RU2799580C2 - Способ обеспечения сохранности пыльцы - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Способ обеспечения сохранности совокупности пыльцевых зерен предусматривает перемешивание пыльцевых зерен по меньшей мере с одним веществом, предотвращающим воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, при этом упомянутое вещество, предотвращающее воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, выбирают из группы, содержащей лактозу или смесь лактозы с кремнийсодержащим материалом марки Sipernat® 50, или Sipernat® 22S, или Sipernat® 340, или Sipernat® 350, или Perkasil® SM660, или Aerosil® 200, и хранят упомянутые пыльцевые зерна с упомянутым по меньшей мере одним веществом, предотвращающим воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна. Содержание влаги в пыльце поддерживают в пределах от 15 до 60%. Отношение упомянутого по меньшей мере одного вещества, предотвращающего воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, к пыльцевым зернам составляет по меньшей мере 1:1 или 3:1. Предлагаемый способ обеспечения сохранности пыльцы предусматривает предотвращение контактов между мертвым пыльцевым материалом и живыми пыльцевыми зернами, что значительно продлевает жизнеспособность пыльцы, предотвращает её комкование, снижает гигроскопичность. 9 з.п. ф-лы, 17 ил., 4 табл., 17 пр.

Description

[001] Для данной заявки на патент испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США сер. №62/529 198, поданной 06 июля 2017 года и озаглавленной «Method of Improving Pollen Viability and Storability» («Способ повышения жизнеспособности и сохранности пыльцы»). Содержание предварительной заявки на патент США сер. №62/529 198 настоящим включается в данную заявку во всей полноте.

Область техники, к которой относится предлагаемое изобретение

[002] Предлагаемое изобретение относится в целом к новому способу повышения общей жизнеспособности и фертильности пыльцы и к предотвращению некроза пыльцы, результатом чего является получение улучшенной пыльцы для использования при выращивании опыляемых растений. Предлагаемый способ может быть использован по отношению как к свежей пыльце, так и к пыльце, которая была заготовлена впрок или законсервирована.

Предпосылки создания предлагаемого изобретения

[003] Предлагаемое изобретение применимо в плане повышения долговечности и жизнеспособности пыльцы. На долговечность пыльцы значительное влияние оказывают условия среды, особенно температура и относительная влажность. Пыльца, которая в естественных условиях сбрасывается цветками или цветковыми структурами покрытосемянных растений, быстро теряет жизнеспособность после сброса. В зависимости от конкретных растений и условий среды жизнеспособность пыльцы может быть утрачена в течение минут или часов. Особенно вредоносными для жизнеспособности и долговечности сброшенной растением пыльцы факторами среды являются сухость и высокая температура воздуха. Таким образом, в естественных полевых условиях пыльца имеет ограниченный срок, в течение которого она жизнеспособна. В данной заявке на патент этот срок жизни пыльцы далее называется «окном жизнеспособности». Особенно уязвимой и короткоживущей является, в частности, пыльца растений семейства Роаесеае (Gramineae) (злаковые или мятликовые) (см. Barnabas & Kovacs (1997) In: Pollen Biotechnology For Crop Production And Improvement. (1997). Sawhney, V.K., and K.R. Shivanna (eds). Cambridge University Press, pp. 293-314). К этому растительному семейству принадлежит много экономически важных зерновых культур, в том числе кукуруза. Способы повышения жизнеспособности пыльцы и продления этой жизнеспособности имеют важное значение для сельскохозяйственного производства.

[004] Говоря более конкретно, если пыльца, собранная с растений, может быть сохранена в жизнеспособном состоянии в течение некоторого периода времени, то эта пыльца может быть использована для опыления женских цветков несколькими обеспечивающими преимущество способами по желанию. Использование заготовленной впрок пыльцы обеспечивает возможность опыления независимо от активного сброса пыльцы растениями, от синхронизации с воспринимающей способностью пестика женского цветка, от использования мужской стерильности и/или других средств ограждения от других источников пыльцы. В настоящее время у многих видов растений производство фертильного семени или зерна злака зависит от самоопыления либо перекрестного опыления соседними растениями. Чтобы обеспечить перекрестное опыление и в то же время не допустить самоопыления женских растений при получении гибридных семян сельскохозяйственных культур, обычно осуществляют механическое, физическое и/или генетическое вмешательство, с тем чтобы для получения гибридных семян использовалась пыльца определенного генетического строения. Такого рода меры регулярно применяют, например, при получении гибридных семян кукурузы и риса. Для некоторых хлебных культур, однако, для обеспечения перекрестного опыления конкретным желаемым источником пыльцы даже эти меры не столь эффективны. В настоящее время производить эти хлебные культуры в виде гибридов экономически неоправданно. К таким культурам относятся, в частности, пшеница и соя.

[005] Делалось много попыток обеспечить сохранность пыльцы и продлить ее жизнеспособность для возможности опыления за пределы временного периода, в течение которого она остается жизнеспособной в неконтролируемых условиях местной окружающей среды. Для злаковых культур образцовым примером с точки зрения прогресса, которого удалось добиться в обеспечении сохранности пыльцы, являются эксперименты с кукурузой. С целью поддержания или продления жизнеспособности и/или фертильности пыльцы кукурузы было испытано много методов обработки. Имеется много сообщений о пользе обработки и/или хранения пыльцы кукурузы в условиях высокой влажности и/или низких температур.

[006] В самом раннем сообщении, касающемся обеспечения сохранности пыльцы кукурузы (см. Andronescu, Demetrius I., The physiology of the pollen of Zea mays with special regard to vitality. Докторская диссертация, Университет Иллинойса, 1915 год) говорилось, что при хранении в не контролируемом микроклимате пыльца погибала в течение двух-четырех часов. При повышении в среде хранения относительной влажности жизнеспособность пыльцы поддерживалась в течение 48 часов. Кроме того, жизнеспособность пыльцы стимулировало ее хранение при пониженной температуре (например, от 8°С до 14°С).

[007] При пониженной температуре (например, от 2°С до 7°С в течение 3-120 часов) хранения кукурузной пыльцы даже в отсутствие контроля относительной влажности прорастаемость in vitro более чем удваивается по сравнению с первоначальной жизнеспособностью до хранения или по сравнению с жизнеспособностью при хранении при температуре 35°С (см. Pfahler, P.L and Linskens, H.F., (1973) Planta, 111(3), pp. 253-259; Frova, C.B. and Feder, W.A., (1979) Ann Bot, 43(1), pp. 75-79). При сочетании высокой относительной влажности (90%) и низкой температуры (4°С) хранения пыльцы прорастание кукурузной пыльцы на искусственных средах остается от хорошей до приемлемой в течение восьми дней (см. Sartoris, G.B., (1942) Am J Bot, pp. 395-400). Хранение кукурузной пыльцы в течение восьми дней в тех же условиях тоже обеспечивает сохранение ею фертильности, хотя и на более низком уровне, и способности образования зерен в початках после опыления (см. Jones, M.D. and Newell, L.C., (1948) JAmer Soc Agron 40:195-204).

[008] Полевое кондиционирование кукурузной пыльцы в условиях высокой относительной влажности и низкой температуры обычно способствует восстановлению пыльцы с низкой жизнеспособностью и/или продлению ее долговечности, обеспечивая, тем самым, по меньшей мере ограниченное завязывание семян после опыления початков. Однако стимулирующее действие низкой температуры на фертильность наблюдается не всегда (см. Walden, D.B., (1967) Crop Science, 7(5), pp. 441-444), и если пыльца становится чрезмерно обезвоженной, то образование пыльцевых трубок на искусственных средах и кистях нитей рылец может существенно сокращаться (см. Hoekstra, FA. (1986) In: Membranes, Metabolism and Dry Organisms. (Ed., AC Leopold), pp. 102-122, Comstock Publishing Associates, Ithaca, NY; Barnabas, B. and Fridvalszky, L, (1984) Acta Bot Hung 30:329-332).

[009] Высокая относительная влажность и низкая температура вызывают временное снижение жизнеспособности пыльцы злаковых растений в процессе ее хранения, а оптимизация этих параметров среды хранения пыльцы только отсрочивает полную потерю жизнеспособности и фертильности. Для дальнейшего повышения долговечности хранимой пыльцы до такой степени, чтобы ее можно было на деле использовать для добавочного опыления с целью повышения объемов производства семян и зерна, в дополнение к регулированию относительной влажности и температуры хранения пыльцы требуются другие способы. Кроме того, регулирование относительной влажности и температуры хранения пыльцы при крупномасштабном применении представляет технические трудности и связано с экономическими затратами, поэтому много более целесообразным представляется осуществление дополнительного опыления с помощью более простых решений.

[0010] В некоторых случаях представляется желательным подвергнуть пыльцу такой обработке, при которой она подвергается обезвоживанию до той или иной степени. Это обезвоживание может быть достигнуто с помощью вакуумной сушки или выдерживанием пыльцы при таких значениях относительной влажности и температуры, которые вызывают выход воды из пыльцы (то есть, дефицит давления водяного пара). Дефицита давления водяного пара, способствующего высушиванию пыльцы, можно достичь разными способами, в частности, с помощью обезвоживающих веществ (десиккантов), с помощью механического оборудования, обеспечивающего регулирование температуры и относительной влажности в замкнутом помещении, а также с помощью насыщенных соляных растворов, выставленных в замкнутом пространстве (см. Jackson, М.А. and Payne, A.R. (2007) Biocontrol Sci Techn, 17(7), pp. 709-719), Greenspan, L, (1977) J Res Nat Bur Stand, 87(1), pp. 89-96).

[0011] В опытах по обезвоживанию и сохранению пыльцы сахарного тростника пыльцу хранили при низкой температуре в вакууме в присутствии небольшого количества хлорида кальция (CaCl₂) в качестве десикканта (см. Sartoris, G.B. (1942) Am J Bot, pp. 395-400). Пыльца оставалась сухой на всем протяжении процесса хранения, что и требовалось, но хранение при низком давлении было не так благоприятно, как хранение при нормальном атмосферном давлении. Поведение пыльцы зерновых культур очень похоже на поведение пыльцы сахарного тростника. Проводились опыты по непосредственному обезвоживанию пыльцы в условиях установленных или регистрируемых относительной влажности и температуры. Эти примеры показывают, что обезвоживание пыльцы кукурузы может осуществляться до очень низких уровней (например, до содержания воды в пыльце от 7% до 10%), и при этом пыльца все же сохраняет способность, хотя и пониженную, образовывать семена после опыления ею початка (см. Barnabas, В., et al. (1988) Euphytica, 39(3), рр. 221-225; Патент США №5,596,838).

[0012] Обезвоживание пыльцы обычно выполняют перед ее замораживанием для хранения и обеспечения сохранности при очень низких температурах. В случае кукурузы свежую пыльцу обезвоживают при комнатной температуре в вакуумной камере, в камере влажности, или просто воздушной сушкой или медленным нагревом (см. патент США №5,596,838; Barnabas, В. and Rajki, Ε. (1981). Ann Bot, 48(6), pp. 861-864; Connor, K.F. and Towill, L.E. (1993) Euphytica, 68(1), pp. 77-84). По оттаивании после кратковременного или длительного хранения криосохраненная пыльца может быть жизнеспособной и фертильной, но фертильность проявляется не всегда, а кроме того, некоторые представители семейства злаковых, такие как кукуруза, сорго, овес и пшеница, трудно переносят криосохранение (см. Collins, F.C., et al. (1973) Crop Sci, 13(4), pp. 493-494). Одно из объяснений этой неподатливости состоит в избыточности высушивания или в старении пыльцы (см. Collins, F.C., et al. (1973) Crop Sci, 13(4), pp. 493-494). Очевидно, на качество пыльцы могут повлиять превалирующие условия окружающей среды во время развития цветка, созревания пыльцы и цветения (см. Shivanna, K.R., et al. (1991) Theor Appl Genet 81(1), pp.38-42; Schoper, J.B., et al. (1987) Crop Sci, 27(1), pp. 27-31; Herrero, M.P. and Johnson, R.R. (1980) Crop Sci, 20(6), pp. 796-800). Пыльца, подвергавшаяся стрессам в эти периоды, может иметь пониженную способность противостоять обезвоживанию и замораживанию для криосохранения. Существует потребность в том, чтобы решить эту проблему и сделать криосохранение пыльцы злаковых растений более достижимым и общеприменяемым, так чтобы эта технология сохранения пыльцы могла применяться на основе предварительного расчета в коммерческих масштабах.

