BR112020002429A2 - uso de variantes constitutivamente ativas de receptores de fator de crescimento como marcador de seleção para geração de linhagens celulares produtoras estáveis - Google Patents
uso de variantes constitutivamente ativas de receptores de fator de crescimento como marcador de seleção para geração de linhagens celulares produtoras estáveis Download PDFInfo
- Publication number
- BR112020002429A2 BR112020002429A2 BR112020002429-5A BR112020002429A BR112020002429A2 BR 112020002429 A2 BR112020002429 A2 BR 112020002429A2 BR 112020002429 A BR112020002429 A BR 112020002429A BR 112020002429 A2 BR112020002429 A2 BR 112020002429A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- growth factor
- cells
- factor receptor
- fact
- constitutively active
- Prior art date
Links
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 94
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 28
- 210000000692 cap cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 claims description 18
- 101710184277 Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 claims description 12
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 10
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 9
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims description 9
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 9
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 claims description 7
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 claims description 7
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 claims description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 6
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 6
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 4
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 4
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 4
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 4
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 4
- -1 antibodies Proteins 0.000 claims description 4
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 4
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 4
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 4
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000051631 human SERPINA1 Human genes 0.000 claims description 4
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 claims description 4
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims description 4
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 claims description 4
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 claims description 4
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 3
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 3
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 claims description 3
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 102000055157 Complement C1 Inhibitor Human genes 0.000 claims description 2
- 108700040183 Complement C1 Inhibitor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 claims description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 2
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 claims description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108050007539 Plasma protease C1 inhibitor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027637 Plasma protease C1 inhibitor Human genes 0.000 claims description 2
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 claims description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 2
- 229940009550 c1 esterase inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 abstract description 3
- 108010024777 Mating Factor Receptors Proteins 0.000 abstract 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 17
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 17
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 17
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 101001034652 Homo sapiens Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 5
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000006552 constitutive activation Effects 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122966 Glycoprotein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101001077604 Homo sapiens Insulin receptor substrate 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100025087 Insulin receptor substrate 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 description 1
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 1
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 208000006682 alpha 1-Antitrypsin Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000009949 anti-apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000009640 growth promoting pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000001743 silencing effect Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70517—CD8
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A presente invenção refere-se a métodos para a seleção de uma linhagem celular produtora estável que expressa uma ou mais proteínas de interesse (POIs), compreendendo a transfecção estável de células com um gene que codifica uma variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento, respectiva-mente métodos para a expressão de uma ou mais POIs nessas linhagens celulares produtoras estáveis e usos de uma variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento como marcador de seleção no cultivo de células.
Description
[001] A presente invenção refere-se a métodos para a seleção de uma linha- gem celular produtora estável que expressa uma ou mais proteínas de interesse (POIs), compreendendo a transfecção estável de células com um gene que codifica uma variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento, méto- dos respectivos para a expressão de uma ou mais POIs nessas linhagens celulares produtoras estáveis e usos de uma variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento como marcador de seleção no cultivo de células.
[002] Os marcadores de seleção são ferramentas essenciais para a geração de linhagens celulares produtoras estáveis, isto é, linhagens celulares que expres- sam de forma estável uma ou mais POIs, como por exemplo biofarmacêuticos. Ge- ralmente, esses marcadores de seleção são genes de resistência a antibióticos que são codificados no vetor de expressão e que são integrados de maneira estável no genoma alvo (por exemplo, por transfecção) juntamente com o (s) gene (s) de inte- resse (GOIs). O cultivo das células transfectadas na presença do respectivo antibió- tico seleciona células produtoras com vetor de expressão integrado.
[003] Marcadores de seleção baseados em antibióticos comumente usados para sistemas de expressão em mamíferos incluem por exemplo, genes de resistên- cia à blasticidina S de Bacillus cereus ou Aspergillus terreus, gene de resistência G418 (Geneticin) do transposon Tn5 (neo), gene de resistência à puromicina de Streptomyces spp., gene de resistência à higromicina B de Escherichia coli e gene de resistência à Zeocina de Scherptoalloteichus hindustanus.
[004] As desvantagens dos marcadores de seleção baseados em resistência a antibióticos incluem o fato de que apenas um conjunto muito limitado de marcado- res de seleção está disponível. Além disso, existem problemas com os clones produ-
tores instáveis, especialmente ao expressar proteínas multiméricas muito grandes, em que a expressão recombinante da proteína alvo é silenciada ao longo do tempo, resultando em baixas titulações durante a produção. Para evitar o silenciamento, as células podem ser cultivadas na presença do respectivo agente de seleção de anti- bióticos. No entanto, a produção em larga escala de POIs na presença de antibióti- cos não é desejável, pois isso requer extensas etapas de remoção e análise após a produção.
[005] Assim, há uma necessidade urgente de novos marcadores de seleção, por exemplo, caso vários construtos de expressão precisem ser integrados de ma- neira estável, permitindo maior estabilidade das linhagens celulares e facilidade de uso. Idealmente, esses novos marcadores de seleção suportam a expressão susten- tada do POI na ausência de agentes de seleção.
[006] Consequentemente, o problema técnico subjacente à presente inven- ção é fornecer os respectivos marcadores de seleção e métodos usando os mes- mos.
[007] A solução para o problema técnico acima é alcançada pelas modalida- des caracterizadas nas reivindicações.
