CN110859786B - 一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法和应用，属于日化技术领域，其技术要点是：一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法为选取龙胆药材，粉碎成20‑60目；加纯化水经闪式提取法提取出龙胆提取液，过滤浓缩，高温灭菌后为龙胆浓缩母液；龙胆浓缩母液和PDA液体培养基混合，接入目标菌种种子液，恒温搅拌培养3~5d；培养液过滤后调节pH至碱性，过滤；滤液浓缩至生药比（10~15）:1；加入1，2‑丙二醇或1,3‑丁二醇，搅拌过滤；加入纯化水，调节pH至5~7，过滤，超滤；纳滤，脱盐浓缩即可。本发明通过特殊的龙胆内生真菌水解法和精制工艺，得到脱色龙胆抗刺激因子，相对于普通的龙胆抗刺激因子，新品具有颜色浅、电导率低、耐强碱、抗敏活性更高的优点。

Description

一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法和应用

技术领域

本发明属于日化领域，更具体地说，它涉及一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法和应用。

背景技术

目前的化妆品、日用领域中的抗刺激成分有很大的应用市场，随着环境污染的日益严重，人的皮肤原来越脆弱，越来越多的人长期使用化妆品会产生刺激，因此几乎所有的配方都需要添加抗刺激的成分来减少产品的不良反应，而植物来源的抗刺激成分是最受欢迎的，相对于合成抗敏剂，其更为安全，但植物来源的抗刺激成分往往存在效果不强，不稳定，气味难闻，颜色深无法被消费者接受等缺点。

其中龙胆抗刺激因子是比较主流的一个产品，它具有与合成抗敏剂类似的功效，是从龙胆草中制备得到，主要由龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、当药苷、三叶苷、苦龙苷、四乙酰龙胆苦苷、苦樟苷、龙胆黄碱、龙胆碱、β-谷甾醇等组成。如专利授权公布号为CN107137261 B的中国发明专利公开了一种龙胆抗刺激因子的制备方法、用途及植物提取装置，文中指出上述龙胆抗刺激因子的制备方法是采用提取吸附解析集成法制备得到。

但是该品种也存在一些不足，比如其颜色较深，在无色或者浅色配方中无法大比例添加使用；电导率较高，引起配方粘度降低；对碱性环境敏感，在强碱性配方中活性大幅度降低；龙胆主成分为皂苷类成分，脂溶性差，不易透皮，对其功效有一定影响，因此需要提出一种新的技术方案来解决上述问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，通过特殊的龙胆内生真菌水解法和精制工艺，得到脱色龙胆抗刺激因子，相对于普通的龙胆抗刺激因子，新品具有颜色浅、电导率低、耐强碱、抗敏活性更高的优点。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，包括如下操作步骤：

步骤一、选取龙胆药材，粉碎成20-60目；

步骤二、加入纯化水，经闪式提取法提取出龙胆提取液，过滤，浓缩，高温灭菌后为龙胆浓缩母液；

步骤三、龙胆浓缩母液和PDA液体培养基混合，接入目标菌种种子液，恒温搅拌培养3～5d，至生物总碱含量：总皂苷含量＝(80～100):1；

步骤四、培养液过滤后调节pH至碱性，过滤；

步骤五、滤液浓缩至生药比(10～15):1；

步骤六、加入1，2-丙二醇或1,3-丁二醇，搅拌，过滤；

步骤七、加入纯化水，调节pH至5～7，过滤，超滤；

步骤八、纳滤，脱盐浓缩即可。

进一步的，PDA液体培养基是马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，是一种常用的培养基，宜培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。

进一步的，PDA液体培养基中原材料的配方：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15～20克，以及蒸馏水1000毫升。其制备的方法是：先洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，(115℃)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。

通过采用上述技术方案，对提取的龙胆浓缩母液与PDA液体培养基混合，接入目标菌种种子液进行培养，上述操作是采用内生真菌代替外源真菌的方式进行操作，此时内生真菌对龙胆成分的分解不会产生正常药材所含额外的成分，而外源真菌则有产生其他不确定甚至有害次级代谢产物的风险，从而大大减少了对人体皮肤的伤害，进一步降低了过敏的机率。

与此同时，再经由调pH、过滤、加入1，2-丙二醇或1,3-丁二醇，再次过滤、超滤以及纳滤等精制工艺，得到脱色龙胆抗刺激因子，相对于普通的龙胆抗刺激因子，新品具有颜色浅、电导率低、耐强碱、抗敏活性更高的优点。