[0013] Известно, что обезвоживание непосредственно влияет на жизнеспособность пыльцы. Было показано (см. Barnabas (1985) Ann Bot 55:201-204 and Fonseca and Westgate (2005) Field Crops Research 94: 114-125), что свежесобранная пыльца кукурузы может выжить при уменьшении содержания влаги приблизительно на 50% по сравнению с первоначальным, но при дальнейшей потере воды ниже этого уровня лишь немногие пыльцевые зерна проявляют жизнеспособность или способность формировать нормальную пыльцевую трубку. В ранних работах Барнабаса и Раджки (см. Barnabas and Rajki (1976), Euphytica 25: 747-752) было показано, что пыльца с уменьшенным содержанием влаги сохраняет жизнеспособность при криогенном хранении при температуре -196°С. Последующие их работы (см. Barnabas & Rajki (1981) Ann Bot 48:861-864) показали, что такие частично обезвоженные пыльцевые зерна, хранившиеся при температуре -76°С или -196°С, также могут оплодотворять готовые к оплодотворению женские цветки. В данной отрасли известны и другие технологии обеспечения сохранности пыльцы в течение разных периодов времени, в частности, лиофилизация, вакуумная сушка и хранение в органических неполярных растворителях. Проблемы, касающиеся масштабируемости этих технологий обеспечения сохранности пыльцы, осложняемые необходимостью использовать сложное стационарное оборудование, делают эти технологии непригодными к использованию для больших объемов пыльцы, требуемых для обработки полей. Например, можно было бы создать вакуумную камеру, которая имела бы объем, достаточный для хранения пыльцы в промышленных масштабах. Но это была бы вакуумная камера много большего объема, чем имеющиеся сейчас вакуумные камеры для данного назначения, и в ней нужно было бы быстро изменять давление. Промышленные поля для выращивания родительских растений обычно имеют площадь не менее одного акра (0,4047 га), а поля для производства гибридов обычно имеют площадь не менее 10 акров (4,047 га). Такие поля требуют значительного количества пыльцы, и следовательно, для ее хранения потребовалась бы вакуумная камера большого размера. Вакуумная камера с такими техническими параметрами потребовала бы создания пониженного давления 5 мм рт. ст. (0,67 кПа) или ниже с возможностью быстрого его повышения и столь же быстрого понижения до нужного уровня. С увеличением физического объема образцов возможность осуществления такого цикла давления не может быть обеспечена с помощью механических насосов. Что же касается хранения пыльцы в органических растворах, то оно сопряжено с рисками, обусловленными химическими факторами.

[0014] В патенте США №5,596,838 на имя Гривз и др. (Greaves et al.) раскрыт способ хранения пыльцы, в котором используют уменьшение влажности пыльцы путем выдерживания ее перед хранением в условиях пониженного давления. Этим способом обрабатывали малые количества пыльцы, например, от одного растения кукурузы, для последующего ее хранения при минусовой температуре. Однако данная методика и требования к механической системе не обеспечивают возможности производить хранимую таким способом пыльцу в количествах, достаточных для применения этого способа для коммерческого производства семян или зерна. Эти требования исключают всякую возможность выйти за пределы исследовательского уровня. Еще в одном патенте на имя Гривз и др. (Greaves et al.), в патенте США №6,141,904, раскрывается способ, при котором для повышения текучести пыльцу помещают в материал-носитель, получая текучий порошок. Кроме того, в патенте США №2,669,066 в случаях кратковременного хранения предлагается для обработки и применения перемешивать пыльцу с веществами с высоким содержанием протеина, например, с порошкообразным яичным белком, порошкообразным казеином или порошкообразным молоком.

[0015] Доступность сохраненной жизнеспособной пыльцы решает многие проблемы, с которыми сталкивается производство гибридных семян. Что касается производства гибридных семян, то доступность сохраненной пыльцы для опыления женских цветков могла бы сделать ненужными много стандартных дорогостоящих технологий производства семян, в частности, таких как (но не только) выращивание мужских растений отдельно, но неподалеку от женских растений для обеспечения гибридизации, изоляция женских растений от нежелательных источников опыления и обеспечение генетической или механической мужской стерильности женских растений. Эти технологии требуют значительного увеличения площади поля и ресурсов, предназначенных для женских растений, производящих семена или зерно. Упразднение любой из этих технологий оказало бы немедленное положительное действие на урожайность семян. Кроме того, сохраненную пыльцу можно использовать в любое время. Когда сброс пыльцы мужскими растениями не совпадает по времени с запланированным (по причине управленческих, климатических или генетических вариаций), применение запасенной впрок жизнеспособной пыльцы обеспечивает опыление же неких растений в оптимальный момент времени. При применении сохраненной пыльцы желаемого типа в нужное время может быть уменьшено или полностью устранено опыление от нежелательных внешних (случайных) источников пыльцы или нежелательное самоопыление женских растений. В настоящее время генетика конкретного гибридного семени определяется в начале вегетационного периода генотипом мужских растений - доноров пыльцы и женских растений - получателей пыльцы, растущих вместе на поле. Однако согласно предлагаемому изобретению производитель гибридных семян, реагируя на переменчивую конъюнктуру рынка, может принять решение использовать во время опыления другую пыльцу (то есть другой генетический источник), чтобы производить более ценные гибридные семена. Таким образом, сохраненная пыльца может быть использована для придания высокопродуктивным инбредным женским растениям уникальных генетических признаков или генов, которые повышают характеристики качества семян. Например, могут быть приданы признаки сопротивляемости по отношению к распространившимся насекомым-вредителям. Важно отметить, что предлагаемое изобретение обеспечивает также высокий уровень генетической чистоты гибридных семян. Как таковые, способы повышения жизнеспособности пыльцы и продления срока ее жизнеспособности представляют значительную ценность для сельскохозяйственного производства.

Краткое описание прилагаемых графических материалов

[0016] На фиг. 1 изображены пыльцевые зерна, находящиеся в искусственной питательной среде, как описано в рабочем примере 1. Это изображение демонстрирует, что пыльцевые зерна, образующие скопления, имеют в целом более низкую скорость прорастания по сравнению с отдельными пыльцевыми зернами, не находящимися в контакте с другими пыльцевыми зернами. Два скопления пыльцевых зерен на изображении выделены квадратными рамками. Следует заметить, что эти скопления не показывают сильного роста пыльцевых трубок.

[0017] На фиг. 2 графически изображено, как мертвая или умирающая пыльца воздействует на свежую пыльцу, как это описано в рабочем примере 2. Наряду с четырьмя образцами, содержавшими пыльцу, подвергнутую обработке, которая вызвала бы гибель пыльцы, были испытаны два контрольных образца.

[0018] На фиг. 3 графически изображено, как мертвая пыльца воздействует на свежую пыльцу или на четырехдневную пыльцу, как это описано в рабочем примере 3. Показано негативное действие мертвой пыльцы на живую пыльцу, которая быстро теряет жизнеспособность. Показано, что действие мертвой пыльцы более значительно проявляется в отношении пыльцы, которая уже начала портиться.

[0019] На фиг. 4 представлены данные из рабочего примера 4. В эксперименте использовали пыльцу кукурузы, собранную с поля и хранившуюся в измельченном до частиц древесном угле. Пыльцу перемешивали с частицами древесного угля в различных соотношениях, так что содержание угля в смеси составляло от 2,5% до 75%. На фиг. 4 представлены результаты, касающиеся жизнеспособности пыльцы и содержания в ней влаги через один и через шесть дней хранения.

[0020] На фиг. 5 представлены данные из рабочего примера 5. В эксперименте измеряли жизнеспособность пыльцы кукурузы, собранной в теплице и хранившейся с сахарами разного типа. Для получения каждого образца пыльцу перемешивали с соответствующей сахарной средой в соотношении 1:1. На фиг. 5 представлены результаты, касающиеся жизнеспособности пыльцы через 24 часа, 2 дня, 5 дней, 8 дней и 13 дней.

[0021] На фиг. 6 представлены данные из рабочего примера 6. Пыльцу хранили в частицах диоксида кремния различного размера, чтобы определить влияние размера частиц на сохранность пыльцы и ее жизнеспособность. После хранения пыльцы в частицах диоксида кремния в течение 24 часов ее использовали для ручного опыления. На фиг. 6 показано множество зерен для каждого образца.

[0022] На фиг. 7 представлены данные, собранные в рабочем примере 7. В эксперименте использовали смешанную пыльцу кукурузы, собранную в ростовой камере. Пыльцу хранили в ряде разных сред, все из которых содержали 98% лактозы и 2% различных веществ, предназначенных для повышения текучести. На фиг. 7 представлены результаты, касающиеся жизнеспособности пыльцы и содержания в ней влаги через три дня хранения.

[0023] На фиг. 8 представлены данные, собранные в рабочем примере 8. В эксперименте использовали смешанную пыльцу кукурузы, собранную в ростовой камере. Пыльцу хранили в ряде разных сред, все из которых содержали 98% лактозы и 2% различных веществ, предназначенных для повышения текучести. Одну группу образцов подвергали обезвоживанию в течение двух дней, а другую обезвоживанию не подвергали. На фиг. 8 представлены результаты, касающиеся жизнеспособности пыльцы и содержания в ней влаги через два и через шесть дней хранения.

[0024] На фиг. 9 представлены данные, собранные в рабочем примере 10. В эксперименте измеряли жизнеспособность пыльцы кукурузы, хранимой в среде, содержащей 4% Aerosil® и лактозу, в двух разных соотношениях. Для сравнения использовался контрольный образец - пыльца вне среды. На фиг. 9 представлены результаты, касающиеся жизнеспособности пыльцы в течение периода хранения на дни 0, 4, 6, 10, 12 и 17.

[0025] На фиг. 10 представлены данные, собранные в рабочем примере 11. В эксперименте использовали пыльцу из пыльников пшеницы, содержащих как послевсходовую, но не сброшенную пыльцу, так и послевсходовую сброшенную пыльцу. Пыльники хранили вне всякой среды как контрольный образец, а экспериментальные образцы хранили с порошкообразной лактозой, а также со смесью лактозы и Sipernat® 340. На фиг. 10 представлены результаты, касающиеся жизнеспособности пыльцы через 3 и 14 дней хранения.

[0026] На фиг. 11 представлены данные, собранные в рабочем примере 12. В эксперименте использовали пыльцу из хранимых объединенных пыльников риса. Пыльники хранились вне всякой среды как контрольный образец, а экспериментальные образцы хранились с порошкообразной лактозой, а также со смесью лактозы и Sipernat® 340. На фиг 11 представлены результаты, касающиеся жизнеспособности пыльцы из этих пыльников через 4 и 10 дней хранения.

[0027] На фиг. 12 представлены данные, собранные в рабочем примере 13. Эксперимент с урожаем зерен злака проводили с использованием пыльцы, хранившейся с веществом-разделителем для сравнения урожая зерен злака, полученного от открытого опыления, и контрольного образца, полученного от опыления свежей пыльцой. На фиг. 12 представлены результаты, касающиеся количества зерен в каждом образце.

[0028] На фиг. 13 изображена пыльца, перемешанная с Sipernat® D17. Видно, что пыльца покрыта частицами, в результате чего возникла скользящая поверхность, препятствующая успешному опылению.

[0029] На фиг. 14 изображена пыльца, перемешанная с казеином, как это проделано в рабочем примере 15. Видно, что казеин негативно влияет на жизнеспособность пыльцы, в результате чего жизнеспособность пыльцы после хранения ее в течение 20 часов при температуре 4°С оказалась от незначительной до нулевой.

[0030] На фиг. 15 изображена пыльца, перемешанная с целлюлозой, как это проделано в рабочем примере 15. Видно, что целлюлоза негативно влияет на жизнеспособность пыльцы, что проявляется в снижении жизнеспособности пыльцы после хранения ее в течение 20 часов при температуре 4°С.

[0031] На фиг. 16 представлены данные, собранные в рабочем примере 16. Наблюдается хорошая жизнеспособность при хранении пыльцы согласно предлагаемому способу. Пыльцу кукурузы хранили со смесью лактозы и Sipernat 340 при температурах 29,6°С и 32,8°С, результатом чего стала хорошая жизнеспособность.

[0032] На фиг. 17 представлены данные, собранные в рабочем примере 17. Можно видеть, что хранение пыльцы в среде минерального масла Sonneborn® PD-23 привело к хорошей жизнеспособности пыльцы.

