CN110869505A

CN110869505A - 生长因子受体的组成型活性变体作为选择标记物在生成稳定生产细胞系中的用途

Info

Publication number: CN110869505A
Application number: CN201880045239.7A
Authority: CN
Inventors: 妮可·佛斯特; 西尔克·维辛; 尼古拉·施特伦佩尔
Original assignee: Cevec Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: Cevec Pharmaceuticals GmbH
Priority date: 2017-08-08
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2020-03-06
Also published as: CA3070261A1; SG11201913179XA; JP2020533961A; EP3441471A1; US12060561B2; KR20200035270A; JP7179828B2; US20200377895A1; WO2019030069A2; WO2019030069A3; AU2018312856A1; KR102608562B1; EP3665288A2; BR112020002429A2

Abstract

本发明涉及选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，其包括用编码生长因子受体的组成型活性变体的基因稳定转染细胞；还涉及在这种稳定生产细胞系中表达一种或多种POI的相应的方法；以及生长因子受体的组成型活化变体作为选择标记物在细胞培养中的用途。

Description

生长因子受体的组成型活性变体作为选择标记物在生成稳定生产细胞系中的用途

本发明涉及选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，所述方法包括用编码生长因子受体的组成型活性变体的基因稳定转染细胞；还涉及在这种稳定生产细胞系中表达一种或多种POI的相应的方法；以及生长因子受体的组成型活性变体作为选择标物记在细胞培养中的用途。

选择标记物是用于生成稳定生产细胞系(即稳定表达一种或多种POI例如生物药的细胞系)的必要工具。通常，这些选择标记物是抗生素抗性基因，其在表达载体上编码，并且与目的基因(GOI)一起稳定地整合在靶基因组中(例如通过转染)。在相应的抗生素存在的情况下培养转染的细胞用于选择具有整合表达载体的生产细胞。

用于哺乳动物表达系统的常用的基于抗生素的选择标记物包括，例如来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cerus)或土曲霉(Aspergillus terreus)的灭瘟素S抗性基因、来自转座子Tn5(neo)的G418(遗传霉素)抗性基因、来自链霉菌(Streptomyces spp.)的嘌呤霉素抗性基因、来自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的潮霉素B抗性基因和来自印度斯坦异壁链霉菌(Streptoalloteichus hindustanus)的博来霉素(Zeocin)抗性基因。

基于抗生素抗性的选择标记物的缺点包括以下事实：只有非常有限的一组选择标记物可用。此外，存在不稳定的生产克隆的问题，特别是在表达非常大的多聚体蛋白时，其中靶蛋白的重组表达随着时间的推移而沉默，从而导致生产过程中的低滴度。为了防止沉默，这些细胞可以在相应的抗生素选择剂的存在下培养。然而，在抗生素存在的情况下大规模生产POI是不希望的，因为这需要在生产后进行大量的去除步骤和分析步骤。

因此，迫切需要新的选择标记物，例如如果需要稳定整合多个表达构建体，则允许增强细胞系的稳定性并易于使用。理想地，这样的新选择标记物在没有选择剂的情况下支持POI的持续表达。

因此，本发明的技术问题是提供相应的选择标记物和使用选择标记物的方法。

通过在权利要求书中表征的实施方案来实现解决上述技术问题的方案。

特别地，第一方面，本发明涉及选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，其包括以下步骤：

(a)提供细胞系，

(b)同时稳定转染所述细胞系，所述细胞系具有：

(i)编码生长因子受体的组成型活性变体的基因，其中在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下，所述细胞系的生长取决于由所述生长因子受体识别的生长因子，以及

(ii)编码所述POI的一种或多种目的基因(GOI)，以及

(c)在细胞培养基中培养所述细胞系，所述细胞培养基或者不包含由所述生长因子受体识别的生长因子，或者在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下包含浓度低至无法支持细胞生长的所述生长因子。

通常，通过结合相应的配体即相应的生长因子(例如，IGF-1、IFG-2或IGF-1R的胰岛素)而激活生长因子受体，随后的二聚化导致下游磷酸化事件以及包括MAP-激酶和NFkappaB途径在内的促生长和抗凋亡途径的激活。这些生长因子存在于血清中，并且在无血清生长培养基中培养依赖于这些因子的细胞时需要补充。表现出对IGF-1和胰岛素的生长反应的细胞包括CAP、CHO、BHK、HEK 293、Vero、

