CN110868855A - 花粉保存方法 - Google Patents
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Abstract
公开了保存花粉的方法，使得花粉与留在环境条件下的花粉相比具有提高的存活力。本发明的方法包括将死亡花粉内含物与活花粉粒分离。在一些实施方案中，将花粉粒与防止死亡花粉内含物与活花粉粒相互作用的物质一起储存。该物质可以是固体、液体、气体或它们的组合。在一些实施方案中，该物质可以至少部分地调节花粉水分含量，例如将花粉水分含量维持在15％‑60％。
Description
本申请要求2017年7月6日提交的题为“提高花粉存活力和可储存性的方法”的美国临时申请序列号62/529,198的优先权。将美国临时申请序列号62/529,198的内容通过引用的方式全文并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及一种新的用于增加花粉整体存活力和繁殖力并防止花粉坏死的方法，其导致用于授粉植物中的花粉得到改善。本发明可以用新鲜花粉或者先前已经被储存或保存的花粉进行。
背景
本发明应用于花粉寿命和存活力领域。花粉寿命受到环境条件尤其是温度和相对湿度的显著影响。从被子植物的花或开花结构中自然脱落的花粉，一旦从植物脱落，就会迅速丧失存活力。根据物种和环境条件，存活力能在几分钟到几小时内丧失。一旦花粉从植物脱落，暴露于干燥空气和高温对于其存活力和寿命就特别有害。因此，在自然田间条件下，花粉具有有限的寿命，在该寿命期间它保持有存活力，在本申请中称为“存活力窗口”，如本文下面提供的。特别地，来自Poaeceae(禾本科(Gramineae))科植物(通常称为禾本科植物(grasses))的花粉特别容易受到伤害且寿命特别短(Barnabas&Kovacs(1997)In:PollenBiotechnology For Crop Production And Improvement.(1997).Sawhney,V.K.,andK.R.Shivanna(eds).Cambridge University Press.pp.293-314)。该科植物包括许多经济上重要的谷类作物，包括玉米。提高花粉存活力和延长其存活力持续期间的方法对农业产业具有重要价值。
具体而言，如果从植物采集的花粉可以以有存活力的状态储存一段时间，则该花粉可以以许多有利的方式根据需要用于对雌花进行授粉。利用储存的花粉允许不依赖于脱落的活性花粉的授粉、与雌蕊(雌花)可授性的时间同步性、雄性不育的使用和/或与其他花粉来源的物理隔离。目前，许多物种依靠自花授粉或邻近植物的异花授粉来产生可繁殖的种子或谷物。通常，在农业杂交种子产业中，需要机械、物理和/或遗传干预以确保雌性植物被异花授粉，而不是自花授粉，从而使用特定基因组成的花粉来产生杂交种子。例如，常规地使用这些措施来生产杂交玉米和水稻种子。然而，在一些作物中，即使这些措施也不能有效地确保被特定的期望花粉来源进行异花授粉。目前，将这些作物在商业上作为杂交种来生产是不经济的。这些作物的实例包括但不限于小麦和大豆。
已经进行了许多尝试来保存花粉并延长其存活力，以用于在超出花粉如果暴露于非受控的环境条件下保持有存活力的时间进行授粉。在禾本科植物中，用玉米进行的研究是花粉保存方面取得进展的示例。对于维持或延长玉米花粉存活力和/或繁殖力，已经测试了许多类型的处理。其中，许多人已报道了在高湿度和/或低温下处理和/或储存玉米花粉的有利性。
在最早的玉米花粉保存的描述(Andronescu,Demetrius I.,The physiology ofthe pollen of Zea mays with special regard to vitality.博士学位论文，University of Illinois，1915)中，报道了在没有受控环境储存条件下，花粉在两到四个小时内死亡。通过提高储存环境的相对湿度，花粉的存活力保持48小时。此外，在低温(例如8-14℃)下储存对花粉的存活力具有刺激作用。
即使在储存期间不控制相对湿度，与初始的储存前存活力相比或与35℃下的储存相比，保持在低温(例如，2-7℃下3-120小时)的玉米花粉可使其体外萌发能力增加多于一倍(Pfahler,P.L.和Linskens,H.F.,(1973)Planta,111(3),pp.253-259；Frova,C.B.和Feder,W.A.,(1979)Ann Bot,43(1),pp.75-79)。当储存期间的高湿度(90％RH)和低温(4℃)结合用于花粉处理时，玉米花粉在人工培养基上的萌发在八天内保持良好至一般(Sartoris,G.B.,(1942)Am J Bot,pp.395-400)。在相同条件下储存玉米花粉八天也允许花粉保持可繁殖(尽管水平降低)，并且能够在授粉后在穗上形成穗粒(kernel)(Jones,M.D.和Newell,L.C.,(1948)J Amer Soc Agron 40:195-204)。
在高湿度和低温下对玉米花粉进行现场调节通常有助于使低存活力的花粉复活和/或延长其寿命，由此在穗的授粉后发生至少有限的种子形成。但是，并不是总能观察到低温储存对繁殖力的刺激作用(Walden,D.B.,(1967)Crop Science,7(5),pp.441-444)，并且如果花粉脱水到过高水平，则人工培养基和穗丝上的花粉管形成可以显著减少(Hoekstra,FA.(1986):Membranes,Metabolism and Dry Organisms.(Ed.,AC Leopold),pp.102-122,Comstock Publishing Associates,Ithaca,NY；Barnabas,B.和Fridvalszky,L.,(1984)Acta Bot Hung 30:329-332)。
虽然高湿度和低温减缓了禾本科花粉储存期间存活力随时间的衰减，但优化这些用于保存的环境条件仅推迟了存活力和繁殖力的完全丧失。除了调节湿度和温度之外，还需要进一步提高储存的花粉的寿命的方法，以便它可以用于补充授粉的商业实践中，以改善种子和谷物的生产。此外，在大规模应用中调节湿度和温度在技术上具有挑战性且昂贵，因此较简单的方法将使补充授粉更加可行。
在一些情况下，可能需要处理花粉以使其脱水至不同程度。脱水可以通过真空干燥或将花粉暴露于使水从花粉中扩散出来的相对湿度和温度(即蒸汽压亏缺)来实现。有利于花粉干燥的蒸汽压亏缺可以以多种方式产生，例如用干燥剂、被设计为在封闭室内控制温度和相对湿度的机械装置以及用保持在封闭空间内的饱和盐溶液(Jackson,M.A.和Payne,A.R.(2007)Biocontrol Sci Techn,17(7),pp.709-719；Greenspan,L.,(1977)JRes Nat Bur Stand,81(1),pp.89-96)。
为了使甘蔗花粉脱水和保存，在少量CaCl2干燥剂的存在下，将花粉真空储存在低温下(Sartoris,G.B.(1942)Am J Bot,pp.395-400)。根据需要，花粉在整个储存期间保持干燥，但使用低压不如在正常大气压下储存有利。玉米花粉的行为与甘蔗的行为非常相似。更直接的脱水尝试已经在确定的或记录的相对湿度和温度的条件下孵育花粉。这些实例表明，玉米花粉可以被脱水至非常低的水平(例如，7-10％的花粉水含量)并且仍然具有在穗授粉之后实现种子形成的能力(尽管降低)(Barnabas,B.,et al.(1988)Euphytica,39(3),pp.221-225；US专利5,596,838)。
通常在冷冻以在非常低的温度下储存和保存之前进行花粉的脱水。如对玉米所实施的，在室温下，在真空室、湿度培养箱中或仅通过空气干燥或温和的热量对新鲜花粉进行脱水(US专利5,596,838；Barnabas,B.和Rajki,E.(1981).Ann Bot,48(6),pp.861-864；Connor,K.F.和Towill,L.E.(1993)Euphytica,68(1),pp.77-84)。在短期或长期储存后解冻后，冷冻保存的花粉可以是有存活力的和有繁殖力的，但繁殖力并不总是表现出来，并且禾本科的一些成员，如玉米、高粱、燕麦和小麦，可能难以冷冻保存(Collins,F.C.,et al.(1973)Crop Sci,13(4),pp.493-494)。对这种顽固性的一种解释是花粉的过度干燥或老化(Collins,F.C.,et al.(1973)Crop Sci,13(4),pp.493-494)。很明显，在花发育、花粉成熟和开花期间，花粉质量会受到主要环境条件的影响(Shivanna,K.R.,et al.(1991)TheorAppl Genet 81(1),pp.38-42；Schoper,J.B.,et al.(1987)Crop Sci,27(1),pp.27-31；Herrero,M.P.和Johnson,R.R.(1980)Crop Sci,20(6),pp.796-800)。以这些方式受应激(stressed)的花粉可能表现出降低的承受用于冷冻保存的脱水和冷冻的严苛条件的倾向。需要克服这个问题并使禾本科花粉的冷冻保存更容易和常规，从而使这种形式的花粉保存可以在商业规模上以可预测的方式进行实施。