Краткое описание предлагаемого изобретения

[0033] Предлагается способ обеспечения сохранности совокупности пыльцевых зерен, при котором предотвращают взаимодействие мертвого пыльцевого материала с живыми пыльцевыми зернами. В некоторых вариантах осуществления предлагаемого способа предусмотрено хранение пыльцевых зерен вместе по меньшей мере с одним веществом, предотвращающим взаимодействие мертвого пыльцевого материала с живыми пыльцевыми зернами. Это вещество может находиться в твердом, жидком или газообразном агрегатном состоянии, или же в комбинации этих агрегатных состояний. Кроме того, это вещество может окружать по меньшей мере одно пыльцевое зерно таким образом, чтобы была обеспечена минимизация контакта между поверхностями упомянутой совокупности пыльцевых зерен. Содержание влаги в пыльце может поддерживаться в пределах от 15% до 60%, в частности, от 35% до 60%. Кроме того, перемешанное состояние пыльцевых зерен и этого вещества может поддерживаться, например, путем непрерывного перемешивания. Соотношение вещества и пыльцевых зерен может составлять по меньшей мере 3:1. Кроме того, размер частиц вещества может находиться в пределах от минимум одной десятой размера пыльцевого зерна до максимум десятикратного размера пыльцевого зерна. В некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения предусмотрено использование частиц вещества разных размеров. Вещество может быть выбрано из следующей группы: лактоза, Sipernat® 50, Sipernat® 50S, Sipernat® 2200, Sipernat® 22, Sipernat® 22S, Sipernat® 340, Sipernat® 350, Perkasil® SM660, косточки жожоба, Aerosil® 200, Syloid® 244, а также комбинации этих веществ. Предлагаемый способ может быть применен к свежесобранной пыльце, к сохраненной пыльце, а также к их смеси. Кроме того, предлагаемый способ может предусматривать полевое кондиционирование пыльцы.

[0034] Согласно другому варианту осуществления предлагаемого изобретения предусмотрено создание способа, при котором пыльцевые зерна перемешивают с веществом - регулятором влажности, которое придает пыльце содержание влаги от 15% до 60%. В некоторых вариантах содержание влаги в пыльце может быть обеспечено в пределах от 36% до 60%, в частности, от 45% до 55%. Это вещество- регулятор влажности может быть гидрофильным и может дополнительно предотвращать взаимодействие мертвого пыльцевого материала с живыми пыльцевыми зернами. Кроме того, предлагаемый способ может предусматривать понижение содержания влаги в пыльце после ее сбора до уровня ниже 60%.

Глоссарий

[0035] Под термином «камера» в тексте данной заявки понимается замкнутое пространство, пригодное для размещения и хранения в нем пыльцы.

[0036] Под термином «мертвый пыльцевой материал» здесь понимается любой материал, относящийся к мертвым или умирающим пыльцевым зернам, включающий как собственно пыльцевые зерна, так и материал, вытекающий из мертвых или умирающих пыльцевых зерен.

[0037] Под термином «женское растение» здесь понимается растение, используемое как реципиент пыльцы и имеющее воспринимающие пыльцу цветки, которые оплодотворяются.

[0038] Терминами «фертильный» и «фертильность» здесь описывается способность пыльцы доставлять ядро спермия к семязачатку и тем самым осуществлять двойное оплодотворение. По отношению к цветковым растениям термином «двойное оплодотворение» обозначается процесс слияния одного ядра спермия с полярными ядрами для получения тканей эндосперма и другого ядра спермия с ядром яйцеклетки для получения зародыша.

[0039] Под термином «свежий» в отношении пыльцы здесь понимается пыльца, высвобожденная из пыльников цветка, который при естественном росте и развитии сбрасывает пыльцу после растрескивания пыльников в качестве реакции на действие факторов окружающей среды.

[0040] Под термином «прорастаемость» здесь понимается способность пыльцы прорастать и образовывать пыльцевые трубки.

[0041] Под термином «долговечность» в отношении пыльцы здесь понимается продолжительность периода времени, на протяжении которого пыльца остается как жизнеспособной, так и фертильной.

[0042] Под термином «потеря жизнеспособности» здесь понимается характеристика пыльцы, указывающая на то, что уровень жизнеспособности пыльцы упал ниже требуемого для успешного начала развития семени.

[0043] Под термином «потеря фертильности» здесь понимается характеристика пыльцы, указывающая на то, что уровень фертильности пыльцы упал ниже требуемого для успешного начала развития семени.

[0044] Под термином «мужское растение» здесь понимается растение, пыльцу которого собирают для опыления.

[0045] Под термином «обеспечение сохранности» или «сберегающее хранение» по отношению к пыльце здесь понимается такое хранение собранной пыльцы, в результате которого уровень ее жизнеспособности, фертильности или и того и другого отличается в лучшую сторону от уровня ее жизнеспособности, фертильности или и того и другого, который имел бы место при ее хранении в нерегулируемых условиях.

[0046] Под термином «хранение» по отношению к пыльце в тексте данной заявки понимается защищенное содержание пыльцы в течение определенного времени с целью ее последующего использования в более позднее время и/или дату.

[0047] Под термином «межповерхностный контакт» по отношению к пыльцевым зернам здесь понимается контакт между любой частью поверхности одного пыльцевого зерна с некоторой областью поверхности другого одного или большего числа пыльцевых зерен.

[0048] Термины «жизнеспособный» и «жизнеспособность» здесь применены к пыльце, способной прорастать и выращивать пыльцевую трубку до размера, по меньшей мере вдвое превышающего диаметр пыльцевого зерна или пыльцевой частицы, в отношении которой было вынесено решение, что она жизнеспособна на основании демонстрации того факта, что клеточная природа материала осталась целостной, и что она осталась неповрежденной, так что обеспечена возможность протекания нормального клеточного процесса метаболизма и межклеточного взаимодействия. Жизнеспособность пыльцы может быть оценена многими способами, в частности (но не только), путем оценки роста пыльцевой трубки на искусственной среде или на иссеченных рыльцах пестика, путем оценки клеточной целостности с помощью прижизненного окрашивания различного рода, по отсутствию истечения электролитов (например, калия) и по импедансу при проточной цитометрии. Понятие жизнеспособности может относиться к единичному пыльцевому зерну или к группе пыльцевых зерен. Когда говорят о процентах жизнеспособности пыльцы, то обычно это относится к группе пыльцевых зерен.

[0049] Под термином «окно жизнеспособности» по отношению к пыльце здесь понимается период времени, в течение которого пыльца сохраняет жизнеспособность, попав под действие нерегулируемых условий хранения.

[0050] Под термином «сила роста» как характеристика пыльцы здесь понимается скорость прорастания и роста пыльцевой трубки.

Подробное описание предлагаемого изобретения

[0051] Далее следует подробное описание вариантов осуществления предлагаемого способа хранения и/или обеспечения сохранности пыльцы, обеспечивающего повышенную и/или продленную жизнеспособность собранной пыльцы путем воздействия на нее специальными условиями и приемами хранения. Пыльца может быть собрана с активно сбрасывающих пыльцу растений, или же она может быть предварительно собранной и сохраненной другими способами, известными в данной отрасли сейчас, или способами, которые будут открыты в будущем. К таким способам относятся, в частности, замораживание, лиофилизация, хранение в жидком азоте и т.д.

[0052] Согласно одному из вариантов осуществления предлагаемого изобретения, для обеспечения сохранности пыльцы с повышенной и/или продленной жизнеспособностью совокупность пыльцевых зерен содержит мертвый пыльцевой материал и живые пыльцевые зерна, при этом предотвращено взаимодействие мертвого пыльцевого материала с живыми пыльцевыми зернами. Иначе говоря, предлагаемым изобретением предусмотрено частичное или полное изолирование пыльцевых зерен как друг от друга, так и от мертвого пыльцевого материала. Во многих вариантах осуществления предлагаемого изобретения обеспечивают такое состояние пыльцы, при котором межповерхностный контакт отдельных пыльцевых зерен минимален. Как будет более подробно рассмотрено далее, когда пыльцевые зерна находятся в контакте с другими пыльцевыми зернами, особенно в течение периода времени, типичного для целей хранения, те пыльцевые зерна, которые теряют или уже потеряли жизнеспособность, негативно влияют на фертильность и жизнеспособность пыльцевых зерен, которые в других условиях были бы здоровыми. Этот вывод иллюстрируется в Примерах 1-3, описываемых ниже. В Примере 1 и относящихся к нему графических материалах показано, что пыльца, образующая скопления, часто нежизнеспособна. Кроме того, Примеры 2 и 3 показывают, что мертвая пыльца, будучи перемешана со свежей пыльцой, оказывает на последнюю негативное действие, состоящее в том, что ее жизнеспособность уменьшается.

[0053] Таким образом, оказалось, что мертвый пыльцевой материал действует на живые пыльцевые зерна как источник смертоносной инфекции, приводя их к гибели скорее, чем если бы они умирали естественным образом, будучи отделенными от мертвого пыльцевого материала. Можно предположить вытекание или иного рода перенос смертоносного содержимого из клеток мертвых или умирающих пыльцевых зерен. Воздерживаясь от конкретного теоретического объяснения, авторы предлагаемого изобретения предполагают, что, когда пыльцевые зерна находятся в процессе умирания или уже умерли, по всей вероятности имеет место вытекание содержимого этих пыльцевых зерен. Это вытекающее содержимое воздействует на другие пыльцевые зерна и вызывает их смерть или потерю жизнеспособности. Цель предлагаемого изобретения состоит в минимизации и/или предотвращении этого губительного воздействия. Таким образом, предлагаемым изобретением предусмотрено разделение мертвого пыльцевого материала и живых пыльцевых зерен. Такая собранная пыльца может храниться на протяжении любого периода времени, в том числе достаточно длительного для того, чтобы перенести пыльцу на растение, находящееся на том же или на соседнем поле, в течение минут, часов, дней, недель, месяцев и/или лет. В предпочтительных вариантах осуществления предлагаемого изобретения предусмотрено использование веществ, обеспечивающих разделение мертвого пыльцевого материала и живых пыльцевых зерен с предотвращением, тем самым, взаимодействия мертвого пыльцевого материала с живыми пыльцевыми зернами. Такое разделение может быть осуществлено, в частности (но не только), с помощью твердотельных частиц, жидкости, потоков воздуха или других газов, уменьшенной гравитации или путем хранения, при котором пыльцевые зерна изолированы друг от друга. Во многих вариантах предлагаемого изобретения обеспечено предотвращение или ограничение межповерхностного контакта пыльцевых зерен и/или клеточного содержимого пыльцевых зерен. Для целей предлагаемого изобретения хранение пыльцы может осуществляться в камере. Камера может иметь разные размеры и может быть выполнена из разных материалов. Размер камеры может быть любым, лишь бы он обеспечивал пригодность камеры для содержания в ней определенного количества пыльцы, и камера может представлять собой любого типа трубку, контейнер, картридж, сосуд, емкость или другое замкнутое пространство, в котором хранится пыльца; это пространство и является камерой для хранения пыльцы в необходимых количествах. В некоторых вариантах предусмотрено также нахождение в камере твердотельных частиц, жидкости и/или газа для минимизации межповерхностного контакта пыльцевых зерен.

[0054] Представляется обеспечивающим преимущество, хотя и не требуется в обязательном порядке, чтобы это вещество или вещества, используемые в предлагаемом способе, отвечали одному или большему числу требований в дополнение к требованию разделения мертвого пыльцевого материала и живых пыльцевых зерен. Прежде всего, представляется обеспечивающим преимущество такое свойство этого вещества, как его способность регулировать содержание влаги в пыльце. Как будет более подробно описано ниже, этой цели могут соответствовать определенные гидрофильные вещества. Кроме того, это вещество могло бы обеспечивать повышенную текучесть при нанесении пыльцы на женское растение, например, при механическом опылении. Представляется желательным также, чтобы вещество не было дорогостоящим и чтобы его можно было экономически эффективно использовать на больших площадях, для чего представляется обеспечивающим преимущество использование его в твердом агрегатном состоянии в виде частиц. Еще одно преимущество использования твердотельных частиц состоит в том, что их легче переносить или перевозить, что может быть особенно выгодно при применении предлагаемого способа к пыльце, собираемой на поле. Представляется предпочтительным также, чтобы применяемые вещества были безвредными как для растения, так и для окружающей среды. Кроме того, представляется предпочтительным, чтобы вещество не воздействовало на женское растение и/или не связывалось с женским растением, на которое наносят пыльцу или, как это предусмотрено во многих вариантах осуществления предлагаемого изобретения, пыльцу в смеси с этим веществом. В частности, представляется обеспечивающим преимущество такое положение, когда вещество не воздействует на рыльце пестика женского растения. Сходным образом, представляется обеспечивающим преимущество такое положение, когда вещество и пыльцевые зерна, предназначенные для нанесения на женские растения, отделяют друг от друга после или непосредственно перед опылением, так чтобы вещество не связывалось ни с пыльцой, ни с женскими растениями, в том числе (но не только) с воспринимающими пыльцу.