MDCK细胞、杂交瘤细胞和成纤维细胞。培养这种细胞通常需要补充生长因子，这增加了相应生产过程的成本。本发明实现了一种新方法，即，在细胞培养基中稳定地整合组成型活性生长因子受体变体和通过生长因子耗竭进行的正向选择，从而允许在无蛋白质的培养基中生产。

如本文所用，术语“选择”系指通过建立选择压力来允许期望的阳性细胞克隆的排他性存活和增殖的过程，即，根据本发明，在细胞培养基中培养所述细胞，所述细胞培养基或者不包含由所述生长因子受体识别的生长因子，或者在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下包含浓度低至无法支持细胞生长的所述生长因子，而不需要的阴性细胞克隆是在所述选择压力下无法生存和增殖。术语“选择”的使用应与所需细胞的物理分离和/或富集明显区别，例如通过分选或附着，从更大的细胞池中分离出来。

如本文所用，术语“生产细胞系”系指细胞系生产即表达一种或多种POI。在这方面，术语“稳定生产细胞系”系指这样的事实：编码所述POI的基因(目的基因；GOI)，以及编码生长因子受体的组成型活性变体的基因被稳定地整合至细胞基因组中。

在具体实施方案中，本发明的方法的步骤(a)中提供的细胞系是哺乳动物细胞系，包括人细胞系。优选地，细胞系选自CHO细胞、HEK293细胞、CAP细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、Vero细胞、MDCK细胞、杂交瘤细胞和成纤维细胞。更优选地，该细胞是CAP细胞系。

本发明中使用的由细胞系表达的POI没有特别的限制。它们包括可能需要表达的任何蛋白质，例如选自细胞外基质蛋白质、生长因子、肽激素、细胞因子、酶、抗体、抗体片段、凝血因子、蛋白酶抑制剂和病毒蛋白产物。具体实例包括人重组α-1-抗胰蛋白酶(rhAAT)，纤维蛋白原，层粘连蛋白(LAM)，干扰素(IFN)，白细胞介素(IL)，免疫球蛋白G(IgG)，免疫球蛋白M(IgM)，双特异性单克隆抗体(BsAb)，促红细胞生成素(EPO)，凝血因子VII(FVII)，凝血因子VIII(FVIII)，凝血因子IX(FIX)，von-Willebrand因子(vWF)，C1酯酶抑制剂(C1-抑制剂；C1 Inh)，来自HIV-1、HIV-2、EIAV、SIV或其他逆转录病毒科(gag-pol)的gag-pol，来自腺相关病毒的rep蛋白(REP)，来自腺相关病毒的cap蛋白(CAP)及其变体。

在本发明的方法的步骤(b)中，用(i)编码生长因子受体的组成型活性变体的基因，其中在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下，所述细胞系的生长取决于由所述生长因子受体识别的生长因子；以及(ii)编码所述POI的一种或多种GOI来稳定转染细胞系。相应的转染方法没有特别限制并且是本领域已知的。

如本文所用，术语“稳定转染”表示以下事实：相应基因被稳定地整合至细胞基因组中。

术语“其中在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下，所述细胞系的生长取决于由所述生长因子受体识别的生长因子”表明以下事实：为了使本发明的方法按要求工作，必须选择生长因子受体/生长因子，使得在天然条件下，即在未转染的细胞中，细胞的生长取决于所述生长因子和相应的生长因子受体信号传导。

术语“生长因子受体的组成型活性变体”涉及即使在没有它们相应的生长因子配体的情况下也处于激活状态的生长因子受体变体。

在优选的实施方案中，编码生长因子受体的组成型活性变体的基因和GOI存在于同一载体上。合适的载体没有特别限制并且是本领域已知的。

在具体实施方案中，生长因子受体和相应的生长因子是IGF-1R(胰岛素样生长因子1受体)、IR(胰岛素受体)和IGF-1、IGF-2和/或胰岛素；EGFR(表皮生长因子受体)和相应的EGFR配体；FGFR(成纤维细胞生长因子受体)和FGF；或PDGFR(血小板衍生生长因子受体)和PDGF。

在具体实施方案中，生长因子受体的组成型活性变体是细胞外结构域缺失的EGFR、ZNF198-FGFR1融合蛋白、具有点突变的PDGFR、具有点突变的IR、细胞外结构域缺失的IGF-1R的组成型活性变体(IGF1R TM-icd)及其本领域已知的用以增加激活作用的点突变。