进一步的，在步骤一中，目标菌种种子液获取的具体操作为：

S1、挑选龙胆药材：分别选取云南的云雾龙胆、新疆的三花龙胆、东北的条叶龙胆、巴基斯坦的欧龙胆、西藏的青藏龙胆和粗根龙胆作为培养的龙胆药材。

S2、将S1中的龙胆药材的根用纯水清洗干净。

S3、将S2中龙胆药材的根切成0.5-2cm长的根段后进行消毒处理，依次为75v/v％乙醇浸泡20-50s、5v/v％次氯酸钠浸泡20-50s、75v/v％乙醇浸泡5-20s、无菌水冲洗2-5次。

S4、无菌环境沥干后，用灭过菌的手术刀将根段切成3-7mm厚的薄片，作为培养组织。

S5、在超净工作台中，每个PDA培养皿中接种3-6块龙胆组织，放进25-30℃培养箱中培养5-8天，每天观察培养皿中真菌生长状况，有新的菌丝生长出来时，挑取菌丝接入新的培养皿中培养，继续纯化，获得纯化后的真菌菌种。

S6、将S5中获得纯化后的真菌菌种分别接入装有1000-1500mL PDA液体培养基的2000mL锥形瓶中，摇床发酵10-15天，获得发酵液，过滤后进行浓缩，用乙醇沉淀，过滤后滤液减压浓缩得到真菌代谢产物浸膏。

S7、将真菌代谢产物浸膏进行抗敏功效测试、水解效率比对、皮肤使用的安全性评估后以菌株的次级代谢产物综合效果最佳的作为目标菌株，并以此获得目标菌种种子液。

进一步的，在步骤一中，目标菌种种子液获取的具体操作为：

S1、挑选龙胆药材：分别选取云南的云雾龙胆、新疆的三花龙胆、东北的条叶龙胆、巴基斯坦的欧龙胆、西藏的青藏龙胆和粗根龙胆作为培养的龙胆药材。

S2、将S1中的龙胆药材的根用纯水清洗干净。

S3、将S2中龙胆药材的根切成1cm长的根段后进行消毒处理，依次为75v/v％乙醇浸泡30s、5v/v％次氯酸钠浸泡30s、75v/v％乙醇浸泡10s、无菌水冲洗3次。

S4、无菌环境沥干后，用灭过菌的手术刀将根段切成5mm厚的薄片，作为培养组织。

S5、在超净工作台中，每个PDA培养皿中接种4块龙胆组织，放进28℃培养箱中培养7天，每天观察培养皿中真菌生长状况，有新的菌丝生长出来时，挑取菌丝接入新的培养皿中培养，继续纯化，获得纯化后的真菌菌种。

S6、将S5中获得纯化后的真菌菌种分别接入装有1000mL PDA液体培养基的2000mL锥形瓶中，摇床发酵14天，获得发酵液，过滤后进行浓缩，用乙醇沉淀，过滤后滤液减压浓缩得到真菌代谢产物浸膏。

S7、将真菌代谢产物浸膏进行抗敏功效测试、水解效率比对、皮肤使用的安全性评估后以菌株的次级代谢产物综合效果最佳的作为目标菌株，并以此获得目标菌种种子液。

通过采用上述技术方案，得到目标菌种种子液在抗敏功效测试、水解效率比对、皮肤使用的安全性评估中具有突出的优势，此时在次基础上将得到目标菌种种子液接入到PDA液体培养基中，用于内生真菌水解法中，由此大大提高了内生真菌水解法的效果，为后期得到脱色龙胆抗刺激因子创造了优良的先决条件。

进一步的，在步骤二中，所述闪式提取条件为：纯化水的体积为龙胆药材粉碎后的体积的10～15倍，提取时间60s～120s至药材颗粒度为≤20目。

通过控制纯化水与龙胆药材粉碎后的体积比，使其有足够的提取溶剂(即纯化水)进行闪式提取操作；再者通过控制提取的时间，可使提取药材颗粒度达到20目以下(包含20目)的操作效果。

进一步的，在步骤二中，过滤方式为板框压滤，过滤介质为0.45μm滤膜，浓缩方式为减压浓缩，终点为生药比的(12～15):1；灭菌条件为95～100℃保温灭菌30min。

通过采用上述技术方案，采用板框+滤膜压滤的方式进行过滤，达到固液分离，浓缩到特定浓度也是后续微生物培养的必要条件，随后进行灭菌处理，以去除浓缩液中的细菌或者其他的微生物，为下一步的内生真菌水解法做好先决的条件。