[0055] В тех вариантах осуществления предлагаемого изобретения, в которых для отделения живых пыльцевых зерен друг от друга и от мертвого пыльцевого материала используют жидкое вещество, в качестве последнего могут быть использованы изотонические растворы и/или масляные растворы. Представляется предпочтительным, чтобы эта жидкость не вступала в химические реакции с пыльцевыми зернами. Кроме того, в предпочтительных вариантах осуществления предлагаемого изобретения для более эффективного отделения живых пыльцевых зерен друг от друга и от мертвого пыльцевого материала жидкость и пыльцу взбалтывают. Взбалтывание может быть эпизодическим или, что предпочтительно, непрерывным. Представляется предпочтительным, чтобы пыльцевые зерна в таком растворе не имели длительных контактов ни друг с другом, ни с мертвым пыльцевым материалом. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения пыльца может быть диспергирована в среде жидкости, по существу образуя с ней суспензию. В Примере 17 описано успешное хранение пыльцы в среде минерального масла Sonneborn® PD-23.

[0056] Сходным образом, в некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения для предотвращения контактов живых пыльцевых зерен друг с другом и с мертвым пыльцевым материалом может быть использован воздух или другой газ или тазы (далее «газ» или «газы»), с тем чтобы предотвратить взаимодействие между мертвым пыльцевым материалом и живыми пыльцевыми зернами. Представляется предпочтительным такое решение, при котором газовые потоки обеспечивают перемешивание пыльцевых зерен и отделение живых пыльцевых зерен друг от друга и от мертвого пыльцевого материала (под «отделением» и «разделением» здесь и далее понимается в основном недопущение контакта). Может осуществляться также перемешивание другими способами, нежели газовыми потоками, например, путем эпизодического или непрерывного встряхивания. Представляется предпочтительным такое решение, при котором пыльцевые зерна в камере, наполненной газом, не имеют длительных контактов ни с другими пыльцевыми зернами, ни с мертвым пыльцевым материалом. В некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения пыльца может находиться во взвешенном состоянии в газовой среде.

[0057] Согласно еще одному варианту осуществления предлагаемого изобретения, отделение живых пыльцевых зерен друг от друга и от мертвого пыльцевого материала может быть осуществлено их физическим и/или пространственным разделением с предотвращением, таким образом, взаимодействия между мертвым пыльцевым материалом и живыми пыльцевыми зернами. Пыльцевые зерна могут храниться, например, слоями толщиной в одно зерно с промежутками между отдельными пыльцевыми зернами. В некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения структура хранения может обеспечивать физическое отделение пыльцевых зерен как от мертвого пыльцевого материала, так и друг от друга. В других вариантах осуществления предлагаемого изобретения отделение пыльцевых зерен как от мертвого пыльцевого материала, так и друг от друга может осуществляться с помощью находящегося в камере газа. Возможны также такие варианты осуществления предлагаемого изобретения, в которых отделение пыльцевых зерен как от мертвого пыльцевого материала, так и друг от друга осуществляется с помощью органических или неорганических структур. Поэтому пыльцевые зерна не находятся в контакте друг с другом. Само собой разумеется, может быть использовано физическое разделение любого типа: как известное в настоящее время, так и такое, которое будет открыто в будущем.

[0058] Как говорилось выше, раскрываемый в данной заявке на патент способ обеспечивает повышение и/или продление жизнеспособности пыльцы. Жизнеспособная пыльца способна успешно прорастать и как правило обладает мощностью, необходимой, чтобы способствовать оплодотворению и началу развития семени. Не вся жизнеспособная пыльца является также и фертильной. В некоторых случаях, даже когда пыльцевое зерно жизнеспособно и начинается рост пыльцевой трубки, ему может не хватить мощности, чтобы достичь семязачатка и осуществить оплодотворение. Нежизнеспособные пыльцевые зерна не способны к успешному прорастанию. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения желательно использовать пыльцу с хорошей жизнеспособностью. Уровень жизнеспособности и фертильности, требуемый для успешного опыления, в данной отрасли обычно определяют как среднее на один шелковистый нитевидный пестик (у кукурузы) из четырех свежих пыльцевых зерен или от четырех до восьми пыльцевых зерен, сохранность которых обеспечивалась предлагаемым способом.

[0059] Как говорилось выше, во многих вариантах осуществления предлагаемого изобретения требуется собирать пыльцу или иметь пыльцу, собранную ранее. Сбор пыльцы для целей предлагаемого изобретения может осуществляться любым способом и в любом месте, где растут нужные растения, например, в ростовой камере, в теплице, в парнике, в перголе, в арочной теплице, в установке для вертикального выращивания культур, в гидропонной установке или в любом другом устройстве для выращивания, обеспечивающем возможность культивируемого выращивания растения с выбрасыванием султана, как будет описано ниже. Перед закладкой на хранение или обеспечение сохранности пыльца может быть (факультативно) подвергнута полевому кондиционированию, например, способом, раскрываемым в заявке на патент США №15/486,737, озаглавленной "Pollen Conditioning and Preservation Method" («Способ кондиционирования и обеспечения сохранности пыльцы»), содержание которой полностью включается в данную заявку по ссылке. Полевое кондиционирование в случае его применения может осуществляться другими способами, как известными в настоящее время, так и теми, которые будут открыты в будущем. В некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения полевое кондиционирование может выполняться сразу после сбора или же в любое время между сбором и закладкой на хранение. Кроме того, предполагается, что полевое кондиционирование может включать способ по предлагаемому изобретению.

[0060] Сбор свежей пыльцы может выполняться любым из широко известных в данной отрасли способов. Например, пыльцу можно собирать любым из множества способов с цветков или с мужских цветковых структур в период сброса пыльцы. Кукуруза, как и многие другие виды растений имеет смешанный тип цветения, и на одном растении имеются как мужские, так и женские соцветия. На практике при размножении растений, их опылении, перекрестном опылении и гибридизации некоторые растения используют как мужские, и с них собирают пыльцу для целей опыления, а другие растения используют как женские- они предназначены быть реципиентами пыльцы. В случаях самоопыления одно и то же растение является и мужским, и женским, так как его женские цветки оплодотворяются пыльцой из его собственных мужских цветков. По типу самоопыления осуществляют родственное опыление, при котором растения с той же генетикой (например, соседствующие растения с одного поля) служат как в качестве мужских, так и в качестве женских растений. В тексте данной заявки в смысловой объем термина «самоопыление» включается также и родственное опыление, поскольку в обоих случаях задействована одна и та же генетика. Что же касается кукурузы, то пыльцу этого растения собирают со сбрасывающих пыльцу мужских цветков, находящихся на султанах, которые могут быть как оставленными на растении, так и отделены от него.

[0061] Пыльца любого вида растения может собираться с растений, выращиваемых в любой среде, пригодной для роста растения. Такой средой могут быть, в частности (но не только), поле, ростовая камера, теплица, парник, пергола, арочная теплица, установка для вертикального выращивания культур или гидропонная установка. В альтернативном варианте пыльцу можно собирать непосредственно из пыльников, раздробляя или размалывая последние, или же дав им высохнуть и выбросить пыльцу естественным образом, а потом ее собрать. Кроме того, пыльцу можно собирать с установки для культивирования султанов (см. Pareddy DR, Greyson RI, Walden DB (1989) Production of normal, germinable and viable pollen from in vitro-cultured maize tassels. Theor Appl Genet 77:521-526). Культивируемые султаны могут представлять собой зрелые султаны, удаленные с растений, выращиваемых в установке для выращивания любого типа или в любой среде, включая поле, или установки для выращивания другого типа, и помещенные в воду в контролируемой среде для сбора пыльцы, или же культивируемые султаны могут представлять собой ткань, взятую с цветковых структур на стадии неполовозрелости и затем культивированную до развития в султан.

[0062] В альтернативном варианте можно собирать непосредственно пыльники, а не пыльцу. Пыльники следует собирать до созревания в них пыльцы, в процессе созревания пыльцы, или же когда пыльца уже созрела и происходит ее сброс. Для позднейшего использования можно хранить также целые пыльники, которые можно хранить в смесях согласно предлагаемому изобретению. Пыльца, которая может быть незрелой, частично зрелой, почти зрелой, но еще не сбрасываемой, или же зрелой пыльцой во вскрывшихся пыльниках, может быть извлечена из собранных пыльников путем их обдирки, перемалывания, встряхивания, высушивания или другими подходящими способами. В частности, в случае незрелой пыльцы эффективно перемалывание, так как перемалывание целого пыльника с незрелой пыльцой можно выполнять в смеси согласно предлагаемому изобретению. Такой процесс обеспечивает автоматическое высвобождение пыльцы в идеальную среду, в которой поверхность каждого пыльцевого зерна ограничена в возможности вступать в контакт с другими пыльцевыми зернами. Кроме того, пыльники можно хранить способом по предлагаемому изобретению с твердотельным, жидкостным, газовым и/или физическим разделением пыльцевых зерен с отделением мертвого пыльцевого материала от живых пыльцевых зерен.

[0063] В данной заявке раскрываются как способ минимизации межповерхностного контакта между пыльцевыми зернами, так и вещества, используемые для минимизации межповерхностного контакта между пыльцевыми зернами с целью повышения их жизнеспособности и фертильности. Эти вещества могут быть в форме твердотельных частиц, в виде жидкостей или в виде газовых смесей, или же они могут представлять собой комбинации твердотельных частиц и газов, жидкостей и газов или твердотельных частиц и жидкостей. Может быть предусмотрена смена веществ с одних на другие в процессе хранения пыльцы. Кроме того, могут использоваться комбинации веществ, в том числе комбинации разных веществ, все из которых могут находятся как в одном и том же, так и в разных агрегатных состояниях (твердом, жидком или газообразном). Кроме того, со временем вещество может освежаться или заменяться тем же самым или другим веществом. Таким образом, в процессе хранения пыльцы может производиться замена одного вещества другим. Следует заметить, что в тексте данного описания термин «жидкость» включает в себя также гели.

[0064] В предпочтительных вариантах осуществления предлагаемого изобретения для отделения пыльцевых зерен от мертвого пыльцевого материала и/или друг от друга с предотвращением, тем самым, взаимодействия между мертвым пыльцевым материалом и живыми пыльцевыми зернами используют твердотельные частицы. Во многих вариантах осуществления предлагаемого изобретения твердотельные частицы минимизируют межповерхностный контакт между пыльцевыми зернами. В случае использования твердотельных частиц представляется предпочтительным такое решение, при котором размер этих частиц согласован с размером пыльцевых зерен, подлежащих сберегающему хранению. Если твердотельные частицы слишком велики, то они не всегда эффективны с точки зрения предотвращения контакта между пыльцевыми зернами, так как пыльцевые зерна в этом случае могут образовывать скопления в зазорах между частицами. Если же твердотельные частицы слишком малы, то они тоже не всегда эффективны с точки зрения разделения пыльцевых зерен и мертвого пыльцевого материала, так как не обеспечивают достаточного разделения. Разные виды пыльцы растений имеют очень сильно различающиеся размеры: приблизительно от 6 мкм до 100 мкм в диаметре. Кроме того, у некоторых пыльцевых зерен поверхность не является идеально круглой, в результате чего ее площадь увеличена. Таким образом, смеси твердотельных частиц разных размеров и/или форм обеспечивают возможность использовать их с пыльцой от разных видов растений. В альтернативном варианте идеальный размер твердотельных частиц может быть определен опытным путем без избыточного экспериментирования на основе размеров и морфологии пыльцевых зерен, подлежащих сберегающему хранению, как это описано ниже в Примерах 6 и 7. Согласно одному из вариантов осуществления предлагаемого изобретения, размер твердотельных частиц может варьироваться от одной десятой размера пыльцевого зерна до десятикратного размера пыльцевого зерна, подлежащего хранению. В случае кукурузы предпочтительный размер частицы может составлять 20 мкм. В качестве одного из примеров твердотельных частиц такого размера можно назвать Sipernat 340.

