BR112020000213B1 - Método de preservação de pólen - Google Patents
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Abstract
método de preservação de pólen a presente invenção descreve métodos de preservação de pólen, tal que o pólen tenha viabilidade aperfeiçoada quando comparado a pólen que seja deixado em condições ambientais. um método da presente invenção inclui a separação do conteúdo de pólen morto de grãos de pólen vivos. em algumas modalidades, grãos de pólen são armazenados com uma substância que impede que o conteúdo de pólen morto interaja com grãos de pólen vivos. a substância pode ser um sólido, um líquido, um gás ou combinações dos mesmos. em algumas modalidades, a substância pode, pelo menos parcialmente, regular o teor em umidade do pólen, tal como mantendo o teor em umidade do pólen em 15-60%.
Description
[0001] Este pedido reivindica a prioridade a partir do Pedido Provisório dos Estados Unidos de Número de Série 62/529.198, depositado em 06 de Julho de 2017 e intitulado “METHOD OF IMPROVING POLLEN VIAIBLITY AND STORABILITY”. O conteúdo do Pedido Provisório dos Estados Unidos de Número de Série 62/529.198 é aqui incorporado em sua totalidade por referência.
[0002] Esta invenção se refere, de maneira geral, a um novo método para aumentar a viabilidade e a fertilidade globais de pólen e para impedir a necrose do pólen, que resulta em pólen aperfeiçoado para uso na polinização de plantas. A invenção pode ser conduzida ou com pólen fresco ou com pólen que tenha sido previamente armazenado ou preservado.
[0003] A presente invenção tem aplicação no campo de longevidade e de viabilidade de pólen. A longevidade de pólen é significativamente influenciada por condições ambientais, muitíssimo notavelmente temperatura e umidade relativa. O pólen, que é naturalmente derramado a partir das flores ou de estruturas de floração de angiospermas, está sujeito à rápida perda de viabilidade uma vez que ele seja derramado a partir da planta. A viabilidade pode ser perdida em minutos a horas, dependendo da espécie e das condições ambientais. A exposição ao ar seco e à elevada temperatura é particularmente prejudicial à viabilidade e à longevidade do pólen uma vez que ele seja derramado a partir da planta. Portanto, sob condições de campo naturais, o pólen tem um tempo de vida limitado, durante o qual ele permanece viável, a que se refere, neste pedido, como a “janela de viabilidade”, conforme fornecida aqui abaixo. Em particular, o pólen a partir da família de plantas Poaeceae (Gramineae), a que se refere comumente como gramíneas, é particularmente vulnerável e de vida curta (Barnabas & Kovacs (1997) In: Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement. (1997). Sawhney, V.K. e K.R. Shivanna (eds). Cambridge University Press, pp. 293-314). Essa família de plantas inclui muitas culturas de cereais economicamente importantes, incluindo milho. Métodos para aperfeiçoar a viabilidade do pólen e estender a duração de sua viabilidade são de valor significativo para a indústria da agricultura.
[0004] De maneira específica, se o pólen coletado a partir de plantas puder ser armazenado em um estado viável por um período de tempo, este pólen pode ser usado para polinizar flores femininas, conforme desejado, de inúmeras maneiras vantajosas. A utilização de pólen armazenado propicia a polinização, que não seja dependente do derramamento de pólen ativo, da sincronia temporal com a receptividade do pistilo (flor feminina), do uso de esterilidade masculina e/ou do isolamento físico de outras fontes de pólen. Atualmente, muitas espécies dependem de autopolinização ou de polinização cruzada por plantas vizinhas para produzir sementes ou grãos férteis. Tipicamente, na indústria de sementes híbridas para agricultura, são necessárias intervenções mecânicas, físicas e/ou genéticas para assegurar que plantas femininas sejam polinizadas por cruzamento, e não autopolinizadas, de modo que o pólen de uma constituição genética específica seja empregado para produzir sementes híbridas. Tais medidas, por exemplo, são usadas rotineiramente para produzir sementes de milho e de arroz híbridas. Em algumas culturas, entretanto, mesmo essas medidas não são tão efetivas para assegurar a polinização cruzada por uma fonte de pólen desejada específica. Atualmente, não é econômico produzir essas culturas comercialmente como híbridos. Exemplos dessas culturas incluem, mas não estão limitadas a, trigo e soja.
[0005] Muitas tentativas têm sido feitas para preservar o pólen e para estender a sua viabilidade, para polinizações além do tempo que o pólen permaneceria viável, se deixado exposto a condições ambientais não controladas. Dentre as gramíneas, estudos com milho são exemplificativos do progresso feito em preservação de pólen. Muitos tipos de tratamentos têm sido testados para manutenção ou extensão da viabilidade e/ou da fertilidade do pólen de milho. Dentre eles, a favorabilidade de tratamento e/ou de armazenamento de pólen de milho em elevada umidade e/ou temperatura fria tem sido relatada por muitos.
[0006] Dentre os mais antigos relatos de preservação de pólen de milho (Andronescu, Demetrius I., The physiology of the pollen of Zea mays with special regard to vitality. Tese para grau de Ph.D. da University of Illinois. 1915), foi relatado que, na ausência de condições de armazenamento ambientais controladas, pólen morreu em duas a quatro horas. Por elevação da umidade relativa do ambiente de armazenamento, a viabilidade do pólen foi mantida durante 48 horas. Além disso, o armazenamento em baixa temperatura (por exemplo, 8-14°C) teve um efeito estimulante sobre a viabilidade do pólen.
[0007] Mesmo quando a umidade relativa não for controlada durante o armazenamento, o pólen de milho mantido em baixa temperatura (por exemplo, 2-7°C, durante 3-120 horas) pôde mais do que dobrar sua germinabilidade in vitro, comparado à vitalidade pré- armazenamento, inicial, ou comparado ao armazenamento à 35°C (Pfahler, P.L. e Linskens, H.F., (1973) Planta,111(3), pp.253-259; Frova, C.B. e Feder, W.A., (1979) Ann Bot, 43(1), pp.75-79). Quando elevada umidade (90% de UR) e baixa temperatura (4°C), durante armazenamento, são combinadas para o tratamento de pólen, a germinação de pólen de milho em meios artificiais permanece boa, apropriadamente, durante oito dias (Sartoris, G.B., (1942) Am J Bot, pp.395-400). O armazenamento de pólen de milho sob as mesmas condições por oito dias também permite que o pólen permaneça fértil, embora em um nível reduzido, e capaz de formar grãos nas espigas após a polinização (Jones, M.D. and Newell, L.C., (1948) J Amer Soc Agron 40:195-204).
[0008] O condicionamento de campo de pólen de milho, em elevada umidade baixa temperatura, comumente auxilia a reviver o pólen de baixa viabilidade e/ou a estender sua longevidade, por meio do quê ocorre formação de sementes pelo menos limitada seguindo a polinização de espigas. No entanto, o efeito estimulante do armazenamento em baixa temperatura sobre a fertilidade nem sempre é observado (Walden, D.B., (1967) Crop Science, 7(5), pp.441-444) e se o pólen se tornar desidratado em níveis excessivos, a formação de tubo de pólen em meios artificiais e de cabelos (silks) pode ser marcantemente reduzida (Hoekstra, FA. (1986) In: Membranes, Metabolism and Dry Organisms. (Ed., AC Leopold), pp. 102-122, Comstock Publishing Associates, Ithaca, NY; Barnabas, B. e Fridvalszky, L., (1984) Acta Bot Hung 30:329-332).
[0009] Embora elevada umidade e baixa temperatura retardem o decaimento temporal de vitalidade durante o armazenamento de pólen de Gramineae, a otimização destas condições ambientais para preservação somente adia a perda completa de viabilidade e de fertilidade. Métodos adicionais para regulação da umidade e da temperatura são necessários para intensificar adicionalmente a longevidade de pólen armazenado, de modo que ele possa ser usado na prática comercial de polinização suplementar para produção de grãos e sementes aperfeiçoada. Além disso, a regulação da umidade e da temperatura em aplicações de grande escala é tecnologicamente desafiadora e onerosa, assim, abordagens mais simples tornariam polinizações suplementares muito mais viáveis.
[0010] Em alguns casos, pode ser desejável tratar o pólen de modo que ele seja desidratado até vários graus. A desidratação pode ser conseguida por secagem à vácuo ou exposição do pólen a uma umidade relativa e a uma temperatura (isto é, déficit de pressão de vapor) que façam com que a água se difunda para fora do pólen. Os déficits de pressão de vapor favoráveis para a secagem de pólen podem ser produzidos de inúmeras maneiras, tais como com dessecantes, equipamento mecânico projetado para controlar a temperatura e a umidade relativa em uma câmara cerrada e com soluções de sal saturadas mantidas em um espaço fechado (Jackson, M.A. e Payne, A.R. (2007) Biocontrol Sci Techn, 77(7), pp.709-719), Greenspan, L., (1977) J Res Nat Bur Stand, 87(1), pp.89-96).
[0011] Em um esforço para desidratar e preservar pólen de cana de açúcar, o pólen foi armazenado em baixa temperatura sob vácuo com uma pequena quantidade de dessecante de CaCl2 presente (Sartoris, G.B. (1942) Am J Bot, pp.395-400). O pólen permaneceu seco ao longo de todo o armazenamento, conforme desejado, mas o uso de baixa pressão não foi tão favorável quanto o armazenamento em pressão atmosférica normal. O comportamento de pólen de milho foi muito similar àquele de cana de açúcar. Tentativas mais diretas em desidratação incubaram pólen em condições de umidade relativa e de temperatura estabelecidas ou registradas. Esses exemplos mostram que o pólen de milho pode ser desidratado até níveis muito baixos (por exemplo, 7-10% de teor em água do pólen) e ainda possuir uma capacidade, embora reduzida, de efetuar a formação de sementes seguindo a polinização de espigas (Barnabas, B., et al. (1988) Euphytica, 39(3), pp.221-225; Patente US 5.596.838).
[0012] A desidratação de pólen é comumente realizada antes do congelamento para armazenamento e preservação em temperaturas muito baixas. Conforme praticado com milho, o pólen fresco é desidratado em temperatura ambiente em uma câmara de vácuo, incubadora com umidade ou simplesmente com secagem com ar ou calor suave (Patente US 5.596.838; Barnabas, B. e Rajki, E. (1981). Ann Bot, 48(6), pp.861- 864; Connor, K.F. e Towill, L.E. (1993) Euphytica, 68(1), pp.77-84). Quando do derretimento depois do armazenamento de curto ou de longo prazo, o pólen criopreservado pode ser viável e fértil, mas a fertilidade nem sempre é exibida e em alguns membros da família das Gramineae, tais como milho, sorgo, aveia e trigo, pode ser difícil se criopreservar (Collins, F.C., et al. (1973) Crop Sci, 13(4), pp.493-494). Uma explicação oferecida para essa recalcitrância é secagem ou envelhecimento em excesso do pólen (Collins, F.C., et al. (1973) Crop Sci, 13(4), pp.493-494). É evidente que a qualidade do pólen pode ser afetada por condições ambientais predominantes durante o desenvolvimento floral, a maturação do pólen e a ântese (Shivanna, K.R., et al. (1991) Theor Appl Genet 81(1), pp.38-42; Schoper, J.B., et al. (1987) Crop Sci, 27(1), pp.27-31; Herrero, M.P. e Johnson, R.R. (1980) Crop Sci, 20(6), pp.796-800). O pólen estressado dessa maneira poderia exibir uma propensão reduzida a resistir aos rigores da desidratação e do congelamento para criopreservação. Existe uma necessidade de se superar esse problema e de se tornar a criopreservação de pólen de Gramineae mais atingível e rotineira; assim, esta forma de preservação de pólen pode ser implementada de uma maneira previsível em uma escala comercial.