[008] Em particular, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a seleção de uma linhagem celular produtora estável que expressa uma ou mais proteínas de interesse (POIs), compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma linhagem celular, (b) simultaneamente transfectar de forma estável a referida linhagem celular com (i) um gene que codifica uma variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento, em que o crescimento da referida linhagem celular na au- sência de expressão da referida variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento depende do fator de crescimento que é reconhecido pelo referi-
do fator de crescimento receptor e (ii) um ou mais gene (s) de interesse (GOIs) que codificam essas POIs, e (c) cultivar a referida linhagem celular em um meio de cultura de células que não contenha o fator de crescimento que é reconhecido pelo referido receptor de fator de crescimento ou que contenha o referido fator de crescimento em concentra- ções que são muito baixas para suportar o crescimento das células na ausência de expressão da referida variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento.
[009] Geralmente, os receptores do fator de crescimento são ativados pela ligação do respectivo ligando, ou seja, o respectivo fator de crescimento (por exem- plo, IGF-1, IFG-2 ou insulina para IGF-1R) e subsequente dimerização, levando a eventos de fosforilação a jusante e ativação de vias promotoras de crescimento e antiapoptóticas, incluindo as vias MAP-quinase e NFkappaB. Esses fatores de cres- cimento estão presentes no soro e precisam ser suplementados ao cultivar células que são dependentes desses fatores no meio de crescimento livre de soro. As célu- las que mostram uma resposta de crescimento a IGF-1 e insulina incluem CAP, CHO, BHK, HEK 293, Vero, PER.C6®, células MDCK, células MDCK, células de hibridoma e fibroblastos. O cultivo dessas células geralmente requer a suplementa- ção de fatores de crescimento que aumentam os custos dos respectivos processos de produção. A presente invenção realiza uma nova abordagem, isto é, a integração estável de variantes do receptor do fator de crescimento constitutivamente ativo e seleção positiva por depleção do fator de crescimento no meio de cultura de células, permitindo a produção em meio livre de proteína.
[010] O termo "seleção", conforme usado neste documento, refere-se a um processo que permite a sobrevivência e proliferação exclusivas dos clones celulares positivos desejados, estabelecendo uma pressão de seleção, isto é, de acordo com a presente invenção, cultivar as referidas células em um meio de cultura de células que não contenha o fator de crescimento que é reconhecido pelo referido receptor de fator de crescimento ou que contenha o referido fator de crescimento em concen- trações que são muito baixas para suportar o crescimento das células na ausência de expressão da referida variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento, enquanto que clones de células negativas não desejadas não são ca- pazes de sobreviver e proliferar-se sob a referida pressão de seleção. Este uso do termo "seleção" deve ser claramente distinguido do isolamento físico e/ou enrique- cimento das células desejadas, por exemplo, por classificação de ou ligação a, um conjunto maior de células.
[011] O termo "linhagem celular produtora", conforme aqui utilizado, refere-se a linhagens celulares que produzem, ou seja, expressam uma ou mais POIs. O ter- mo "linhagem de células produtoras estáveis" a esse respeito refere-se ao fato de que o (s) gene (s) que codifica as referidas POIs (gene (s) de interesse; GOIs), bem como o gene que codifica a variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento , são integrados de maneira estável no genoma celular.
[012] Em modalidades específicas, a linhagem celular fornecida na etapa (a) dos métodos da presente invenção é uma linhagem celular de mamífero, incluindo uma linhagem celular humana. De preferência, a linhagem celular é selecionada a partir do grupo que consiste em células CHO, células HEK293, células CAP, células Per.C6, células BHK, células Vero, células MDCK, células de hibridoma e fibroblas- tos. Mais preferivelmente, a célula é uma linhagem celular CAP.
[013] POIs a serem expressas pelas linhagens celulares utilizadas na pre- sente invenção não são particularmente limitadas. Elas incluem qualquer expressão de proteína que possa ser desejada, por exemplo, proteínas selecionadas a partir do grupo que consiste em proteínas da matriz extracelular, fatores de crescimento, hormônios peptídicos, citocinas, enzimas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, fa- tores de coagulação do sangue, inibidores de protease e produtos de proteína viral.
Exemplos específicos incluem alfa-1-antitripsina recombinante humana (rhAAT), fi- brinogênio, lamininas (LAM), interferons (IFN), interleucinas (IL), imunoglobulina G (IgG), imunoglobulina M (IgM), anticorpos monoclonais biespecíficos (BsAb), eritro- poietina (EPO), fator VII (FVII), fator VIII (FVIII), fator IX (FIX), fator de von- Willebrand (vWF), inibidor da esterase C1 (inibidor de C1; C1 Inh), gag-pol do HIV-1, HIV-2, EIAV, SIV ou outros retroviridae (gag-pol), proteína rep do vírus Adeno- associado (REP), proteína cap do vírus Adeno-associado (CAP) e suas variantes.
[014] Na etapa (b) dos métodos da presente invenção, a linhagem celular é transfectada de maneira estável com (i) um gene que codifica uma variante constitu- tivamente ativa de um receptor de fator de crescimento, em que o crescimento da referida linhagem celular na ausência de expressão da referida variante constituti- vamente ativa de um receptor de fator de crescimento é dependente do fator de crescimento que é reconhecido pelo referido receptor de fator de crescimento, e (ii) um ou mais GOIs que codificam as referidas POIs. Os respectivos métodos de trans- fecção não são particularmente limitados e são conhecidos na técnica.