[0065] Еще одно соображение касается соотношения между твердотельными частицами и пыльцевыми зернами. Более высокие значения отношения количества вещества к количеству пыльцевых зерен способствуют большему разделению мертвого пыльцевого материала и живых пыльцевых зерен. Кроме того, более высокие значения этого отношения приводят к разрежению пыльцы, что иногда дает благоприятный эффект при нанесении пыльцы на женские растения. В некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения количественное отношение пыльцы к веществу может находиться между 1:1 и 1:100. В некоторых случаях представляется предпочтительным отношение пыльцы к веществу 1:3. Кроме того, идеальное отношение может зависеть от длительности предполагаемого периода хранения пыльцы. При коротком периоде хранения это отношение менее важно. С другой стороны, с увеличением периода хранения пыльцы это отношение приобретает все более важное значение для поддержания жизнеспособности сохраняемой пыльцы. В Примере 10 проиллюстрирован вариант осуществления предлагаемого изобретения, в котором количественное отношение частиц вещества к пыльце 3:1 оказалось лучше всех других, а также описано обычное экспериментирование, с помощью которого можно найти идеальное отношение для любого типа пыльцы. Это отношение может быть оптимизировано также с точки зрения других преимуществ, в частности (но не только) увеличения длительности хранения, понижения концентрации пыльцы и/или текучести.

[0066] Представляется предпочтительным такое решение, при котором твердотельные частицы, используемые для разделения мертвого пыльцевого материала и живых пыльцевых зерен, не оказывают на пыльцу вредного влияния. В некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения твердотельные частицы являются по своей природе химически инертными, так что пыльца не подвергается с их стороны практически никакому воздействию. Например, эти твердотельные частицы не должны забирать из пыльцы слишком много влаги, так чтобы пыльца не погибла. Потеря влаги действует на жизнеспособность пыльцы, так что чем больше потеря влаги пыльцевым зерном, тем больше потеря его жизнеспособности, вплоть до гибели пыльцевого зерна. В Примерах 8 и 9 показано, что хранение пыльцы с влагопоглощающими веществами негативно сказывается на ее жизнеспособности. Некоторая гидрофильность может быть благоприятной, потому что способствует разделению мертвого пыльцевого материала и живых пыльцевых зерен. А именно, без претензий на научное объяснение, опытным путем было показано, что вещества, обладающие небольшой гидрофильностью, поглощают мертвый пыльцевой материал, вытекающий из мертвой или умирающей пыльцы. Поглощая этот материал, гидрофильные вещества тем самым отделяют его от живых пыльцевых зерен. Кроме того, эти слегка гидрофильные вещества способствуют регулированию содержания влаги в пыльце, что во многих случаях важно с точки зрения поддержания жизнеспособности пыльцы. Такие слегка гидрофильные вещества обычно не обезвоживают пыльцу до такой степени, как это могут делать вещества с более высокой гидрофильностью. Использование гидрофобных частиц представляется не столь желательным, потому что они могут проявлять природное стремление не вступать в физический контакт с пыльцевыми зернами, результатом чего может стать градиент между пыльцой и частицей. Тем не менее, некоторые гидрофобные вещества могут быть успешно использованы. А именно, некоторые гидрофобные вещества могут приставать к поверхности пыльцевых зерен, образуя по меньшей мере частичное покрытие пыльцевых зерен. В результате такое покрытие может обеспечить разделение мертвого пыльцевого материала и живых пыльцевых зерен и/или отделение живых пыльцевых зерен друг от друга.

[0067] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения содержание влаги в пыльце и регулирование этого параметра являются благоприятствующими факторами. Некоторыми вариантами осуществления предлагаемого изобретения предусмотрено содержание влаги в пыльце от 15% до 60%. Предпочтительным представляется содержание влаги в пыльце от 40% до 58%. Еще более предпочтительным представляется содержание влаги в пыльце от 44% до 55%. В некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения было обнаружено, что пыльцу можно сохранять при более высоких значениях влажности, чем те, которые до этого считались в данной отрасли оптимальными. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения преимущество может быть обеспечено при использовании веществ, без вреда поддерживающих содержание влажности пыльцы на более высоком уровне.

[0068] К твердотельным частицам, которые пригодны для целей предлагаемого изобретения, относятся, в частности, частицы таких веществ, как неорганические вещества, органические вещества, регуляторы диапаузы, регуляторы осмоса, ингибиторы и средства прерывания клеточного дыхания, ингибиторы переноса электронов, средства разобщения мембранного переноса электронов, средства стабилизации и кондиционирования мембран, средства стабилизации и кондиционирования клеточных стенок, регуляторы роста, фитогормоны, криопротекторы, моносахариды, дисахариды, полисахариды, антифлокулянты, рассеивающие средства, бентонит, картофельный крахмал, кукурузный крахмал, целлюлоза, песок, поглотитель влаги, минеральное масло, парафиновое масло, сахара в жидкости, сухие сахара, вода, активированный уголь. Должно быть понятно, что при выборе используемых твердотельных частиц следует учитывать тип пыльцы, подлежащей сберегающему хранению. Этот выбор может зависеть, например, от размера конкретных пыльцевых зерен и/или основываться на том, насколько данная пыльца стойка к определенным воздействиям и условиям. Идеальная композиция может включать твердотельные частицы единственного типа, или же она может представлять собой смесь частиц разных типов, выбранных для максимизации жизнеспособности и долговечности пыльцы. Она может включать частицы разных размеров, с тем чтобы с равной эффективностью обеспечить разделение как крупных, так и мелких пыльцевых зерен. Смесь частиц, обеспечивающую сберегающее хранение пыльцы наилучшим образом, можно определить опытным путем, как описано в Примерах 4 и 5.

[0069] Кроме того, дополнительные преимущества могут быть обеспечены при добавлении вещества, способствующего текучести сохраняемой пыльцы, чтобы впоследствии ее можно было легко наносить на опыляемые растения. Такие вещества не должны негативно воздействовать ни на другие твердотельные частицы, присутствующие в среде для хранения, ни на пыльцевые зерна. В качестве примеров веществ, способных обеспечивать разделение между мертвым пыльцевым материалом и живыми пыльцевыми зернами, а также способствовать текучести, могут быть названы Sipernat® 50, Sipernat® 50S, Sipernat® 2200, Sipernat® 22, Sipernat® 22S, Sipernat® 340, Sipernat® 350, Perkasil® SM660, косточки жожоба, Aerosil® 200, Syloid®244, изотонические буферные растворы, масла и газы.

[0070] Согласно еще одному варианту осуществления предлагаемого изобретения в качестве вещества могут использоваться пустые пыльцевые зерна. То есть, для разделения мертвого пыльцевого материала и живых пыльцевых зерен с предотвращением, тем самым, их взаимодействия могут быть использованы пыльцевые зерна, опустошенные вымыванием или иным способом освобожденные от их внутреннего содержимого.

[0071] При осуществлении предлагаемого изобретения предотвращение межповерхностного контакта между пыльцевыми зернами может быть обеспечено также с помощью жидкостей или газов. В таких случаях предотвращается взаимодействие мертвого пыльцевого материала и живых пыльцевых зерен. В случае использования газов в камере, где содержатся пыльцевые зерна, обеспечивают постоянный газовый поток, поддерживающий зерна во взвешенном состоянии и минимизирующий контакты между ними, которые в отсутствие газового потока имели бы место в большей степени. В случае хранения пыльцы в жидкости превосходной средой являются изотонические буферные растворы, которые не обладают свойством легко осуществлять жидкостный обмен сквозь мембрану пыльцевых зерен. Сходным образом минимизируют жидкостный обмен сквозь мембрану также гидрофобные растворы, например, минеральные масла.

[0072] Для повышения способности пыльцы сохранять жизнеспособность и фертильность в течение периода ее хранения пыльца может быть подвергнута дополнительным мерам обеспечения сохранности. Подготовка пыльцы к хранению требует внимательного отношения ко многим факторам, в том числе к таким параметрам окружающей среды, как относительная влажность, температура и давление. Например, температура может составлять приблизительно от 1°С до 10°С. В некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения предусмотрена относительная влажность от 50% до 100%. А давление воздуха может находиться в пределах от 15 кПа до 150 кПа. Кроме того, успеху хранения пыльцы может способствовать присутствие полезных газов. В качестве полезных для этой цели газов могут быть использованы (перечень не исчерпывающий) азот, диоксид углерода, закись азота или смеси этих газов.

[0073] Возможны также такие варианты осуществления предлагаемого изобретения, в которых предусмотрено механическое перемешивание пыльцы, хранящейся в камере. Это перемешивание может быть как эпизодическим, так и непрерывным. Предпочтительным представляется такое решение, при котором перемешивание выполняют в непрерывном режиме. Целью такого механического перемешивания является привести максимум поверхности пыльцевых зерен в контакт с добавленными в камеру твердыми, жидкими или газообразными веществами, обеспечивая, тем самым, однородную смесь пыльцы с добавленными веществами с предотвращением межповерхностного контакта пыльцевых зерен, комкования пыльцы и распространения омертвления пыльцы в случае смерти отдельных пыльцевых зерен. Данные экспериментов, в частности, описанных в Примерах 2 и 3, показывают, что когда поверхности живых пыльцевых зерен вступают в контакт с поверхностями умирающих или мертвых пыльцевых зерен, это негативно влияет на живые пыльцевые зерна, которые затем погибнут. Непрерывное, регулярное и/или эпизодическое механическое перемешивание пыльцевых зерен в композиции, содержащей также мертвые или умирающие пыльцевые зерна, может быть обеспечено разными способами, как-то: с помощью вибраций, сжатым воздухом, вращением, размешиванием и т.д.

[0074] Как было подробно рассмотрено в предшествующих абзацах, максимизация и продление жизнеспособности пыльцы с помощью предлагаемого способа требует внимательного отношения к ряду параметров, которые не должны выходить за определенные пределы. Лабораторным путем на примере пыльцы кукурузы были получены результаты, указывающие на условия, обеспечивающие повышение жизнеспособности пыльцы и требующие изменения одного или большего числа параметров в камере, чтобы уложиться в допустимые пределы, как об этом будет сказано ниже.

[0075] Температура камеры, в которой находится пыльца в составе композиции, может поддерживаться в пределах от приблизительно 1°С до приблизительно 10°С, в том числе она может составлять приблизительно любое из следующих значений: 1°С, 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 6°С, 7°С, 8°С, 9°С или 10°С. Во многих случаях предпочтительны более низкие значения температуры, однако предлагаемое изобретение обеспечивает также возможность поддерживать и/или повышать жизнеспособность пыльцы при температуре окружающего воздуха и/или при высоких температурах, что до сих пор не считалось возможным в данной отрасли. А именно, согласно имеющимся сообщениям, даже очень кратковременное (от 3 до 5 минут) нагревание зрелой пыльцы до 35°С приводило к падению жизнеспособности пыльцы кукурузы (см. Lyakh, et. al., Euphytica 55: 203-207, 1991). Тем не менее, как показано в Примере 16, способом по предлагаемому изобретению удается с успехом поддерживать и/или повышать жизнеспособность пыльцы кукурузы при температуре 32,8°С. Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает возможность поддержания сохранности пыльцы при любой температуре. Некоторые варианты осуществления предлагаемого изобретения можно реализовать в поле или при транспортировке при температуре окружающего воздуха и/или при высоких температурах.

[0076] Согласно некоторым вариантам осуществления предлагаемого изобретения пыльца, подвергнутая сберегающему хранению предлагаемым способом, может найти разные применения в качестве коммерческого или экспериментального продукта. Согласно одному из вариантов осуществления предлагаемого изобретения, сохраненную пыльцу можно использовать для производства семян, гибридных растений, родительских растений в любых условиях, в частности, в лаборатории, в теплице, на поле. Согласно еще одному варианту осуществления предлагаемого изобретения сохраненную пыльцу можно использовать для производства зерна, гибридных растений и т.д., в частности, в лаборатории, в теплице, на поле. Кроме того, как говорилось выше, такой способ может быть применен к пыльце как растений семейства злаковые (мятликовые), так и к растениям других семейств.