在具体实施方案中，生长因子受体的组成型活性变体是人CD8-IGF-1R融合蛋白。优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。此外，所述人CD8-IGF-1R融合蛋白优选由包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码或由SEQID NO:2的核苷酸序列组成的核酸编码。

在本发明的方法的步骤(c)中，在细胞培养基中培养所述细胞系，所述细胞培养基或者不包含由所述生长因子受体识别的生长因子，或者在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下包含浓度低至无法支持细胞生长的所述生长因子。在这种情况下，在这方面过低的相应浓度取决于特定的生长因子和生长因子受体，并且可以由本领域技术人员容易地确定。该步骤优选在允许选择发生的持续时间内进行，即允许不表达生长因子受体的组成型活性变体的细胞的死亡持续足够长的时间。在具体示例中，步骤(c)执行9或10代。在这种情况下，允许进行选择的持续时间取决于若干因素，包括但不限于细胞培养基的组成、表达载体上存在的细胞系和调控元件，因此可能会因这些因素而异。本领域技术人员可以容易地确定相应的持续时间。

第二方面，本发明涉及在稳定生产细胞系中表达一种或多种目的蛋白(POI)的方法，其包括以下步骤：

(a)执行如上所定义的根据本发明的第一方面的方法，

(b)在所述稳定生产细胞系中表达所述POI，以及

(c)从细胞或细胞培养基中收集所述POI。

在细胞系中表达POI及其收集的方法没有特别限制，并且是本领域已知的。

此外，针对本发明的第一方面定义的所有定义和限制以类似的方式适用于本发明的第二方面。

第三方面，本发明涉及生长因子受体的组成型活性变体作为选择标记物在细胞培养中的用途。

在此方面，针对本发明的第一方面定义的所有定义和限制以类似的方式适用于本发明的第三方面。特别地，细胞、生长因子受体、生长因子和生长因子受体的组成型活性变体如上所述。

本发明基于使用组成型活性变体(例如IGF-1R)作为选择标记物的构思。这有利地将新颖的、有效的选择标记物添加到当前可用的选择标记物的有限组中，特别是对于哺乳动物表达系统。进一步，本发明允许在培养生产细胞期间的连续选择压力，提供了使难于表达的靶蛋白的表达稳定化的潜力，而无需随后去除选择剂且不费时，无需昂贵的分析来证明最终产品中不存在选择剂。此外，本发明的优点是可以在大规模生产过程中降低成本，因为不需要用相应的生长因子补充无血清的细胞培养基。

建立连续选择压力而不必提供额外试剂的上述可能性是本发明的方法和用途的重要优点。它允许维持重组蛋白的高产量表达，特别是在生产细胞系在数次传代中不能稳定表达所述蛋白的情况。在这种情况下，应该注意的是，这种不稳定生产细胞系非常普遍，特别是在蛋白表达非常高的情况下，因为过量的蛋白表达会负面影响增殖速率，并且当关闭蛋白生产时，细胞具有存活和增殖的优势。通过建立根据本发明的连续选择压力，有利地且有效地抵消了这种沉默效果。

这些图显示：

图1：

稳定表达重组人α-1-抗胰蛋白酶(rhAAT)的CAP细胞库是通过用pStbl-CD8-IGF1R-AAT或pStbl-bsd-AAT(对照)转染亲代CAP细胞，随后在IGF-1缺失或含有杀稻瘟菌素的CAP-CDM生长培养基中选择而产生。将经过模拟转染的CAP细胞在含有50μg/L Long-R3-IGF的CAP-CDM中，或在没有IGF的CAP-CDM中培养10代以上作为对照。对于所有库，将细胞在125mL摇瓶中以185rpm，5％CO₂和37℃下培养，每72-96小时传代一次，同时将活细胞密度(VCD)调整为1×10⁶个细胞/mL。

图2：

第10天取自CAP-bsd-AAT和CAP-CD8-IGF1R-AAT库细胞的补料分批培养的细胞培养上清液中RhAAT水平。通过ELISA定量RhAAT效价。

在以下实施例中将进一步说明本发明，但不限于此。

实施例

实施例1：

通过使用组成型活性CD8-IGF1R变体作为选择标记物来产生稳定表达人重组α-1- 抗胰蛋白酶(AAT)的CAP细胞。

介绍：

CAP细胞是人羊膜细胞衍生的悬浮细胞，在不含IGF-1或不补充胰岛素的无血清培养基中显示出生长抑制作用。因此，它们是用于实施本发明的新颖的选择标记物的合适细胞系。