已知干燥对花粉存活力具有直接影响。Barnabas(1985)Ann Bot 55:201-204以及Fonseca和Westgate(2005)Field Crops Research 94:114-125证明，新鲜收获的玉米花粉可以在原始水含量减少约50％的情况下存活，但是对于超过该水平的额外水分损失，很少的花粉粒表现出存活力或正常花粉管形成的能力。Barnabas和Rajki的早期工作((1976),Euphytica 25:747-752)证明，当在-196℃下冷冻储存时，水含量降低的花粉将保持存活力。随后的工作(Barnabas&Rajki(1981)Ann Bot 48:861-864)证明，在-76℃或-196℃下储存的这种部分干燥的玉米花粉粒也可以实现可授雌花的受精。其他将花粉储存不同时间的方法是本领域中已知的，包括冷冻干燥、真空干燥和在有机非极性溶剂中储存。这些花粉保存技术的可扩展性的限制与复杂的非便携式装置要求相结合，使得这些技术用于田间规模应用所需的大量花粉是不切实际的。例如，创建足够大的真空室以进行生产水平的田间授粉保存的能力将需要能够快速改变压力水平的大得多的真空室。生产水平的母本增加场地的大小通常为一英亩或更大，而杂交种生产场地的大小通常是10英亩或更大。这样的场地需要相当大量的花粉，因此需要大的真空室。这些规格的室将要求泵抽下降至5托(0.67kPa)或更低的压力的能力，并具有增加的快速地上升循环和下降循环该压力水平的能力。随着样品的物理体积增加，在5托(0.67kPa)下有效地产生和循环的能力开始超过机械泵可以产生的能力。此外，将花粉储存在有机溶剂中会产生危险化学品要求。
Greaves等人的美国专利5,596,838公开了一种储存花粉的方法，该方法涉及通过在储存之前将花粉暴露于降低的大气压来降低水分含量。该技术制备了少量花粉，例如来自单一玉米植物的花粉，用于随后在零下条件下储存。然而，方法学和机械系统的要求缺乏以足够大的量生产储存的花粉以能够实现商业种子生产或谷物生产应用的能力。这些要求有效地否定了将技术推进到研究水平调查以外的任何机会。Greaves等人的另一专利美国专利6,141,904提供了可以将花粉放置在载体材料中以增加流动性，例如可流动的粉末。此外，美国专利号2,669,066建议将花粉与具有高蛋白质含量的物质混合以进行处理和应用，例如在短期储存的情况下的蛋白粉、酪蛋白粉或奶粉。
保存的有存活力的花粉的可用性克服了杂交种子产业所面临的许多生产挑战。对于杂交种子生产，储存的花粉用于递送至雌花的可用性可以消除种子生产的许多标准的、昂贵的实践，包括但不限于：与雌性植物分开但在雌性植物附近种植雄性植物以实现杂交、将雌性植物与不期望的花粉来源分离以及使用雌性植物的遗传或机械雄性不育。这些实践大大增加了专门用于生产种子或谷物的雌性植物的场地空间和资源。消除这些实践中的任何一种都将对每英亩种子产量产生直接的积极影响。此外，可以在任何时间应用储存的花粉。当花粉从雄性植物脱落且雌性植物的花粉可授性不能按计划重合(由于管理、环境或遗传变异)时，保存的有存活力的花粉的应用确保在最佳的时间对雌性植物进行授粉。通过在适当的时间施用所需类型的储存的花粉，也可以减少或消除被不期望的外部(偶然的)来源的花粉授粉或者不期望的雌性植物自花授粉。今天，通过在田间种植在一起的供给花粉的雄性植物和接受花粉的雌性植物的基因型，在生长季节开始时确定特定杂交种子的遗传学。然而，使用本公开的实施方案，响应于变化的市场机会的杂交种子生产者可以在授粉时决定使用不同的雄性花粉(即，遗传来源)进行授粉以产生更有价值的杂交种子。因此，储存的花粉可以用于向高产雌性自交系提供增强种子质量特征的独特的遗传特性或基因。例如，可以提供对存在的选择的害虫的抗性的特性。重要的是，本公开的实施方案还确保杂交种子的高水平遗传纯度。因此，提高花粉存活力并延长其存活力持续期间的方法对于农业产业来说具有重要价值。
附图简要说明
图1显示了如工作实施例1中描述的静置在人工生长培养基中的花粉粒的图像。该图像证明，与没有与其他花粉粒接触的单个花粉粒相比，簇聚在一起的花粉具有较低的整体萌发率。两个花粉簇在图像上标记在方框内。注意，这些簇没有显示出强的花粉管生长。
图2显示了如工作实施例2中描述的死亡或垂死的花粉对新鲜花粉的影响。测试了两个对照样品以及含有已经经受会导致花粉死亡的处理的花粉的四个样品。
图3显示了如工作实施例3中描述的死亡花粉对新鲜花粉和4天龄花粉的影响。该图证明了死亡花粉对活花粉具有的消极影响，导致存活力的快速下降。该图显示了死亡花粉对已经开始劣化的花粉具有更显著的影响。
图4显示了从工作实施例4收集的数据。该实验使用了从田间收集并储存在颗粒状炭中的玉米花粉。花粉与炭以2.5％至75％炭的不同百分比进行混合。该图显示了储存1天和6天后的存活力和花粉水分含量(PMC)测试的结果。
图5显示了从工作实施例5收集的数据。该实验测量了从温室采集并与各种糖一起储存的玉米花粉的存活力。对于每个样品，将花粉与糖介质以1:1的比例混合。该图显示了在24小时、2天、5天、8天和13天之后的花粉的存活力。
图6显示了从工作实施例6收集的数据。将花粉储存在不同尺寸的二氧化硅颗粒中，以确定粒径对花粉储存和其存活力的影响。在二氧化硅颗粒中储存24小时后，将花粉用于进行手工授粉。该图显示了对于每个样品的穗粒组。
图7显示了从工作实施例7收集的数据。该实验使用从生长室采集的混合的玉米花粉。花粉用各种不同的介质储存，这些介质全部包括98％的乳糖和2％的旨在改善流动性的一系列不同物质。该图显示了在储存3天之后花粉的存活力和PMC。
图8显示了从工作实施例8收集的数据。该实验使用从生长室采集的混合的玉米花粉。花粉用各种不同的介质储存，这些介质全部包括98％的乳糖和2％的旨在改善流动性的一系列不同物质。一些样品经受2天的干燥时段并且其他样品不经历干燥时段。该图显示了在储存2天和6天之后花粉的存活力和PMC。
图9显示了从工作实施例10收集的数据。该实验测量了用包括乳糖和4％的
的不同的比例的介质储存的玉米花粉的存活力。未混合的对照样品用于比较目的。该图显示了在储存期间在第0、4、6、10、12和17天花粉的存活力。
图10显示了从工作实施例11收集的数据。该实验使用了从出苗后但未脱落花粉以及出苗后且脱落花粉的储存小麦花药采集的花粉。花药在没有介质的情况下储存(作为对照)、与粉状乳糖一起储存或与乳糖和
340的组合一起储存。该图显示了在3天和14天储存之后花粉的存活力。
图11显示了从工作实施例12收集的数据。该实验使用了来自储存的、合并水稻花药的花粉。花药在没有介质的情况下储存(作为对照)、与粉状乳糖一起储存或与乳糖和
340的组合一起储存。该图显示了在4天和10天储存之后来自花药的花粉的存活力。
图12显示了从工作实施例13收集的数据。为了与来自开放授粉和新鲜花粉对照的穗粒组进行比较，使用已经与分离化合物一起储存的花粉进行穗粒组实验。该图显示了得自每个样品的穗粒数。
图13显示了已经与
D17组合的花粉。该图证明花粉上的颗粒涂层导致滑的表面，从而防止成功授粉。
图14显示了如工作实施例15中提供的已经与酪蛋白组合的花粉。该图证明酪蛋白对花粉存活力具有消极影响，导致当在4摄氏度下储存20小时时几乎没有存活力至没有存活力。
图15显示了如工作实施例15中提供的已经与纤维素组合的花粉。该图证明纤维素对花粉存活力具有消极影响，导致当在4摄氏度下储存20小时时存活力降低。
图16显示了工作实施例16中收集的数据。即，该图显示了当根据本发明的方法储存花粉时良好的存活力。将玉米花粉与乳糖和Sipernat 340的混合物一起在29.6和32.8摄氏度下储存，导致良好的存活力。
图17显示了工作实施例17的结果。即，该图显示了玉米花粉在
PD-23矿物油中的储存导致良好的花粉存活力。
发明内容
提供了一种保存多个花粉粒的方法，包括防止死亡花粉内含物与活花粉粒相互作用。在一些实施方案中，该方法可以包括将花粉粒与至少一种防止死亡花粉内含物与活花粉粒相互作用的物质一起储存。该物质可以是固体、液体、气体或它们的组合。此外，该物质可以围绕至少一个花粉粒，例如通过使多个花粉粒之间的表面与表面接触最小化。可以将花粉水分含量维持在15％-60％，例如35％-60％。此外，可以将花粉粒和该物质混合，例如通过连续混合。该物质与花粉粒的比例可以为至少3:1。此外，该物质的尺寸范围是从至少比花粉粒尺寸小十倍到至少比花粉粒尺寸大十倍。在一些实施方案中，该物质可以包括变化尺寸的颗粒。该物质可以选自乳糖、