[0077] Раскрываемый в данной заявке на патент способ обеспечения сохранности пыльцы имеет целью успешное ее сбережение с поддержанием жизнеспособности пыльцы на таком уровне, чтобы для успешного оплодотворения семязачатка было достаточно от 4 до 20 пыльцевых зерен.

[0078] Различные представительные варианты осуществления предлагаемого изобретения были описаны выше с определенной степенью конкретности, однако без отступления от существа и объема предлагаемого изобретения, которые определены описанием изобретения и прилагаемой формулой изобретения, специалисты соответствующего профиля могли бы внести в эти варианты много модификаций. В некоторых случаях те или иные стадии и операции прямо или опосредствованно методологически изложены здесь так, будто они выполнимы в единственно возможном порядке, однако специалистам соответствующего профиля должно быть понятно, что в каких-то случаях без отступления от существа и объема предлагаемого изобретения некоторые стадии и операции могли бы быть выполнены в другом порядке, заменены или опущены. Должно быть понятно также, что все, что содержится в приведенном выше описании изобретения и изображено на прилагаемых чертежах, служит только целям иллюстрации, но не ограничивает объема предлагаемого изобретения. Без отступления от существа и объема предлагаемого изобретения, определенного прилагаемой формулой изобретения, возможны изменения в деталях или в структуре изобретения.

[0079] Хотя предлагаемое изобретение описано выше на конкретных примерах его осуществления, должно быть ясно, что среднему специалисту соответствующего профиля понятны различные его альтернативные варианты, модификации, вариации и усовершенствования, как уже известные, так и предсказуемые. Перечисление стадий предлагаемого способа в определенном порядке не накладывает ограничений на порядок выполнения этих стадий. Таким образом, изложенные выше варианты осуществления предлагаемого изобретения имеют иллюстративный, а не ограничивающий характер. Специалистам соответствующего профиля должно быть понятно, что без отступления от существа и объема предлагаемого изобретения возможны изменения в деталях изобретения. Поэтому объем предлагаемого изобретения включает все известные или ранее разработанные альтернативные варианты, модификации, вариации, усовершенствования и существенные эквиваленты. [0080] Далее предлагаемое изобретение будет проиллюстрировано более подробно на примерах, в которых описывается, как предлагаемое изобретение может быть осуществлено в отношении пыльцы растений разных видов.

[0081] Пример 1

[0082] В этом примере экспериментально показана корреляция между плотностью пыльцы и ее способностью успешно образовывать пыльцевую трубку. Помещать пыльцу в искусственную жидкую среду является общепринятой практикой для измерения жизнеспособности пыльцевых зерен.

[0083] При разработке способа по предлагаемому изобретению для испытания сохраненной пыльцы на жизнеспособность были проделаны тысячи анализов, при этом ключевую роль при определении жизнеспособности пыльцы играла искусственная жидкая среда для прорастания. В процессе этого экспериментирования было замечено, что та пыльца, которая в искусственной жидкой среде для прорастания образует скопления, имеет в целом более низкую скорость прорастания, чем та пыльца, в которой пыльцевые зерна не контактируют друг с другом. На фиг. 1 можно видеть скопления пыльцевых зерен, не образующих пыльцевых трубок. Это наблюдение стимулировало разработку композиций для сберегающего хранения пыльцы, которые предотвращали бы вступление пыльцевых зерен в контакт друг с другом и отделяли бы живые пыльцевые зерна от мертвого пыльцевого материала и/или других живых пыльцевых зерен, предотвращая, тем самым, негативное влияние таких контактов.

[0084] Пример 2

[0085] Чтобы оценить вредное действие мертвого пыльцевого материала или умирающих пыльцевых зерен на свежую пыльцу, испытали несколько способов получения мертвой пыльцы. Каждую порцию мертвой пыльцы перемешивали с образцами свежесобранной пыльцы.

[0086] Порцию свежесброшенной пыльцы кукурузы объемом 20 мл поделили поровну между пятью центрифужными пробирками емкостью 50 мл каждая, пыльца в двух из которых использовалась в качестве контрольных образцов. Образцы пыльцы подвергали трем разным видам обработки, которые должны были убить пыльцевые зерна. Первый образец засыпали в стеклянную пробирку, которую затем на 5 минут поместили в термостатную установку с температурой 95°С. В этом образце пыльца приняла обугленный вид и было видно очень малое содержание в ней влаги. Второй вид обработки состоял в том, что свежесобранную пыльцу поместили в стеклянную пробирку, которую на 1 минуту поместили в микроволновую печь. Микроволновую печь часто используют для смертоносного воздействия в проточном цитометре типа «Amphasys». Микроволновое воздействие разрушает клеточные мембраны, что приводит к истечению цитоплазматического содержимого и, тем самым, к смерти пыльцы. Третий вид обработки состоял в том, что свежесобранную пыльцу поместили в стеклянную пробирку, которую затем на 3 минуты поместили в термостатную установку с температурой 95°С. Пыльца имела полуобугленный вид и была менее обуглена, чем первый образец. Четвертый вид обработки применили к пыльце из другого источника. Эта пыльца была собрана месяцем раньше, и ей дали просохнуть при температуре 21°С и относительной влажности 50% в течение 30 дней. Так как долговечность пыльцы кукурузы очень невелика, эту пыльцу сочли полностью мертвой.

[0087] Было собрано дополнительное количество сброшенной пыльцы. Эту свежую пыльцу в одинаковом по объему количестве добавили к каждому из описанных выше четырех по-разному обработанных образцов. Каждую пробирку встряхивали до полного перемешивания содержимого, затем оставляли на 10 минут, после чего наносили содержимое пробирок на свежие кисти нитей рылец.

[0088] Опыленные початки оставили созревать на несколько недель, после чего собрали урожай. Для каждого образца подсчитали и записали число зерен на початок. Из приведенных на фиг. 2 результатов видно, что подмешивание к свежей пыльце мертвой пыльцы, полученной всеми способами ее обработки, неблагоприятно влияет на жизнеспособность здоровой пыльцы.

[0089] На общую жизнеспособность свежей пыльцы особо неблагоприятно влияет подмешанная пыльца, убитая микроволновой обработкой: этот образец дал в среднем лишь немногим больше 2 зерен на початок. Следующей по вредности действия была полуобугленная пыльца, за которой следовала старая высушенная пыльца. Что касается полностью обугленной пыльцы, то ее вредное действие было наименьшим из наблюдаемых, но все же она очень сильно понизила жизнеспособность пыльцы. Очевидно, для поддержание пыльцы в здоровом жизнеспособном состоянии требуется разделение пыльцевых зерен, особенно предотвращение взаимодействия здоровой пыльцы с мертвой или умирающей пыльцой.

[0090] Пример 3

[0091] Для дополнительной оценки негативного воздействия мертвой или умирающей пыльцы на свежую пыльцу было проведено несколько испытаний, в ходе которых наблюдали воздействие мертвой пыльцы на свежую пыльцу и на четырехдневную пыльцу. Каждую порцию мертвой пыльцы перемешивали с образцами свежесобранной пыльцы.

[0092] Свежесобранную пыльцу поделили на четыре образца, четырехдневную пыльцу тоже поделили на четыре образца. В три пробирки каждого набора из четырех пробирок добавляли пыльцу кукурузы, которая до этого была оставлена сохнуть в течение 30 дней (и потому была мертвой). Первая пробирка использовалась в качестве контрольного образца, и в нее мертвой пыльцы не добавляли. Во втором наборе пробирок живая и мертвая пыльца были перемешаны в отношении 75:25. В третьем наборе пробирок живая и мертвая пыльца были перемешаны в отношении 50:50. В четвертом наборе пробирок живая и мертвая пыльца были перемешаны в отношении 25:75. Показатели жизнеспособности получали с помощью проточного цитометра типа «Amphasys» в моменты времени 0, 24 часа и 5 дней. Результаты представлены на фиг. 3. Для приведения к единой шкале показатель жизнеспособности в момент Т0 нормализован как 100%-ная жизнеспособность и ожидаемая скорость потери жизнеспособности изображена прямой линией. Через 24 часа показатель жизнеспособности по проточному цитометру «Amphasys» показал, что при всех соотношениях мертвой и живой пыльцы в смесях мертвая пыльца приводила к порче живой пыльцы по экспоненте, то есть гораздо резче, чем по линейному закону. Отмечено также, что чем больше доля мертвой пыльцы в смеси, тем больше ее вредное влияние на общее здоровье образца. Наконец, общее угасание здоровья у четырехдневной пыльцы было выражено намного ярче, чем у свежей пыльцы, что говорит о том, что пыльца, которая уже начала деградировать, более подвержена вредному воздействию мертвой пыльцы, чем образцы свежей пыльцы.

[0093] Пример 4

[0094] В первых экспериментах по испытанию веществ-разделителей различного типа в качества вещества-разделителя для сберегающего хранения пыльцы использовали активированный уголь. Пыльцу собирали вручную с поля, на котором росла кукуруза с разным генотипом, затем пыльцу временно держали в конических пробирках емкостью 50 мл при температуре 5°С. В момент времени Т0 в отношении несмешанной контрольной пыльцы выполняли анализ с помощью цитометра "Amphasys" («Амфазис») и определяли содержание влаги. Амфазис-анализ обеспечивает надежное определение жизнеспособности пыльцы с помощью импедансной проточной цитометрии путем измерения электрических характеристик пыльцевых зерен. В момент времени Т0 жизнеспособность пыльцы составляла 97% при содержании влаги 57% с использованием стандартного способа сушки в шкафу в течение одной ночи. Пыльцу смешивали с порошком древесного угля (активированный уголь) в различных соотношениях. Активированный уголь часто используют для абсорбции токсичных веществ. Затем образцы полученных смесей хранили в открытых пробирках емкостью 50 мл при температуре 5°С. Измерения в определенных временных точках проводили в дни 1 и 6 с помощью проточного цитометра «Amphasys», когда это позволяла концентрация угля. Небольшие количества образцов диспергировали с получением суспензии в среде «Ampha 6», после чего для отфильтровывания крупных частиц, которые могли бы повлиять на протекание струй в цитометре, пропускали через 150-микронный фильтр, Как можно видеть на фиг. 4, доля угля в смеси влияла как на жизнеспособность пыльцы, так и на содержание в ней влаги. При использовании в более низких количествах, в данном случае от 2,5% до 25%, через 6 дней хранения жизнеспособность пыльцы оставалась на высоком уровне (92%). Однако были отмечены проблемы с текучестью: к шестому дню образцы стали рыхлыми и наблюдалось образование скоплений.

[0095] Пример 5

[0096] При дальнейших испытаниях разных веществ для целей разделения пыльцевых зерен с целью определения эффективности в отношении разделения пыльцевых зерен и обеспечения их сохранности проводили эксперимент с разными сахаридами. Смешанную пыльцу собирали с разных активно сбрасывающих пыльцу растений кукурузы, выращиваемых в теплице. Для удаления пыльников применяли ручной сбор с использованием воронки и сита. Всю пыльцу делили на четыре равных порции, каждая из которых составляла приблизительно 5 мл в объеме. Каждый образец держали в течение ночи в закрытой конической пробирке емкостью 50 мл при температуре 5°С, и жизнеспособность пыльцы определяли с помощью проточного цитометра «Amphasys» приблизительно через 24 часа после сбора. В каждую пробирку добавляли сахар одного из трех разных типов в объемном соотношении 1:1, так что в каждой пробирке количество сахара было равно количеству пыльцы. Затем каждую пробирку многократно переворачивали до полного перемешивания сахара с пыльцой. Пробирка 1 в соотношении 1:1 содержала смесь пыльцы кукурузы и инозитола в соотношении 1:1, пробирка 2 в соотношении 1:1 содержала смесь пыльцы кукурузы и лактозы, а пробирка 3 в соотношении 1: 1 содержала смесь пыльцы кукурузы и трегалозы. Пробирка 4 содержала только 5 мл пыльцы как контрольный образец. Каждая пробирка была закрыта и помещена в среду с температурой 4°С. Данные о жизнеспособности пыльцы, определенные с помощью цитометра «Amphasys» в отношении небольшого аликвотного количества, отобранного из каждой пробирки, получали во временных точках 24 часа, день 2, день 5, день 8 и день 13. Эти данные представлены на фиг. 5.