[0013] Sabe-se que a dessecação apresenta um impacto direto sobre a viabilidade do pólen. Barnabas (1985) Ann Bot 55:201-204 e Fonseca e Westgate (2005) Field Crops Research 94: 114-125 demonstraram que pólen de milho recém-coletado poderia sobreviver a uma redução no teor em água original de aproximadamente 50%, mas poucos grãos de pólen demonstraram viabilidade ou uma capacidade para formação de tubo de pólen normal com uma perda de água adicional além daquele nível. Trabalho preliminar, por Barnabas e Rajki ((1976), Euphytica 25: 747-752, demonstrou que pólen com teor em água reduzido reteria a viabilidade quando armazenado de maneira criogênica à -196°C. Trabalho subsequente (Barnabas & Rajki (1981) Ann Bot 48:861-864) demonstrou que tais grãos de pólen de milho parcialmente dessecados, armazenados à -76°C ou -196°C, também poderiam efetuar a fertilização de flores femininas receptivas. Outros métodos de armazenamento de pólen durante períodos de tempo variáveis são conhecidos na técnica, incluindo liofilização, secagem à vácuo e armazenamento em solventes orgânicos não polares. Limitações na escalabilidade dessas técnicas de preservação de pólen, combinadas com as exigências de equipamentos não portáteis, complexas, tornam estas técnicas impraticáveis para uso com grandes volumes de pólen necessários para aplicações em escala de campo. Por exemplo, a capacidade de criar uma câmara de vácuo grande o suficiente para preservações de polinização de campo em nível de produção teria exigido uma câmara de vácuo muito maior capaz de mudar rapidamente os níveis de pressão. Campos de aumento parentais em nível de produção são tipicamente de um acre ou mais, enquanto que campos de produção híbridos são tipicamente de 10 acres ou mais em tamanho. Tais campos exigem uma quantidade considerável de pólen e, portanto, uma câmara de vácuo grande seria necessária. Uma câmara dessas especificações exigiria a capacidade de bombear para uma pressão de 5 Torr (0,67 KPa) ou menos, com a capacidade adicional de rapidamente aumentar e diminuir, de maneira cíclica, este nível de pressão. Conforme o volume físico da amostra aumentar, a capacidade de gerar e ciclizar em 5 Torr (0,67 KPa) começa, de maneira eficiente, a ir além do que as bombas mecânicas podem gerar. Em adição, o armazenamento de pólen em solventes orgânicos cria exigências químicas de perigo.
[0014] A Patente US 5.596.838, de Greaves, et al., descreve um método de armazenamento de pólen que envolve uma redução no nível de umidade por exposição do pólen a pressões atmosféricas reduzidas antes do armazenamento. Essa técnica preparou pequenas quantidades de pólen, tal como a partir de uma única planta de milho, para armazenamento subsequente sob condições subzero. A metodologia e as exigências de sistemas mecânicos, no entanto, faltou a capacidade de produzir pólen armazenado em quantidades grandes o suficiente para possibilitar aplicações de produção de sementes ou de produção de grãos comerciais. Essas exigências negaram, de maneira efetiva, qualquer oportunidade de avançar a tecnologia além de investigações ao nível de pesquisa. Outra patente de Greaves et al., Patente US 6.141.904, fornece que pólen pode ser colocado em um material de veículo para aumentar a capacidade de escoamento, tal como um pó escoável. Em adição, a Patente US N° 2.669.066 sugere misturar o pólen com substâncias apresentando um elevado teor em proteína para tratamento e aplicação, tal como albumina de ovo pulverizada, caseína pulverizada ou leite pulverizado, em casos de armazenamento de curto prazo.
[0015] A disponibilidade de pólen viável preservado supera muitos dos desafios de produção enfrentados pela indústria de sementes híbridas. Com respeito à produção de sementes híbridas, a disponibilidade de pólen armazenado para entrega a flores femininas pode eliminar muitas práticas custosas padrão da produção de sementes, incluindo, mas não limitadas a, o plantio de plantas masculinas de maneira separada de, mas em proximidade a, plantas femininas, para permitir a hibridização, o isolamento de plantas femininas de fontes de pólen indesejadas, e o uso de esterilidade masculina genética ou mecânica das plantas femininas. Essas práticas aumentam dramaticamente o espaço do campo e os recursos dedicados às plantas femininas, que produzam sementes ou grãos. A eliminação de qualquer uma dessas práticas teria um impacto positivo imediato sobre o rendimento em sementes por acre. Além disso, o pólen armazenado pode ser aplicado a qualquer tempo. Quando o pólen derramado a partir de plantas masculinas e a receptividade ao pólen de plantas femininas falham em coincidirem conforme planejado (devido ao gerenciamento, ambiente ou variação genética), a aplicação de pólen viável preservado assegura a polinização de plantas femininas no tempo ótimo. A polinização por fontes de pólen externas (adventícias) indesejadas ou autopolinização indesejada de plantas femininas também podem ser reduzidas ou eliminadas por aplicação de pólen armazenado, de um tipo desejado, no tempo apropriado. Atualmente, a genética de uma semente híbrida em particular é determinada no início de uma estação de crescimento pelo genótipo das plantas masculinas doadoras de pólen e das plantas femininas receptoras de pólen plantadas em conjunto no campo. No entanto, usando-se as modalidades da presente invenção, um produtor de sementes híbridas, respondendo a oportunidades de mudanças de mercado, pode decidir, no momento da polinização, usar um pólen masculino diferente (isto é, fonte genética) para polinização, para produzir sementes híbridas mais valiosas. Portanto, o pólen armazenado pode ser usado para entregar traços genéticos ou genes únicos, que intensificam as características de qualidade das sementes para consanguíneos femininos altamente produtivos. Por exemplo, traços para resistência a pestes de insetos selecionadas, que estão presentes, poderiam ser entregues. De maneira importante, as modalidades da presente invenção também asseguram um elevado nível de pureza genética na semente híbrida. Como tais, os métodos de aperfeiçoamento da viabilidade de pólen e de extensão da duração de sua viabilidade são de valor significativo para a indústria da agricultura.
[0016] A Figura 1 mostra uma imagem de grãos de pólen repousando em meios de crescimento artificiais, conforme descrito no Exemplo de Operação 1. A imagem demonstra que o pólen que se agrupa em conjunto apresenta uma taxa de germinação global mais baixa em comparação aos grãos de pólen individuais, que não estão em contato com outros grãos de pólen. Dois aglomerados de pólen estão marcados nas caixas dentro da imagem. Note-se que esses aglomerados não exibem forte crescimento de tubo de pólen.
[0017] A Figura 2 mostra o impacto que pólen morto ou morrendo tem sobre pólen fresco, conforme descrito no Exemplo de Operação 2. Duas amostras de controle foram testadas, assim como quatro amostras, que continham pólen que tinha sido submetido a tratamentos que causaria a morte do pólen.
[0018] A Figura 3 mostra o impacto de pólen morto sobre pólen fresco e pólen de quatro dias de idade, conforme descrito no Exemplo de Operação 3. A figura demonstra o impacto negativo que o pólen morto tem sobre pólen vivo, causando um rápido declínio de viabilidade. A figura mostra que o pólen morto tem um efeito mais significativo sobre o pólen que já começou a se deteriorar.
[0019] A Figura 4 mostra os dados coletados a partir do Exemplo de Operação 4. O experimento usou pólen de milho coletado a partir do campo e armazenado em carvão particulado. O pólen foi misturado com carvão em várias percentagens variando de 2,5 a 75% de carvão. A figura mostra os resultados de testagem de viabilidade e de teor em umidade do pólen (TUP) depois de 1 e 6 dias de armazenamento.
[0020] A Figura 5 mostra os dados coletados a partir do Exemplo de Operação 5. O experimento mediu a viabilidade de pólen de milho coletado a partir de uma estufa e armazenado com vários açúcares. O pólen foi misturado em uma razão de 1:1 com os meios de açúcar para cada amostra. A figura mostra a viabilidade do pólen depois de 24 horas, 2, 5, 8 e 13 dias.
[0021] A Figura 6 mostra os dados coletados a partir do Exemplo de Operação 6. O pólen foi armazenado em partículas de sílica de diferentes tamanhos, para determinar o efeito do tamanho de partícula sobre o armazenamento de pólen e sua viabilidade. Seguindo o armazenamento durante 24 horas nas partículas de sílica, o pólen foi usado para conduzir polinizações manuais. A figura mostra o conjunto de grãos de milho para cada amostra.
[0022] A Figura 7 mostra os dados coletados a partir do Exemplo de Operação 7. O experimento usou pólen de milho misto coletado a partir de uma câmara de crescimento. O pólen foi armazenado com uma variedade de meios diferentes todos compreendendo 98% de lactose e 2% de uma série de diferentes substâncias que se pretendia aperfeiçoassem a capacidade de escoamento. A figura mostra a viabilidade e o TUP do pólen depois de 3 dias de armazenamento.
[0023] A Figura 8 mostra os dados coletados a partir do Exemplo de Operação 8. O experimento usou pólen de milho misto coletado a partir de uma câmara de crescimento. O pólen foi armazenado com uma variedade de meios diferentes todos compreendendo 98% de lactose e 2% de uma série de diferentes substâncias que se pretendia aperfeiçoassem a capacidade de escoamento. Algumas amostras foram submetidas a um período de dessecamento de 2 dias e outras não foram. A figura mostra a viabilidade e o TUP do pólen depois de 2 e 6 dias de armazenamento.
[0024] A Figura 9 mostra os dados coletados a partir do Exemplo de Operação 10. O experimento mediu a viabilidade de pólen de milho armazenado com diferentes razões de um meio compreendendo lactose e 4% de Aerosil®. Uma amostra de controle não misturada foi usada para finalidades de comparação. A figura mostra a viabilidade do pólen no dia 0, 4, 6, 10, 12 e 17 durante o período de armazenamento.
[0025] A Figura 10 mostra os dados coletados a partir do Exemplo de Operação 11. O experimento usou pólen a partir de anteras de trigo armazenadas, coletadas tanto de pólen de pós-emergência mas não de derramamento, quanto pólen de pós-emergência e de derramamento. As anteras foram armazenadas sem qualquer meio como um controle, com lactose pulverizada ou com uma combinação de lactose e Sipernat® 340. A figura mostra a viabilidade do pólen depois de 3 e 14 dias de armazenamento.
[0026] A Figura 11 mostra os dados coletados a partir do Exemplo de Operação 12. O experimento usou pólen a partir de anteras de arroz reunidas armazenadas. As anteras foram armazenadas sem qualquer meio como um controle, com lactose pulverizada ou com uma combinação de lactose e Sipernat® 340. A figura mostra a viabilidade do pólen das anteras depois de 4 e 10 dias de armazenamento.
[0027] A Figura 12 mostra os dados coletados a partir do Exemplo de Operação 13. Um experimento com conjunto de grãos de milho foi conduzido usando-se pólen que tinha sido armazenado com um composto de separação, a fim de comparar o conjunto de grãos de milho a partir de uma polinização aberta e um controle com pólen fresco. A figura mostra o número de grãos de milho resultante de cada amostra.
[0028] A Figura 13 mostra pólen que tinha sido combinado com Sipernat® D17. A figura demonstra o revestimento das partículas no pólen, o que resultou em uma superfície escorregadia, por meio do quê se impede que as polinizações sejam bem sucedidas.
[0029] A Figura 14 mostra pólen que tinha sido combinado com caseína, conforme fornecido no Exemplo de Operação 15. A figura demonstra que a caseína apresenta um impacto negativo sobre a viabilidade do pólen, resultando em pouca a nenhuma viabilidade, quando armazenado durante 20 horas à 4°C.
[0030] A Figura 15 mostra pólen que tinha sido combinado com celulose, conforme fornecido no Exemplo de Operação 15. A figura demonstra que a celulose apresenta um impacto negativo sobre a viabilidade do pólen, resultando em viabilidade reduzida, quando armazenado durante 20 horas à 4°C.