50、
50S、
2200、
22、
22S、
340、
350、
SM660、霍霍巴珠、
200、
244和它们的组合。该方法可以包括已新鲜采集的、储存的或它们的组合的花粉。此外，该方法可以包括现场调节花粉。
在本发明的另一实施方案中，提供了一种方法，其中将花粉粒与导致花粉粒具有15％-60％的花粉水分含量的物质混合。在一些实施方案中，花粉水分含量可以为35％-60％，例如45％-55％。该物质可以是亲水的并且还可以防止死亡花粉内含物与活花粉粒相互作用。此外，该方法可以包括在花粉采集之后将花粉水分含量减小到小于60％。
术语汇编
“室”在本文中用于表示适于容纳和储存花粉的外壳(enclosure)。
“死亡花粉内含物(Dead Pollen Contents)”在本文中用于表示与死亡或垂死的花粉粒有关的任何材料，包括但不限于花粉粒本身和从死亡或垂死的花粉粒泄漏的材料。
“雌性植物”用于表示用作花粉接受者的植物，并且其具有正在受精的可授性花。
“可繁殖的(fertile)”或“繁殖力(fertility)”用于描述花粉将精核递送至胚珠并由此实现双受精的能力。在开花植物中，术语“双受精”是指一个精核与极核融合以产生胚乳组织，而另一个精核与卵核融合以产生胚胎。
当应用于花粉时，“新鲜的”表示从花的花药释放的花粉，该花在其器官生长和发育的天然模式中，在响应于促进性环境条件而裂开时释放花粉。
“萌发能力”是指花粉萌发和形成花粉管的能力。
当应用于花粉时，“寿命”是用来描述花粉保持有存活力的和可繁殖的时间长度。
“丧失存活力”是一种花粉特征，其表示花粉的存活力水平已降至低于成功开始种子发育所需的水平。
“丧失繁殖力”是一种花粉特征，其表示花粉的繁殖力水平已降至低于成功开始种子发育所需的水平。
“雄性植物”表示从其采集花粉用于授粉的植物。
“保存(preservation)”是指采集的花粉的任何储存，其导致存活力、繁殖力或两者的水平不同于如果花粉被保持在未调节的周围环境条件下时会发生的存活力、繁殖力或两者的水平。
“储存(storage)”表示容纳花粉以期在以后的时间和/或日期使用花粉的任何期间。
花粉粒之间的“表面与表面接触(surface-to-surface contact)”表示一个花粉粒的表面积的任何部分与一个或多个其他花粉粒的表面积的接触。
“有存活力的(viable)”或“存活力(viability)”用于描述能够萌发并使花粉管生长至花粉粒直径的至少两倍长度的花粉，或者通过证明物质的细胞性质保持完整并被判断为保持完整性从而可能实现正常的细胞代谢过程和细胞内功能，被判断为有存活力的花粉。可以通过多种方式评估花粉的存活力，包括但不限于评估人工培养基或切除的柱头或花柱上的花粉管生长、通过许多种类的活体染色评估细胞完整性、不存在电解质(例如，钾)泄漏和阻抗流式细胞术。存活力可以是指单个花粉粒或花粉粒的群。当用百分比值来描述花粉存活力时，该值通常应用于花粉的群。
“存活力窗口”是指当暴露于未调节的周围环境条件时花粉保持有存活力的寿命期间。
“活力(vigor)”是指花粉性能，例如萌发和管生长的速度。
详细说明
以下是对储存和/或保存花粉的技术和方法的实施方案的详细描述，所述技术和方法通过使采集的花粉经受专门的储存条件和技术，能够提高和/或延长其存活力。花粉可以从主动脱落的植物中采集，或者可选地，花粉可以根据现在或将来本领域已知的其他方法预先采集和储存。这些方法包括例如冷冻、冷冻干燥、储存在液氮中等等。
根据本发明的一个实施方案，为了以提高和/或延长的存活力保存花粉，多个花粉粒包括死亡花粉内含物和活花粉粒，并且防止死亡花粉内含物与活花粉粒相互作用。换句话说，本发明提供了花粉粒彼此之间以及花粉粒与死亡花粉内含物之间的部分或完全的隔离或分离。在许多实施方案中，以使单个花粉粒之间的表面与表面接触最小化的方式保持花粉。如在本公开中更详细讨论的，当花粉粒与其他花粉粒接触时，特别是经历用于储存目的的典型时间段，正在丧失存活力或已经丧失存活力的花粉粒对其他健康花粉粒的繁殖力和存活力产生消极影响。下文的实施例1-3说明了这个概念。在实施例1和随附的图中注意到，簇聚在一起的花粉通常是没有存活力的。此外，实施例2和3显示，死亡的花粉与新鲜花粉混合对新鲜花粉产生消极影响，使得存活力降低。
因此，已经证明死亡花粉内含物是传染剂，其导致活花粉粒比如果将活花粉粒与死亡花粉内含物分离的情况死亡得更快。这可以暗示从死亡或垂死的花粉粒中的具有传染性的细胞内含物的泄漏或某种转移。因此，在不受特定理论束缚的情况下，发明人已经发现，当花粉粒处于垂死的过程中或已经死亡时，可能发生花粉内含物的泄漏。这种泄漏与其他花粉粒相互作用并也导致它们的死亡或丧失存活力。本发明试图最小化和/或防止这种相互作用。因此，本发明包括将死亡花粉内含物与活花粉粒分离。这样采集的花粉可以储存任何时间长度，包括但不限于足以将花粉转移到相同或相邻田间中的植物的时间长度、数分钟、数小时、数天、数周、数月和/或数年。在本发明的优选实施方案中，公开的方法使用物质将死亡花粉内含物与活花粉粒分离，由此防止死亡花粉内含物与活花粉粒之间的相互作用。这种分离可以通过但不限于固体颗粒、液体、流动的空气或气体、降低的重力或者其中花粉粒彼此隔离的储存而发生。在许多实施方案中，防止或限制花粉粒之间和/或花粉粒的细胞内含物之间的表面与表面接触。出于本发明的目的，花粉可以储存在室中。室的尺寸和结构材料可以变化。室可以具有适于容纳一定量花粉的任何尺寸，并且可以是其中储存有花粉的任何种类的管、容器、盒、器皿、外壳或空间，其中该空间用作用于储存不同量的花粉的室。在一些实施方案中，室还可以包含使花粉粒表面的表面与表面接触最小化的固体颗粒、液体和/或气体。
如果本发明的方法中采用的物质除了将死亡花粉内含物与活花粉粒分离之外还满足一个或多个标准，那么是有益的(虽然不是必须的)。首先，如果该物质调节花粉水分含量，那么可以是有益的。如下面更详细地讨论的，某些亲水物质可以完成这个目标。此外，当花粉施用到雌性植物(例如用于机械施用)时，该物质可以提供增加的流动性。如果该物质对于大规模操作具有成本效益，那么这也是理想的，这通常是固体物质或颗粒的一个益处。固体颗粒的另一益处是它们更容易可携带或可运输，当该方法将在采集花粉时对花粉进行时(例如在田间)，这可以是特别有益的。还优选的是，该物质对植物和/或环境无害。此外，优选的是，该物质不与雌性植物相互作用和/或连通(在许多实施方案中，与该物质组合的花粉将施用在所述雌性植物上)。例如，如果该物质不与雌性植物的柱头相互作用，那么可以是有益的。类似地，有益的是，如果在施用之后或紧接在施用之前将该物质与花粉粒分离，使得物质不与花粉和/或雌性植物(包括但不限于花粉受体)结合，以用于施用到雌性植物。
在本发明的实施方案中，其中液体用来分离并由此防止花粉粒彼此之间以及花粉粒与死亡花粉内含物之间的相互作用，可以使用等渗溶液和/或油溶液。优选地，液体将不与花粉粒反应。此外，在优选的实施方案中，将液体和花粉搅动以增强花粉粒彼此以及花粉粒与死亡花粉内含物的分离。搅动可以是偶尔的或连续的，并且优选是连续的。优选地，这种溶液中的花粉粒将不与其他花粉粒和/或死亡花粉内含物长时间接触。此外，在一些实施方案中，花粉可以基本上悬浮在液体中。实施例17说明了花粉在
PD-23矿物油中的成功储存。
类似地，在本发明的一些实施方案中，空气或气体(统称为“气体(gas或gases)”)可以用于将花粉粒彼此以及将花粉粒与死亡花粉内含物分离，由此防止死亡花粉内含物与活花粉粒之间的相互作用。优选地，气体正在流动以实现搅动花粉粒并且将花粉粒彼此以及将花粉粒与死亡花粉内含物分离。还可以使用除了气体的流动之外的搅动，例如偶尔的或连续的搅动。优选地，具有气体的室中的花粉粒将不与其他花粉粒和/或死亡花粉内含物长时间接触。在一些实施方案中，花粉可以基本上悬浮在气体中。
在本发明的又一实施方案中，花粉的物理和/或空间分离可以导致花粉粒彼此和/或花粉粒与死亡花粉内含物的分离，由此防止死亡花粉内含物与活花粉粒之间的相互作用。例如，花粉粒可以储存在单个粒层中，其中在单个花粉粒之间存在空间。在一些实施方案中，储存结构可以提供花粉粒与死亡花粉内含物之间和/或花粉粒彼此之间的物理分离。在其他实施方案中，室中的气体可以提供花粉粒与死亡花粉内含物之间和/或花粉粒彼此之间的分离。在其他实施方案中，有机或非有机结构可以将花粉内含物与死亡花粉内含物和/或其他花粉粒分离。因此，花粉粒彼此不接触。当然，可以使用任何类型的物理分离，无论是现在已知的还是将来已知的。
如上文所讨论的，本文公开的方法提高和/或延长花粉的存活力。有存活力的花粉可以成功地萌发，并且通常具有促进受精和开始种子发育所需的活力。并非所有有存活力的花粉也都是可繁殖的花粉。在一些情况下，即使当花粉粒是有存活力的并且开始花粉管生长时，它也可能缺乏到达胚珠和促进受精所需的活力。没有存活力的花粉粒不能成功地萌发。因此，在本发明的一些实施方案中，期望具有良好的存活力的花粉与本公开中的方法一起使用。成功授粉所需的存活力和繁殖力水平在本领域中通常被接受或定义为平均每根穗丝四粒新鲜花粉，或四至八粒已根据本公开的方法保存的保存花粉。