IGF-1R是跨膜受体酪氨酸激酶，通过激活PI3K/Akt激酶+mTOR和MAP激酶途径，对细胞生长和蛋白质生物合成至关重要。它是包含两个α-亚基和两个β-亚基的四聚体。它的配体是IGF-1(最高亲和力)、IGF-2和胰岛素(最低亲和力)。配体与α-亚基的结合导致构象变化(α-亚基的二聚化)和随后β-亚基的特定酪氨酸残基(Tyr1131、Tyr1135、Tyr1136、Tyr950)的自磷酸化，随后是受体底物(IRS1-4，shc)与其结合位点的结合以及下游信号传导途径的开始。

IGF-1R的组成型激活可通过将其细胞内和跨膜结构域与人T细胞标记物CD8的细胞外结构域融合来实现。该方法先前在本领域中已有描述，其中将CD8-IGF1R融合构建体用作在小鼠模型中研究IGF1R信号传导在肿瘤发育中的作用的工具。在本领域中，没有将CD8-IGF1R的重组表达和IGF1R的相关组成型激活作为生成稳定细胞系的选择标记物。

α-1-抗胰蛋白酶(AAT)是52kDa糖蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂，特别针对中性粒细胞弹性蛋白酶。遗传性AAT缺乏会导致严重的肺气肿。重组人AAT(rhAAT)已在CAP细胞中成功产生，并在本文中用作模型蛋白，用于涉及CD8-IGF1R作为新的选择标记物的研究。

实验步骤：

表达构建体的克隆：

CD8-IGF1R融合蛋白的成分是(i)人CD8α链的1-218位氨基酸(Uniprot P01732-1)和(ii)人IGF-1R的细胞内结构域的964-1367位氨基酸(NCBI蛋白质数据库NP000866)。它们在无接头(linker)的情况下在框架内融合，产生CD8-IGF1R融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO:1，如后文所示)。相应的cDNA序列为SEQ ID NO:2，如后文所示。

cDNA由GeneArt(赛默飞世尔科技公司)合成，并通过用CD8-IGF1R构建体替换bsd抗性基因，亚克隆到pStbl表达载体(塞维克制药有限责任公司，德国)中。最终表达构建体pStbl-CD8-IGF1R-AAT的成分是(i)受CMV启动子控制的人α1-抗胰蛋白酶(AAT)的cDNA，(ii)受人Ubc启动子的控制的包含CD8-IGF1R的选择盒，(iii)用于整合的ORF稳定转录的增强元件，(iv)在大肠埃希氏杆菌中繁殖的pUC ori，以及(v)用于在大肠埃希氏杆菌中选择的氨苄青霉素抗性盒。

通过由Eurofins MWG Operon进行的测序验证质粒。作为对照载体，使用(i)pStbl-bsd-AAT(受CMV启动子控制的AAT cDNA，bsd选择盒)和(ii)pStbl-bsd(空；无GOI，bsd选择盒)。

细胞培养：

在185rpm(5cm轨道)，5％CO₂和37℃下的振荡培养箱中的摇瓶(125mL；康宁)中将亲代CAP、CAP-bsd-AAT和CAP模拟细胞在化学成分明确的无血清的但补充了6mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，德国)以及50μg/L Long-R3-IGF-1(SAFC，德国)的CAP-CDM培养基(默克密理博，德国)中常规培养。

CAP-CD8-IGF1R-AAT细胞在化学成分明确的无血清的但补充了6mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，德国)而不含Long-R3-IGF-l的CAP-CDM培养基(默克密理博，德国)中培养。

在常规培养期间，每72-96小时用新鲜培养基将细胞稀释至1×10⁶细胞/ml的活细胞密度。通过利用CEDEX XS细胞计数器(Innovatis，Roche Applied Science)进行台盼蓝排排斥法来测定活细胞密度和活力。

在发酵过程中，在第3、5和7天用10％(v/v)CAP-CDM饲料(默克密理博，德国)和4mML-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，德国)培养细胞。