[0097] Через 24 часа хранения жизнеспособность пыльцы в образце с трегалозой была несколько более низкой по сравнению с ее жизнеспособностью в других образцах. В день 2 жизнеспособность пыльцы в образце с трегалозой еще больше упала по сравнению с ее жизнеспособностью в остальных трех образцах. В день 5 резко упала жизнеспособность пыльцы во всех образцах за исключением образца с лактозой. В день 8 стало отчетливо ясно, что лактоза хорошо действует на сохранность пыльцы: жизнеспособность последней в образце с лактозой составляла 77%, в то время как в контрольном образце - только 24%. На основе общих результатов было установлено, что сахариды могут быть использованы в качестве веществ-разделителей, обеспечивающих отделение пыльцевых зерен друг от друга и поддерживающих их жизнеспособность, причем как для разделения пыльцевых зерен, так и для поддержания их жизнеспособности особенно пригодна лактоза. Было отмечено также, что в образце с лактозой пыльца была несколько комковатой и не проявляла столь же хорошей текучести как свежесобранная пыльца.

[0098] Пример 6

[0099] Для изучения того, как действуют на разделение пыльцевых зерен и их сохранность размеры частиц вещества, испытывали сберегающее хранение пыльцы с несколькими композициями твердотельных частиц с последующим нанесением пыльцы на кисти нитей рылец растений кукурузы. Свежую пыльцу собирали с активно сбрасывающих пыльцу растений кукурузы. Собранную пыльцу поделили на шесть равных порций, каждую из которых поместили в отдельную центрифужную пробирку емкостью 50 мл. В каждой пробирке к пыльце добавили в одинаковом соотношении частицы диоксида кремния того или иного размера. Размеры этих частиц диоксида кремния составляли от 5,5 мкм до 340 мкм. После добавления частиц содержимое каждой пробирки перемешали и полученные образцы оставили на 24 часа при температуре 4°С. Затем смесь из каждой пробирки нанесли вручную на пять накрытых мешочками початков, которые после опыления были снова покрыты мешочками, чтобы не допустить попадания на кисти нитей рылец посторонней пыльцы. Початкам дали созреть, после чего их срезали и посчитали количество кукурузных зерен в каждом початке. Данные представлены на фиг. 6. Образцы с разными размерами частиц диоксида кремния показали разную эффективность, при этом наибольшее среднее количество кукурузных зерен на початок дал образец с размерами частиц 20 мкм. Этот эксперимент показывает, как можно определить оптимальный размер частиц для пыльцевых зерен конкретного размера.

[00100] Пример 7

[00101] Для дополнительного изучения влияния размеров частиц на отделение пыльцевых зерен друг от друга, на обеспечение их сохранности и на текучесть смеси была проведена серия экспериментов по долговременному хранению пыльцы в смесях с твердотельными частицами. В качестве основы вещества-разделителя использовалась лактоза, в которую вносили разные добавки с целью повышения текучести пыльцы для возможного последующего использования сохраненной пыльцы для механического опыления в условиях поля.

[00102] Метелки кукурузы сведенных воедино сортов и на активных стадиях цветения собирали и хранили в ростовой камере типа «Conviron®». Для продления продуктивности метелок с целью сбора пыльцы эту ростовую камеру программировали на работу в течение 18 часов при температуре 12°С и относительной влажности 90% и в течение 6 часов при температуре 26°С и относительной влажности 70%. Сведенную воедино пыльцу собирали вручную с метелок кукурузы и смешивали в отношении 1:3 по объему с каждой из добавок, указанных в Таблице 1. Был приготовлен также контрольный образец, который состоял только из пыльцы без среды хранения. Контрольные образцы и образцы смесей пыльцы и частиц хранили в закрытых фильтрующей крышкой центрифужных пробирках емкостью 50 мл, которые были помещены в герметичный контейнер большего размера, в котором находилось приблизительно 100 мл гранул силикагеля (влагопоглотитель) «Dry & Dry». Фильтрующие крышки были снабжены сетчатым элементом, обеспечивающим прохождение воздуха, но не допускающим утечки пыльцы. Герметичный контейнер хранили в ростовой камере при температуре 3°С. При таких условиях для хранения пыльцы в пробирках с фильтрующими крышками обеспечивается микроклимат холодный и несколько сухой.

[00103] При перемешивании образцов было отмечено, что трудно работать со смесями с косточками жожоба и Sipernat® 2200, так как эти добавки вызывали комкование смесей, что предполагает плохую текучесть.

[00104] Жизнеспособность пыльцы в начальный момент времени ТО, измеренная с помощью цитометра «Amphasys» в начале испытаний составляла 89,26%. После трех дней хранения образцы пыльцы были исследованы с помощью системы «Amphasys» путем измерения жизнеспособности. Система «Amphasys» обеспечивает надежное определение жизнеспособности пыльцы с помощью импедансной проточной цитометрии, при которой измеряют электрические характеристики пыльцевых зерен.

[00105] Как можно видеть на фиг. 7, жизнеспособность контрольного образца упала мало, при этом по причине высокого содержания влаги в пыльце контрольный образец показал плохую текучесть. Все другие испытуемые образцы показали хорошую жизнеспособность и хорошую текучесть.

[00106] Пример 8

[00107] Для длительного сберегающего хранения пыльцы в присутствии обезвоживающего вещества и в отсутствие такового использовали ряд композиций с твердотельными частицами. На лучшую текучесть пыльцы при ее механическом нанесении в полевых условиях испытывали различные добавки.

[00108] Метелки кукурузы сведенных воедино сортов и на активных стадиях цветения собирали и хранили в ростовой камере типа «Conviron®». Для продления продуктивности метелок с целью сбора пыльцы эту ростовую камеру программировали на работу в течение 18 часов при температуре 12°С и относительной влажности 90% и в течение 6 часов при температуре 26°С и относительной влажности 70%. Сведенную воедино пыльцу собирали вручную с метелок кукурузы и смешивали в отношении 1:3 по объему (пыльцу в количестве 1 мл добавляли к 3 мл композиции) с каждой из композиций, указанных в Таблице 2. Были приготовлены также контрольные образцы, которые состояли только из пыльцы без композиции. Образцы хранили в закрытых фильтрующей крышкой пробирках. Фильтрующие крышки пробирок были снабжены сетчатым элементом, обеспечивающим прохождение воздуха, но не допускающим утечки пыльцы. Было приготовлено два идентичных набора образцов. Один из этих наборов образцов на два дня поместили в герметичный контейнер, в котором находилось обезвоживающее вещество, как указано в Примере 7. Другой набор образцов также поместили в контейнер, но без обезвоживающего вещества. По прошествии двух дней хранения все образцы из контейнера с обезвоживающим веществом переместили в контейнер без обезвоживающего вещества. Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы показать, повышается ли сохраняемость жизнеспособности пыльцы при некотором, но не избыточном ее обезвоживании.

[00109] Жизнеспособность пыльцы в начальный момент времени ТО, измеренная с помощью цитометра «Amphasys» в начале испытаний составляла 97%. После двух и шести дней хранения образцы пыльцы были исследованы с помощью системы «Amphasys» для измерения жизнеспособности пыльцы. Система «Amphasys» обеспечила надежное определение жизнеспособности пыльцы с помощью импедансной проточной цитометрии путем измерения электрических характеристик пыльцевых зерен. Полученные результаты приведены на фиг. 8.

[00110] За исключением контрольного образца, все образцы, не подвергавшиеся действию обезвоживающего вещества, показали лучшие результаты, чем образцы, такому действию не подвергавшиеся. Так было и в день 2, и в день 6. Все образцы показали сильную жизнеспособность в день 6. В данном случае обезвоживание в присутствии добавок не повысило сохранение жизнеспособности при хранении. Все образцы пыльцы, смешанные с композициями, имели жизнеспособность более высокую, чем контрольный образец.

[00111] Пример 9

[00112] Для определения действия обезвоживания на жизнеспособность пыльцы выполняли хранение пыльцы с обезвоживающим веществом и без такового. Метелки кукурузы смешанных сортов и возрастов собирали и хранили в ростовой камере типа «Conviron®». Для продления продуктивности метелок с целью сбора пыльцы эту ростовую камеру программировали на работу в течение 18 часов при температуре 12°С и относительной влажности 90% и в течение 6 часов при температуре 26°С и относительной влажности 70%. Пыльцу, общее количество которой было несколько более 3 г, собрали с этих метелок в ростовой камере выколачиванием их над ситом, пропускающим пыльцу, но задерживающим пыльники. Из фильтровальной бумаги «Whatman №4» изготовили пакетики, в каждый из которых поместили 1,75 г свежей пыльцы. Пакетики свернули в рулончики и поместили в конические пробирки емкостью 50 мл. В некоторых из этих пробирок находилось 30 мл гранул силикагеля (влагопоглотитель) «Dry & Dry». Пробирки закрыли крышками и поместили на хранение на три дня при температуре 3°С.

[00113] Измерения, проведенные через три дня с помощью цитометра «Amphasys», показали, что пыльца, хранившаяся в присутствии обезвоживающего вещества, имела влажность 10,9%, и ее жизнеспособность составляла 0,067%, в то время как пыльца, хранившаяся без такого вещества, содержала влагу в количестве 57%, и ее жизнеспособность составляла 91,52%.

[00114] Этот эксперимент показал, что слишком длительный контакт пыльцы с обезвоживающим веществом при ее хранении при низкой температуре не поддерживает жизнеспособность и долговечность пыльцы.

[00115] Пример 10

[00116] Проводили исследование, чтобы определить, как влияет на жизнеспособность пыльцы соотношение пыльцы и вещества, обеспечивающего физическое разделение пыльцы. Доставленные с Гавайских островов метелки кукурузы сведенных воедино сортов и на начальной стадии активного цветения хранили в ростовой камере типа «Conviron®». Для продления продуктивности метелок с целью сбора пыльцы эту ростовую камеру программировали на работу в течение 18 часов при температуре 12°С и относительной влажности 90% и в течение 6 часов при температуре 26°С и относительной влажности 70%. Сведенную воедино пыльцу собирали вручную с метелок кукурузы, при этом небольшое количество пыльцы в нулевой момент времени с помощью цитометра «Amphasys» испытали на жизнеспособность, которая оказалось равной 96%.

[00117] Остальную пыльцу разделили на четыре равных порции и разложили по центрифужным пробиркам емкостью 50 мл, в которых ее в трех разных соотношениях перемешали с веществом-разделителем, в составе которого 96% приходилось на лактозу и 4% на Aerosil®. Первая пробирка содержала контрольный образец в виде пыльцы, к которой не добавляли никакого вещества-разделителя. Во второй пробирке соотношение между пыльцой и веществом-разделителем составляло 3:1. В третьей пробирке соотношение между пыльцой и веществом-разделителем составляло 1:1. В четвертой пробирке соотношение между пыльцой и веществом-разделителем составляло 1:3. В каждой пробирке полностью перемешали пыльцу с веществом-разделителем путем многократного переворачивания, после чего поместили пробирки на хранение при температуре 4°С. Жизнеспособность пыльцы в каждой пробирке проверяли с помощью цитометра «Amphasys» через 2, 4, 6, 10, 12 и 17 дней хранения. Результаты представлены на фиг. 9.

[00118] Через 4 дня хранения образцы со всеми соотношениями пыльцы и вещества-разделителя показали жизнеспособность более высокую, чем контрольный образец. Через 6 дней хранения образец, в котором соотношение пыльцы и вещества-разделителя составляло 3:1, показал резкое падение жизнеспособности пыльцы по сравнению с образцами, в которых соотношение пыльцы и вещества-разделителя составляло 1:1 и 1:3, но все же и в этом отстающем образце жизнеспособность пыльцы была все еще выше, чем в контрольном образце. Образец с соотношением пыльцы и вещества-разделителя 1:1 тоже показал заметное падение жизнеспособности пыльцы. Через 10 дней хранения наблюдалось продолжение отмеченных выше тенденций. Через 12 дней хранения образец с соотношением 3:1 и контрольный образец показали отсутствие жизнеспособности у пыльцы. Образец с соотношением 1:1 показал низкий уровень жизнеспособности пыльцы, в то время как в образце с соотношением 1:3 жизнеспособность пыльцы составляла 80%. Даже через 17 дней хранения образец с соотношением 1:3 показал жизнеспособность пыльцы 56%. Эти испытания еще раз подтвердили, что чем больше разделение между зернами пыльцы при хранении, то есть чем меньше контакт между ними, тем дольше пыльца остается жизнеспособной при хранении.