如上文所讨论的，本发明的许多实施方案需要花粉采集或获取先前已经采集的花粉。出于本发明的目的，花粉采集可以通过任何方法并在植物生长的任何地方进行，例如生长室、温室、玻璃暖房、遮阳房、拱形温室、垂直农业设施、水培设施或提供栽培雄穗的任何生长设施，如下文所述。可选地，花粉可以在储存或保存之前进行田间调节，例如根据题为花粉调节和保存方法(Pollen Conditioning and Preservation Method)的美国专利申请号15/486,737中所述的方法，其全部内容通过引用的方式并入本文。如果使用现场调节，也可以使用现在或将来本领域已知的其他方法进行。在一些实施方案中，现场调节可以在采集后立即发生或在采集与储存之间的任何点发生。此外，可预期的是，现场调节可以包括本发明的方法。
新鲜花粉的采集可以以本领域公知的方式进行。例如，花粉可以从以任何各种方式产生的新鲜脱落的花或雄花结构中采集。在玉米和许多其他物种的情况下，植物是雌雄同株的并且在单一植物上包含雄性和雌性花序。在育种、授粉、异花授粉和杂交的实践中，一些植物充当雄性植物，从其采集花粉用于授粉，而一些植物充当雌性植物，其是花粉接受者。在自花授粉的情况下，单一植物既充当雄性植物又充当雌性植物，因为雌花被来自其自身的雄花的花粉授精。与自花授粉相似，当具有相同遗传学的植物(例如来自同一田间的相邻植物)既充当雄性植物又充当雌性植物时，发生同胞授粉。出于本公开的目的，术语“自花授粉”包括同胞授粉，因为在这两种情况下都涉及相同的遗传学。仍然参考玉米为例，花粉是从雄穗上结的新鲜脱落雄花中采集的，该雄穗可以附着于植物或与植物分离。
可以从适于植物生长的任何环境中生长的植物采集来自任何类型植物的花粉。这样的环境包括但不限于田间、生长室、温室、玻璃暖房、遮阳房、拱形温室、垂直农业设施或水培设施。可选地，通过压碎或研磨花药或通过使它们随着花药干燥自然地继续排出花粉从而释放花粉并允许其采集，可以直接从花药采集花粉。此外，可以从雄穗培养设施采集花粉(Pareddy DR,Greyson RI,Walden DB(1989)Production of normal,germinable andviable pollen from in vitro-cultured maize tassels.Theor Appl Genet 77:521–526)。培养的雄穗可以是成熟的雄穗，其已经从在任何类型的生长设施或环境(包括田间或其他类型的生长设施)中的植物中移除，并在受控环境中置于水中以采集花粉，或者培养的雄穗可以是在未成熟阶段从开花结构收获然后培养以发育成雄穗的组织。
可选地，可以直接采集花药，而不是花粉。在花粉在花药中成熟之前、成熟时间期间或当花粉成熟并被释放时，可以采集花粉。通过将整个花药储存在本发明的组合物中，也可以将其储存以备后用。不成熟的、部分成熟的、接近成熟但尚未释放的花粉或成熟开裂的花粉可以通过剥离、研磨、摇动、干燥或其他类似方法从收集的花药中释放。特别地，研磨对于未成熟的花粉是有效的，因为整个花药与未成熟的花粉的研磨可以在本发明的组合物中进行。此过程将自动将花粉释放到理想环境中，在其中，每个花粉粒的表面在其与其他粒接触的能力方面受到限制。此外，可以采用本发明的方法来储存花药，包括但不限于花粉粒的固体、液体、气体和/或物理分离，以将死亡花粉内含物与活花粉粒分离。
本公开概述了使花粉粒之间的表面与表面接触最小化的方法以及用于使花粉表面与表面接触最小化的物质，以便提高存活力和繁殖力。这些物质可以是基于固体颗粒、液体或气体的组合物，或者可以是固体和气体、液体和气体或者固体和液体的组合。这可以包括在储存期间将花粉从一种物质切换到另一种物质。此外，可以使用物质的组合，包括单一状态(即固体、液体和/或气体)的多种物质，或各种状态的多种物质。此外，物质可以随着时间的流逝而更新或替换，包括使用相同或新的物质。因此，这可以包括在储存期间将花粉从一种物质切换到另一种物质。如本文使用的术语“液体”包括凝胶。
本发明的优选实施方案利用固体颗粒将花粉粒与死亡花粉内含物和/或花粉粒彼此分离，由此防止死亡花粉内含物与活花粉粒之间的相互作用。在许多实施方案中，固体颗粒使花粉粒之间的表面与表面接触最小化。在固体颗粒物质的情况下，优选地应相对于意图要储存的花粉粒的尺寸确定颗粒的尺寸。如果固体颗粒太大，那么它们有时不能有效防止花粉粒之间的接触，因为花粉可能在颗粒之间的空腔中聚集。如果固体颗粒太小，那么它们也不能有效分离花粉粒与死亡花粉内含物，因为它们不提供足够的分离。不同植物物种的花粉的大小可以变化，直径范围约6至100μm。此外，一些花粉粒的表面不是完美圆形，这导致较大的表面积。因此，使用包含一定范围的颗粒尺寸和/或形状的固体颗粒组合物将允许与来自不同物种的花粉一起使用。可选地，常规实验将基于待储存的花粉粒的尺寸和形态学容易地确定固体颗粒的理想尺寸，例如实施例6和7所示。在一个实例中，固体颗粒的尺寸可以在比待储存的花粉小十倍至比待储存的花粉大十倍之间。参考玉米为例，颗粒的优选尺寸可以是20微米。Sipernat 340就是这种尺寸的固体颗粒的一个实例。
进一步的考虑是固体颗粒状物质与花粉粒的比例。物质与花粉的高比例倾向于增加死亡花粉内含物与活花粉粒之间的分离。此外，高比例导致花粉的稀释，这有时有利于将花粉施用到雌性植物。在实施方案的一些实例中，花粉粒与物质的比例可以是1:1至1:100中的任何处。在一些实例中，花粉粒与物质的比例优选是1:3。此外，理想比例可以取决于花粉将被储存的时间量。在短期内，已显示出该比例不太重要。另一方面，随着时间的流逝，该比例在维持保存花粉的存活力方面变得更加重要。实施例10证明，其中固体颗粒状物质与花粉粒的3:1的比例的实施方案优于其他比例，并且还描述了可用于在任何类型的花粉中找到理想比例的常规测试。可以优化该比率以获得益处，包括但不限于增加储存持续期间、分散花粉和/或优化流动性。
优选地，用于将死亡花粉内含物与活花粉粒分离的任何固体颗粒组合物的性质包括不会导致与花粉的消极相互作用的颗粒。在一些实施方案中，固体颗粒具有非反应性质，从而花粉基本上不受颗粒的影响。例如，固体必须不能从花粉中去除太多的水分，因为花粉将死亡。丧失水分影响花粉的存活力，水分丧失越多导致存活力丧失越多，最终导致花粉粒的死亡。实施例8和9显示，与干燥剂一起储存的花粉对存活力产生消极影响。略微亲水性质可以是有益的，因为其可以将死亡花粉内含物与活花粉粒分离。更具体而言，在不受特定理论束缚的情况下，实验已显示，略微亲水的物质吸收从死亡和/或垂死的花粉中逃脱或泄漏的死亡花粉内含物。因为亲水物质吸收这种材料，所以它与活花粉粒分离。此外，略微亲水的材料有助于调节花粉水分含量，这通常可对花粉存活力很重要。略微亲水的物质通常不会像亲水性较高的物质那样使花粉失水。疏水颗粒可能是不太期望的，因为它们可具有避免与花粉粒物理接触的自然趋势，这可能导致花粉与颗粒之间的梯度。但是，一些疏水物质可以是有益的。即，一些疏水物质可以附着于花粉粒的表面并且至少部分地覆盖花粉粒。这种覆盖可以导致死亡花粉内含物与活花粉粒的分离和/或活花粉粒之间的分离。
因此，在本发明的某些实施方案中，花粉水分含量及其调节是有益的。在实施方案的一些实例中，该方法可以包括15％-60％的花粉水分含量。更具体而言，花粉水分含量可以为40％-58％。在甚至更进一步的实施方案中，花粉水分含量可以为45％-55％。在本发明的一些实施方案中，已经发现，花粉可以保持在比先前本领域中认为最佳的水分水平更高的水分水平。因此，在一些实施方案中，如果本发明中使用的物质能够保持较高的花粉水分含量而无损害，那么可以是有益的。
可用于公开的发明的固体颗粒包括但不限于无机颗粒、有机颗粒、休眠调节剂、渗透调节剂、细胞呼吸抑制剂和破坏剂、电子传输抑制剂、膜电子传输解偶联剂、膜稳定剂和调节剂、细胞壁稳定剂和调节剂、生长调节剂、植物激素、冷冻保护剂、单糖、二糖、多糖、抗絮凝剂、分散剂、膨润土、马铃薯淀粉、玉米淀粉、纤维素、砂、干燥剂、流动剂、矿物油、石蜡油、液体中的糖、干糖、水和活性炭。应理解，待使用的固体颗粒的选择可以受到待储存的花粉类型的影响。例如，选择可以基于尺寸和/或特定花粉对某些相互作用和特征的耐受性。理想的组合物可以包括被选择以使花粉存活力和寿命最大化的单一固体颗粒类型或者颗粒类型的组合。它还可以包含一定范围的颗粒尺寸，以确保以相等的效率分离较大和较小的花粉粒。可以根据实施例4和5进行常规实验，以确定用于储存目的的最佳颗粒或颗粒混合物。