[0031] A Figura 16 mostra os dados coletados no Exemplo de Operação 16. A saber, a figura mostra boa viabilidade quando do armazenamento do pólen de acordo com os métodos da presente invenção. Pólen de milho foi armazenado com uma mistura de lactose e Sipernat® 340, à 29,6°C e 32,8°C, resultando em boa viabilidade.
[0032] A Figura 17 mostra os resultados do Exemplo de Operação 17. A saber, a figura mostra que o armazenamento de pólen de milho em óleo mineral Sonneborn® PD-23 resultou em boa viabilidade do pólen.
[0033] É f ornecido um método de preservação de uma pluralidade de grãos de pólen, compreendendo o impedimento de que o conteúdo de pólen morto interaja com grãos de pólen vivos. Em algumas modalidades, o método pode incluir o armazenamento de grãos de pólen com pelo menos uma substância, que impeça que o conteúdo de pólen morto interaja com grãos de pólen vivos. A substância pode ser um sólido, um líquido, um gás ou combinações dos mesmos. Além disso, a substância pode circundar pelo menos um grão de pólen, tal como por minimização do contato superfície a superfície entre a pluralidade de grãos de pólen. O teor em umidade do pólen pode ser mantido em 15-60%, tal como em 35-60%. Em adição, os grãos de pólen e a substância podem ser misturados, tal como por mistura contínua. A razão da substância em relação aos grãos de pólen pode ser de pelo menos 3:1. Além disso, o tamanho da substância pode variar de um mínimo de dez vezes menor do que o tamanho dos grãos de pólen até um mínimo de dez vezes maior do que o tamanho dos grãos de pólen. Em algumas modalidades, a substância pode incluir partículas de tamanhos variáveis. A substância pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em lactose, Sipernat® 50, Sipernat® 50S, Sipernat® 2200, Sipernat® 22, Sipernat® 22S, Sipernat® 340, Sipernat® 350, Perkasil® SM660, contas de jojoba, Aerosil® 200, Syloid® 244, e combinações das mesmas. O método pode incluir pólen que tenha sido recém-coletado, armazenado ou combinações dos mesmos. Além disso, o método pode incluir o condicionamento de campo do pólen.
[0034] Em outra modalidade da invenção, é fornecido um método, no qual grãos de pólen são misturados com uma substância, sendo que a substância faz com que os grãos de pólen tenham um teor em umidade do pólen de 15-60%. Em algumas modalidades, o teor em umidade do pólen pode ser de 35-60%, tal como de 45-55%. A substância pode ser hidrofílica e pode adicionalmente impedir que o conteúdo de pólen morto interaja com grãos de pólen vivos. Além disso, o método pode incluir a redução do teor em umidade do pólen, depois da coleta do pólen, para menos do que 60%.
[0035] “Câmara” é usada aqui como significando um invólucro adequado para conter e armazenar o pólen.
[0036] “Conteúdo de Pólen Morto” é usado aqui como significando qualquer material relacionado a um grão de pólen morto ou morrendo, incluindo, mas não limitado a, o próprio grão de pólen e material vazado a partir de um grão de pólen morto ou morrendo.
[0037] “Planta feminina” é usada a significar uma planta que esteja sendo usada como o receptor de pólen, e que tenha flores receptivas que estejam sendo fertilizadas.
[0038] “Fértil” ou “fertilidade” são usados para descrever a capacidade do pólen em entregar os núcleos de esperma ao óvulo e, por meio disto, efetuar dupla fertilização. Em plantas em floração, a expressão “dupla fertilização” se refere a um núcleo de esperma fundindose com os núcleos polares, para produzir os tecidos do endosperma, e o outro núcleo de esperma fundindo-se com o núcleo do ovo, para produzir o embrião.
[0039] “Fresco”, quando aplicado a pólen, significa pólen liberado a partir das anteras de uma flor, que, em seu padrão natural de crescimento e desenvolvimento de órgãos, libera pólen quando da deiscência, em resposta a condições ambientais promotoras.
[0040] “Germinabilidade” se refere à capacidade do pólen germinar e formar um tubo de pólen.
[0041] “Longevidade”, quando aplicada a pólen, é usada para descrever o intervalo de tempo que o pólen permanece tanto viável quanto fértil.
[0042] “Perda de viabilidade” é uma característica do pólen que significa que o nível de viabilidade do pólen caiu a um nível abaixo daquele necessário para iniciação bem sucedida do desenvolvimento de semente.
[0043] “Perda de fertilidade” é uma característica do pólen que significa que o nível de fertilidade do pólen caiu a um nível abaixo daquele necessário para iniciação bem sucedida do desenvolvimento de semente.
[0044] “Planta masculina” significa uma planta, a partir da qual o pólen é coletado para uso em polinizações.
[0045] “Preservação” significa qualquer armazenamento de pólen coletado, que resulte em um nível de viabilidade, fertilidade, ou ambas, que seja diferente do que o nível de viabilidade, fertilidade, ou ambas, que ocorreria se o pólen fosse mantido em condições não reguladas.
[0046] “Armazenamento” significa qualquer período de contenção do pólen com a intenção de usar o pólen em um tempo e/ou uma data posteriores.
[0047] “Contato superfície a superfície” entre grãos de pólen significa o tocar de qualquer parte da área de superfície de um grão de pólen à área de superfície de um ou mais grãos de pólen.
[0048] “Viável” ou “viabilidade” são usados para descrever o pólen que seja capaz de germinar e crescer um tubo de pólen até pelo menos um comprimento duas vezes o diâmetro do grão de pólen ou do pólen que tenha sido julgado viável por demonstração de que a natureza celular do material permanece integral e seja julgado viável a manter higidez, tal que processos celulares normais do metabolismo e do funcionamento intracelular sejam possíveis. A viabilidade do pólen pode ser avaliada de inúmeras maneiras, incluindo, mas não limitadas a, avaliação do crescimento do tubo de pólen em meios artificiais ou estigmas ou cabelos excisados, avaliação da higidez celular por tingimento vital de inúmeros tipos, ausência de vazamento de eletrólitos (por exemplo, potássio) e citometria de escoamento por impedância. A viabilidade pode se referir a um único grão de pólen ou a uma população de grãos de pólen. Quando um valor de percentagem for usado para descrever a viabilidade do pólen, tipicamente, o valor estará sendo aplicado a uma população de pólen.
[0049] “Janela de viabilidade” se refere ao tempo de vida, durante o qual o pólen permanece viável quando exposto a condições não reguladas.
[0050] “Vigor” se refere ao desempenho do pólen, tais como velocidade de germinação e crescimento de tubo.
[0051] O seguinte é uma descrição detalhada de modalidades de tecnologia e métodos de armazenamento e/ou preservação de pólen, que possibilitam viabilidade aperfeiçoada e/ou estendida de pólen coletado, por submissão do mesmo a condições e técnicas de armazenamento especializadas. O pólen pode ser coletado a partir de plantas que derramam ativamente ou, alternativamente, o pólen pode ter sido previamente coletado e armazenado de acordo com outros métodos conhecidos na técnica, agora ou no futuro. Tais métodos incluem, por exemplo, congelamento, liofilização, armazenamento em nitrogênio líquido, etc.
[0052] De acordo com uma modalidade da invenção, a fim de preservar o pólen com viabilidade aperfeiçoada e/ou estendida, uma pluralidade de grãos de pólen incluem conteúdo de pólen morto e grãos de pólen vivos e o conteúdo de pólen morto é impedido de interagir com os grãos de pólen vivos. Dito de outra maneira, a invenção fornece isolamento ou separação parcial ou total entre grãos de pólen e uns dos outros, assim como do conteúdo de pólen morto. Em muitas modalidades, o pólen é mantido em uma maneira que minimiza o contato superfície a superfície entre grãos de pólen individuais. Conforme discutido em mais detalhes nesta invenção, quando os grãos de pólen estiverem em contato com outros grãos de pólen, particularmente durante um período de tempo que seria típico para finalidades de armazenamento, os grãos de pólen que estejam perdendo ou que tenham perdido viabilidade, causarão impacto, de maneira negativa, na fertilidade e na viabilidade de grãos de pólen de outra maneira saudáveis. Os Exemplos 1-3, aqui abaixo, são ilustrativos desse conceito. No Exemplo 1 e a figura acompanhante, observa-se o pólen, que se aglomera em conjunto, é, frequentemente, não viável. Além disso, os Exemplos 2 e 3 mostram que o pólen morto misturado com pólen fresco causa impacto, de maneira negativa, no pólen fresco, tal que a viabilidade seja diminuída.
[0053] Consequentemente, comprovou-se que o conteúdo de pólen morto são agentes infecciosos que fazem com que grãos de pólen vivos morram mais rapidamente do que eles o fariam se os grãos de pólen vivos fossem separados do conteúdo de pólen morto. Isso pode implicar em vazamento ou em algum tipo de transferência do conteúdo celular, que seja infeccioso, para fora dos grãos de pólen mortos ou morrendo. Portanto, sem se estar ligado a uma teoria em particular, os inventores constataram que, quando os grãos de pólen estiverem no processo de morte ou tiverem morrido, o vazamento do conteúdo do pólen provavelmente ocorrerá. Esse vazamento interage com outros grãos de pólen e provoca sua morte ou também perda de viabilidade. A presente invenção busca minimizar e/ou impedir tal interação. Consequentemente, a invenção inclui a separação do conteúdo de pólen morto de grãos de pólen vivos. Tal pólen coletado pode ser armazenado durante qualquer período de tempo, incluindo, mas não limitados a, apenas longo o suficiente para transferir o pólen para uma planta no mesmo campo ou em um campo nas vizinhanças, minutos, horas, dias, semanas, meses e/ou anos. Em modalidades preferidas da invenção, o método descrito usa substâncias para separar o conteúdo de pólen morto de grãos de pólen vivos, impedindo, assim, a interação entre o conteúdo de pólen morto e os grãos de pólen vivos. Tal separação pode ocorrer via, mas não está limitada a, partículas sólidas, líquidos, ar ou gases em escoamento, gravidade reduzida ou armazenamento, sendo que os grãos de pólen são isolados uns dos outros. Em muitas modalidades, o contato superfície a superfície entre grãos de pólen e/ou o conteúdo celular dos grãos de pólen é impedido ou limitado. Para as finalidades desta invenção, o pólen pode ser armazenado em uma câmara. A câmara pode variar de tamanho e de material de construção. A câmara pode ser de qualquer tamanho que seja adequado para conter uma quantidade de pólen, e pode ser qualquer tipo de tubo, recipiente, estojo, vaso, invólucro ou espaço, no qual o pólen esteja sendo armazenado, sendo que o espaço serve como uma câmara para o armazenamento de quantidades de pólen. Em algumas modalidades, a câmara também pode conter partículas sólidas, líquido e/ou gás, que minimize o contato superfície a superfície das superfícies de grãos de pólen.
[0054] É benéfi co, embora não necessário, se a(s) substância(s) empregada(s) no método da presente invenção atender(em) a um ou mais critérios, em adição a separar o conteúdo de pólen morto dos grãos de pólen vivos. Em primeiro lugar, pode ser benéfico se a substância regular o teor em umidade do pólen. Conforme discutido abaixo em mais detalhes, certas substâncias hidrofílicas podem cumprir com esse objetivo. Além disso, a substância pode fornecer escoabilidade aumentada quando o pólen for aplicado a uma planta feminina, tal como para aplicação mecânica. É também desejável se a substância for efetiva quanto aos custos para operações em grande escala, o que é um benefício de substâncias sólidas ou de particulados de uma maneira geral. Outro benefício de partículas sólidas é que elas são mais facilmente portáveis ou transportáveis, o que pode ser especialmente benéfico quando o método for realizado em pólen como ele é coletado, tal como em um campo. É também preferido que as substâncias não sejam nocivas à planta e/ou ao ambiente. Além disso, prefere- se que a substância não interaja e/ou se comunique com a planta feminina, por sobre a qual o pólen, combinado com a substância em muitas modalidades, será aplicado. Por exemplo, pode ser benéfico se a substância não interagir com o estigma da planta feminina. Similarmente, será benéfico se a substância e os grãos de pólen se segregarem depois ou imediatamente antes da aplicação, tal que a substância não se ligue ao pólen e/ou à planta feminina, incluindo, mas não limitado a, receptores de pólen, para aplicação a plantas femininas.