[015] O termo "transfecção estável", conforme usado aqui, indica o fato de que os respectivos genes estão integrados de maneira estável no genoma celular.
[016] O termo "em que o crescimento da referida linhagem celular na ausên- cia de expressão da referida variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento depende do fator de crescimento que é reconhecido pelo referido receptor de fator de crescimento" indica o fato de que, para o método da presente invenção funcionar como desejado, o receptor de fator de crescimento / fator de crescimento deve ser selecionado de modo que o crescimento das células em con- dições nativas, isto é, nas células não transfectadas, dependa do referido fator de crescimento e da sinalização do respectivo receptor de fator de crescimento.
[017] O termo "variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento" refere-se a variantes de receptor de fator de crescimento que estão em um estado ativado, mesmo na ausência de seu respectivo ligante do fator de cres- cimento.
[018] Em uma modalidade preferida, o gene que codifica uma variante cons- titutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento e os GOIs estão presen- tes no mesmo vetor. Os vetores adequados não são particularmente limitados e são conhecidos na técnica.
[019] Em modalidades específicas, o receptor do fator de crescimento e os respectivos fatores de crescimento são IGF-1R (receptor de fator de crescimento 1 tipo insulina), IR (receptor de insulina) e IGF-1, IGF-2 e/ou insulina; EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) e respectivos ligandos de EGFR; FGFR (recep- tor do fator de crescimento de fibroblastos) e FGFs; ou PDGFR (receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas) e PDGFs.
[020] Em modalidades específicas, a variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento é um EGFR excluído do domínio extracelular, uma proteína de fusão ZNF198-FGFR1, um PDGFR com mutações pontuais, um IR com mutações pontuais, uma variante constitutivamente ativa de um domínio extracelular excluído IGF-1R (IGF1R TM-icd) e suas mutações pontuais para aumentar a ativa- ção, como conhecido na técnica.
[021] Em uma modalidade particular, a variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento é uma proteína de fusão CD8-IGF-1R humana. De preferência, a referida proteína de fusão compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Além disso, a referida proteína de fusão CD8- IGF-1R humana é preferivelmente codificada por um ácido nucleico compreendendo ou consistindo na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 2.
[022] Na etapa (c) dos métodos da presente invenção, a linhagem celular é cultivada em um meio de cultura de células que não contém quer o fator de cresci- mento que é reconhecido pelo referido receptor do fator de crescimento ou que con-
tém o referido fator de crescimento em concentrações muito baixas para suportar crescimento das células na ausência de expressão da referida variante constitutiva- mente ativa de um receptor de fator de crescimento. Neste contexto, as concentra- ções respectivas que são muito baixas a este respeito dependem do fator de cres- cimento específico e do receptor do fator de crescimento e podem ser facilmente determinadas pelo especialista na técnica. Esta etapa é preferivelmente realizada por uma duração que permite a seleção, isto é, por uma duração que seja longa o suficiente para permitir a morte de células que não expressam a variante constituti- vamente ativa do receptor do fator de crescimento. Em exemplos específicos, a eta- pa (c) é realizada para 9 ou 10 passagens. Nesse contexto, a duração que permite que a seleção ocorra depende de vários fatores, incluindo, entre outros, a composi- ção do meio de cultura celular, a linhagem celular e os elementos reguladores pre- sentes no vetor de expressão e, portanto, podem variar dependendo desses fatores. As respectivas durações podem ser facilmente determinadas pelo especialista na técnica.
[023] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a um método para a expressão de uma ou mais proteínas de interesse (POIs) em uma linhagem celular produtora estável, compreendendo as etapas de: (a) executar o método de acordo com o primeiro aspecto da presente inven- ção, como definido acima, (b) expressar as referidas POIs na referida linhagem celular produtora está- vel, e (c) recuperar as referidas POIs das células ou do meio de cultura de células.
[024] Os métodos para a expressão de POIs em uma linhagem celular e sua recuperação não são particularmente limitados e são conhecidos na técnica.
[025] Além disso, todas as definições e limitações definidas para o primeiro aspecto da presente invenção aplicam-se a este segundo aspecto da presente in-
venção de maneira análoga.
[026] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de uma variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento como mar- cador de seleção no cultivo de células.
[027] Neste aspecto, todas as definições e limitações definidas para o primei- ro aspecto da presente invenção aplicam-se a este terceiro aspecto da presente in- venção de maneira análoga. Em particular, as células, receptores de fator de cres- cimento, fatores de crescimento e variantes constitutivamente ativas de receptores de fator de crescimento são como definidos acima.
[028] A presente invenção é baseada na ideia de usar receptores de fator de crescimento constitutivamente ativos (por exemplo, IGF-1R) como marcadores de seleção. Isso adiciona vantajosamente novos marcadores de seleção eficientes ao painel limitado de marcadores de seleção atualmente disponíveis, em particular para sistemas de expressão em mamíferos. Além disso, a presente invenção permite pressão de seleção contínua durante o cultivo de células produtoras, fornecendo o potencial de estabilizar a expressão de proteínas alvo difíceis de expressar sem a necessidade de remoção posterior do agente de seleção e análises onerosas e de- moradas para provar a ausência do agente de seleção no produto final. Além disso, a presente invenção permite vantajosamente uma redução de custos em processos de produção em larga escala, pois não há necessidade de suplementação de meio de cultura de células sem soro com os respectivos fatores de crescimento.