进一步的，在步骤三中，所述龙胆浓缩母液和PDA液体培养基中混合比例为(0.8～1):1。

通过采用上述技术方案，在此比例下，龙胆浓缩母液和PDA液体培养基中进行混合培养，发酵终点至生物总碱含量：总皂苷含量＝(80～100):1得到的脱色龙胆抗刺激因子的抗敏功效最佳。

进一步的，在步骤四中，用5～50v/v％的氢氧化钠或氢氧化钾调节pH至8～9，过滤方式为板框压滤，过滤介质为0.45μm滤膜。

通过采用上述技术方案，用5～50v/v％的氢氧化钠或氢氧化钾调节pH，此时可有效控制pH的竖直在碱性范围内(pH＝8～9)，此时内生的真菌的生长会受到抑制，甚至死亡，从而通过调节pH，达到了去除内生的真菌的作用；同时使生物碱呈游离态，便于后续进行精制。

进一步的，步骤六中，加入10～12倍量的1，2-丙二醇或1,3-丁二醇，搅拌时间为0.5～1h，过滤方式为板框压滤，过滤介质为0.22μm滤膜。

通过采用上述技术方案，可以有效除去龙胆浓缩母液中的非生物碱和总皂苷的杂质。

进一步的，在步骤七中，纯水和丙二醇的比例为4:6～6:4；纯水和丁二醇的比例为4:6～5:5，调酸用5～50v/v％的盐酸或者柠檬酸；过滤方式为板框压滤，过滤介质为0.22μm滤膜，超滤孔径为1～5万道尔顿，取透过液。

通过采用上述技术方案，可以达到进一步脱色、除杂和除菌的作用，有助于提高脱色龙胆抗刺激因子的品质。

进一步的，在步骤八中，纳滤膜孔径为500～1000道尔顿，取截留液，终点为龙胆苦苷含量100～200ppm，电导率≤200μS/cm。

通过采用上述技术方案，以此达到脱盐和浓缩的目的。

本发明提供了一种脱色龙胆抗刺激因子在日化领域的应用，尤其是在无色或者浅色乳液、面膜、凝胶、洗发水、化妆水、精华液、霜，以及染发剂、脱毛膏等强碱性配方中的应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过特殊的龙胆内生真菌水解法和精制工艺，得到脱色龙胆抗刺激因子，相对于普通的龙胆抗刺激因子，新品具有颜色浅、电导率低、耐强碱、抗敏活性更高的优点；

2、优化的，通过控制水解产物的成分比例，以及最终产品的参数指标，实现产品功效的提升；

3、优化的，通过步骤七中的调酸、过滤、超滤等操作可以达到进一步脱色、除杂和除菌的作用，有助于提高脱色龙胆抗刺激因子的品质。

具体实施方式

以下结合各实施例对本发明作进一步详细说明。

一、制备例

制备例1：一种获取目标菌种种子液的方法，其具体操作为：

S1、挑选龙胆药材：分别选取云南的云雾龙胆、新疆的三花龙胆、东北的条叶龙胆、巴基斯坦的欧龙胆、西藏的青藏龙胆和粗根龙胆作为培养的龙胆药材。

S2、将S1中的龙胆药材的根用纯水清洗干净。

S3、将S2中龙胆药材的根切成1cm长的根段后进行消毒处理，依次为75v/v％乙醇浸泡30s、5v/v％次氯酸钠浸泡30s、75v/v％乙醇浸泡10s、无菌水冲洗3次。

S4、无菌环境沥干后，用灭过菌的手术刀将根段切成5mm厚的薄片，作为培养组织。

S5、在超净工作台中，每个PDA培养皿中接种4块龙胆组织，放进28℃培养箱中培养7天，每天观察培养皿中真菌生长状况，有新的菌丝生长出来时，挑取菌丝接入新的培养皿中培养，继续纯化，获得纯化后的真菌菌种，总计获得内生真菌35株。

S6、将S5中获得纯化后的真菌菌种分别接入装有1000mL PDA液体培养基的2000mL锥形瓶中，摇床发酵14天，获得发酵液，过滤后进行浓缩，用乙醇沉淀，过滤后滤液减压浓缩得到真菌代谢产物浸膏。

S7、将真菌代谢产物浸膏进行抗敏功效测试、水解效率比对、皮肤使用的安全性评估后以菌株的次级代谢产物综合效果最佳的作为目标菌株，并以此获得目标菌种种子液。

制备例2：一种获取目标菌种种子液的方法，其具体操作为：

S1、挑选龙胆药材：分别选取云南的云雾龙胆、新疆的三花龙胆、东北的条叶龙胆、巴基斯坦的欧龙胆、西藏的青藏龙胆和粗根龙胆作为培养的龙胆药材。

S2、将S1中的龙胆药材的根用纯水清洗干净。

S3、将S2中龙胆药材的根切成0.5cm长的根段后进行消毒处理，依次为75v/v％乙醇浸泡20-50s、5v/v％次氯酸钠浸泡20-50s、75v/v％乙醇浸泡5-20s、无菌水冲洗2次。

