CN110872314A - 一种不对称硅基取代罗丹明衍生物及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种不对称硅基取代罗丹明衍生物及制备方法和应用，其衍生物结构式如式I所示，其中R为甲基、(S)‑2‑氨基‑4‑甲基戊基或(S)‑3‑氨基‑3‑羧基正丙基。本发明合成的不对称硅基取代罗丹明衍生物有近红外的荧光信号(650‑800nm)，较宽的pH适用范围——酸碱耐受性好(pH＝4.0‑11)。该系列不对称硅基取代罗丹明通过酰胺键的断裂及连接来控制内酯螺环的打开及关闭，从而实现染料分子的荧光调控。在酰胺键的一端连接不同的取代基R，能够与对应的目标蛋白酶特异识别结合，目标蛋白酶特异性地水解肽键使螺环打开，并释放近红外荧光，从而实现实时原位、灵敏快速地检测复杂体系中的蛋白酶。

Description

一种不对称硅基取代罗丹明衍生物及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及有机分子荧光染料及其作为检测平台的蛋白酶识别检测领域。具体涉及一类不对称硅基取代罗丹明衍生物及合成和利用该类荧光分子实现生物体中亮氨酸氨基肽酶、γ-谷氨酰转肽酶的检测。
背景技术
罗丹明是一种氧杂蒽环结构的有机小分子化合物，水溶性好，荧光量子产率高，摩尔吸光系数高。传统罗丹明分子的荧光光谱多位于可见光区，在用于生物组织非侵入式荧光成像时容易受到生物样品的背景荧光干扰。硅取代罗丹明可调控分子荧光发射峰红移至近红外区域，因而具有荧光信号背景干扰低、组织穿透性强、光毒性小，是一个性质优良的生物荧光体系。
在荧光检测分析中，通过待测物与荧光分子的相互作用使荧光分子荧光信号改变可实现待测物的定性检测和定量分析。罗丹明内酯螺环结构中，螺环开关的状态对应罗丹明分子荧光信号开关的特性，已经作为一种快速高效的荧光开关调控机制被广泛运用于探针分子设计中。在生物系统中，蛋白与蛋白酶之间存在高灵敏、高特异性反应。将这类反应机制引入到荧光信号调控中具有较大意义。相关文献报道报道(J.Am.Chem.Soc.2013,135,409-414)Nagano等基于亮氨酸氨肽酶和亮氨酸肽具有特异结合快速水解的机制，设计构建了罗丹明荧光探针体系hydroxymethyl rhodamine(HMR)。该体系具有荧光背景低，信号灵敏度高的优势，但其分子骨架对酸性环境的耐受性差，限制了它的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一类不对称硅基取代罗丹明衍生物及其合成方法和应用，衍生物具有近红外的荧光性质和较宽的pH使用范围。特定的有着识别能力的R基，使得该系列染料能在细胞中快速准确的识别检测亮氨酸氨基肽酶、γ-谷氨酰转肽酶。
实现本发明目的的具体技术方案是：
一类不对称硅基取代罗丹明衍生物，所述衍生物具有式I结构：
Figure BDA0002282582750000011
其中，R为甲基、(S)-2-氨基-4-甲基戊基或(S)-3-氨基-3-羧基正丙基。
所述不对称硅基取代罗丹明衍生物具体形式为：
Figure BDA0002282582750000021
一种所述的不对称硅基取代罗丹明衍生物的合成方法，该方法包括以下具体步骤：步骤1：前驱体SiRB2的合成
合成过程如下式所示：
Figure BDA0002282582750000022
具体包括以下步骤：
1.1：烧瓶中充满氩气，加入6-溴-1-乙基吲哚啉和乙醚，保持0℃，加入正丁基锂，0℃反应2小时；混合物导入二氯二甲基硅烷的乙醚溶液中继续反应，缓慢升至室温，反应2小时；提纯得到6-(氯二甲基甲硅烷基)-1-乙基二氢吲哚；其中，所述6-溴-1-乙基吲哚啉、正丁基锂和二氯二甲基硅烷摩尔量比为1∶1∶5；
1.2：烧瓶中充满氩气，加入N，N-二烯丙基-3-溴苯胺和乙醚，保持0℃，加入正丁基锂，0℃反应2小时；所得液体混合物导入6-(氯二甲基甲硅烷基)-1-乙基二氢吲哚的乙醚溶液中，缓慢升温至室温反应8小时；淬灭反应，分离纯化得到DASE-2；其中所述N，N-二烯丙基-3-溴苯胺、正丁基锂和6-(氯二甲基甲硅烷基)-1-乙基二氢吲哚摩尔量比为1∶1.0～1.1∶1；
1.3：密闭管中加入DASE-2、2-甲酰基苯甲酸和溴化铜,140℃反应8小时；分离纯化得到Allyl-SiRB2；其中DASE-2、2-甲酰基苯甲酸和溴化铜摩尔量比为1∶5∶0.1；
1.4：烧瓶充满氩气，加入Pd(PPh3)4、1,3-二甲基巴比妥酸和Allyl-SiRB2的1,2-二氯乙烷溶液，35℃反应12小时；分离纯化得到SiRB2；其中，Pd(PPh3)4、1,3-二甲基巴比妥酸和Allyl-SiRB2摩尔量比为0.03∶1∶1；