核转染和稳定库的产生：

根据制造商的说明，使用Lonza的Nucleofector生成稳定的库。对于每个核转染反应，通过离心(150×g，5分钟)收集1×10⁷个细胞。将细胞重悬于100μl完全核转染溶液V(Lonza)中，并与5μg线性化表达载体混合。将DNA/细胞悬浮液转移到比色皿中，并使用X001程序进行核转染。将转染的细胞转移至12.5mL生长培养基中，并如前所述在185rpm下于37℃，5％CO₂下培养。

为了产生稳定的库，将细胞通过离心成小球并重悬于选择培养基中(参见表1)，转染后72-96小时，然后如前所述在振荡培养箱中培养。

在IGF-1缺失的CAP-CDM培养基中培养的CAP模拟细胞用作阴性对照。

表1：

产生的CAP细胞库和相应的表达载体及培养基

ELISA:

使用双位点ELISA测定CAP细胞培养上清液中重组AAT的浓度。在这种基于微板的测定中，AAT由固定化山羊AAT特异性抗体捕获，并由第二山羊AAT特异性抗体检测，该抗体与辣根过氧化物酶偶联(Bethyl，Cat.#A80-122A/B)。

对于包被，将96孔微量滴定板用稀释的捕获抗体(Bethyl，0.1M Na₂CO₃/0.1MNaHCO₃中为1.33μg/mL；100μL/孔)在37℃孵育1小时。

将孔用TBS+0.05％(v/v)吐温-20(＝TBST；200μl/孔)洗涤四次，并在4℃下用TBST+5％(w/v)脱脂奶粉(＝TBSTM；200μL/孔)封闭过夜。封闭后，将板用TBST(200μL/孔)洗涤两次，并加入AAT标准品(0.2-200ng/mL，TBST中的两倍连续稀释液)、样品和阴性对照(100μL/孔)。将板密封并在37℃下孵育90分钟。

接下来，如上所述将板洗涤四次，然后添加检测抗体(TBSTM中为66.7ng/mL；100μL/孔)，并在37℃下孵育1小时。如上所述洗涤孔，并添加TMBD底物(在24mM柠檬酸盐/52mMNa₂HPO₄/0.006％H₂O₂，pH 5.0中为0.1mg/mL)(100μL/孔)。

在环境温度下孵育10分钟后，通过添加0.5M H₂SO₄(100μL/孔)终止反应，并使用BioRad微量滴定板读数器测量450nm(＝A450)的吸光度。由AAT标准稀释液的A450值生成标准曲线(4-参数拟合)。该曲线用于定量细胞培养上清液中的重组AAT。

结果：

为了证明组成型活性IGF1R受体作为选择标记物生成稳定(CAP)生产细胞系的适用性，用CD8-IGF1R-AAT表达载体或含有杀稻瘟菌素抗性盒的AAT表达载体作为选择标记物转染亲代CAP细胞。用空的pStbl-bsd质粒(CAP模拟)转染的CAP细胞作为对照。核转染后1代，将细胞转移到相应的选择培养基(表1)中，并培养9至10代。在IGF1缺失的生长培养基中传代8至9代后，CAP-CD8-IGF1R-AAT库从选择中收集，并达到了与在含有IGF1的全生长培养基中培养的CAP模拟库相当的活细胞密度和活力(>2×10⁶细胞/mL，72-96小时后活力>85％)。相比之下，模拟转染的CAP细胞在IGF-1缺失的生长培养基中无法存活，活细胞密度和活力经过3代后72-96小时开始下降至<2×10⁶细胞/mL，活力<85％(图1)。此数据表明CD8-IGF1R在CAP细胞中的重组表达确实导致CD8-IGF1R和相关的下游信号通路的组成型激活，并且这种组成型IGF1R激活可以补偿IGF1饥饿，从而允许CAP细胞在IGF1缺失的细胞培养基中生长。

为了比较通过常规杀稻瘟菌素选择产生的CAP细胞库和使用新颖的CD8-IGF1R选择标记物产生的CAP细胞库的生产效率，使用稳定的CAP细胞库在10天内进行补料分批生产，并通过ELISA对细胞培养上清液中rhAAT的浓度定量化。两个CAP细胞库(每个5.6μgAAT/1x10⁶细胞；图2)的滴度相当，这表明通过使用CD8-IGF1R融合构建体和IGF-1缺失的生长培养基进行选择，在4周内生成稳定表达AAT的CAP细胞库是成功的，并且CD8-IGF1R构建体是与GOI共转染时用于生成稳定CAP细胞的合适选择标记物。

