg，含各有关物质5μg的样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图5，图5为草酸艾司西酞普兰及其有关物质色谱图，图中保留时间33.735和43.504min的色谱峰为草酸艾司西酞普兰中间体，其余为各有关物质色谱峰。
对上述草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的分析方法进行如下验证：
1、专属性实验
取草酸艾司西酞普兰中间体及各有关物质适量，磷酸盐缓冲液-甲醇（90：10）溶解并配制成浓度为5μg/mL溶液用于定位溶液；取草酸艾司西酞普兰中间体及其各有关物质适量，用溶剂溶解样品配制成含草酸艾司西酞普兰中间体0.5mg/mL，各有关物质5μg/ml的溶液作为系统适用性溶液；另取溶剂适量作为空白溶剂，按实施例1的色谱条件进行分离测定，记录色谱图。由图1~图3可知，在此条件下，草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的色谱峰峰形良好，分离度符合要求，且溶剂和样品中其他未知杂质对草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的测定无干扰。
表1 专属性实验结果
Figure 837099DEST_PATH_IMAGE004
2、溶液稳定性
取草酸艾司西酞普兰中间体适量，用初始比例流动相溶解样品配制成含草酸艾司西酞普兰中间体0.5mg/mL的样品溶液。在室温条件下，按实施例1的色谱条件，将样品溶液分别于0、3、6、9、12、15、18小时进样，考察样品定量测定时溶液的稳定性，由结果可见，样品溶液在室温18小时内稳定。
表2 草酸艾司西酞普兰中间体溶液稳定性
Figure 978231DEST_PATH_IMAGE005
3、进样重复性
取草酸艾司西酞普兰中间体适量，用溶剂溶解样品配制成含草酸艾司西酞普兰中间体0.5mg/mL样品的溶液，按实施例1的色谱条件，重复进样6针，考察样品定量测定时的进样重复性。由结果可见，主峰保留时间无明显变化，RSD%值符合要求，进样重复性良好。
表3 草酸艾司西酞普兰中间体进样重复性
Figure 476208DEST_PATH_IMAGE006
4、定量限和检测限
分别取草酸艾司西酞普兰中间体及其各有关物质适量，精密称定，加初始比例流动相溶解样品，配制成一定浓度的贮备液，再分别精密量取贮备液适量，逐级稀释，按实施例1的色谱条件进样考察。采用信噪比法（S/N约为3时，对应的浓度为检测限；S/N约为10时，对应的浓度为定量限），草酸艾司西酞普兰中间体及其各有关物质定量限和检测限数据如下表所示：
表4 草酸艾司西酞普兰中间体及各有关物质定量限和检测限
名称 定量限（ng） 检测限（ng）
有关物质7 1.69 0.51
有关物质4 0.48 0.14
有关物质9 1.32 0.40
有关物质3 0.47 0.14
有关物质1 0.38 0.11
有关物质8 1.06 0.32
中间体 1.44 0.43
有关物质5 0.58 0.17
有关物质2 2.40 0.72
有关物质6 1.59 0.48

Claims (7)

1.一种液相色谱法分离测定草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的方法，其特征在于：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，缓冲盐溶液为流动相A，有机相为流动相B，采用梯度洗脱的方法分离检测草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质。
2.根据权利要求1所述的分离测定方法，色谱柱选自品牌Waters、Thermo、Apollo或YMC等品牌。
3.根据权利要求1所述的分离测定方法，色谱柱优选YMC-Pack-ODS-AQ，规格为150×4.6 mm，S-3μm，12nm。
4.根据权利要求1所述的分离测定方法，所说的有机相选自以下溶剂中的一种或几种：甲醇、乙腈、丙醇，并进一步优选为甲醇或乙腈。
5.根据权利要求1所述的分离测定方法，所说的缓冲盐溶液包含的盐选自以下无机盐：磷酸、碳酸、甲酸、乙酸等中的一种，并进一步优选为磷酸。
6.根据权利要求5所述的分离测定方法，所说的缓冲盐溶液中包含的磷酸盐浓度为10～50mM，优选浓度为25mM。
7.根据权利要求1所述的分离测定方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
1）分别取草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质适量，用磷酸盐缓冲液-甲醇=90：10适量溶解，配制成每1mL含草酸艾司西酞普兰中间体0.2~1.0mg，含各有关物质1~5μg的系统适用性溶液；取草酸艾司西酞普兰中间体适量，配制成每1mL含草酸艾司西酞普兰中间体0.2~1.0mg的供试品溶液；
2）设置流动相流速为1.0~1.5mL/min，检测波长为230~250nm，洗脱梯度为：
T（min） 0.01 40 50 55 75 75.01 85 B（%） 10 45 55 65 65 10 10
柱温箱温度为25~30℃；
3）取1）的样品溶液10~20μL，注入液相色谱仪，完成草酸艾司西酞普兰中间体及其有关物质的分离测定。
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