步骤2：不对称硅基取代罗丹明衍生物的合成
以前躯体SiRB2为起始原料，R＝甲基、(S)-2-氨基-4-甲基戊基或S)-3-氨基-3-羧基正丙基时，合成过程如下式所示：
Figure BDA0002282582750000031
2.1：合成SiRB2-Ac；烧瓶中加入化合物SiRB2、二氯甲烷、吡啶和乙酸，室温反应24h；分离纯化后得白色固体SiRB2-Ac；其中SiRB2、吡啶和乙酸摩尔量比为1∶12∶3；
2.2：合成SiRB2-Leu；烧瓶充满氩气，加入化合物SiRB2、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺和四氢呋喃；0℃反应10分钟，加入BOC-L-亮氨酸，室温反应8小时；再加入等体积比分析纯二氯甲烷和三氟乙酸室温反应2小时；分离纯化，得到浅白色固体SiRB2-Leu；其中，SiRB2、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺和BOC-L-亮氨酸摩尔量比为1∶4∶4∶4；
2.3：合成SiRB2-Glu；烧瓶充满氩气，加入化合物SiRB2、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺和四氢呋喃；0℃反应10分钟，加入Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯，室温反应8小时；再加入等体积比二氯甲烷和三氟乙酸，室温反应2小时；分离纯化，得到浅白色固体SiRB2-Glu；其中SiRB2、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺和Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯摩尔量比为1∶4∶4∶4。
一种所述的不对称硅基取代罗丹明衍生物在检测亮氨酸氨基肽酶及γ-谷氨酰转肽酶的应用。
本发明的有益效果：衍生物具有近红外的荧光性质和较宽的pH使用范围。特定的有着识别能力的R基，使得该系列染料能在细胞中快速准确的识别检测亮氨酸氨基肽酶、γ-谷氨酰转肽酶。
附图说明
图1为SiRB2和SiRB2-Ac的紫外可见吸光图谱、荧光发射光谱及其在不同pH环境下的光谱数据图；
图2为不对称硅基罗丹明SiRB2-Leu的酶促反应数据图；
图3为不对称硅基罗丹明SiRB2-Glu的酶促反应数据图；
图4为SiRB2-Leu和SiRB2-Glu对检测底物选择性的测定图。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明中的不对称硅取代罗丹明的合成方法、采用该方法所合成的具有全新结构的硅基罗丹明衍生物进一步详细说明。
实施例1
Figure BDA0002282582750000041
100mL烧瓶充满氩气，加入6-溴-1-乙基吲哚啉(2.712g，12mmol)和乙醚(10mL)。0℃加入正丁基锂(1.6M/正己烷，7.9mL 12mmol)。0℃反应2小时，即得高活性反应锂试剂。
实施例2
Figure BDA0002282582750000042
将实施例1中，所得液体混合物导入到0℃的二氯二甲基硅烷(7.3ml 60.0mmol)的乙醚溶液(10mL)中继续反应。缓慢升温至室温，反应2小时。减压蒸馏除去溶剂乙醚和多余的二氯二甲基硅烷直接得到粗品6-(氯二甲基甲硅烷基)-1-乙基二氢吲哚。
实施例3
Figure BDA0002282582750000043
50mL充满氩气烧瓶，加入N，N-二烯丙基-3-溴苯胺(1.512g，6.0mmol)和乙醚(10mL)。0℃加入正丁基锂(1.6M/正己烷，4.0mL 6.4mmol)。0℃下反应2小时，即得高活性反应锂试剂。
实施例4
Figure BDA0002282582750000044
将实施例3中所得液体混合物导入到0℃,6-(氯二甲基甲硅烷基)-1-乙基二氢吲哚(6mmol)的乙醚溶液(10mL)中反应。缓慢升温至室温，反应8小时。用30mL的水淬灭反应，后使用柱色谱分离纯化得到DASE-2(1.116g 52％)。化合物DASE-2核磁:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.21(dd,J＝8.1,7.3Hz,1H),7.10(d,J＝7.1Hz,1H),6.92(d,J＝2.6Hz,1H),6.87(dd,J＝7.0,3.7Hz,2H),6.73(dd,J＝8.0,2.2Hz,1H),6.67(s,1H),5.92-5.80(m,2H),5.21-5.13(m,4H),3.92(d,J＝5.0Hz,4H),3.34(t,J＝8.2Hz,2H),3.15(q,J＝7.2Hz,2H),2.97(t,J＝8.2Hz,2H),1.20(t,J＝7.2Hz,3H),0.51(s,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ151.8,147.9,139.1,136.9,134.3,131.7,128.5,124.0,123.9,122.3,118.2,116.1,113.3,112.3,52.9,52.2,43.2,28.6,12.1,-2.1.MS(ESI)calcd.for C24H32N2Si[M+H]+:377.2,found:377.2。