[029] A possibilidade acima de estabelecer uma pressão de seleção contí- nua, sem a necessidade de fornecer reagentes adicionais, é uma vantagem signifi- cativa dos métodos e usos da presente invenção. Permite a manutenção da expres- são de alto rendimento de proteínas recombinantes, em particular nos casos em que uma linhagem celular produtora não está expressando estavelmente as referidas proteínas ao longo de várias passagens. Nesse contexto, deve-se notar que essas linhagens celulares produtoras instáveis são bastante comuns, particularmente quando a expressão protéica é muito alta, pois a expressão excessiva de proteínas pode afetar negativamente as taxas de proliferação e as células têm uma vantagem de sobrevivência e proliferação ao interromper a produção de proteínas. Este efeito silenciador é vantajosa e eficientemente combatido através do estabelecimento de uma pressão de seleção contínua de acordo com a presente invenção.
[030] As figuras mostram: Figura 1:
[031] Agrupamentos de células CAP que expressam estavelmente alfa-1- antitripsina humana recombinante (rhAAT) foram gerados por transfecção de células CAP parentais com pStbl-CD8-IGF1R-AAT ou pStbl-bsd-AAT (controle) após a sele- ção em IGF-1 empobrecido ou blasticidina contendo meio de crescimento CAP- CDM. As células CAP transfectadas simuladas foram cultivadas em CAP-CDM con- tendo 50 µg/L de Long-R3-IGF ou em CAP-CDM sem IGF ao longo de 10 passagens como um controle. Para todos os agrupamentos, as células foram cultivadas em frascos de 125 mL a 185 rpm , 5% de CO2 e 37 ºC e foram passadas a cada 72-96 h enquanto ajustavam a densidade celular viável (VCD) para 1 x 106 células/mL. Figura 2:
[032] Níveis de RhAAT em sobrenadantes de cultura de células das culturas de bateladas alimentadas de células do agrupamento CAP-bsd-AAT e CAP-CD8- IGF1R-AAT tomados no dia 10. As titulações de RhAAT foram quantificadas por ELISA.
[033] A presente invenção será ainda ilustrada nos exemplos a seguir, sem se limitar a eles. Exemplos Exemplo 1: Geração de células CAP que expressam de forma estável alfa-1-antitripsina recombinante humana (AAT) utilizando uma variante CD8-IGF1R constitutivamente ativa como marcador de seleção. Introdução:
[034] Células CAP são células de suspensão derivadas de amniócitos huma- nos que mostram uma inibição do crescimento em meio livre de soro sem IGF-1 ou suplementação de insulina. Assim, elas são uma linhagem celular adequada para implementação do novo marcador de seleção de acordo com a presente invenção.
[035] IGF-1R é uma tirosina quinase de receptor transmembranar essencial para o crescimento celular e a biossíntese de proteínas, ativando as vias PI3K/Akt- quinase + mTOR e MAP quinase. É um tetrâmero que compreende duas subunida- des alfa e duas subunidades beta. Seus ligantes são IGF-1 (maior afinidade), IGF-2 e insulina (menor afinidade). A ligação de ligantes à subunidade alfa leva a altera- ções conformacionais (dimerização das subunidades alfa) e subsequente autofosfo- rilação de resíduos específicos de tirosina das subunidades beta (Tyr1131, Tyr1135, Tyr1136, Tyr950), seguida pela ligação de substratos receptores (IRS1-4, shc) aos seus sítios de ligação e início de vias de sinalização a jusante.
[036] Ativação constitutiva de IGF-1R pode ser conseguida fundindo os seus domínios intracelular e transmembranar ao domínio extracelular do marcador de cé- lulas T humana CD8. Este método foi descrito anteriormente na técnica, onde o construto de fusão CD8-IGF1R foi utilizado como uma ferramenta para investigar o papel da sinalização de IGF1R para o desenvolvimento de tumores em um modelo de camundongo. Em nenhuma das técnicas, a expressão recombinante de CD8- IGF1R e a ativação constitutiva associada de IGF1R serviram como um marcador de seleção para a geração de linhagens celulares estáveis.
[037] A alfa-1-antitripsina (AAT) é um inibidor da glicoproteína de 52 kDa e serina protease, direcionado principalmente à elastase de neutrófilos. A deficiência hereditária de AAT leva ao enfisema pulmonar grave. AAT humana recombinante
(rhAAT) foi produzida com sucesso em células CAP e é usada aqui como uma prote- ína modelo para estudos envolvendo o CD8-IGF1R como um novo marcador de se- leção. Procedimentos experimentais: Clonagem de construtos de expressão:
[038] Os componentes da proteína de fusão CD8-IGF1R são (i) aminoácidos 1-218 da cadeia alfa CD8 humana (Uniprot P01732-1) e (ii) aminoácidos 964-1367 do domínio intracelular de IGF-1R humano (Banco de Dados de Proteínas NCBI NP000866). Estes são fundidos na estrutura sem um ligante, resultando na sequên- cia de aminoácidos da proteína de fusão CD8-IGF1R (SEQ ID NO: 1, como mostra- do a seguir). A respectiva sequência de cDNA é a SEQ ID NO: 2, como mostrado a seguir.