[0055] Em modalidades da invenção, nas quais um líquido é usado para separar e, portanto, impedir a interação entre grãos de pólen uns com os outros e com o conteúdo de pólen morto, soluções isotônicas podem ser usadas. De preferência, o líquido não reagirá com os grãos de pólen. Além disso, em modalidades preferidas, o líquido e o pólen seriam agitados para intensificar a separação dos grãos de pólen uns dos outros e do conteúdo de pólen morto. A agitação pode ser ocasional ou contínua e é, de preferência, contínua. De preferência, os grãos de pólen, em uma tal solução, não terão contato prolongado com outros grãos de pólen e/ou com o conteúdo de pólen morto. Além disso, em algumas modalidades, o pólen pode estar essencialmente suspenso no líquido. O Exemplo 17 ilustra o armazenamento de pólen bem sucedido em óleo mineral Sonneborn® PD-23.
[0056] Similarmente, em algumas modalidades da invenção, ar ou gases (coletivamente, “gás” ou “gases”) podem ser usados para separar os grãos de pólen uns dos outros e do conteúdo de pólen morto, impedindo, assim, a interação entre o conteúdo de pólen morto e os grãos de pólen vivos. De preferência, o gás está escoando de modo a efetuar a agitação dos grãos de pólen e separar os grãos de pólen uns dos outros e do conteúdo de pólen morto. Agitação diferente do que o escoamento do gás também pode ser usada, tal como agitação ocasional ou contínua. De preferência, os grãos de pólen, em uma câmara com gás, não terá contato prolongado com outros grãos de pólen e/ou com o conteúdo de pólen morto. Em algumas modalidades, o pólen pode estar essencialmente suspenso no gás.
[0057] Em ainda outra modalidade da invenção, a separação física e/ou mecânica do pólen pode resultar em separação de grãos de pólen uns dos outros e/ou do conteúdo de pólen morto, impedindo, assim, a interação entre o conteúdo de pólen morto e os grãos de pólen vivos. Por exemplo, os grãos de pólen podem ser armazenados em camadas de grãos simples, em que existe um espaço entre grãos de pólen individuais. Em algumas modalidades, a estrutura de armazenamento pode fornecer uma separação física entre os grãos de pólen e o conteúdo de pólen morto e/ou uns dos outros. Em outras modalidades, o gás na câmara pode fornecer a separação entre os grãos de pólen e o conteúdo de pólen morto e/ou uns dos outros. Em ainda outras modalidades, estruturas orgânicas ou não orgânicas podem separar o conteúdo de pólen do conteúdo de pólen morto e/ou de outros grãos de pólen. Portanto, os grãos de pólen não estão em contato uns com os outros. Obviamente, qualquer tipo de separação física pode ser usado, seja conhecido agora ou no futuro.
[0058] Conforme discutido acima, os métodos descritos aqui aperfeiçoam e/ou estendem a viabilidade do pólen.Pólen viável pode ser germinado de maneira bem sucedida e comumente possui o vigor necessário para promover a fertilização e a iniciação do desenvolvimento de semente. Nem todo pólen viável é também pólen fértil. Em alguns casos, mesmo quando um grão de pólen for viável e comece o crescimento do tubo de pólen, ele pode carecer do vigor necessário para alcançar o óvulo e promover a fertilização. Grãos de pólen não viáveis não podem germinar de maneira bem sucedida. Portanto, em algumas modalidades da presente invenção, pólen com boa viabilidade é desejável para uso com os métodos da presente invenção. Os níveis de viabilidade e de fertilidade necessários para polinizações bem sucedidas são tipicamente aceitos ou definidos na técnica como sendo uma média e quatro grãos de pólen fresco por cabelo, ou quatro a oito grãos de pólen preservado, que tenha sido preservado de acordo com os métodos da presente invenção.
[0059] Conforme discutido acima, muitas modalidades da presente invenção exigem a coleta de pólen ou a aquisição de pólen, que tenha sido previamente coletado. A coleta de pólen, para as finalidades da invenção, pode ocorrer por qualquer método e em qualquer local, no qual as plantas são cultivadas, tal como uma câmara de crescimento, uma estufa, uma estufa especial (glasshouse), uma estufa sombreada (shade house), uma estufa de capela (hoop house), uma instalação agrícola vertical, uma instalação hidropônica ou qualquer instalação de cultivo que forneça espiguetas (tassels) cultivadas, conforme descrito abaixo. Opcionalmente, o pólen pode ser condicionando em campo antes do armazenamento ou da preservação, tal como de acordo com os métodos apresentados no Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 15/486.737, intitulado “Método de Condicionamento e de Preservação de Pólen”, o conteúdo inteiro do qual é aqui incorporado por referência. O condicionamento de campo, se usado, também pode ocorrer usando-se outros métodos conhecidos na técnica, agora ou no futuro. Em algumas modalidades, o condicionamento de campo pode ocorrer imediatamente quando da coleta ou em qualquer ponto entre a coleta e o armazenamento. Em adição, antecipa-se que o condicionamento de campo pode incluir os métodos da presente invenção.
[0060] A coleta de pólen fresco pode ser conduzida de maneiras comumente conhecidas na técnica. Por exemplo, o pólen pode ser coletado a partir de flores com recém- derramamento ou de estruturas de flores masculinas produzidas em qualquer uma de uma variedade de maneiras. No caso de milho, e de muitas outras espécies, a planta é monóica e contém inflorescências masculinas e femininas em uma única planta. Na prática de reprodução, de polinização, de polinização cruzada e de hibridização, algumas plantas atuam como a planta masculina, a partir da qual o pólen é coletado para uso em polinizações, e algumas plantas atuam como a planta feminina sendo a receptora do pólen. No caso de autopolinizações, uma única planta está atuando tanto como a planta masculina quanto como a planta feminina, porque as flores femininas são fertilizadas por pólen a partir de suas próprias flores masculinas. Similarmente às autopolinizações, polinizações fraternas (sib- pollinations) ocorrem quando plantas com a mesma genética (tal como uma planta vizinha a partir do mesmo campo) atuam tanto como a planta masculina quanto como a planta feminina. Para as finalidades desta invenção, a expressão “autopolinização” inclui polinizações fraternas, uma vez que a mesma genética está envolvida em ambas as situações. Ainda referindo-se ao milho como um exemplo, o pólen é coletado a partir de flores masculinas com recém-derramamento nascidas em espiguetas, que possam ser destacadas, ou destacadas, da planta.
[0061] O pólen de qualquer tipo de planta pode ser coletado de plantas cultivadas em qualquer ambiente adequado para o cultivo de plantas. Tais ambientes incluem, mas não estão limitados a, um campo, uma câmara de cultivo, uma estufa, uma estufa especial, uma estufa sombreada, uma estufa de capela, uma instalação agrícola vertical ou uma instalação hidropônica. Alternativamente, o pólen pode ser coletado diretamente de anteras por esmagamento ou moagem das anteras ou deixando-as naturalmente continuar a expelir o pólen conforme a antera se seque, por meio disto liberando o pólen e propiciando a sua coleta. Em adição, o pólen pode ser coletado de uma instalação de cultivo de espiguetas (Pareddy DR, Greyson RI, Walden DB (1989) Production of normal, germinable and viable pollen from in vitro-cultured maize tassels. Theor Appl Genet 77:521 - 526). Espiguetas cultivadas podem ser espiguetas maduras que tenham sido removidas de plantas em qualquer tipo de instalação de cultivo ou ambiente, incluindo um campo ou outro tipo de instalações de cultivo, e colocadas em água, em um ambiente controlado, para coletar o pólen, ou espiguetas cultivadas podem ser o tecido, que tenha sido coletado de estrutura de floração em estágios imaturos e, então, cultivado para se desenvolver formando uma espigueta.
[0062] Alternativamente, anteras podem ser coletadas diretamente, ao invés do pólen. As anteras podem ser coletadas antes da maturação do pólen na antera, durante o tempo de maturação ou quando o pólen estiver maduro e sendo liberado. Anteras integrais também podem ser armazenadas para uso posterior armazenando-as nas composições da invenção. O pólen que seja ou imaturo, parcialmente maduro, próximo à maturidade mas não ainda sendo liberado, ou pólen que sofreu deiscência (dehisced) maduro, podem ser liberados de anteras coletadas por remoção, moagem, agitação, secagem ou outros métodos similares. Em particular, a moagem é efetiva para pólen imaturo porque a moagem da antera integral em conjunto com o pólen imaturo pode ser conduzida na composição da invenção. Esse processo liberará automaticamente o pólen ao ambiente ideal, em que as superfícies de cada grão de pólen estarão limitadas em sua capacidade de tocar outros grãos. Além disso, as anteras podem ser armazenadas empregando métodos da presente invenção, incluindo, mas não limitados a, com separação com sólido, líquido, gás e/ou física de grãos de pólen, para separar o conteúdo de pólen morto de grãos de pólen vivos.
[0063] Esta invenção destaca tanto os métodos de minimização de contato superfície a superfície entre grãos de pólen, e as substâncias, que são usadas para minimizar o contato superfície a superfície do pólen, a fim de aperfeiçoar a viabilidade e a fertilidade. Essas substâncias podem ser partículas sólidas, líquidos ou composições com base em gás, ou podem ser combinações de sólidos e gases, líquidos e gases ou sólidos e líquidos. Isso pode incluir a comutação de pólen a partir de uma substância para outra durante o armazenamento. Além disso, uma combinação de substâncias pode ser usada, incluindo múltiplas substâncias em um único estado (isto é, sólido, líquido e/ou gasoso), ou múltiplas substâncias em vários estados. Além disso, a substância pode ser renovada ou reposta ao longo do tempo, incluindo com a mesma ou uma nova substância. Consequentemente, isso pode incluir a comutação do pólen a partir de uma substância para outra durante o armazenamento. A palavra “líquido(a)”, conforme usada aqui, inclui géis.
[0064] Modalidades preferidas da invenção utilizam partículas sólidas para separar grãos de pólen do conteúdo de pólen morto e/ou uns dos outros, impedindo, assim, a interação entre o conteúdo de pólen morto e os grãos de pólen vivos. Em muitas modalidades, as partículas sólidas minimizam o contato superfície a superfície entre os grãos de pólen. No caso de substâncias de partículas sólidas, de preferência, o tamanho das partículas deve ser determinado em relação ao tamanho dos grãos de pólen que se pretende sejam armazenados. Se as partículas sólidas forem grandes demais, elas podem, algumas vezes, ser ineficazes para o impedimento do contato entre os grãos de pólen, porque o pólen pode se reunir em bolsas entre as partículas. Se as partículas sólidas forem pequenas demais, elas também podem ser ineficazes na separação dos grãos de pólen e do conteúdo de pólen morto, porque elas não fornecerão separação suficiente. Espécies diferentes de pólen de planta podem variar de tamanho, variando de aproximadamente 6 a 100 μm de diâmetro. Em adição, alguns grãos de pólen apresentam superfícies que não são perfeitamente arredondadas, o que resulta em uma maior área de superfície. Consequentemente, usando-se composições com partículas sólidas, que contenham uma gama de tamanhos de partículas e/ou de formatos, permitir-se-á o uso de pólen a partir de diferentes espécies. Alternativamente, a experimentação de rotina determinará facilmente o tamanho ideal de partículas sólidas, com base no tamanho e na morfologia dos grãos de pólen a serem armazenados, tal como mostrado nos Exemplos 6 e 7. Em um exemplo, o tamanho das partículas sólidas pode estar entre dez vezes menor do que o pólen a ser armazenado a dez vezes maior do que o pólen a ser armazenado. Com referência a milho como um exemplo, o tamanho preferido do particulado pode ser de 20 μm. Apenas um exemplo de um particulado sólido daquele tamanho é Sipernat® 340.