实施例5
Figure BDA0002282582750000051
在15mL可密闭管中加入DASE-2(1mmol，1.0eq)2-甲酰基苯甲酸(5mmol，5.0eq)和溴化铜(0.mmol，0.1eq)。密封反应管，140℃加热反应8小时。冷却至室温，使用柱色谱分离纯化得到产物Allyl-SiRB2。化合物Allyl-SiRB2核磁：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝7.5Hz,1H),7.61(t,J＝7.3Hz,1H),7.52(t,J＝7.4Hz,1H),7.26(d,J＝7.4Hz,2H),6.94(d,J＝1.8Hz,1H),6.74(d,J＝8.9Hz,1H),6.68(s,1H),6.63(s,1H),6.52(dd,J＝8.8,2.1Hz,1H),5.90-5.77(m,2H),5.18(d,J＝5.6Hz,2H),5.14(s,2H),3.92(d,J＝4.6Hz,4H),3.31(t,J＝8.2Hz,2H),3.20(q,J＝7.1Hz,2H),2.80(t,J＝7.6Hz,2H),1.20(t,J＝7.2Hz,3H),0.58(s,3H),0.56(s,3H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ170.9,155.1,151.3,147.4,136.4,134.9,133.7,133.7,132.3,128.5,128.17,126.7,125.6,124.4,123.6,116.6,116.5,116.3,113.4,106.0,92.1,52.8,51.7,42.7,28.4,12.0,0.2,-1.2.MS(ESI)calcd.forC32H34N2O4Si[M+H]+:507.3,found:507.4。
实施例6
Figure BDA0002282582750000052
50mL充满氩气烧瓶，加入Pd(PPh3)4(35.0mg,0.03mmol)、1,3-二甲基巴比妥酸(160mg,1.0mmol)和1,2-二氯乙烷溶解的化合物Allyl-SiRB2，35℃反应12小时。结束反应，使用碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液洗涤有机相。使用柱色谱分离纯化得到产物SiRB2。化合物SiRB2核磁：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝7.5Hz,1H),7.60(t,J＝7.4Hz,1H),7.51(t,J＝7.4Hz,1H),7.23(d,J＝7.6Hz,1H),6.94(d,J＝2.2Hz,1H),6.73(d,J＝8.6Hz,1H),6.66(s,2H),6.51(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),3.75(s,2H),3.31(t,J＝8.3Hz,2H),3.20(q,J＝7.2Hz,2H),2.80(t,J＝9.6Hz,2H),1.20(t,J＝7.2Hz,3H),0.59(s,3H),0.56(s,3H)；13CNMR(75MHz,CDCl3)δ171.0,155.3,151.5,145.6,136.9,134.3,133.9,133.0,132.5,128.6,128.3,126.2,125.6,124.2,123.5,119.4,116.3,110.2,91.7,51.7,42.7,28.4,12.0,0.1,-1.0.HRMS(ESI)calcd.for C26H26N2O4Si[M+H]+:427.1836,found:427.1822。
实施例7
Figure BDA0002282582750000061