此外，添加将增加储存的花粉的流动性的物质可以是有益的，使得花粉可以在随后的日期容易地施用于植物。这种化合物必须不导致储存介质中其他固体颗粒之间以及花粉粒之间的消极相互作用。将死亡花粉内含物与活花粉粒分离并还有助于流动性的化合物的实例包括但不限于
50、
50S、
2200、
22、
22S、
340、
350、
SM660、霍霍巴珠、
200、
244、等渗缓冲液、油和气体。
在又一实施方案中，物质可以是空花粉粒。即，已经被洗去或以其他方式清空其内部组合物的花粉粒可以用于将死亡花粉内含物与活花粉粒分离，从而防止两者之间的相互作用。
使用液体或气体以防止花粉粒之间的表面与表面接触也可以用于实现本发明的目的。在这种情况下，防止死亡花粉内含物与活花粉粒之间的相互作用。在气体的情况下，恒定的气体流过包含花粉的室使颗粒悬浮，并使可能由于缺乏流动而遇到的任何接触减至最少。在将花粉储存在液体中的情况下，等渗的缓冲液不易跨花粉膜交换流体，因此是优秀的储存介质。类似地，例如矿物油的疏水溶液也使跨膜的流体交换最小化。
花粉可以经受额外的保存步骤，以便增加其在储存时期内保持存活力和繁殖力的能力。花粉的储存准备需要仔细的过程，包括具有已知相对湿度水平以及特定温度和大气压条件的环境。例如，温度可以为1℃至约10℃。在一些实施方案中，相对湿度可以为50％-100％。此外，空气压力可以为15kPa–150kPa。此外，有用气体的存在将有助于使储存成功最大化。有用气体可以包括但不限于氮气、二氧化碳、一氧化二氮、氧气或这些气体的混合物。
可选地，在花粉储存时期期间，可以机械地搅动容纳在室内的花粉。搅动可以是偶尔的或连续的。在优选的实施方案中，搅动是连续的。搅动用于使花粉的最大表面积暴露于室中的添加剂(无论固体、液体或气体)，从而确保花粉与添加剂的均质混合，并且防止花粉粒的表面与表面接触、花粉的结块以及在一些花粉粒死亡的情况下坏死的蔓延。实验数据(特别是下面的实施例2和3)已经显示，当活花粉粒表面接触垂死或死亡的花粉粒的表面时，活花粉会受到消极影响并将随后死亡。可以以多种不同方式来实现对组合物中花粉粒(包括死亡或垂死的花粉粒)的连续、定期和/或偶尔的搅动，包括使用振动、强制空气、旋转、混合或其他方式。
如在前面的段落中详细解释的，使用所公开的方法最大化和延长花粉的存活力需要在限定的范围内仔细地操纵多个因素中的一个或多个。使用玉米花粉作为测试物种的实验室产生的数据表明，用于提高花粉存活力的条件包括修改室内的一种或多种条件以使其落入如下所述的公开范围内。
可以将容纳组合物中的花粉的室的温度维持在约1℃至约10℃，包括约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃和约10℃。虽然通常优选较低的温度，但是本发明还具有在环境温度和/或高温下维持和/或增加花粉存活力的能力，这是本领域迄今为止未知的。即，根据Lyakh,et.al.,Euphytica 55:203-207,1991，即使在非常短的暴露时间(3-5分钟)下，在35摄氏度下加热成熟花粉也降低了玉米花粉粒的存活力。但是，如下面的实施例16所示的，本发明的方法能够在高达32.8摄氏度的温度下以相当大的成功维持和/或增加玉米花粉存活力。因此，本发明的方法可以包括在任何温度下储存花粉。在实施方案的一些实例中，高温和/或环境温度方法可以方便地在田间使用和用于运输。
在实施方案的实例中，经受公开的方法的花粉可以用于花粉是商业或实验单元的任何应用中。在一个实例中，保存的花粉可以用于在任何设置(包括但不限于实验室、温室和田间)中产生种子、杂交种、母本或其他。在另一个实例中，花粉可以用于在任何设置(包括但不限于实验室、温室和田间)中产生谷物、杂交种或其他。此外，如上文所讨论的，这种方法可以应用于来自Poaeceae(禾本科)科植物的花粉，以及其中期望使用花粉的任何其他植物物种。
本发明中公开的保存技术旨在成功地保存花粉，使得保存的花粉保持其存活力至约4至约20个花粉粒足以成功地对一个胚胎授粉的程度。
尽管上文已经以某种程度的细节描述了本发明的各种代表性实施方案，但是本领域技术人员可以在不偏离说明书和权利要求书中提出的发明主题的精神或范围的情况下对所公开的实施方案做出许多改变。在一些情况下，在本文中直接或间接提出的方法论中，以一种可能的操作顺序描述了各种步骤和操作，但是本领域技术人员将认识到，可以重新安排、替换或消除步骤和操作，而不必然偏离本发明的精神和范围。旨在在上文的描述中包含的或在附图中示出的所有事项应被解释为仅是说明性的而非限制性的。在不偏离所附权利要求所限定的本发明的精神的情况下，可以进行细节或结构的改变。
尽管已经参考上文所概述的实施方案描述了本发明，但是各种替代、修改、变化、改进和/或实质等同方案，无论其是已知的还是现在能预见的或可能预见的，对于至少具有本领域普通技能的人来说都是显而易见的。以某种顺序列出方法的步骤不构成对该方法的步骤顺序的任何限制。因此，上文提出的本发明的实施方案旨在是说明性的而非限制性的。本领域技术人员将认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行改变。因此，本发明旨在涵盖所有已知或早期开发的替代、修改、变化、改进和/或实质等同方案。
以下实施例更详细地说明了本发明，并说明了本文所述的发明如何在各种物种的花粉中实施。
实施例1
试验已经证明花粉密度与其成功形成花粉管的能力之间的相关性。将花粉放置在人工液体培养基中是用于测量花粉粒存活力的常用做法。
在人工液体萌发培养基在确定花粉存活力方面起关键作用的情况下，在本公开中的发明的开发过程中，已经进行了数千次测定来测试储存的花粉的存活力。在整个该实验中，已经注意到，当与不直接与其他花粉粒接触的花粉相比时，在人工液体萌发培养基中簇聚在一起的花粉具有较低的整体萌发率。图1证明了花粉粒的簇没有成功形成管。该观察已促进用于花粉储存的组合物的发展，所述组合物防止花粉粒彼此接触并且将活花粉粒与死亡花粉内含物和/或其他活花粉粒分离，从而防止这种接触可能产生的任何消极影响。
实施例2
为了评估死亡或垂死的花粉对新鲜花粉的消极影响，测试了几种产生死亡花粉的方法以观察对新鲜花粉的影响。将每批死亡花粉与新鲜采集的花粉样品混合。
收集一批20mL新鲜脱落的玉米花粉，并将其平均分入五个不同的50mL离心管，其中两个是对照管。对花粉样品进行杀死花粉的三种不同的处理。将第一份样品倒入玻璃试管中，然后将其放入设定为95℃的加热块中，持续5分钟。花粉的烧焦外观使它看起来碳化，并且在样品中可视觉检测到极少的水分含量。对于第二种处理，将新鲜采集的花粉放入玻璃试管中，并微波处理1分钟的时段。微波是通常用作在Amphasys流式细胞仪上产生杀死步骤的手段。微波破坏细胞膜，导致细胞质内含物溢出，从而杀死花粉。对于第三种处理，将新鲜采集的花粉放入玻璃试管中，然后将其放入设定为95℃的加热块中，持续3分钟。花粉的外观呈半碳化状态，样品的烧焦程度低于碳化处理。对于第四种处理，使用了不同的花粉来源。该花粉已在一个月前采集，并已使其在21℃和50％相对湿度下彻底干燥30天以上的时段。因为在这种条件下玉米花粉的寿命很短，所以预期该花粉完全死亡。
进行了新鲜脱落的花粉的另一次收集。将新鲜花粉以相等的体积添加到上述四个处理过的花粉样品中的每个中。摇动每个试管以充分混合内含物，使其静置10分钟，然后通过将试管的内含物施用到新鲜的穗丝上而施用到穗丝。
使授粉的穗在数周的过程中成熟，然后收获。对于每种处理，计数并记录每个穗的穗粒数。总之，图2中的数据显示了，当将它们混合在一起时，各种处理产生的死亡花粉严重影响健康花粉的存活力。
微波处理的花粉对整体新鲜花粉存活力具有最大影响，平均每个穗仅产生2个穗粒。半碳化的花粉紧邻于最低的，接着是旧的干燥的花粉。最后，碳化的花粉显示了最小量的影响，但花粉存活力仍大大降低。显然，将新鲜花粉维持在健康、有存活力的状态需要维持花粉粒之间的分离，特别是防止健康的花粉与死亡或垂死的花粉的相互作用。
实施例3
为了进一步评估死亡或垂死的花粉对新鲜花粉的消极影响，进行了若干测试以观察死亡花粉对新鲜花粉以及4天龄花粉的影响。将每批死亡花粉与新鲜采集的花粉样品混合。
将新鲜采集的花粉和4天龄花粉分别分成四个样品。然后将已经干燥30天以上的时段的玉米花粉(因此是死亡的)添加到4组管中的3组中。第一管用作对照，并且没有向其添加死亡花粉。第二组管以活花粉与死亡花粉的75:25比例混合。第三组管以活花粉与死亡花粉的50:50比例混合。第四组管以活花粉与死亡花粉的25:75比例混合。使用Amphasys在零时间、24小时和5天获得存活力百分数。该数据在图3中示出。为了使每个数据组具有相等的相对性，将零时间存活力分数归一化为100％存活力，并且以线性形式绘制预期的花粉存活力丧失率。在24小时之后，使用Amphasys获取的存活力分数表明，在每种混合比例下，死亡花粉导致健康的大大超过线性形式的指数衰减。还注意到这样的趋势：死亡花粉与活花粉的比例越高，样品整体健康的下降发生得越快。最后，4天龄样品组的健康整体下降比新鲜花粉的管组更加明显，这表明已经开始劣化的花粉受添加的死亡花粉的影响大于新鲜花粉样品。