本发明涉及以下核苷酸序列。

SEQ ID NO:1

人CD8-IGF1R融合蛋白

MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTYSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFLEIISSIKEEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEELDLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRHSGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTC

SEQ ID NO:2

编码人CD8-IGF1R融合蛋白的cDNA

(CD8部分(斜体)，IGF1R部分(下划线)，Kozak序列(粗体)

序列表

<110> 塞维克制药有限责任公司

<120> 生长因子受体的组成型活性变体作为选择标记物在生成稳定生产细胞系中的用途

<130> C 4764WO - kl

<150> EP 17 001 356.9

<151> 08.08.2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 622

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CD8-IGF1R融合蛋白

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr

20 25 30

Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser

35 40 45

Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala

50 55 60

Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala

65 70 75 80

Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp

85 90 95

Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe

115 120 125

Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

130 135 140

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

145 150 155 160

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

165 170 175

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

180 185 190

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His

195 200 205

Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Asn Ser Arg Leu Gly Asn

210 215 220

Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp

225 230 235 240

Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met

245 250 255

Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val

260 265 270

Ala Lys Gly Val Val Lys Asp Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys

275 280 285

Thr Val Asn Glu Ala Ala Ser Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn

290 295 300

Glu Ala Ser Val Met Lys Glu Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu

305 310 315 320

Leu Gly Val Val Ser Gln Gly Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu

325 330 335

Met Thr Arg Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu

340 345 350

Met Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile

355 360 365

Gln Met Ala Gly Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala Asn

370 375 380

Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val Ala Glu

385 390 395 400

Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg Asp Ile Tyr

405 410 415

Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu Leu Pro Val Arg

420 425 430

Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val Phe Thr Thr Tyr Ser

435 440 445

Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Ala Thr Leu Ala

450 455 460

Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gln Val Leu Arg Phe Val

465 470 475 480

Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp Lys Pro Asp Asn Cys Pro Asp Met Leu

485 490 495

Phe Glu Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro

500 505 510

Ser Phe Leu Glu Ile Ile Ser Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Pro Gly

515 520 525

Phe Arg Glu Val Ser Phe Tyr Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Leu Pro Glu

530 535 540

Pro Glu Glu Leu Asp Leu Glu Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu

545 550 555 560

Asp Pro Ser Ala Ser Ser Ser Ser Leu Pro Leu Pro Asp Arg His Ser

565 570 575

Gly His Lys Ala Glu Asn Gly Pro Gly Pro Gly Val Leu Val Leu Arg

580 585 590

Ala Ser Phe Asp Glu Arg Gln Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg

595 600 605

Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys

610 615 620

<210> 2

<211> 1875

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码人CD8-IGF1R融合蛋白的cDNA

<400> 2

gccaccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60

gccaggccga gccagttccg ggtgtcgccg ctggatcgga cctggaacct gggcgagaca 120

gtggagctga agtgccaggt gctgctgtcc aacccgacgt cgggctgctc gtggctcttc 180

cagccgcgcg gcgccgccgc cagtcccacc ttcctcctat acctctccca aaacaagccc 240

aaggcggccg aggggctgga cacccagcgg ttctcgggca agaggttggg ggacaccttc 300

gtcctcaccc tgagcgactt ccgccgagag aacgagggct actatttctg ctcggccctg 360

agcaactcca tcatgtactt cagccacttc gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc 420