[00119] Пример 11

[00120] Чтобы установить, эффективен ли способ, построенный на принципе разделения пыльцевых зерен, для растений других видов, были проведены эксперименты на пшенице. Колосья пшеницы сорта «Grandin» собирали на ранней стадии всхода и в послевсходовый период. В этот послевсходовый период на колосьях показались несколько пыльников. Эти пыльники собрали из подвыборки колосьев и растерли с помощью нейлонового пестика в среде «Ampha 6» объемом 1,5 мл, затем профильтровали и пропустили через цитометрическую систему «Amphasys», чтобы измерить жизнеспособность пыльцы в нулевой момент времени (Т0). «Amphasys» обеспечивает надежное определение жизнеспособности пыльцы с помощью импедансной проточной цитометрии путем измерения электрических характеристик пыльцевых зерен.

[00121] Из разных областей каждого колоса была взята еще одна подвыборка пыльников пшеничных колосьев, собранных на ранней стадии всхода и в послевсходовый период. Эти образцы хранили полностью в криопробирках при температуре 5°С. Образцы в этих криопробирках либо не содержали никакой среды хранения, либо содержали в качестве таковой порошкообразную лактозу или лактозу (моногидрат D-лактозы лабораторного качества, RPI#L26100-1000.0) в комбинации с 2% Sipernat® 340. Через 3 и 14 дней хранения пыльцу извлекали из хранившихся пыльников с помощью нейлонового пестика и с помощью цитометра «Amphasys» измеряли ее жизнеспособность.

[00122] Жизнеспособность пыльцы из образцов представлена в Таблице 3 ниже.

[00123] Результаты представлены на фиг. 10. Через три дня хранения было отмечено некоторое повышение жизнеспособности по сравнению с жизнеспособностью ранневсхожих пыльников в нулевой момент времени. Зрелые пыльники имели сходную жизнеспособность независимо от обработки. Хранение в среде на основе лактозы дало положительный результат.

[00124] Пример 12

[00125] Еще один эксперимент был проведен для проверки эффективности предлагаемого способа для риса. Пыльники риса собирали из срезанной колосковой чешуи. Одну порцию пыльников перемололи нейлоновым пестиком в 1,5 мл среды «Ampha 6», профильтровали и пропустили через цитометрическую систему «Amphasys», чтобы измерить жизнеспособность пыльцы в нулевой момент времени (Т0). «Amphasys» обеспечивает надежное определение жизнеспособности пыльцы с помощью импедансной проточной цитометрии путем измерения электрических характеристик пыльцевых зерен.

[00126] Еще одну подвыборку пыльников поделили на три образца, которые хранили целиком при температуре 5°С в криопробирках. Образцы в этих криопробирках либо не содержали никакой среды хранения, либо содержали в качестве таковой порошкообразную лактозу или лактозу химического качества в комбинации с 2% Sipernat® 340. Через 4 и 10 дней пыльцу извлекали из хранившихся пыльников с помощью нейлонового пестика и с помощью цитометра «Amphasys» измеряли ее жизнеспособность. Результаты представлены на фиг. 11.

[00127] Жизнеспособность пыльцы из образцов представлена в Таблице 4 ниже.

[00128] Через 4 дня хранения наблюдалось повышение жизнеспособности пыльцы по сравнению с жизнеспособностью в нулевой момент хранения пыльцы из пыльников, хранившихся в беспримесной лактозе.

[00129] Пример 13

[00130] Был проведен эксперимент по определению того, даст ли пыльца, хранившаяся с веществом-разделителем, больше или меньше зерен злака, чем в случае нанесения свежей пыльцы или в случае свободного опыления. Испытуемые растения с единым генотипом выращивали в поле в мешочках, за исключением группы растений, предназначавшихся для свободного опыления, которым была предоставлена возможность естественного опыления. С растений, представлявших группу негативного контроля, мешочки никогда не снимались. Для контрольного опыления собрали свежесброшенную пыльцу, которую поделили на две порции. Первую порцию использовали для ручного опыления контрольных растений, при этом эти растения были под мешочками во избежание заноса и попадания на кисти нитей рылец посторонней пыльцы. Другую порцию свежей пыльцы смешали в соотношении 1:1 с веществом-разделителем, в составе которого было 98% лактозы и 2% Sipernat 340. Образцы этой смеси хранили при температуре 4°С в течение 24 часов. Через 24 часа с растений, предназначенных для испытаний со смесью пыльцы с веществом-разделителем, мешочки были сняты и смесь была нанесена на кисти нитей рылец, после чего эти растения были снова накрыты мешочками во избежание заноса и попадания на кисти нитей рылец посторонней пыльцы. Всем опыленным растениям была предоставлена возможность созреть, после чего со всех растений были собраны початки. На каждом початке было подсчитано количество зерен, результаты представлены на фиг. 12. Из этих результатов видно, что между свободно опылявшимися растениями, контрольными растениями и растениями, опыленными пыльцой, хранившейся в смеси с веществом-разделителем, нет статистически значимой разницы. Это значит, что пыльца, хранившаяся в смеси с веществом-разделителем, полностью сохранила жизнеспособность, в результате чего опыленные ею початки дали большее количество кукурузных зерен, чем контрольные початки, опыленные свежей пыльцой.

[00131] Пример 14

[00132] В этом примере испытывали на пригодность вещество-разделитель, представляющее смесь из 97% лактозы и 3% Sipernat® D17. С метелок кукурузы собрали свежесброшенную пыльцу, жизнеспособность которой в начальный момент времени (Т0), измеренная с помощью цитометра «Amphasys», составила 95,8%. Остальную пыльцу в объемном соотношении 1:1 перемешали с указанным веществом-разделителем. На третий и седьмой день хранения измеряли жизнеспособность пыльцы с помощью цитометра «Amphasys», и после каждого из этих интервалов опыляли ею початки, защищенные мешочками, которые после опыления снова надевали во избежание заноса и попадания на кисти нитей рылец посторонней пыльцы. Хотя после каждого интервала хранения в смеси присутствовала жизнеспособная пыльца, это полевое опыление не привело к образованию кукурузных зерен. В результате более тщательного изучения использованной смеси-добавки было установлено, что агент Sipernat® D17, обладающий некоторой гидрофобностью, образовывал оболочку вокруг пыльцевых зерен, которая препятствовала связыванию пыльцы с кистями нитей рылец при опылении.

[00133] На фиг. 13 представлено полученное под микроскопом изображение пыльцы, покрытой оболочкой из агента Sipernat® D17. Эта оболочка на пыльце образовала скользкую поверхность, препятствующую успешному опылению, хотя пыльца и жизнеспособна. Кроме того, на этом изображении можно видеть, что после хранения в течение 14 дней пыльцевые зерна все же довольно увлажнены. Этот эксперимент показывает, что простым экспериментированием различные вещества-разделители могут быть проверены на эффективность и легко могут быть выявлены вещества, лучше всего годящиеся для этой роли применительно к пыльце и растениям, представляющим интерес.

[00134] Пример 15

[00135] В качестве возможных веществ, способствующих поддержанию или повышению жизнеспособности пыльцы, отдельно испытывали казеин и целлюлозу. Имелись сообщения, что казеин является веществом, особо совместимым с пыльцой. С активно пылящих метелок кукурузы собрали пыльцу. Собранную пыльцу разделили на две равных порции, каждую из которых поместили в центрифужную пробирку емкостью 50 мл. В одну пробирку добавили такое же количество казеина. В другую пробирку добавили такое же количество целлюлозы. Обе пробирки поместили на хранение при температуре 4°С на 24 часа. Через 24 часа проводили испытание на прорастание. В результате было установлено, что и казеин, и целлюлоза на жизнеспособность пыльцы влияют неблагоприятно, что отражено на фиг. 14 и фиг. 15. А именно, на фиг. 14 можно видеть, что пыльца, смешанная с казеином, по большей части, если не полностью, стала нежизнеспособной через 20 часов хранения при температуре 4°С. А на фиг. 15 видно, что пыльца, смешанная с целлюлозой, через 20 часов хранения при температуре 4°С имеет низкую жизнеспособность.

[00136] Пример 16

[00137] Проводили испытания эффективности предлагаемого изобретения в условиях высоких температур. Было собрано некоторое количество свежей пыльцы. С помощью цитометра «Amphasys» измерили жизнеспособность этой пыльцы в начальный момент времени (Т0). Затем пыльцу в соотношении 1: 5 перемешали с добавкой (на одну часть пыльцы пять частей добавки), состоявшей из 98% лактозы и 2% Sipernat 340. Затем полученную смесь распределили по двум емкостям, так что общий объем в каждой емкости составлял 100 мл. Чтобы исключить ошибку, которая могла быть обусловлена послойной неравномерностью свойств пыльцы, перед взятием образца для проверки жизнеспособности пыльцы одну емкость закрыли крышкой и взболтали. Другую емкость закрывали крышкой, но не взбалтывали перед взятием образца для проверки жизнеспособности с помощью цитометра «Amphasys». Во время испытаний обе емкости были выставлены под действие прямых солнечных лучей. Во время испытаний температура составляла от 29,6°С до 32,8°С. В результате было установлено, что в обоих случаях пыльца оставалась в высокой степени жизнеспособной на протяжении периода 330 минут, в течение которого она подвергалась действию высоких температур. Результаты представлены на фиг. 16.

[00138] Пример 17

[00139] В качестве агента-разделителя для пыльцы испытывали минеральное масло Sonneborn® PD-23. На всех стадиях данного эксперимента это вещество находилось в жидком состоянии. Свежесобранную пыльцу кукурузы поместили в среду этого минерального масла и хранили при температуре 4°С в течение 20 часов. Через 20 часов в этот масляный состав внесли среду для прорастания. Результаты подтвердили, что жидкость может служить подходящей средой для хранения пыльцы. При этом было замечено, что пыльцевые зерна, находившиеся в непосредственном контакте друг с другом, по большей части были неспособны к прорастанию, в то время как среди пыльцевых зерен, не находившихся в контакте друг с другом, высокий процент образовал пыльцевые трубки. Это лишний раз подтвердило, что разделение пыльцевых зерен способствует жизнеспособности. Результаты приведены на фиг. 17.

Claims (13)

1. Способ обеспечения сохранности совокупности пыльцевых зерен, при котором

упомянутые пыльцевые зерна перемешивают по меньшей мере с одним веществом, предотвращающим воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, при этом упомянутое вещество, предотвращающее воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, выбирают из группы, содержащей лактозу или смесь лактозы с кремнийсодержащим материалом марки Sipernat® 50, или Sipernat® 22S, или Sipernat® 350, или Perkasil® SM660, или Aerosil® 200, и хранят упомянутые пыльцевые зерна с упомянутым по меньшей мере одним веществом, предотвращающим воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, при этом содержание влаги в пыльцевых зернах поддерживают в пределах от 15 до 60%, и в котором отношение упомянутого по меньшей мере одного вещества, предотвращающего воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, к пыльцевым зернам составляет по меньшей мере 1:1 или 1:3.

2. Способ по п. 1, в котором в качестве упомянутого по меньшей мере одного вещества, предотвращающего воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, используют вещество,

(i) способное окружать или изолировать по меньшей мере одно пыльцевое зерно, или

(ii) минимизировать межповерхностные контакты пыльцевых зерен в упомянутой совокупности пыльцевых зерен.

3. Способ по п. 1, в котором упомянутое содержание влаги поддерживают в пределах от 35 до 60%.

4. Способ по п. 1, в котором упомянутые пыльцевые зерна и по меньшей мере одно вещество, предотвращающее воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, на стадии хранения подвергают механическому перемешиванию.

5. Способ по п. 1, в котором используют размер частиц упомянутого по меньшей мере одного вещества, предотвращающего воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, от максимум в десять раз превышающего размер пыльцевых зерен до минимум в десять раз меньшего, чем размер пыльцевых зерен, при этом используют вещество, предотвращающее воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, имеющее частицы разных размеров.

6. Способ по п. 1, в котором упомянутые пыльцевые зерна выбирают из группы, состоящей из свежесобранных пыльцевых зерен и сохраненных пыльцевых зерен.

7. Способ по п. 1, в котором дополнительно выполняют полевое кондиционирование пыльцевых зерен.

8. Способ по п. 6, в котором в качестве упомянутого вещества, предотвращающего воздействие мертвых пыльцевых зерен на живые пыльцевые зерна, используют лактозу.

9. Способ по п. 3, в котором содержание влаги в пыльцевых зернах поддерживают в пределах от 45 до 55%.

10. Способ по п. 6, в котором после сбора пыльцевых зерен содержание влаги в них понижают до уровня ниже 60%.

Images