[039] cDNA foi sintetizado por GeneArt (Thermo Fisher Scientific) e subclo- nado em um vetor de expressão pStbl (CEVEC Pharmaceuticals, Alemanha) por substituição do gene de resistência a bsd pelo construto CD8-IGF1R. Os componen- tes do construto de expressão final pStbl-CD8-IGF1R-AAT são (i) cDNA da alfa1- antitripsina humana (AAT) sob o controle do promotor CMV, (ii) cassete de seleção contendo CD8-IGF1R sob o controle do promotor Ubc humano, (iii) elemento melho- rador para transcrição estável de ORFs integradas, (iv) pUC ori para propagação em E. coli e (v) cassete de resistência à ampicilina para seleção em E. coli.
[040] A verificação do plasmídeo foi realizada por sequenciamento realizada por Eurofins MWG Operon. Como vetores de controle foram utilizados (i) pStbl-bsd- AAT (cDNA de AAT sob controle do promotor CMV, cassete de seleção de bsd) e (ii) pStbl-bsd (vazio; sem GOI, cassete de seleção de bsd). Cultura de células:
[041] Células parentais CAP, CAP-bsd-AAT e CAP simuladas foram rotinei- ramente cultivadas em meio CAP-CDM livre de soro quimicamente definido (Merck
Millipore, Alemanha) suplementado com 6 mM de L-alanil-L-glutamina (Biochrom, Alemanha) e 50 µg/L de Long-R3-IGF-I (SAFC, Alemanha) em frascos de agitação (125 mL; Corning) em uma incubadora com agitação a 185 rpm (5 cm de órbita), 5% de CO2 e 37 ºC.
[042] Células CAP-CD8-IGF1R-AAT foram cultivadas em meio CAP-CDM li- vre de soro, quimicamente definido (Merck Millipore, Alemanha), suplementado com 6 mM de L-alanil-L-glutamina (Biochrom, Alemanha) sem Long-R3-IGF-I.
[043] Durante o cultivo de rotina, as células foram diluídas com meio fresco até uma densidade viável de células de 1 x 106 células/ml a cada 72 - 96 h. A densi- dade celular viável e a viabilidade foram determinadas por exclusão de azul de tripa- no utilizando um contador de células CEDEX XS (Innovatis, Roche Applied Science).
[044] Durante a fermentação, as células foram alimentadas nos dias 3, 5 e 7 com alimentação de 10% (v/v) de CAP-CDM (Merck Millipore, Alemanha) e 4 mM de L-Alanil-L-glutamina (Biochrom, Alemanha). Nucleofecção e geração de agrupamentos estáveis:
[045] Agrupamentos estáveis foram gerados usando o Nucleofetor da Lonza, de acordo com as instruções do fabricante. Para cada reação de nucleofecção, 1 x 107 células foram colhidas por centrifugação (150 x g, 5 min). As células foram res- suspensas em 100 µl da solução completa de nucleofetores V (Lonza) e misturadas com 5 µg do vetor de expressão linearizado. A suspensão de DNA / célula foi trans- ferida para uma cubeta e a nucleofecção foi realizada usando o programa X001. As células transfectadas foram transferidas para 12,5 mL de meio de crescimento e cul- tivadas como descrito anteriormente a 37 ºC, CO2 a 5% a 185 rpm.
[046] Para a geração de agrupamentos estáveis, as células foram peletiza- das por centrifugação e ressuspensas em meio de seleção (vide Tabela 1) 72 - 96 h após a transfecção, seguido de cultivo em uma incubadora com agitação, como des- crito anteriormente.
[047] As células simuladas de CAP cultivadas em meio CAP-CDM empobre- cido com IGF-1 serviram como controle negativo. Tabela 1: Agrupamentos de células CAP geradas e vetores de expressão e meios cor- respondentes Linhagem celular Plasmídeo Meio de seleção CAP-bsd-AAT pStbl-bsd-AAT CAP-CDM + 6 mM de L-alanil-L-glutamina + 50 µg/L Long-R3-IGF-1 + 5 µg/mL blasticidina CAP-CD8- pStbl-CD8- CAP-CDM + 6 mM de L-alanil-L-glutamina IGF1R-AAT IGF1R-AAT CAP simulada pStbl-bsd (vazio) a) CAP-CDM + 6 mM de L-alanil-L- glutamina + 50 µg/L Long-R3-IGF-1 b) CAP-CDM + 6 mM L-alanil-L- glutamina ELISA:
[048] Concentrações de AAT recombinante nos sobrenadantes da cultura de células CAP foram determinadas usando um ELISA de dois sítios. Neste ensaio ba- seado em microplacas, o AAT é capturado por um anticorpo específico para AAT de cabra imobilizado e detectado por um segundo anticorpo específico para AAT de cabra que é acoplado à peroxidase de rábano silvestre (Bethyl, Cat. # A80-122A / B).
[049] Para o revestimento, as placas de microtitulação de 96 poços foram in- cubadas com anticorpo de captura diluído (Bethil, 1,33 µg/mL em Na2CO3 a 0,1 M / NaHCO3 a 0,1 M; 100 µL/poço) por 1 h a 37 ºC.
[050] Os poços foram lavados quatro vezes com TBS + 0,05% (v/v) de Tween-20 (= TBST; 200 µL/poço) e bloqueados com TBST + 5% (p/v) de leite em pó desnatado (= TBSTM; 200 µL/poço) durante a noite a 4 ºC. Após o bloqueio, a placa foi lavada duas vezes com TBST (200 µL/poço), e padrão AAT (0,2 - 200 ng/mL, di- luições em série em TBST), amostras e controles negativos foram adicionados (100 µL/poço). As placas foram seladas e incubadas por 90 min a 37 ºC.