[0065] Uma consideração adicional é a razão de substância particulada sólida em relação aos grãos de pólen. Razões elevadas de substância em relação ao pólen tendem a aumentar a separação entre o conteúdo de pólen morto e os grãos de pólen vivos. Além disso, razões mais elevadas resultam em diluição do pólen, o que, algumas vezes, é benéfico para aplicação do pólen às plantas femininas. Em alguns exemplos de modalidades, a razão pode estar em qualquer lugar de 1:1 a 1:100 de grãos de pólen em relação à substância. Em alguns exemplos, uma razão de 1:3 de grãos de pólen em relação à substância é preferida. Além disso, a razão ideal pode depender da quantidade de tempo, durante a qual o pólen será armazenado. Durante o curto prazo, mostrou-se que a razão é menos importante. Por outro lado, conforme o tempo progride, a razão se torna mais importante na manutenção da viabilidade do pólen preservado. O Exemplo 10 demonstra uma modalidade, na qual uma razão de 3:1 de substância particulada sólida em relação aos grãos de pólen supera outras razões e adicionalmente descreve a testagem de rotina, que pode ser usada para encontrar razões ideais em qualquer tipo de pólen. A razão pode ser otimizada para benefícios incluindo, mas não limitados a, aumento da duração do armazenamento, desconcentração do pólen e/ou otimização da escoabilidade.
[0066] De preferência, a natureza de quaisquer composições de partículas sólidas, usadas para separar o conteúdo de pólen morto dos grãos de pólen vivos, inclui partículas que não causam interações negativas com o pólen. Em algumas modalidades, as partículas sólidas são de uma natureza não reativa, de modo que o pólen seja essencialmente não afetado pelas partículas. Por exemplo, a partícula sólida tem que não remover umidade demais do pólen, porque o pólen morrerá. A perda de umidade causa impacto na viabilidade do pólen, com maior perda de umidade resultando em maior perda de viabilidade, e eventualmente a morte do grão de pólen. Os Exemplos 8 e 9 mostram que o pólen armazenado com dessecantes impacta negativamente a viabilidade. Uma natureza levemente hidrofílica pode ser benéfica porque ela pode separar o conteúdo de pólen morto dos grãos de pólen vivos. Mais especificamente, e sem estar ligado a uma teoria em particular, a experimentação mostrou que substâncias que sejam levemente hidrofílicas absorvem o conteúdo de pólen morto que escape ou vaze do pólen morto e/ou morrendo. Devido ao fato de que as substâncias hidrofílicas absorvem esse material, ele é separado dos grãos de pólen vivos. Além disso, materiais levemente hidrofílicos auxiliam a regular o teor em umidade do pólen, que pode, muitas vezes, ser importante para a viabilidade do pólen. As substâncias levemente hidrofílicas frequentemente não dessecam o pólen da mesma maneira que substâncias mais hidrofílicas o fazem. Partículas hidrofóbicas podem ser menos desejáveis porque elas podem apresentar uma tendência natural de evitar o contato físico com os grãos de pólen, o que poderia resultar em um gradiente entre o pólen e a partícula. No entanto, algumas substâncias hidrofóbicas podem ser benéficas. Nomeadamente, algumas substâncias hidrofóbicas podem se fixar à superfície dos grãos de pólen e, pelo menos parcialmente, revestir os grãos. Tal revestimento pode resultar na separação do conteúdo de pólen morto dos grãos de pólen vivos e/ou na separação entre os grãos de pólen vivos.
[0067] Consequentemente, o teor em umidade do pólen e a regulação do mesmo são benéficos em certas modalidades da invenção. Em alguns exemplos de modalidades, o método pode incluir teor em umidade do pólen em 15-60%. Mais especificamente, o teor em umidade do pólen pode ser de 40-58%. Mesmo em modalidades adicionais, o teor em umidade do pólen pode ser de 45-55%. Em algumas modalidades da invenção, foi constatado que o pólen pode ser mantido em níveis de umidade mais elevados do que tem sido previamente considerado ótimo na técnica. Consequentemente, em algumas modalidades, pode ser benéfico se a substância usada na invenção puder possibilitar a manutenção do teor em umidade do pólen mais elevado sem prejuízo.
[0068] Partículas sólidas, que podem ser úteis para a invenção descrita, incluem, mas não estão limitadas a, partículas inorgânicas, partículas orgânicas, reguladores de dormência, reguladores osmóticos, inibidores e interruptores de respiração celular, inibidores de transporte de elétrons, desacopladores de transporte de elétron em membrana, estabilizadores e condicionadores de membrana, estabilizadores e condicionadores de parede celular, reguladores de crescimento, hormônios vegetais, crioprotetores, monossacarídeos, dissacarídeos, polissacarídeos, antifloculantes, agentes de dispersão, bentonita, amido de batata, amido de milho, celulose, areia, dessecantes, agentes de escoamento, óleo mineral, óleo de parafina, açúcares em líquido, açúcares secos, água e carvão ativado. Deve ser entendido que a seleção das partículas sólidas a serem usadas pode ser influenciada pelo tipo de pólen a ser armazenado. Por exemplo, a seleção pode ser com base no tamanho e/ou no quão tolerante o pólen específico é a certas interações e características. Uma composição ideal pode incluir um único tipo de partículas sólidas ou uma combinação de tipos de partículas, que sejam escolhidas para maximizar a viabilidade e a longevidade do pólen. Ela também pode conter uma gama de tamanhos de partículas para assegurar que grãos de pólen tanto maiores quanto menores estejam sendo separados com igual eficiência. Experimentação de rotina pode ser conduzida de acordo com os Exemplos 4 e 5, para determinar a melhor partícula ou combinação de partículas para finalidades de armazenamento.
[0069] Em adição, pode ser benéfico adicionar uma substância que aumentará a escoabilidade do pólen armazenado, tal que o pólen possa ser facilmente aplicado a plantas em uma data posterior. Um tal composto tem que não causar interações negativas entre outras partículas sólidas no meio de armazenamento, nem entre os grãos de pólen. Exemplos de compostos, que separam o conteúdo de pólen morto dos grãos de pólen vivos e que também auxiliam na escoabilidade, incluem, mas não estão limitados a, Sipemat® 50, Sipemat® 50S, Sipemat® 2200, Sipemat® 22, Sipemat® 22S, Sipemat® 340, Sipemat® 350, Perkasil® SM660, contas de jojoba, Aerosil® 200, Syloid® 244, tampões isotônicos, óleos e gases.
[0070] Em ainda outra modalidade, a substância pode ser grãos de pólen esvaziados. Nomeadamente, os grãos de pólen, que tenham sido liberados por lavagem ou de outra maneira esvaziados de sua composição interna, podem ser usados para separar o conteúdo de pólen morto dos grãos de pólen vivos, por meio disto impedindo a interação entre os dois.
[0071] O uso de líquido ou gás para impedir o contato superfície a superfície entre grãos de pólen também pode ser usado para se atingir os objetivos da invenção. Em tais casos, a interação entre o conteúdo de pólen morto e os grãos de pólen vivos é impedida. No caso de gases, um escoamento constante de gás através da câmara contendo o pólen suspende os grãos e minimiza qualquer contato que, de outra maneira, seria experimentado devido à falta de escoamento. No caso do armazenamento de pólen em líquido, tampões que sejam isotônicos, não trocam prontamente fluido através da membrana de pólen, e servem como um excelente meio de armazenamento. Similarmente, soluções hidrofóbicas, tal como óleo mineral, também minimizam a troca de fluido através da membrana.
[0072] O pólen pode ser submetido a etapas de preservação adicionais, a fim de aumentar a sua capacidade de reter a viabilidade e a fertilidade durante períodos de armazenamento. A preparação do pólen para armazenamento exige um cuidadoso processo, incluindo um ambiente com níveis de umidade relativa conhecidos, assim como condições de temperatura e de pressão atmosférica específicas. Por exemplo, a temperatura pode ser 1°C a cerca de 10°C. Em algumas modalidades, a umidade relativa pode ser de 50-100%. Além disso, a pressão do ar pode ser se 15 KP - 150 KPa. Em adição, a presença de gases úteis auxiliará na maximização do sucesso do armazenamento. Gases úteis podem incluir, mas não estão limitados a, nitrogênio, dióxido de carbono, óxido nitroso, oxigênio ou uma mistura destes gases.
[0073] Opcionalmente, durante o período de armazenamento do pólen, o pólen contido dentro da câmara pode ser agitado mecanicamente. A agitação pode ser ocasional ou contínua. Em modalidades preferidas, a agitação é contínua. A agitação serve para expor a área de superfície máxima do pólen aos aditivos na câmara, sejam sólidos, líquidos ou gasosos, por meio disto assegurando uma mistura homogênea do pólen com o aditivo, e impedindo o contato superfície a superfície de grãos de pólen, aglutinação do pólen e a disseminação de necrose no caso, em que alguns grãos de pólen morram. Dados experimentais, particularmente os Exemplos 2 e 3, abaixo, mostraram que, quando as superfícies dos grãos de pólen vivos entram em contato com as superfícies de grãos de pólen morrendo ou mortos, o pólen vivo é impactado de maneira negativa e, subsequentemente, morrerá. A agitação continuada, regular e/ou ocasional dos grãos de pólen na composição, incluindo grãos de pólen mortos ou morrendo, pode ser conseguida de inúmeras maneiras diferentes, incluindo o uso de vibração, ar forçado, rotação, mistura ou outros meios.
[0074] Conforme explicado em detalhes nos parágrafos precedentes, a maximização e a extensão da viabilidade do pólen usando o método descrito exige manipulação cuidadosa de um ou mais de inúmeros fatores dentro de faixas definidas. Dados gerados em laboratório, usando pólen de milho como uma espécie de teste, indicaram as condições para o aperfeiçoamento da viabilidade do pólen, incluem a modificação de uma ou mais condições dentro da câmara para recaírem dentro das faixas descritas, conforme mostrado abaixo.
[0075] A temperatura da câmara contendo o pólen dentro da composição pode ser mantida de cerca de 1°C a cerca de 10°C, incluindo cerca de 1°C, cerca de 2°C, cerca de 3°C, cerca de 4°C, cerca de 5°C, cerca de 6°C, cerca de 7°C, cerca de 8°C, cerca de 9°C e cerca de 10°C. Enquanto que temperaturas mais baixas são frequentemente preferíveis, esta invenção também apresenta a capacidade de manter e/ou aumentar a viabilidade do pólen em temperaturas ambiente e/ou elevadas, que, até a presente data, têm sido desconhecidas na técnica. Nomeadamente, de acordo com Lyakh, et. al., Euphytica 55: 203-207, 1991, o aquecimento de pólen maduro à 35°C diminui a viabilidade de grãos de pólen de milho mesmo em exposição muito curta (3-5 min). No entanto, conforme mostrado no Exemplo 16, abaixo, os métodos da presente invenção são capazes de manter e/ou aumentar a viabilidade de pólen de milho, em temperaturas tão elevadas quanto 32,8°C com sucesso considerável. Consequentemente, os métodos da presente invenção podem incluir o pólen armazenado em qualquer temperatura. Em alguns exemplos de modalidades, os métodos de temperatura elevada e/ou ambiente podem ser usados de maneira conveniente no campo e para transporte.
[0076] Em exemplos de modalidades, o pólen submetido ao método descrito pode ser usado em qualquer aplicação, em que o pólen seja uma unidade comercial ou experimental. Em um exemplo, o pólen preservado pode ser usado para produzir sementes, híbridos, parentais ou, de outra maneira, em qualquer configuração, incluindo, mas não limitada a, um laboratório, uma estufa e campo. Em outro exemplo, o pólen pode ser usado para produzir grãos, híbridos ou de outra maneira, em qualquer configuração, incluindo, mas não limitada, um laboratório, uma estufa e campo. Além disso, conforme discutido acima, um tal método pode ser aplicado a pólen a partir da família de plantas das Poaeceae (Gramineae), assim como qualquer outra espécie vegetal, em que seja desejado usar pólen.