实施例4
在考虑将不同类型的分离化合物用于花粉储存的初始实验中，使用活性炭作为分离物进行了实验。从各种玉米基因型中手工采集田间花粉，并在5℃下暂时储存在50mL锥形管中。T0 Amphasys与未混合的对照花粉的花粉水分含量(PMC)测定一起进行。Amphasys使用阻抗流式细胞仪提供可靠的花粉存活力测定，其测量花粉粒的电性质。使用标准的过夜烘烤方法，T0时的存活力为97％，PMC为57％。将花粉与炭粉(活性炭)以不同百分比混合。活性炭通常用于吸收有毒物质。然后将混合的样品在5℃下储存在无盖50mL管中。当炭浓度允许时，使用Amphasys在第1天和第6天收集时间点数据。将少量样品悬浮在Ampha 6培养基中，然后用150μm过滤器过滤，以去除可能影响Amphasys流体性能的任何大颗粒。如图4所示，炭的百分比既影响花粉存活力，又影响花粉水分含量(PMC)。以较低的量(在这种情况下为2.5-25％)使用时，在储存6天后的存活力仍高达92％。然而，随着样品变得蓬松并在第6天聚集起来，发现流动性差的问题。
实施例5
为了花粉粒分离的目的，在继续努力测试不同物质时，用一系列不同的糖进行了实验以确定花粉粒分离和保存的功效。从在温室中生长的各种主动脱落的玉米植物中采集混合花粉。进行手工采集，用漏斗和筛子去除花药。将整体花粉样品分成四个相等的部分，其中每个部分的体积为约5mL。将每个花粉样品在5℃下在有盖的50mL锥形管中储存过夜，并在收集后约24小时使用Amphasys测试其活力。将1:1体积比的三种不同类型的糖之一添加到每个试管中，使得每个试管中糖的量等于花粉的量。然后将试管倒置多次以将糖与花粉充分混合。试管1包含玉米花粉与肌醇的1:1混合物，试管2包含玉米花粉与乳糖的1:1混合物，试管3包含玉米花粉与海藻糖的1:1混合物。试管4用5mL花粉作为对照。将每个试管加盖并储存在4℃的环境中。在24小时、2天、5天、8天和13天的时间点从每支试管的小等分试样中收集Amphasys存活力数据。该数据如图5所示。
在储存24小时之后，当与其他样品相比时，海藻糖样品的存活力显示出存活力的轻微下降。当与其他3个样品相比时，第2天显示出海藻糖样品的存活力急剧下降。第5天显示出所有样品的存活力急剧下降，除了乳糖。第8天提供了一个非常明确的指标，其表明乳糖显示出良好的花粉保存，与对照中的24％相比，存活力为77％。基于整体结果，确定了糖可以是合适的分离化合物，以用于保持花粉粒彼此分离，同时维持存活力，并且乳糖特别适于保持玉米花粉粒彼此分离且保持存活力。还注意到，乳糖样品中的花粉本质上是轻微成块的，其花粉不像新鲜收获的花粉那样自由流动。
实施例6
为了研究储存化合物粒径对花粉分离和储存的影响，将一系列固体颗粒状组合物用于花粉储存并施用到正在生长的玉米植物上的穗丝。从主动脱落的玉米植物中收获新鲜花粉。将花粉分成六个相等的样品，将其分别放入50mL离心管中。随后，每个样品具有相等比例的添加到花粉中的特定尺寸的二氧化硅颗粒。添加的二氧化硅颗粒的尺寸范围为5.5μ至340μ。在添加颗粒之后，将每个管混合并在4℃下放置储存24小时。然后用5个装在新果穗袋中穗从每个管中的混合物进行手工授粉，并在授粉后将穗装袋，以防止其他花粉落在穗丝上。允许穗成熟，在此之后收获穗，并计数每个穗的穗粒总数。数据显示在图6中。20μ粒径产生最高的平均穗粒数，但是其余粒径也以不同功效率产生穗粒。该实验证明了如何对特定的花粉尺寸确定最佳的粒径。
实施例7
为了进一步研究粒径对花粉分离、储存和流动性的影响，将一系列固体颗粒状组合物用于花粉的长期储存。在基于乳糖的分离化合物中使用不同的添加剂，以测试花粉的流动性是否得到改善，以最终用于田间环境中花粉的机械应用。
表1
在活性花药的开始阶段，收获合并品种的玉米雄穗并将其储存在
生长室中。为了延长雄穗的生产力，出于采集目的，对
生长室进行了编程，使其在12℃和90％RH下运行18小时，在26℃和70％RH下运行6小时。从玉米雄穗中手工采集合并的花粉，并将其与表1中的每种添加剂以1:3的体积比混合。还制备了对照样品，其仅包含花粉，而没有任何储存介质。将对照样品以及花粉和颗粒的样品混合物储存在加有过滤器盖的50mL离心管中，这些离心管保留在封闭的较大密封容器中，该容器具有约100mL的Dry&Dry二氧化硅珠干燥剂。过滤器盖具有网状元件，其允许空气通过而不会溢出花粉。将密封容器在3℃下储存在生长室中。这样保持微气候，该微气候是冷的并且略微干燥，用于储存带过滤器盖的管。
注意到在混合样品时，霍霍巴珠和
2200混合物很难操作，因为它们导致混合物结块，表明流动性差。
在测试时段开始时，使用Amphasys的T0存活力为89.26％。在储存三天之后，使用Amphasys系统测试储存的花粉样品以测量存活力。Amphasys使用阻抗流式细胞仪提供可靠的花粉存活力测定，阻抗流式细胞仪测量花粉粒的电性质。
如图7所示，对照样品显示了存活力的小幅降低，并由于高PMC而具有差的流动性。所有其他测试样品都显示了强的存活力和流动性。
实施例8
在具有干燥剂处理和不具有干燥剂处理的情况下，将一系列固体颗粒状组合物用于花粉的长期储存。使用了不同的添加剂来测试花粉的改善的流动性，以用于田间环境中花粉的机械应用。
表2
在活性花药的开始阶段，收获合并品种的玉米雄穗并将其储存在
生长室中。为了延长雄穗的生产力，出于采集目的，对
生长室进行了编程，使其在12℃和90％RH下运行18小时，在26℃和70％RH下运行6小时。从玉米雄穗中手工采集合并的花粉，并与表2中的组合物以1:3的体积比混合(将1mL的花粉添加到3mL的组合物中)。还制备了对照样品，其仅包含花粉，而没有任何颗粒状介质组合物。将样品储存在加有过滤器盖的样品管中。过滤器盖具有网状元件，其允许空气通过，但是防止管内含物溢出。制备两组相同的样品。将一组样品混合并在含有如实施例7所述的干燥剂的密闭容器中储存，以储存两天。将第二组样品也储存在容器中，但是没有任何干燥剂。在储存两天之后，将所有装有干燥剂的容器中的样品移至无干燥剂的容器中。该实验的目的是通过略微但不过度降低花粉水分含量来证明任何存活力的提高。
在测试时段开始时，使用Amphasys的T0存活力为97％。在储存二天和六天之后，使用Amphasys系统测试储存的花粉样品以测量存活力。Amphasys使用阻抗流式细胞仪提供可靠的花粉存活力测定，阻抗流式细胞仪测量花粉粒的电性质。数据显示在图8中。
除对照样品外，所有未干燥的样品的性能均优于暴露于干燥剂的样品。在第2天和第6天就是这种情况。所有样品在6天时都显示出强的存活力。在这种情况下，用添加剂进行干燥不增加储存期间的存活力。与组合物混合的所有样品均具有比对照样品更好的存活力。
实施例9
测试具有和不具有干燥剂的花粉储存，以确定干燥剂对花粉存活力的影响。收获混合品种和年龄的玉米雄穗，并将其储存在
生长室中。为了延长雄穗的生产力，出于采集目的，对
生长室进行了编程，使其在12℃和90％RH下运行18小时，在26℃和70％RH下运行6小时。通过在允许花粉通过而不允许花药通过的筛子上敲击雄穗，从生长室雄穗中采集总计刚刚超过3克的花粉。用Whatman滤纸#4制成袋，并向每个袋中添加1.75g新鲜花粉。将袋滚动并放置到50mL锥形管中。一些管中包含30mL的Dry&Dry硅胶珠干燥剂。将管盖好并在3℃下储存三天。
使用Amphasys在3天时进行的测试表明，与干燥剂一起储存的花粉的花粉水分含量(PMC)为10.9％，存活力为0.67％。在没有干燥剂的情况下储存的花粉的PMC为57％，存活力为91.52％。
该实验证明，在冷储存期间与干燥剂的过多接触不支持花粉存活力和寿命。
实施例10
进行了一项研究，以基于花粉与物理花粉分离化合物的比例确定对花粉存活力是否有影响。在活性花药的开始阶段，从夏威夷收获并运输玉米雄穗合并品种并将其储存在
生长室中。为了延长雄穗的生产力，出于采集目的，对
生长室进行了编程，使其在12℃和90％RH下运行18小时，在26℃和70％RH下运行6小时。从玉米雄穗中手工采集合并花粉，并使用Amphasys对一小部分零时间花粉进行了存活力测试，获得了96％的存活力。
将剩余的花粉分成四个等量，并放置在50mL离心管中。并以三种不同的重量比与包括96％乳糖和4％
的分离化合物混合。第一管用作对照，并且没有向其添加分离化合物。第二管的花粉与分离化合物的比例为3:1。第三管的花粉与分离化合物的比例为1:1。第四管的花粉与分离化合物的比例为1:3。将每个管彻底倒置以将花粉与分离化合物混合，并将其置于4℃下储存。在4、6、10、12和17天之后，使用Amphasys检查每个管的花粉存活力。数据显示在图9中。