50mL烧瓶，加入化合物SiRB2(43mg，0.1mmol)、二氯甲烷(5mL)和吡啶(100.0uL)。缓慢加入27uL的乙酸(30mg,0.3mmol)，室温下反应24h。使用柱色谱分离可得到白色固体SiRB2-Ac(30mg，64％)。SiRB2-Ac核磁：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.99-7.96(m,1H),7.91(d,J＝2.4Hz,1H),7.86(s,1H),7.64-7.51(m,2H),7.31-7.25(m,1H),7.21(d,J＝7.6Hz,1H),6.86(d,J＝8.7Hz,1H),6.70(s,1H),6.66(s,1H),3.34(t,J＝8.3Hz,2H),3.22(q,J＝7.2Hz,2H),2.85-2.80(m,2H),2.18(s,3H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H),0.62(s,3H),0.52(s,3H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ171.3,168.7,155.3,151.5,139.9,137.5,136.6,134.3,134.0,132.7,132.21,128.8,127.5,125.7,125.6,124.4,124.08,123.4,120.9,110.2,91.3,51.6,42.6,28.34,24.5,12.0,-0.1,-0.9.HRMS(ESI)calcd.for C28H28N2O4Si[M+H]+:469.1942,found:.469.1921。
实施例8
Figure BDA0002282582750000062
50ml充满氩气烧瓶，加入化合物SiRB2(43mg，0.1mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(152mg，0.4mmol)、N,N-二异丙基乙胺(66uL，0.4mmol)和四氢呋喃(4mL)，0℃反应10分钟。缓慢加入溶解在0.5mL四氢呋喃中的BOC-L-亮氨酸(92mg，0.4mmol)，室温反应8小时。再加入二氯甲烷和三氟乙酸(2mL/2mL)，室温反应2小时。结束反应使用柱色谱分离纯化。得到浅白色固体SiRB2-Leu(38mg，70％)SiRB2-Leu核磁：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ9.57(d,J＝5.7Hz,1H),7.96-7.94(m,2H),7.59-7.38(m,3H),7.19(dd,J＝7.7,3.5Hz,1H),6.94(dd,J＝8.7,5.8Hz,1H),6.70(d,J＝5.1Hz,1H),6.64(d,J＝1.9Hz,1H),3.53-3.51(m,1H),3.31(t,J＝8.3Hz,2H),3.19(q,J＝7.2Hz,2H),2.84-2.76(m,2H),1.83-1.79(m,2H),1.44-1.40(m,1H),1.18(t,J＝7.2Hz,3H),0.97(d,J＝6.1Hz,3H),0.94(d,J＝6.3Hz,3H),0.62(s,3H),0.57(3H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ173.6,171.1,155.4,155.27,151.6,140.1,137.2,136.7,136.6,134.1,134.1,134.0,132.7,132.7,132.4,128.7,127.6,127.6,125.8,124.0,123.9,123.9,123.4,123.4,120.5,120.5,110.1,91.1,53.9,51.7,43.8,42.6,28.4,25.0,23.4,21.3,12.0,0.0,-0.8..HRMS(ESI)calcd.forC32H37N3O3Si[M+H]+:540.2677,found:540.2673。
实施例9
Figure BDA0002282582750000071
50mL充满氩气烧瓶，加入化合物SiRB2(43mg，0.1mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(152mg，0.4mmol)、N,N-二异丙基乙胺(66uL，0.4mmol)和四氢呋喃(4mL)0℃反应10分钟。缓慢加入溶解在0.5mL四氢呋喃中的Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯(121mg，0.4mmol)，室温反应8小时。再加入二氯甲烷和三氟乙酸(2mL/2mL)，室温反应2小时。结束反应，使用柱色谱分离纯化，得到浅白色固体SiRB2-Glu(37mg，67％)。