[0077] As técnicas de preservação descritas nesta invenção pretendem preservar pólen, de maneira bem sucedida, tal que o pólen preservado mantenha sua viabilidade na extensão que cerca de 4 a cerca de 20 grãos de pólen sejam suficientes para polinizar, de maneira bem sucedida, um embrião.
[0078] Embora várias modalidades representativas desta invenção tenham sido descritas acima com um certo grau de particularidade, os técnicos especializados no assunto poderiam fazer inúmeras alterações nas modalidades descritas sem se desviar do espírito e do escopo da matéria objeto da invenção mostrada no relatório descritivo e definida nas reivindicações. Em alguns casos, em metodologias diretamente ou indiretamente mostradas aqui, várias etapas e operações são descritas em uma possível ordem de operação, mas os técnicos especializados no assunto reconhecerão que etapas e operações podem ser rearranjadas, substituídas ou eliminadas sem necessariamente se desviar do espírito e do escopo da presente invenção. Pretende-se que toda a matéria contida na descrição acima ou mostrada nos desenhos acompanhantes seja interpretada somente como ilustrativa e não limitante. Mudanças em detalhes ou estrutura podem ser feitas sem se desviar do espírito da invenção conforme definida nas reivindicações apensas.
[0079] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às modalidades destacadas acima, várias alternativas, modificações, variações, aperfeiçoamentos e/ou equivalentes substanciais, sejam conhecidos ou que são ou possam ser atualmente previstos, podem se tornar evidentes àqueles tendo pelo menos conhecimento ordinário na técnica. A listagem das etapas de um método em uma certa ordem não constitui qualquer limitação na ordem das etapas do método. Consequentemente, as modalidades da invenção mostradas acima pretendem ser ilustrativas, não limitantes. Pessoas especializadas no assunto reconhecerão que mudanças podem ser feitas em forma e detalhe sem se desviar do espírito e do escopo da invenção. Portanto, a invenção pretende englobar todas as alternativas, modificações, variações, aperfeiçoamentos e/ou equivalentes substanciais conhecidos ou anteriormente desenvolvidos.
[0080] Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção em mais detalhes e são ilustrativos de como a invenção descrita aqui poderia ser implementada em pólen de várias espécies.
[0081] A experimentação demonstrou uma correlação entre a densidade do pólen e sua capacidade de formar, de maneira bem sucedida, um tubo de pólen. A colocação de pólen em um meio líquido artificial é uma prática comum para medir a viabilidade de grãos de pólen.
[0082] Com os meios de germinação líquidos artificiais desempenhando um papel chave na determinação da viabilidade do pólen, milhares de ensaios têm sido realizados para testar a viabilidade do pólen armazenado durante o desenvolvimento da invenção nesta descrição. Ao longo de toda esta experimentação, foi observado que o pólen, que se aglomera em conjunto no meio de germinação líquido artificial, apresenta uma taxa de germinação global mais baixa comparado ao pólen que não esteja em contato direto com outros grãos de pólen. A Figura 1 mostra aglomerados de grãos de pólen que não formam tubos de pólen de maneira bem sucedida. Essa observação alimentou o desenvolvimento de composições para o armazenamento de pólen que impeçam que os grãos de pólen toquem uns aos outros e que separem grãos de pólen vivos do conteúdo de pólen morto e/ou de outros grãos de pólen vivos, por meio disto impedindo qualquer impacto negativo que tal toque possa gerar.
[0083] A fim de avaliar o impacto negativo que o pólen morto ou morrendo tem sobre o pólen fresco, vários métodos de produção de pólen morto foram testados para observar o impacto sobre o pólen fresco. Cada batelada de pólen morto foi misturada com amostras de pólen recém-coletado.
[0084] Uma batelada de 20 mL de pólen de milho recém- derramado foi coletada e igualmente dividida em cinco diferentes tubos de centrifugação de 50 mL, dos quais dois eram tubos de controle. As amostras de pólen foram submetidas a três diferentes tratamentos que matariam o pólen. A primeira amostra foi vertida em um tubo de ensaio de vidro, que foi, então, colocado em um conjunto de bloqueio com aquecimento à 95°C durante um período de 5 minutos. A aparência carbonizada do pólen o fez parecer queimado e um teor em umidade muito pequeno foi visualmente detectável dentro da amostra. Para o segundo tratamento, pólen recém-coletado foi coletado em um tubo de ensaio de vidro e submetido a micro-ondas durante um período de 1 minuto. As micro-ondas são frequentemente usadas como um meio para criar uma etapa de morte no citômetro de escoamento de Amphasys. As micro-ondas rompem a membrana celular fazendo com que o conteúdo do citoplasma se extravase, por meio disto matando o pólen. Para o terceiro tratamento, pólen recém-coletado foi colocado em um tubo de ensaio de vidro, que foi, então, colocado em um conjunto de bloqueio com aquecimento à 95°C, durante um período de 3 minutos. O pólen tinha uma aparência semi-carbonizada e a amostra estava menos carbonizada do que no caso do tratamento carbonizado.Para um quarto tratamento, foi usada uma fonte diferente de pólen. Esse pólen tinha sido coletado um mês antes e tinha sido deixado secar completamente à 21°C e em 50% de umidade relativa, durante um período de mais do que 30 dias. Devido ao fato de que o pólen de milho tem uma duração de vida muito curta em tais condições, esperava- se que este pólen estivesse completamente morto.
[0085] Foi feita outra coleta de pólen com derramamento recente. O pólen fresco foi adicionado em um volume igual a cada uma das quatro amostras de pólen tratadas descritas acima. Cada tubo foi agitado até a completa mistura do conteúdo, deixado repousar durante 10 minutos e, então, aplicado aos cabelos por aplicação do conteúdo do tubo sobre cabelos frescos.
[0086] As espigas polinizadas foram deixadas maturar durante o decurso de várias semanas e, então, coletadas. Para cada tratamento, o número de grãos de milho por espiga foi contado e registrado. Em resumo, os dados na Figura 2 mostram que, quando eles estão misturados em conjunto, o pólen morto resultante de vários tratamentos impacta, de maneira drástica, a viabilidade do pólen saudável.
[0087] O pólen submetido a micro-ondas teve o maior impacto sobre a viabilidade de pólen fresco, produzindo uma média apenas superior a 2 grãos de milho por espiga. O pólen semi-carbonizado foi o próximo ao mais baixo seguido pelo pólen seco velho. Finalmente, o pólen carbonizado mostrou a menor quantidade de impacto, mas ainda uma redução muito grande na viabilidade do pólen. É evidente que a manutenção de pólen fresco em um estado viável saudável exige a manutenção da separação entre os grãos de pólen e, em particular, o impedimento da interação de pólen saudável com pólen morto ou morrendo.
[0088] A fim de se avaliar adicionalmente o impacto negativo que pólen morto ou morrendo tem sobre pólen fresco, foram conduzidos vários testes para se observar o impacto do pólen morto sobre o pólen fresco, assim como em pólen com 4 dias de idade. Cada batelada de pólen morto foi misturada com amostras de pólen recém- coletado.
[0089] Pólen recém-coletado e pólen com 4 dias de idade foram divididos em quatro amostras de cada um. Pólen de milho, que tinha sido deixado secar durante um período de mais de 30 dias (e que estava, portanto, morto) foi, então, adicionado a 3 dos 4 conjuntos de tubos. O primeiro tubo foi usado como um controle e não tinha pólen morto a ele adicionado. O segundo conjunto de tubos foi misturado com uma razão de 75:25 de pólen vivo em relação a morto. O terceiro conjunto de tubos foi misturado com uma razão de 50:50 de pólen vivo em relação a morto. O quarto conjunto de tubos foi misturado com uma razão de 25:75 de pólen vivo em relação a morto. As pontuações de viabilidade foram obtidas usando-se Amphasys no tempo zero, em 24 horas e em 5 dias. Esses dados são mostrados na Figura 3. A fim de se dar a cada conjunto de dados igual relatividade, as pontuações de viabilidade no tempo zero foram normalizadas para 100% de viabilidade e a taxa esperada de perda de viabilidade do pólen foi plotada de uma forma linear. Depois de 24 horas, as pontuações de viabilidade tomadas usando Amphasys indicaram que, em cada razão de mistura, o pólen morto estava causando um decaimento exponencial de saúde, que excedeu grandemente a forma linear. A tendência foi também observada, uma vez que quanto maior era a razão de pólen morto em relação a pólen vivo, mais rápido ocorreu o declínio na saúde global da amostra. Finalmente, o declínio global de saúde no conjunto de amostras com 4 dias de idade foi muito mais pronunciado do que no conjunto de tubos com pólen fresco, indicando que pólen, que já tinha começado a se deteriorar, é mais afetado pela adição de pólen morto do que as amostras de pólen fresco.
[0090] Em experimentos iniciais considerando diferentes tipos de compostos de separação, a usar para o armazenamento de pólen, foram conduzidos experimentos usando-se carvão ativado como um separador. Pólen de campo foi coletado manualmente a partir de vários genótipos de milho, e armazenado temporariamente em tubos cônicos de 50 mL, à 5°C. Amphasys T0 foi conduzido em conjunto com a determinação do teor em umidade do pólen (TUP) do pólen de controle não misturado. Amphasys fornece uma determinação confiável da viabilidade do pólen usando um citômetro de escoamento por impedância, que mede as propriedades elétricas dos grãos de pólen. A viabilidade em T0 era de 97% com um TUP de 57% usando-se o método em forno durante uma noite padrão. O pólen foi misturado com pó de carvão (carvão ativado) em várias porcentagens. O carvão ativado é frequentemente usado para absorver substâncias tóxicas. Amostras mistas foram, então, armazenadas à 5°C, em tubos de 50 mL destampados. Os dados de pontos de tempo foram coletados nos dias 1 e 6, usando Amphasys, quando a concentração de carvão permitisse. Pequenas quantidades de amostra foram suspensas em meio Ampha 6 e, então, filtradas com um filtro de 150 μm, para remover quaisquer partículas grandes que poderiam afetar os fluidos em Amphasys. Conforme mostrado na Figura 4, a percentagem de carvão influenciou tanto a viabilidade do pólen quanto o teor em umidade do pólen (TUP). Usado em quantidades menores, 2,5-25% neste caso, a viabilidade permaneceu tão elevada quanto 92% em 6 dias de armazenamento. Entretanto, problemas com escoabilidade pobre foram observados, já que as amostras tornaram-se fofas e estavam se agregando no dia 6.
[0091] Em esforços continuados para testar diferentes substâncias para as finalidades de separação de grãos de pólen, foi conduzido um experimento com uma série de diferentes sacarídeos, para determinar a eficácia para a separação e preservação de grãos de pólen. Pólen misto foi coletado a partir de várias plantas de milho com derramamento ativo, cultivadas na estufa. A coleta manual foi feita com um funil e peneira para se remover as anteras. A amostra de pólen em volume foi dividida em quatro porções iguais, cada uma das quais era de aproximadamente 5 mL em volume. Cada amostra de pólen foi armazenada em um tubo cônico de 50 mL tampado, à 5°C, durante uma noite, e sua viabilidade foi testada usando Amphasys aproximadamente 24 horas depois da coleta. Uma razão em volume de 1:1 de um de três diferentes tipos de açúcares foi adicionada a cada tubo, de modo que a quantidade de açúcar fosse igual à quantidade de pólen em cada tubo. O tubo foi, então, invertido várias vezes para misturar completamente o açúcar com o pólen. O tubo 1 continha uma mistura 1:1 de pólen de milho em relação a inositol, o tubo 2 continha uma mistura 1:1 de pólen de milho em relação a lactose e o tubo 3 continha uma mistura 1:1 de pólen de milho em relação a trealose. O tubo 4 serviu como um controle com 5 mL de pólen. Cada tubo foi tampado e armazenado em um ambiente à 4°C. Dados de viabilidade em Amphasys, a partir de uma pequena alíquota de cada tubo, foram coletados nos pontos de tempo de 24 horas, 2, 5, 8 e 13 dias. Esses dados estão apresentados na Figura 5.