在储存4天之后，所有花粉与分离化合物的比例均优于对照。在储存6天之后，当与1:1和1:3的比例相比时，花粉与分离化合物的3:1比例的存活力开始急剧下降，但是仍然优于对照。花粉与分离化合物的1:1比例的存活力也开始下降。在储存10天之后，相同的趋势在继续。在12天之后，对照样品和3:1比例样品都未显示出有存活力的花粉。1:1样品显示出低水平的存活力，然而1:3比例样品仍显示出80％的存活力。即使在17天之后，1:3比例样品也测试出56％的存活力。所提供的该测试进一步证实了在储存期间花粉粒之间发生的分离越多以使接触最小化，在储存时段期间花粉将保持有存活力的时间越长。
实施例11
为了确定维持花粉分离的方法在其他植物物种中是否有效，对小麦进行了实验。格兰丁小麦品种的小麦头在出苗早期和出苗后阶段采集。在出苗后阶段，小麦头上暴露了一些花药。从头的子样品中采集花药，并将采集的花药用尼龙杵在1.5mL Ampha 6培养基中研磨，过滤，且通过Amphasys系统运行，以测定T0存活力。Amphasys使用阻抗流式细胞仪提供可靠的花粉存活力测定，阻抗流式细胞仪测量花粉粒的电性质。
从每个头的不同区域中获取出苗早期阶段和出苗后小麦头的第二子样品。将这些样品全部在冷冻小瓶中在5℃下储存。小瓶中的样品没有储存介质、乳糖颗粒状储存介质、或乳糖(实验室级D-乳糖一水合物，RPI#L26100-1000.0)与2％
340存储介质的组合。在储存3天或14天之后，使用尼龙杵从储存的花药中提取花粉，并使用Amphasys测定存活力。
来自样品的花粉存活力在下面的表3中提供。
表3：小麦花粉存活力
该实验的结果显示在图10中。在3天时，当与出苗早期花药中的T0数据相比时，存活力有小幅提高。无论处理如何，成熟的花药都具有相似的存活力。在基于乳糖的介质中的储存显示出优势。
实施例12
进行另一实验以测试维持水稻中花粉粒分离的功效。从一组剪短颖片(cut backglume)中采集水稻花药。将一个花药样品在1.5mL Ampha 6培养基中用尼龙杵研磨，过滤，且通过Amphasys系统运行以测定T0存活力。Amphasys使用阻抗流式细胞仪提供可靠的花粉存活力测定，阻抗流式细胞仪测量花粉粒的电性质。
将花药的第二子样品分成三组，将其全部在冷冻小瓶中在5℃下储存。这些样品全部在冷冻小瓶中在5℃下储存。小瓶中的样品没有储存介质、乳糖颗粒状储存介质或化学级乳糖与2％
340存储介质的组合。在储存4天或10天之后，使用尼龙杵从储存的花药中提取花粉，并使用Amphasys测定存活力。数据显示在图11中。
来自样品的花粉存活力在下面的表4中提供。
表4：水稻花粉存活力
在第4天时，当与来自仅乳糖介质中储存的花药的花粉的T0数据相比时，花粉的存活力有所提高。
实施例13
进行了穗粒组实验，以确定与分离化合物一起储存的花粉是否会比新鲜花粉施用或开放授粉导致更多或更少的穗粒。对于该实验，除了允许自然授粉的一组开放授粉植物外，将单个基因型的受试植物在田间装在新果穗袋中(shoot-bagged)。对于阴性对照植物，从未移除新果穗袋。对于对照授粉，采集大量新鲜脱落的花粉并将其分成两部分。第一部分用于对对照植物进行手工授粉，此时将其装袋以防止额外的花粉在穗丝上积聚。将第二批花粉与1:1比例的新鲜花粉与98％乳糖和2％Sipernat 340的分离化合物混合。将这些花粉样品在4℃下储存24小时。在24小时之后，将新果穗袋从保留用于分离化合物测试的植物移除，将混合在分离化合物中的花粉施用到穗丝，再次将植物装在新果穗袋中以防止额外的花粉在穗丝上积聚。使所有授粉的植物成熟，并收获来自每种处理的穗。在每个穗上进行穗粒计数，数据显示在图12中。该数据显示了开放授粉植物、对照植物或与分离化合物一起储存的花粉授粉的植物之间没有统计学差异。这证明与分离化合物一起储存的花粉保持了完整的存活力，并且比用新鲜花粉授粉的对照穗获得更高的穗粒数。
实施例14
该实施例测试了97％乳糖与3％
D17的混合物作为分离化合物的性能。从玉米雄穗上收获新鲜脱落的花粉，且使用Amphasys测定的T0存活力为95.8％。将剩余的花粉与分离化合物以1:1的体积比混合。在第3天和第7天使用Amphasys测量花粉的存活力，并在每个间隔对装在新果穗袋中的穗进行手工授粉，在授粉后将袋放置在穗丝上以防止额外的花粉落在穗丝上。尽管每个储存间隔都包含有存活力的花粉，但是田间授粉未能产生穗粒。在仔细检查具有花粉的添加剂混合物后，很明显，略微疏水的
D17产品正在涂覆花粉，防止其在施用时与穗丝的结合。
图13提供了涂覆有
D17产品的花粉的显微图像。花粉上的涂层导致滑的表面，尽管事实上花粉是有存活力的，但是仍阻止了授粉成功。此外，图像显示，花粉粒在储存14天之后仍具有相当多的水分。该实验证明常规实验可以容易地测试各种分离化合物的功效，并且可以容易地鉴定出最适合于所关注的花粉和植物结构的那些化合物。
实施例15
分别测试了酪蛋白和纤维素作为用于维持或增加花粉存活力的可能物质。先前的文献已经提出，酪蛋白尤其是与花粉兼容的物质。从主动脱落的雄穗中收获新鲜收获的玉米花粉。将花粉分成两个相等的部分，将每个部分放置到50ml离心管中。第一管具有向管中添加的等份的酪蛋白。第二管具有向管中添加的等份的纤维素。将每个管在4摄氏度下储存24小时。在24小时之后进行萌发试验。结果显示，酪蛋白和纤维素都对花粉的存活力有害，如图14和图15所示。即，图14显示，在4摄氏度下储存20小时之后，与酪蛋白混合的花粉很大程度上(即使不是完全)没有存活力。此外，图15显示，在4摄氏度下储存20小时之后，与纤维素混合的花粉几乎没有存活力。
实施例16
进行测试以确定本发明在热条件下的性能。在实验中，收获大量新鲜花粉。使用Amphasys进行零时间花粉存活力。然后将花粉与1:5比例的1份花粉、5份98％乳糖和2％Sipernat 340混合。将混合物分配到2个不同的1夸脱容器中，每个容器容纳的总体积为100mL。在取样进行存活力测试之前，将第一个容器加盖并旋转，以确保没有基于容器中花粉层的偏差。在取样以在Amphasys上进行存活力测试之前，将第二个容器加盖并不旋转。在测试期间，将两个容器都放置在直射的阳光下。在整个测试时段中，温度范围从29.6摄氏度到32.8摄氏度。数据显示，在暴露于热的整个330分钟内，每种处理中的花粉都保持高度有存活力，如图16所示。
实施例17
测试了
PD-23矿物油作为花粉分离试剂。该物质在所述实验的所有阶段都为液体。将从大量玉米植物中新鲜收获的花粉放置到矿物油中，并在4摄氏度下储存20小时的时段。在20小时之后，将萌发培养基施用到油制剂中。结果支持了液体可用作花粉的有效储存介质。此外，彼此直接接触的花粉粒大多不能萌发，而不与其他花粉粒接触的高百分比的花粉粒形成花粉管。这进一步支持了花粉粒的分离增加存活力的概念。结果如图17所示。
Claims (23)
1.一种保存多个花粉粒的方法，包括防止死亡花粉内含物与活花粉粒相互作用。
2.如权利要求1所述的方法，包括将花粉粒与至少一种物质一起储存，其中所述至少一种物质防止死亡花粉内含物与活花粉粒相互作用。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述至少一种物质选自固体、液体、气体和它们的组合。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述至少一种物质围绕或隔离至少一个花粉粒。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述至少一种物质使所述多个花粉粒之间的表面与表面接触最小化。
6.如权利要求3所述的方法，其中花粉水分含量维持在15％-60％。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述花粉水分含量维持在35％-60％。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述方法包括将所述花粉和所述至少一种物质混合。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述混合是连续的。
10.如权利要求3所述的方法，其中所述至少一种物质是固体。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述至少一种物质与花粉粒的比例为至少1:1。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述至少一种物质与花粉粒的比例为至少3:1。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述至少一种物质的尺寸范围是从最大为比花粉粒尺寸大十倍到最小为比花粉粒尺寸小十倍。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述物质包括变化尺寸的颗粒。