[051] Em seguida, a placa foi lavada quatro vezes como descrito acima, se-
guido pela adição do anticorpo de detecção (66,7 ng/mL em TBSTM; 100 µL/poço) e uma etapa de incubação de 1 h a 37 ºC. Os poços foram lavados como descrito acima e o substrato TMBD (0,1 mg/mL em 24 mM de citrato / 52 mM de Na2HPO4 / H2O2 a 0,006%, pH 5,0) foi adicionado (100 µL/poço).
[052] Após 10 min de incubação à temperatura ambiente, a reação foi parada pela adição de H2SO4 a 0,5 M (100 µL/poço) e a absorvância a 450 nm (= A450) foi medida usando um leitor de placas de microtitulação BioRad. Uma curva padrão (ajuste de 4 parâmetros) foi gerada a partir dos valores A450 das diluições padrão da AAT. A curva foi utilizada para quantificação de AAT recombinante em sobrena- dantes de cultura de células. Resultados:
[053] Para provar a adequação do receptor IGF1R constitutivamente ativo como marcador de seleção para a geração de linhagens celulares produtoras está- veis (CAP), células CAP parentais foram transfectadas com o vetor de expressão CD8-IGF1R-AAT ou com um vetor de expressão AAT contendo um cassete de resis- tência à blasticidina como marcador de seleção. As células CAP transfectadas com o plasmídeo pStbl-bsd vazio (CAP simulado) serviram como controle. Uma passa- gem após a nucleofecção, as células foram transferidas para o respectivo meio de seleção (Tabela 1) e cultivadas durante um período de 9 a 10 passagens. Após 8 a 9 passagens no meio de crescimento empobrecido por IGF1, o agrupamento CAP- CD8-IGF1R-AAT havia se recuperado da seleção e atingido densidades e viabilida- des celulares viáveis comparáveis ao agrupamento simulado de CAP que foi cultiva- do em meio de crescimento completo contendo IGF1 (> 2 x 106 células/mL, > 85% de viabilidade após 72 - 96 h). Por outro lado, as células CAP simuladas transfecta- das não sobreviveram ao cultivo no meio de crescimento empobrecido por IGF-1, com a densidade e a viabilidade celular viáveis começando a cair para <2x106 célu- las/mL e viabilidade < 85% após 72 - 96 h após 3 passagens (Figura 1). Estes dados indicam que a expressão recombinante de CD8-IGF1R em células CAP realmente leva à ativação constitutiva do CD8-IGF1R e vias de sinalização a jusante relaciona- das e que essa ativação constitutiva de IGF1R pode compensar a privação de IGF1 e, assim, permitir o crescimento de células CAP em meio de cultura celular empo- brecido de IGF1.
[054] Para comparar a produtividade de um agrupamento de células CAP que foi gerado pela seleção convencional de blasticidina e um agrupamento de célu- las CAP que foi gerado usando o novo marcador de seleção CD8-IGF1R, uma pro- dução em batelada alimentada durante 10 dias foi realizada com os agrupamentos de célula CAP estável e concentrações de rhAAT nos sobrenadantes de cultura de célula a partir do dia 10 foram quantificadas por ELISA. As titulações foram compa- ráveis para os dois agrupamentos de células CAP (5,6 µg de AAT/1x106 células ca- da; Figura 2), que indica que a geração de um agrupamento de célula CAP que ex- pressa AAT estável por seleção usando o construto de fusão CD8-IGF1R e meio de crescimento empobrecido de IGF-1 dentro de 4 semanas foram bem sucedidas e que o construto CD8-IGF1R é um marcador de seleção adequado para a geração de células CAP estáveis quando co-transfectadas com o GOI.
[055] A presente invenção refere-se às seguintes sequências nucleotídicas. SEQ ID NO: 1 Proteína de fusão CD8-IGF1R humana
[056] MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLS
KNERALPLPQSSTC SEQ ID NO: 2 cDNA que codifica proteína de fusão CD8-IGF1R humana (Parte CD8 (itálico), parte IGF1R (sublinhada), sequência Kozak (negrito)
Claims (15)
1. Método para a seleção de uma linhagem celular produtora estável que expressa uma ou mais proteínas de interesse (POIs), CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer uma linhagem celular, (b) simultaneamente transfectar de forma estável a referida linhagem celular com (i) um gene que codifica uma variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento, em que o crescimento da referida linhagem celular na au- sência de expressão da referida variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento depende do fator de crescimento que é reconhecido pelo referi- do fator de crescimento receptor e (ii) um ou mais gene (s) de interesse (GOIs) que codificam essas POIs, e (c) cultivar a referida linhagem celular em um meio de cultura de células que não contenha o fator de crescimento que é reconhecido pelo referido receptor de fator de crescimento ou que contenha o referido fator de crescimento em concentra- ções que são muito baixas para suportar o crescimento das células na ausência de expressão da referida variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a linhagem celular é selecionada a partir do grupo que consiste em células CHO, células HEK293, células CAP, células Per.C6, células BHK, células Vero, célu- las MDCK, células de hibridoma e fibroblastos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as POIs são selecionadas a partir do grupo que consiste em proteínas da matriz extracelular, fatores de crescimento, hormônios pep- tídicos, citocinas, enzimas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, fatores de coagu-
lação do sangue, inibidores de protease e produtos de proteína viral.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que as POIs são selecionadas a partir do grupo que consiste em alfa-1-antitripsina recombinante humana (rhAAT), fibrinogênio, lamini- nas (LAM), interferons (IFN), interleucinas (IL), Imunglobulina G (IgG), Imunglobulina M (IgM), anticorpos monoclonais biespecíficos (BsAb), eritropoietina (EPO), Fator VII (FVII), Fator VIII (FVIII), Fator IX (FIX), Fator de von-Willebrand (vWF), inibidor da C1 esterase (inibidor de C1; C1 Inh), gag-pol do HIV-1, HIV-2, EIAV, SIV ou outros re- troviridae (gag-pol), proteína rep do vírus Adeno-associado (REP), proteína cap do vírus adeno-associado (CAP) e suas variantes.
5. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene que codifica uma variante constitutiva- mente ativa de um receptor de fator de crescimento e os GOIs estão presentes no mesmo vetor.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor do fator de crescimento e os respec- tivos fatores de crescimento são IGF-1R (receptor de fator 1 de crescimento tipo in- sulina), IR (receptor de insulina) e IGF-1, IGF-2 e/ou insulina; EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) e respectivos ligandos EGFR; FGFR (receptor do fator de crescimento de fibroblastos) e FGFs; ou PDGFR (receptor do fator de cres- cimento derivado de plaquetas) e PDGFs.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a variante constitutivamente ativa de um recep- tor de fator de crescimento é uma proteína de fusão CD8-IGF-1R humana.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida proteína de fusão CD8-IGF-1R humana compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida proteína de fusão CD8-IGF-1R huma- na é codificada por um ácido nucleico que compreende ou consiste na sequência nu- cleotídica de SEQ ID NO: 2.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (c) é realizada por um período que per- mite que a seleção ocorra.
11. Método para a expressão de uma ou mais proteínas de interesse (POIs) em uma linhagem celular produtora estável, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) executar o método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, (b) expressar as referidas POIs na referida linhagem celular produtora estável, e (c) recuperar as referidas POIs das células ou do meio de cultura de células.
12. Uso de uma variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento CARACTERIZADO pelo fato de que ser como marcador de seleção no cultivo de células.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que as células são uma linhagem celular conforme definida na reivindicação 2.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 12 ou reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor do fator de crescimento é IGF-1R (re- ceptor de fator 1 de crescimento tipo insulina), IR (receptor de insulina), EGFR (recep- tor de fator de crescimento epidérmico), FGFR (receptor de fator de crescimento de fibroblastos) ou PDGFR.
15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a variante constitutivamente ativa de um receptor de fator de crescimento é como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 9.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17001356.9A EP3441471A1 (en) | 2017-08-08 | 2017-08-08 | Use of constitutively active variants of growth factor receptors as selection makers for the generation of stable producer cell lines |
| EP17001356.9 | 2017-08-08 | ||
| PCT/EP2018/070829 WO2019030069A2 (en) | 2017-08-08 | 2018-08-01 | USE OF CONSTITUTIVELY ACTIVE GROWTH FACTOR RECEPTOR VARIANTS AS SELECTION MARKERS FOR THE GENERATION OF STABLE PRODUCTION CELL LINES |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112020002429A2 true BR112020002429A2 (pt) | 2020-07-28 |
Family
ID=59683368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112020002429-5A BR112020002429A2 (pt) | 2017-08-08 | 2018-08-01 | uso de variantes constitutivamente ativas de receptores de fator de crescimento como marcador de seleção para geração de linhagens celulares produtoras estáveis |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20200377895A1 (pt) |
| EP (2) | EP3441471A1 (pt) |
| JP (1) | JP7179828B2 (pt) |
| KR (1) | KR102608562B1 (pt) |
| CN (1) | CN110869505A (pt) |
| AU (1) | AU2018312856A1 (pt) |
| BR (1) | BR112020002429A2 (pt) |
| CA (1) | CA3070261A1 (pt) |
| SG (1) | SG11201913179XA (pt) |
| WO (1) | WO2019030069A2 (pt) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110862972B (zh) * | 2019-11-07 | 2020-10-30 | 衡阳师范学院 | 一种犬腺病毒ⅰ型无血清培养方法 |
| TW202233660A (zh) * | 2020-10-30 | 2022-09-01 | 美商安進公司 | 過表現胰島素樣生長因子受體突變體以調節ｉｇｆ補充 |
| TW202328442A (zh) * | 2021-09-10 | 2023-07-16 | 美商安進公司 | 平臺宿主對ｉｇｆ—培養基之適應 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5262308A (en) * | 1992-01-28 | 1993-11-16 | Thomas Jefferson University | Cell lines which constitutively express IGF-1 and IGF-1 R |
| EP0803570A4 (en) * | 1994-05-12 | 1998-05-20 | Otsuka Pharma Co Ltd | MUTANT DNA RECEPTOR OF HUMAN INSULIN |
| MXPA04008408A (es) * | 2002-03-01 | 2004-11-29 | Squibb Bristol Myers Co | Mamiferos no humanos, transgenicos, que expresan receptores de la tirosina cinasa activados constitutivamente. |
| WO2006113861A2 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Wyeth | Mammalian expression systems |