[0092] Depois de 24 horas de armazenamento, a viabilidade da amostra com trealose exibiu um leve declínio de viabilidade quando comparada às outras amostras. O dia 2 exibiu um declínio mais nítido na viabilidade da amostra com trealose quando comparada às outras 3 amostras. O dia 5 exibiu um nítido declínio de viabilidade para todas as amostras, com a exceção de lactose. O dia 8 forneceu um indicador muito claro de que a lactose estava mostrando boa preservação do pólen, com 77% de viabilidade, quando comparado a 24% no controle. Com base nos resultados globais, foi determinado que os sacarídeos podem ser compostos de separação adequados para manter grãos de pólen separados uns dos outros enquanto se mantém a viabilidade, e que a lactose era particularmente adequada para manter grãos de pólen de milho tanto separados uns dos outros quanto viáveis. Foi também observado que o pólen na amostra com lactose era de natureza levemente aglutinada (clumpy), com o pólen não escoando tão livremente quanto o pólen recém-coletado.
[0093] A fim de estudar o efeito do tamanho de partícula do composto de armazenamento sobre a separação e o armazenamento do pólen, foi usada uma série de composições de particulados sólidos para o armazenamento de pólen e aplicação a cabelos em plantas de milho em crescimento. Pólen fresco foi coletado a partir de plantas de milho com derramamento ativo. O pólen foi dividido em seis amostras iguais, que foram colocadas em tubos de centrífuga de 50 mL individuais. Cada amostra tinha, subsequentemente, uma igual razão de partículas de sílica de um tamanho específico adicionada ao pólen. Os tamanhos das partículas de sílica adicionadas variaram de 5,5 μm até 340 μm. Depois da adição das partículas, cada tubo foi misturado e colocado em armazenamento à 4°C durante 24 horas. Polinizações manuais, a partir da mistura em cada tubo, foram, então, conduzidas com 5 espigas com brotos ensacados e as espigas foram ensacadas depois da polinização para impedir que pólen adicional aterrissasse nos cabelos. Deixou-se as espigas maturarem, depois do quê elas foram coletadas e o número total de grãos de milho por espiga foi contado. Os dados estão apresentados na Figura 6. O tamanho de partícula de 20 μm produziu o número de grãos de milho médio mais elevado, porém o restante dos tamanhos de partícula também produziram grãos de milho com taxas de eficácia variáveis. Este experimento demonstra como o tamanho de partícula ótimo pode ser identificado para um tamanho de pólen específico.
[0094] A fim de se estudar adicionalmente o efeito do tamanho de partícula sobre a separação, o armazenamento e a escoabilidade do pólen, foi usada uma série de composições de particulados sólidos para armazenamento de longo prazo de pólen. Diferentes aditivos foram usados em um composto de separação com base em lactose para testar a escoabilidade aperfeiçoada de pólen para uso eventual em aplicação mecânica do pólen em uma configuração de campo.Tabela 1
[0095] Espiguetas de milho, de variedades reunidas e no estágio inicial de ântese ativa, foram coletadas e armazenadas em uma câmara de cultivo Conviron®. Para prolongar a produtividade das espiguetas, a câmara de cultivo Conviron® foi programada para operar à 12°C e à 90% de UR durante 18 horas, 26°C e 70% de UR durante 6 horas, para finalidades de coleta. O pólen reunido foi coletado manualmente a partir de espiguetas de milho e misturado em uma razão em volume de 1:3 com cada aditivo a partir da Tabela 1. Uma amostra de controle também foi preparada contendo apenas pólen sem qualquer meio de armazenamento. As amostras de controle e as misturas de amostras de pólen e particulados foram armazenadas em tubos de centrífuga de 50 mL tampados com filtro, que são retidos em um recipiente selado maior fechado, que tinha aproximadamente 100 mL de dessecante com contas de sílica Dry-Dry. As tampas de filtro apresentam um elemento de malha (mesh) que permite a passagem de ar sem derramamento do pólen. O recipiente selado foi armazenado em uma câmara de cultivo à 3°C. Isso mantém um microclima que é frio e levemente seco para o armazenamento dos tubos tampados com filtro.
[0096] Foi observado, no instante de mistura das amostras, que as misturas de contas de jojoba e Sipernat® 2200 foram difíceis de se lidar porque elas causaram a aglutinação da mistura, implicando em escoabilidade pobre.
[0097] A viabilidade em T0 usando Amphasys foi de 89,26% no início do período de teste. Depois de três dias de armazenamento, as amostras de pólen armazenadas foram testadas usando o sistema Amphasys para medir a viabilidade. Amphasys fornece uma determinação confiável da viabilidade do pólen usando um citômetro de escoamento por impedância, que mede as propriedades elétricas dos grãos de pólen.
[0098] Conforme mostrado na Figura 7, a amostra de controle exibiu uma pequena redução de viabilidade e apresentou pobre escoabilidade devido ao elevado TUP. Todas as outras amostras testadas exibiram fortes viabilidade e escoabilidade.
[0099] Uma série de composições de particulados sólidos foi usada para armazenamento de longo prazo de pólen com e sem tratamento com dessecante. Foram usados diferentes aditivos para testar a escoabilidade aperfeiçoada do pólen para uso em aplicação mecânica do pólen em uma configuração de campo.Tabela 2
[00100] Espiguetas de milho, de variedade reunida e no estágio inicial de ântese ativa, foram coletadas e armazenadas em uma câmara de cultivo Conviron®. Para prolongar a produtividade das espiguetas, a câmara de cultivo Conviron® foi programada para operar à 12°C e 90% de UR durante 18 horas, 26°C e 70% de UR durante 6 horas, para finalidades de coleta. O pólen reunido foi coletado manualmente a partir das espiguetas de milho e misturado em uma razão em volume de 1:3 (1 mL de pólen foi adicionado a 3 mL da composição) com as composições a partir da Tabela 2. Amostras de controle também foram criadas com somente pólen e nenhuma composição de meio particulado. As amostras foram armazenadas em tubos de amostra tampados com filtro. As tampas de filtro apresentam um elemento de malha que permite a passagem de ar, mas impede o derramamento do conteúdo do tubo. Foram preparados dois conjuntos de amostras idênticos. Um conjunto de amostras foi misturado e armazenado em um recipiente fechado contendo dessecante, conforme destacado no Exemplo 7, durante dois dias de armazenamento. O segundo conjunto de amostras foi também armazenado em um recipiente, mas sem qualquer dessecante. Depois de dois dias de armazenamento, todas as amostras do recipiente com dessecante foram movidas para um recipiente sem dessecante. A finalidade desse experimento era demonstrar qualquer intensificação de viabilidade por diminuição do teor em umidade do pólen de maneira leve, mas não excessivamente.
[00101] A viabilidade em T0 usando Amphasys foi de 97% no início do período de teste. Depois de dois e seis dias de armazenamento, o pólen armazenado foi testado usando o sistema Amphasys para medir a viabilidade. Amphasys fornece uma determinação confiável da viabilidade do pólen usando um citômetro de escoamento por impedância, que mede as propriedades elétricas dos grãos de pólen. Os dados estão apresentados na Figura 8.
[00102] Com a exceção da amostra de controle, todas as amostras não dessecadas tiveram melhor desempenho do que as amostras expostas a dessecante. Esse foi o caso no Dia 2 e no Dia 6. Todas as amostras exibiram forte viabilidade em 6 dias. Nesse caso, a dessecação com aditivos não aumentou a viabilidade durante o armazenamento. Todas as amostras que foram misturadas com as composições tiveram melhor viabilidade do que a amostra de controle.
[00103] O armazenamento de pólen com e sem dessecante foi testado para determinar o efeito do dessecante sobre a viabilidade do pólen. Espiguetas de milho de variedades e idades mistas foram coletadas e armazenadas em uma câmara de cultivo Conviron®. Para prolongar a produtividade das espiguetas, a câmara de cultivo Conviron® foi programada para operar à 12°C e à 90% de UR durante 18 horas, 26°C e 70% de UR durante 6 horas, para finalidades de coleta. Pólen totalizando apenas acima de 3 gramas foi coletado a partir das espiguetas na câmara de cultivo por leves batidas nas espiguetas sobre uma peneira que permitia que o pólen passasse por ela sem permitir que as anteras passassem. Foram formadas bolsas a partir de papel de filtro Whatman #4 e 1,75 g de pólen fresco foram adicionados a cada bolsa. As bolsas foram enroladas e colocadas em tubos cônicos de 50 mL. Alguns tubos continham 30 mL de dessecante com contas de gel de sílica Dry&Dry. Os tubos foram tampados e armazenados à 3°C durante 3 dias.
[00104] A testagem conduzida em 3 dias usando Amphasys demonstrou que o pólen armazenado com o dessecante apresentou um teor em umidade do pólen (TUP) de 10,9% e viabilidade de 0,67%. O pólen armazenado sem o dessecante apresentou um TUP de 57% e viabilidade de 91,52%.
[00105] Esse experimento demonstrou que o contato demasiado com o dessecante não suporta a viabilidade e a longevidade de pólen durante o armazenamento a frio.
[00106] Foi conduzido um estudo para determinar se havia um efeito sobre a viabilidade de pólen com base na razão de pólen em relação ao composto de separação física do pólen. Espiguetas de milho coletadas e remetidas a partir do Havaí, de variedade reunida e no estágio inicial de ântese ativa, foram armazenadas em uma câmara de cultivo Conviron®. Para prolongar a produtividade das espiguetas, a câmara de cultivo Conviron® foi programada para operar à 12°C e à 90% de UR durante 18 horas, 26°C e 70% de UR durante 6 horas, para finalidades de coleta. Pólen reunido foi coletado manualmente a partir das espiguetas de milho e uma pequena porção do pólen de tempo zero foi testada em relação à viabilidade usando Amphasys, que resultou em 96% de viabilidade.
[00107] O restante do pólen foi dividido em quatro quantidades iguais e colocado em tubos de centrífuga de 50 mL, e misturado em três diferentes razões em peso com um composto de separação compreendendo 96% de lactose e 4% de Aerosil®. O primeiro tubo serviu como um controle e nenhum composto de separação foi a ele adicionado. O segundo tubo apresentava uma razão de 3:1, de pólen em relação ao composto de separação. O terceiro tubo apresentava uma razão de 1:1, de pólen em relação ao composto de separação. O quarto tubo apresentava uma razão de 1:3, de pólen em relação ao composto de separação. Cada tubo foi completamente invertido para misturar o pólen com o composto de separação e colocado em armazenamento à 4°C. Cada tubo foi verificado em relação à viabilidade do pólen depois de 4, 6, 10, 12 e 17 dias usando Amphasys. Os dados são apresentados na Figura 9.
[00108] Depois de 4 dias em armazenamento, todas as razões de pólen com composto de separação estavam superando o controle. Depois de 6 dias em armazenamento, a razão de 3:1 de pólen em relação ao composto de separação começou, de maneira nítida, a declinar em viabilidade quando comparada às razões 1:1 e 1:3, no entanto, ela ainda superou o controle. A razão 1:1 de pólen em relação ao composto de separação também começou a declinar em viabilidade. Depois de 10 dias em armazenamento, as mesmas tendências continuaram. Depois de 12 dias, tanto a amostra de controle quanto a amostra com razão de 3:1 não exibiram pólen viável. A amostra com razão de 1:1 exibiu baixos níveis de viabilidade, no entanto, a amostra com razão de 1:3 ainda demonstrou 80% de viabilidade. Mesmo depois de 17 dias, a amostra com razão de 1:3 foi testada com 56% de viabilidade. Esse teste forneceu confirmação adicional de que quanto mais separação ocorrer entre os grãos de pólen durante o armazenamento para minimizar o contato, mais longamente o pólen permanecerá viável durante o período de armazenamento.