15.如权利要求3所述的方法，其中所述物质选自乳糖、
50、
50S、
2200、
22、
22S、
340、
350、
SM660、霍霍巴珠、
200、
244和它们的组合。
16.如权利要求3所述的方法，其中花粉粒选自新鲜采集的花粉和储存的花粉。
17.如权利要求3所述的方法，还包括现场调节花粉。
18.一种保存多个花粉粒的方法，其中将花粉粒与一种物质混合，其中所述物质导致花粉粒具有15％-60％的花粉水分含量。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述花粉水分含量为35％-60％。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述花粉水分含量为45％-55％。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述物质是亲水的。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述物质还防止死亡花粉内含物与活花粉粒相互作用。
23.如权利要求18所述的方法，其中所述方法包括在花粉采集之后将花粉水分含量减小到小于60％。
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| US11998007B2 (en) * | 2021-03-12 | 2024-06-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Maize pollen composition for collecting pollen and storing pollen |
| AR129393A1 (es) * | 2022-05-26 | 2024-08-21 | Syngenta Crop Protection Ag | Almacenamiento del polen de maíz y portadores |
| US20240237637A1 (en) | 2023-01-17 | 2024-07-18 | Accelerated Ag Technologies, Llc | Poaceae pollen preservation and stabilization method |
| CN116098054B (zh) * | 2023-03-17 | 2023-07-18 | 浙江省柑橘研究所 | 一种柑橘杂交育种父本花粉的制备方法及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1118650A (zh) * | 1994-09-15 | 1996-03-20 | 湖南师范大学 | 农作物花粉的贮藏方法 |
| US20140271535A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Thomas T. Yamashita | Compositions for enhancing pollination and methods for using same |
| CN105104363A (zh) * | 2015-09-08 | 2015-12-02 | 玉溪中烟种子有限责任公司 | 利用烟草种子油脂延长烟草花粉贮藏时间的方法 |
| CN105191581A (zh) * | 2015-10-22 | 2015-12-30 | 山西省农业科学院园艺研究所 | 一种授粉用梨花粉的获得方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2669066A (en) * | 1948-04-19 | 1954-02-16 | Leo C Antles | Method of treating and applying live pollen |
| SU1340668A1 (ru) * | 1984-05-08 | 1987-09-30 | Таджикский государственный университет им.В.И.Ленина | Способ определени жизнеспособности пыльцы хлопчатника |
| US6141904A (en) | 1994-06-15 | 2000-11-07 | Garst Seed Company | Method of hybrid crop production using dehydrated pollen from storage |
| US5596838A (en) | 1994-06-15 | 1997-01-28 | Zenco (No. 4) Limited | Method and instrument for the preparation of pollen for cryogenic storage |
| JP2004357628A (ja) * | 2003-06-06 | 2004-12-24 | Katsumi Koide | 花粉加工方法 |
| US10524427B2 (en) * | 2004-02-13 | 2020-01-07 | Klondike Agricultural Products, LLC | Agricultural systems and methods |
| CN1762202A (zh) * | 2005-11-08 | 2006-04-26 | 中国科学院植物研究所 | 一种延长向日葵花粉使用寿命的方法 |
| JP5143579B2 (ja) * | 2008-01-30 | 2013-02-13 | 株式会社ミズホケミカル | 溶液授粉用粉体組成物 |
| EP2915423B1 (en) * | 2014-03-06 | 2021-08-11 | Amphasys AG | Method for the determination of pollen viability and maturation grade of a pollen population |
| CN104498426A (zh) * | 2014-12-15 | 2015-04-08 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | 大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术 |
| WO2017180849A1 (en) * | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Accelerated Ag Technologies, Llc | Pollen field conditioning and preservation method |
| CN106242627A (zh) * | 2016-08-09 | 2016-12-21 | 丁玉琴 | 一种以蒲公英花粉为模板制备双层轻质保温材料的方法 |
-
2018
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-
2020
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1118650A (zh) * | 1994-09-15 | 1996-03-20 | 湖南师范大学 | 农作物花粉的贮藏方法 |
| US20140271535A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Thomas T. Yamashita | Compositions for enhancing pollination and methods for using same |
| CN105104363A (zh) * | 2015-09-08 | 2015-12-02 | 玉溪中烟种子有限责任公司 | 利用烟草种子油脂延长烟草花粉贮藏时间的方法 |
| CN105191581A (zh) * | 2015-10-22 | 2015-12-30 | 山西省农业科学院园艺研究所 | 一种授粉用梨花粉的获得方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| US20240292833A1 (en) | Pollen collection methods, pollen compositions and uses thereof | |
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