| MX2009006336A (es) * | 2006-12-22 | 2009-06-23 | Hoffmann La Roche | Inhibicion mediada por acido ribonucleico en forma de horquillas pequeñas, de la expresion de alfa-1.6-fucosiltransferasa. |
| WO2009010534A1 (en) * | 2007-07-17 | 2009-01-22 | Merck Serono S.A. | Method for generating stable cell lines expressing high levels of a protein of interest |
| EP3527585B1 (en) * | 2009-11-03 | 2022-02-16 | City of Hope | Truncated epiderimal growth factor receptor (egfrt) for transduced t cell selection |
| WO2012077128A1 (en) * | 2010-12-07 | 2012-06-14 | Intas Biopharmaceuticals Limited | A novel cell line development process to produce recombinant proteins using twin vector expression system |
| WO2014015227A1 (en) * | 2012-07-19 | 2014-01-23 | The Scripps Research Institute | Engineering cell surfaces for orthogonal selectability |
| TWI805109B (zh) * | 2014-08-28 | 2023-06-11 | 美商奇諾治療有限公司 | 對cd19具專一性之抗體及嵌合抗原受體 |
-
2017
- 2017-08-08 EP EP17001356.9A patent/EP3441471A1/en not_active Withdrawn
-
2018
- 2018-08-01 SG SG11201913179XA patent/SG11201913179XA/en unknown
- 2018-08-01 EP EP18745645.4A patent/EP3665288A2/en active Pending
- 2018-08-01 WO PCT/EP2018/070829 patent/WO2019030069A2/en unknown
- 2018-08-01 AU AU2018312856A patent/AU2018312856A1/en active Pending
- 2018-08-01 KR KR1020207003914A patent/KR102608562B1/ko active IP Right Grant
- 2018-08-01 CN CN201880045239.7A patent/CN110869505A/zh active Pending
- 2018-08-01 JP JP2020506177A patent/JP7179828B2/ja active Active
- 2018-08-01 BR BR112020002429-5A patent/BR112020002429A2/pt unknown
- 2018-08-01 CA CA3070261A patent/CA3070261A1/en active Pending
- 2018-08-01 US US16/636,622 patent/US20200377895A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019030069A2 (en) | 2019-02-14 |
| CA3070261A1 (en) | 2019-02-14 |
| WO2019030069A3 (en) | 2019-03-21 |
| KR20200035270A (ko) | 2020-04-02 |
| JP7179828B2 (ja) | 2022-11-29 |
| US20200377895A1 (en) | 2020-12-03 |
| JP2020533961A (ja) | 2020-11-26 |
| CN110869505A (zh) | 2020-03-06 |
| AU2018312856A1 (en) | 2020-01-16 |
| EP3441471A1 (en) | 2019-02-13 |
| EP3665288A2 (en) | 2020-06-17 |
| SG11201913179XA (en) | 2020-01-30 |
| KR102608562B1 (ko) | 2023-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BR112020002429A2 (pt) | uso de variantes constitutivamente ativas de receptores de fator de crescimento como marcador de seleção para geração de linhagens celulares produtoras estáveis | |
| JP5301534B2 (ja) | 高効率の分泌性シグナル配列を有する哺乳類発現ベクター | |
| Florin et al. | Heterologous expression of the lipid transfer protein CERT increases therapeutic protein productivity of mammalian cells | |
| JP2016056214A (ja) | ＴＮＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質の製法 | |
| US20040029229A1 (en) | High level protein expression system | |
| CA2578141A1 (en) | Production of polypeptides | |
| Umaña et al. | Tetracycline‐regulated overexpression of glycosyltransferases in Chinese hamster ovary cells | |
| CN106978441A (zh) | 生产蛋白质的方法 | |
| BR112014004830B1 (pt) | Célula de levedura geneticamente modificada, seu uso e método para produzir uma proteína ou polipeptídio recombinante de interesse | |
| US20140024076A1 (en) | Expression Of Soluble Viral Fusion Glycoproteins In Mammalian Cells | |
| CA2777487A1 (en) | Methods for the production of recombinant proteins with improved secretion efficiencies | |
| US20180319854A1 (en) | Expression in mammalian cells with gaussia luciferase signal peptide | |
| MX2010007344A (es) | Furina recombinante substancialmente libre de proteina animal y metodos para la produccion de la misma. | |
| EP2427557A1 (en) | Cho / cert cell lines | |
| KR20140036144A (ko) | 고수율 현탁세포주, 시스템 및 그 제조방법 | |
| WO2023011442A1 (en) | Selectable markers for eukaryotic expression system | |
| Dhamne et al. | Lentiviral vector platform for improved erythropoietin expression concomitant with shRNA mediated host cell elastase down regulation | |
| WO2023125389A1 (en) | Novel markers for recombinant production system | |
| CN106661557B (zh) | 用于增加真核细胞的比生产率的方法 | |
| TW202128735A (zh) | 源自ｃｈｏ細胞之蛋白分泌因子和包含彼之表現載體 | |
| WO2023079058A1 (en) | Cell culture with reduced production of lactate | |
| CN118103512A (zh) | 用于真核表达系统的可选择标志物 | |
| US20170327558A1 (en) | Mammalian cell culture processes for protein production | |
| Kim et al. | Production of recombinant human growth hormone by rCHO cells in a depth filter perfusion system | |
| RU2500818C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАР227, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 2H5 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА VIII |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] |