[00109] A fim de determinar se o método de manutenção da separação de pólen foi efetivo em outras espécies vegetais, foram conduzidos experimentos com trigo. Cabeças de trigo da variedade de trigo Grandin foram coletadas em estágio de emergência inicial e em estágio de pós-emergência. No estágio de pós-emergência, umas poucas anteras foram expostas nas cabeças de trigo. As anteras foram coletadas a partir de uma subamostra das cabeças e as anteras coletadas foram moídas com um pilão de nylon em 1,5 mL de meios Ampha 6, filtradas e passadas através do sistema Amphasys para medir a viabilidade de T0. Amphasys fornece uma determinação confiável da viabilidade do pólen usando um citômetro de escoamento por impedância, que mede as propriedades elétricas dos grãos de pólen.
[00110] Uma segunda subamostra de cabeças de trigo em estágio de emergência inicial e em pós-emergência foram tomadas a partir de regiões de cada cabeça. Essas amostras foram armazenadas inteiras à 5°C em crio frascos. As amostras nos frascos ou não tinham meio de armazenamento, ou tinham meio de armazenamento particulado de lactose ou lactose (D-lactose monoidratada de grau de laboratório, RPI #L26100- 1000.0) combinada com 2% de meio de armazenamento Sipernat® 340. Depois de armazenamento durante ou 3 ou 14 dias, o pólen foi extraído a partir das anteras armazenadas usando o pilão de nylon, e a viabilidade foi determinada usando Amphasys.
[00111] A viabilidade do pólen a partir das amostras é fornecida na Tabela 3, abaixo. Tabela 3: Viabilidade de Pólen de Trigo
[00112] Os resultados desse experimento são apresentados na Figura 10. Em 3 dias, houve um pequeno aperfeiçoamento de viabilidade quando comparado aos dados de T0 nas anteras em emergência inicial. As anteras maduras produziram viabilidade similar, independentemente do tratamento. O armazenamento nos meios com base em lactose mostra uma vantagem.
[00113] Outro experimento foi conduzido para testar a eficácia da manutenção da separação de grãos de pólen em arroz. Anteras de arroz foram coletadas a partir de um agrupamento de glumas cortadas. Uma amostra das anteras foi moída com um pilão de nylon em 1,5 mL de meios Ampha 6, filtradas e passadas através do sistema Amphasys para medir a viabilidade de T0. Amphasys fornece uma determinação confiável da viabilidade do pólen usando um citômetro de escoamento por impedância, que mede as propriedades elétricas dos grãos de pólen.
[00114] Uma segunda subamostra das anteras foi dividida em três grupos que foram armazenadas inteiras à 5°C em crio frascos. Essas amostras foram armazenadas inteiras à 5°C em crio frascos. As amostras nos frascos ou não tinham meio de armazenamento, ou tinham meio de armazenamento particulado de lactose ou lactose de grau químico combinada com 2% de meio de armazenamento Sipernat® 340. Depois do armazenamento ou durante 4 dias ou 10 dias, o pólen foi extraído a partir das anteras armazenadas usando o pilão de nylon, e a viabilidade foi determinada usando Amphasys. Os dados são mostrados na Figura 11.
[00115] A viabilidade do pólen a partir das amostras é fornecida na Tabela 4, abaixo.Tabela 4: Viabilidade de Pólen de Arroz
[00116] Em 4 dias, houve um aperfeiçoamento em viabilidade de pólen quando comparado aos dados de T0 de pólen a partir das antares armazenadas nos meios somente com lactose.
[00117] Um experimento com conjunto de grãos de milho foi conduzido para determinar se o pólen armazenado com um composto de separação resultaria em mais ou menos grãos de milho do que a aplicação de pólen fresco ou polinização aberta. Para esse experimento, plantas de teste de um único genótipo tiveram seus brotos ensacados no campo com a exceção de um grupo de plantas polinizadas abertas, as quais foram deixadas polinizar naturalmente. As plantas de controle negativo nunca tiveram as bolsas de brotos removidas. Para as polinizações de controle, um pólen em massa ou pólen com derramamento recente foi coletado e dividido em duas porções. A primeira porção foi usada para polinizar manualmente as plantas de controle, em cujo instante elas foram ensacadas para impedir que pólen adicional se acumulasse sobre os cabelos. A segunda massa de pólen foi misturada com uma razão de 1:1 de pólen fresco em relação a um composto de separação de 98% de lactose e 2% de Sipernat® 340. Essas amostras de pólen foram armazenadas à 4°C durante 24 horas. Depois de 24 horas, as bolsas de brotos foram removidas das plantas reservadas para os testes de composto de separação, o pólen misturado no composto de separação foi aplicado aos cabelos, e as plantas tiveram novamente seus brotos ensacados para impedir que pólen adicional se acumulasse nos cabelos. Todas as plantas polinizadas foram deixadas amadurecer e as espigas a partir de cada tratamento foram coletadas. As contagens de grãos de milho foram conduzidas em cada espiga e os dados são apresentados na Figura 12. Os dados mostram que não houve diferença estatística entre as plantas polinizadas de maneira aberta, as plantas de controle ou as plantas polinizadas com o pólen armazenado com o composto de separação. Isso demonstra que o pólen armazenado com o composto de separação retém viabilidade completa e resultou em um número de grãos de milho mais elevado do que as espigas de controle polinizadas com pólen fresco.
[00118] Esse exemplo testou o desempenho de 97% de lactose misturada com 3% de Sipemat® D17 como um composto de separação. O pólen com derramamento recente foi coletado a partir de espiguetas de milho e a viabilidade em T0 foi medida em 95,8% usando Amphasys. O restante do pólen foi misturado em uma razão em volume de 1:1 com o composto de separação. A viabilidade do pólen foi medida usando Amphasys em 3 e 7 dias e foram conduzidas polinizações manuais em espigas com botos ensacados em cada intervalo com uma bolsa colocada sobre os cabelos pós polinização, para impedir que pólen adicional pousasse sobre os cabelos. Embora cada intervalo de armazenamento contivesse pólen viável, as polinizações em campo falharam em produzir grãos de trigo. Quando de um exame mais próximo da mistura de aditivos com o pólen, tornou-se evidente que o produto Sipernat® D17, que é ligeiramente hidrofóbico, estava revestindo o pólen, impedindo-o de se ligar aos cabelos quando aplicado.
[00119] A Figura 13 fornece uma imagem microscópica do pólen revestido com o produto Sipernat® D17. O revestimento no pólen resultou em uma superfície escorregadia, impedindo que as polinizações fossem bem sucedidas a despeito do fato de que o pólen era viável. Em adição, a imagem mostra que os grãos de pólen ainda estão razoavelmente bem hidratados depois de 14 dias de armazenamento. Esse experimento demonstra que a experimentação de rotina pode facilmente testar vários compostos de separação em relação à eficácia e pode facilmente identificar aqueles compostos que sejam mais adequados para o pólen e as estruturas de planta de interesse.
[00120] Caseína e celulose foram ambas testadas separadamente como possíveis substâncias para manutenção ou aumento de viabilidade de pólen. A literatura prévia sugeriu que a caseína em particular é uma substância que é compatível com pólen. Pólen de milho recém-coletado foi coletado a partir de espiguetas com derramamento ativo. O pólen foi dividido em duas porções iguais, cada uma das quais foi colocada em um tubo de centrífuga de 50 mL. O primeiro tubo apresentava uma igual porção de caseína adicionada ao tubo. O segundo tubo apresentava uma igual porção de celulose adicionada ao tubo. Cada tubo foi armazenado durante 24 horas è 4°C. Um ensaio de germinação foi conduzido depois de 24 horas. Os resultados mostram que tanto a caseína quanto a celulose são prejudiciais à viabilidade de pólen, conforme mostrado nas Figuras 14 e 15. Nomeadamente, a Figura 14 mostra que o pólen misturado com caseína é grandemente, se não completamente, inviável depois de 20 horas de armazenamento à 4°C. Além disso, a Figura 15 mostra que o pólen misturado com celulose apresenta pouca viabilidade depois de 20 horas de armazenamento à 4°C.
[00121] Testes foram conduzidos para determinar o desempenho da invenção sob condições quentes. No experimento, foi coletada uma massa de pólen fresco. Uma viabilidade de pólen no tempo zero foi conduzida usando Amphasys. O pólen foi, então, misturado com uma razão de 1:5 de 1 parte de pólen, 5 partes de 98% de lactose e 2% Sipernat® 340. A mistura foi coletada em 2 diferentes recipientes de um compartimento, cada um contendo um volume total de 100 mL. O primeiro recipiente foi tampado e turbilhonado antes de se tomar uma amostra para testagem de viabilidade, assegurando que não havia uma tendência com base nas camadas de pólen no recipiente. O segundo recipiente foi tampado e não turbilhonado antes de se tomar uma amostra para testagem de viabilidade em Amphasys. Ambos os recipientes foram colocados sob insolação direta durante a testagem. A temperatura variou de 29,6°C a 32,8°C ao longo de todo o período de testagem. Os dados mostraram que o pólen em cada tratamento permaneceu altamente viável ao longo de todos os 330 minutos de exposição ao calor, conforme mostrado na Figura 16.
[00122] Óleo mineral Sonneborn® PD-23 foi testado como um agente de separação de pólen. Essa substância era um líquido em todos os estágios do experimento descrito. Pólen recém-coletado a partir de uma massa de plantas de milho foi colocado em óleo mineral e armazenado à 4°C durante um período de 20 horas. Depois de 20 horas, meio de germinação foi aplicado na formulação de óleo. Os resultados suportaram que o líquido serve como um meio de armazenamento competente para pólen. Além disso, grãos de pólen, que estiveram em contato direto uns com os outros, na maioria das vezes falharam em germinar, embora uma elevada percentagem de grãos de pólen não em contato com outros grãos de pólen formasse um tubo de pólen. Isso suporta adicionalmente o conceito de que a separação de grãos de pólen aumenta a viabilidade. Os resultados são mostrados na Figura 17.
Claims (13)
1. Método de preservação de uma pluralidade de grãos de pólen, compreendendo: misturar a pluralidade de grãos de pólen com uma substância que impede que conteúdo de pólen morto interaja com grãos de pólen vivos; e armazenar a pluralidade de grãos de pólen e dita substância; em que o teor em umidade de pólen é mantido em 15-60% caracteri zado pelo fato de que dita substância é lactose ou carvão ativado em que a mistura da substância e os grãos de pólen é realizada sob uma razão de massa pólen:substância entre 1:1 e 1:25.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado pelo fato de que a substância é selecionada a partir do grupo consistindo em um sólido, um líquido, um gás e combinações dos mesmos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a substância: (i) circunda ou isola os grãos de pólen; ou (ii) minimiza o contato superfície a superfície entre a pluralidade de grãos de pólen.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o teor em umidade do pólen é mantido em 35-60%.
5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracteri zado pelo fato de que o método inclui agitação do pólen e da substância durante a etapa de armazenamento; opcionalmente em que a agitação é contínua.
6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a substância é um sólido.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracteri zado pelo fato de que o tamanho da substância varia a partir de um máximo de dez vezes maior do que o tamanho dos grãos de pólen até um mínimo de dez vezes menor do que o tamanho dos grãos de pólen; opcionalmente em que a substância inclui partículas de tamanhos variáveis.
8. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os grãos de pólen são selecionados a partir do grupo consistindo em pólen recém-coletado e pólen armazenado.
9. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracteri zado pelo fato de que compreende adicionalmente o condicionamento de campo do pólen.
10. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a substância é lactose.
11. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o teor em umidade do pólen é de 45-55%.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado pelo fato de que a substância é hidrofílica.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de incluir a redução do teor em umidade do pólen, depois da coleta do pólen, para menos do que 60%.
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