SiRB2-Glu核磁：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.03-8.01(m,2H),7.77(t,J＝7.3Hz,1H),7.67(t,J＝7.3Hz,1H),7.52(d,J＝8.6Hz,1H),7.28(d,J＝7.5Hz,1H),7.01(s,1H),6.92(d,J＝8.7Hz,1H),6.73(s,1H),4.11(t,J＝6.0Hz,1H),3.47(t,J＝6.0Hz,2H),2.88(t,J＝9.0Hz,2H),2.73(t,J＝6.7Hz,2H),2.49-2.10(m,2H),1.26(t,J＝7.0Hz,3H),0.67(s,1H),0,60(s,1H)；13CNMR(75MHz,MeOD)δ171.3,170.1,139.4,138.3,136.8,134.3,133.8,129.1,127.7,125.7,124.3,120.7,112.7,52.0,51.7,43.4,31.8,27.5,25.5,10.5,-1.4,-2.6.HRMS(ESI)calcd.for C31H34N3O5Si[M+H]+:556.2262,found:556.2242。
实施例10
不对称硅罗丹明衍生物光学性质的分析：
1.溶液配制
分别精确称取SiRB2，SiRB2-Ac，SiRB2-Glu和SiRB2-Leu 1-2mg，用DMSO溶解并配成1mM的高标溶液，备用。
2.样品吸收光谱和发射光谱的测定
将配好的SiRB2和SiRB2-Ac样品溶液(2.uM pH＝7.4)用紫外分光光度计(SHIMADZU UV-2600)(石英皿，光路长度1cm)测定其紫外吸收光谱，测定范围450-700nm，测定其最大吸收波长；用荧光光谱仪(SHIMADZU RF-6000)测定其荧光发射光谱。并测定SiRB2和SiRB2-Ac在不同pH溶液中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。数据结果显示SiRB2的紫外最大吸收在640nm，并有着近红外的荧光发射信号，SiRB2-Ac紫外吸收和荧光发射强度都很弱，背景干扰信号弱。SiRB2和SiRB2-Ac的紫外吸收光谱图详见附图1a)；SiRB2和SiRB2-Ac的荧光发射光谱详见附图1b)；在pH＝4.0-11的环境下SiRB2和SiRB2-Ac都能维持其性质稳定，在不同pH环境下的紫外吸收光谱图详见附图1c)；SiRB2和SiRB2-Ac在不同pH环境下的荧光发射光谱详见附图1d)。
实施例11
不对称硅罗丹明衍生物SiRB2-Leu和SiRB2-Glu的酶促反应的测定：
2.5uM SiRB2-Leu在pH＝7.4的PBS的缓冲溶液体系下和不同浓度的(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5、2.0、5.0、10.0、50.0U/L)亮氨酸氨基肽酶(LAP)反应，测定其荧光强度的变化，得到SiRB2-Leu和LAP的酶促反应数据图。测试数据显示SiRB2-Leu在LAP的作用下发生酶促反应释放荧光信号，响应迅速。SiRB2-Leu和不同浓度LAP反应后荧光发射强度详见附图2a)，2b)；SiRB2-Leu和LAP的酶促反应、时间和荧光发射强度详见附图2c)；SiRB2-Leu和LAP的酶促反应的米氏方程动力学速率分析详见附图2d)。
2.5uM SiRB2-Glu在pH＝7.4的PBS的缓冲溶液体系下和不同浓度的(0、0.05、1.0、2.0、5.0、7.5、10.0、20.0、50.0、200.0、500.0U/L)亮氨酸氨基肽酶(GGT)反应，测定其荧光发射强度的变化，得到SiRB2-Glu和GGT的酶促反应数据。测试数据显示SiRB2-Glu在GGT的作用下发生酶促反应释放荧光信号，响应迅速。SiRB2-Glu和不同浓度GGT反应后荧光发射强度详见附图3a)，3b)；SiRB2-Glu和GGT的酶促反应、时间和荧光发射强度详见附图3c)；SiRB2-Glu和GGT的酶促反应的米氏方程动力学速率分析详见附图3d)。
实施例12
不对称硅罗丹明衍生物SiRB2-Leu和SiRB2-Glu对检测底物选择性的测定：
2.5uM SiRB2-Leu在pH＝7.4的PBS的缓冲溶液体系下分别与200uM Ca2+、200uMFe2+、200uM Mg2+、200uM Zn2+、200uM H2O2、200uM HClO和LAP反应。测定其荧光发射强度，结果显示SiRB2-Leu对LAP的选择性优良，不受Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、H2O2、HClO的干扰，数据详见附图4a)。