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 480

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 540

ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 600

tcactggtta tcacccttta ctgcaaccac aggaaccgaa gacgtgtttg caaatgtccc 660

aacagcaggc tggggaatgg agtgctgtat gcctctgtga acccggagta cttcagcgct 720

gctgatgtgt acgttcctga tgagtgggag gtggctcggg agaagatcac catgagccgg 780

gaacttgggc aggggtcgtt tgggatggtc tatgaaggag ttgccaaggg tgtggtgaaa 840

gatgaacctg aaaccagagt ggccattaaa acagtgaacg aggccgcaag catgcgtgag 900

aggattgagt ttctcaacga agcttctgtg atgaaggagt tcaattgtca ccatgtggtg 960

cgattgctgg gtgtggtgtc ccaaggccag ccaacactgg tcatcatgga actgatgaca 1020

cggggcgatc tcaaaagtta tctccggtct ctgaggccag aaatggagaa taatccagtc 1080

ctagcacctc caagcctgag caagatgatt cagatggccg gagagattgc agacggcatg 1140

gcatacctca acgccaataa gttcgtccac agagaccttg ctgcccggaa ttgcatggta 1200

gccgaagatt tcacagtcaa aatcggagat tttggtatga cgcgagatat ctatgagaca 1260

gactattacc ggaaaggagg gaaagggctg ctgcccgtgc gctggatgtc tcctgagtcc 1320

ctcaaggatg gagtcttcac cacttactcg gacgtctggt ccttcggggt cgtcctctgg 1380

gagatcgcca cactggccga gcagccctac cagggcttgt ccaacgagca agtccttcgc 1440

ttcgtcatgg agggcggcct tctggacaag ccagacaact gtcctgacat gctgtttgaa 1500

ctgatgcgca tgtgctggca gtataacccc aagatgaggc cttccttcct ggagatcatc 1560

agcagcatca aagaggagat ggagcctggc ttccgggagg tctccttcta ctacagcgag 1620

gagaacaagc tgcccgagcc ggaggagctg gacctggagc cagagaacat ggagagcgtc 1680

cccctggacc cctcggcctc ctcgtcctcc ctgccactgc ccgacagaca ctcaggacac 1740

aaggccgaga acggccccgg ccctggggtg ctggtcctcc gcgccagctt cgacgagaga 1800

cagccttacg cccacatgaa cgggggccgc aagaacgagc gggccttgcc gctgccccag 1860

tcttcgacct gctga 1875

Claims

1.选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，其包括以下步骤：

(a)提供细胞系，

(b)同时稳定转染所述细胞系，所述细胞系具有：

(ii)编码所述POI的一种或多种目的基因(GOI)，以及

2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞系选自CHO细胞、HEK293细胞、CAP细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、Vero细胞、MDCK细胞、杂交瘤细胞和成纤维细胞。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述POI选自细胞外基质蛋白、生长因子、肽激素、细胞因子、酶、抗体、抗体片段、凝血因子、蛋白酶抑制剂和病毒蛋白产物。

4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述POI选自人重组α-1-抗胰蛋白酶(rhAAT)，纤维蛋白原，层粘连蛋白(LAM)，干扰素(IFN)，白细胞介素(IL)，免疫球蛋白G(IgG)，免疫球蛋白M(IgM)，双特异性单克隆抗体(BsAb)，促红细胞生成素(EPO)，凝血因子VII(FVII)，凝血因子VIII(FVIII)，凝血因子IX(FIX)，von-Willebrand因子(vWF)，C1酯酶抑制剂(C1-抑制剂；C1 Inh)，来自HIV-1、HIV-2、EIAV、SIV或其他逆转录病毒科(gag-pol)的gag-pol，来自腺相关病毒的rep蛋白(REP)，来自腺相关病毒的cap蛋白(CAP)及其变体。

5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述编码生长因子受体的组成型活性变体的基因和所述GOI存在于同一载体上。

6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中所述生长因子受体和相应的生长因子是IGF-1R(胰岛素样生长因子1受体)，IR(胰岛素受体)和IGF-1、IGF-2和/或胰岛素；EGFR(表皮生长因子受体)和相应的EGFR配体；FGFR(成纤维细胞生长因子受体)和FGF；或PDGFR(血小板衍生生长因子受体)和PDGF。

7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其中所述生长因子受体的组成型活性变体是人CD8-IGF-1R融合蛋白。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述人CD8-IGF-1R融合蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。

9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述人CD8-IGF-1R融合蛋白由包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸编码或由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成的核酸编码。

10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，其中在允许选择发生的持续时间内执行步骤(c)。

11.在稳定生产细胞系中表达一种或多种目的蛋白(POI)的方法，其包括以下步骤：

(a)执行权利要求1至10中任一权利要求所述的方法，

(b)在所述稳定生产细胞系中表达所述POI，以及

(c)从所述细胞或细胞培养基中收集所述POI。

12.生长因子受体的组成型活性变体作为选择标记物在细胞培养中的用途。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述细胞是如权利要求2中所定义的细胞系。

14.如权利要求12或13所述的用途，其中所述生长因子受体是IGF-1R(胰岛素样生长因子1受体)、IR(胰岛素受体)、EGFR(表皮生长因子受体)、FGFR(成纤维细胞生长因子受体)或PDGFR。

15.如权利要求12至14中任一权利要求所述的用途，其中所述生长因子受体的组成型活性变体如权利要求7至9中任一权利要求所定义。