2.5uM SiRB2-Glu在pH＝7.4的PBS的缓冲溶液体系下分别与200uM Ca2+、200uMFe2+、200uM Mg2+、200uM Zn2+、200uM H2O2、200uM HClO和GGT反应。测定其荧光发射强度，结果显示SiRB2-Glu对LAP的选择性优良，不受Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、H2O2、HClO的干扰，数据详见附图4b)。

Claims (4)

1.一类不对称硅基取代罗丹明衍生物，其特征在于,所述衍生物具有式I结构：
Figure FDA0002282582740000011
其中，R为甲基、(S)-2-氨基-4-甲基戊基或(S)-3-氨基-3-羧基正丙基。
2.根据权利要求1所述的不对称硅基取代罗丹明衍生物，其特征在于，所述衍生物具体形式为：
Figure FDA0002282582740000012
3.一种权利要求1或2所述的不对称硅基取代罗丹明衍生物的合成方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：
步骤1：前驱体SiRB2的合成
合成过程如下式所示：
Figure FDA0002282582740000013
具体包括以下步骤：
1.1：烧瓶中充满氩气，加入6-溴-1-乙基吲哚啉和乙醚，保持0℃，加入正丁基锂，0℃反应2小时；混合物导入二氯二甲基硅烷的乙醚溶液中继续反应，缓慢升至室温，反应2小时；提纯得到6-(氯二甲基甲硅烷基)-1-乙基二氢吲哚；其中，所述6-溴-1-乙基吲哚啉、正丁基锂和二氯二甲基硅烷摩尔量比为1∶1∶5；
1.2：烧瓶中充满氩气，加入N，N-二烯丙基-3-溴苯胺和乙醚，保持0℃，加入正丁基锂，0℃反应2小时；所得液体混合物导入6-(氯二甲基甲硅烷基)-1-乙基二氢吲哚的乙醚溶液中，缓慢升温至室温反应8小时；淬灭反应，分离纯化得到DASE--2；其中所述N，N-二烯丙基-3-溴苯胺、正丁基锂和6-(氯二甲基甲硅烷基)-1-乙基二氢吲哚摩尔量比为1∶1.0～1.1∶1；
1.3：密闭管中加入DASE--2、2-甲酰基苯甲酸和溴化铜,140℃反应8小时；分离纯化得到Allyl--SiRB2；其中DASE--2、2-甲酰基苯甲酸和溴化铜摩尔量比为1∶5∶0.1；
1.4：烧瓶充满氩气，加入Pd(PPh3)4、1,3-二甲基巴比妥酸和Allyl--SiRB2的1,2-二氯乙烷溶液，35℃反应12小时；分离纯化得到SiRB2；其中，Pd(PPh3)4、1,3-二甲基巴比妥酸和Allyl--SiRB2摩尔量比为0.03∶1∶1；
步骤2：不对称硅基取代罗丹明衍生物的合成
以前躯体SiRB2为起始原料，R＝甲基、(S)-2-氨基-4-甲基戊基或S)-3-氨基-3-羧基正丙基时，合成过程如下式所示：
Figure FDA0002282582740000021
2.1：合成SiRB2--Ac；烧瓶中加入化合物SiRB2、二氯甲烷、吡啶和乙酸，室温反应24h；分离纯化后得白色固体SiRB2--Ac；其中SiRB2、吡啶和乙酸摩尔量比为1∶12∶3；
2.2：合成SiRB2--Leu；烧瓶充满氩气，加入化合物SiRB2、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺和四氢呋喃；0℃反应10分钟，加入BOC-L-亮氨酸，室温反应8小时；再加入等体积比分析纯二氯甲烷和三氟乙酸室温反应2小时；分离纯化，得到浅白色固体SiRB2--Leu；其中，SiRB2、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺和BOC-L-亮氨酸摩尔量比为1∶4∶4∶4；
2.3：合成SiRB2--Glu；烧瓶充满氩气，加入化合物SiRB2、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺和四氢呋喃；0℃反应10分钟，加入Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯，室温反应8小时；再加入等体积比二氯甲烷和三氟乙酸，室温反应2小时；分离纯化，得到浅白色固体SiRB2--Glu；其中SiRB2、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺和Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯摩尔量比为1∶4∶4∶4。
4.一种权利要求1或2所述的不对称硅基取代罗丹明衍生物在检测亮氨酸氨基肽酶及γ-谷氨酰转肽酶的应用。
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