S4、无菌环境沥干后，用灭过菌的手术刀将根段切成3mm厚的薄片，作为培养组织。

S5、在超净工作台中，每个PDA培养皿中接种3块龙胆组织，放进25℃培养箱中培养5天，每天观察培养皿中真菌生长状况，有新的菌丝生长出来时，挑取菌丝接入新的培养皿中培养，继续纯化，获得纯化后的真菌菌种。

S6、将S5中获得纯化后的真菌菌种分别接入装有1100mL PDA液体培养基的2000mL锥形瓶中，摇床发酵10天，获得发酵液，过滤后进行浓缩，用乙醇沉淀，过滤后滤液减压浓缩得到真菌代谢产物浸膏。

S7、将真菌代谢产物浸膏进行抗敏功效测试、水解效率比对、皮肤使用的安全性评估后以菌株的次级代谢产物综合效果最佳的作为目标菌株，并以此获得目标菌种种子液。

制备例3：一种获取目标菌种种子液的方法，其具体操作为：

S1、挑选龙胆药材：分别选取云南的云雾龙胆、新疆的三花龙胆、东北的条叶龙胆、巴基斯坦的欧龙胆、西藏的青藏龙胆和粗根龙胆作为培养的龙胆药材。

S2、将S1中的龙胆药材的根用纯水清洗干净。

S3、将S2中龙胆药材的根切成2cm长的根段后进行消毒处理，依次为75v/v％乙醇浸泡20-50s、5v/v％次氯酸钠浸泡20-50s、75v/v％乙醇浸泡5-20s、无菌水冲洗5次。

S4、无菌环境沥干后，用灭过菌的手术刀将根段切成7mm厚的薄片，作为培养组织。

S5、在超净工作台中，每个PDA培养皿中接种6块龙胆组织，放进30℃培养箱中培养5-8天，每天观察培养皿中真菌生长状况，有新的菌丝生长出来时，挑取菌丝接入新的培养皿中培养，继续纯化，获得纯化后的真菌菌种。

S6、将S5中获得纯化后的真菌菌种分别接入装有1500mL PDA液体培养基的2000mL锥形瓶中，摇床发酵15天，获得发酵液，过滤后进行浓缩，用乙醇沉淀，过滤后滤液减压浓缩得到真菌代谢产物浸膏。

S7、将真菌代谢产物浸膏进行抗敏功效测试、水解效率比对、皮肤使用的安全性评估后以菌株的次级代谢产物综合效果最佳的作为目标菌株，并以此获得目标菌种种子液。

二、实施例

实施例1：一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，包括如下操作步骤：

龙胆药材粉碎成40目，纯化水用量为药材的10倍，闪式提取60s，提取结束后用0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至生药比12:1。在95℃的温度下保温灭菌30min，冷却至室温(20℃)得到龙胆浓缩母液。接着龙胆浓缩母液和PDA液体培养基等比例混合，接入目标菌种种子液(制备例1)，恒温搅拌培养4d，至生物总碱含量：总皂苷含量＝90:1，过滤后用5％氢氧化钠调节pH＝8，0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至相当于生药比15:1。加入10倍量的1，2-丙二醇，搅拌0.5h，滤液中加入纯化水至纯水和丙二醇的比例为4:6。用50％盐酸调节pH至5，再经由0.22μm滤膜的板框过滤至澄清，用10000道尔顿的超滤膜超滤，透过液用1000道尔顿膜纳滤至终点为龙胆苦苷含量100～200ppm，电导率≤200μS/cm。

实施例2：一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，包括如下操作步骤：

龙胆药材粉碎成20目，纯化水用量为药材的12倍，闪式提取90s，提取结束后用0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至生药比15:1。在98℃的温度下保温灭菌30min，冷却至室温(25℃)得到龙胆浓缩母液。接着龙胆浓缩母液和PDA液体培养按0.8:1比例混合，接入目标菌种种子液(制备例2)，恒温搅拌培养5d，至生物总碱含量：总皂苷含量＝100:1，过滤后用50％氢氧化钠调节pH＝9，0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至相当于生药比10:1，加入12倍量的1，2-丙二醇，搅拌0.5h，滤液加入纯化水至纯水和丙二醇的比例为6:4。用5％盐酸调节pH至7，再经由0.22μm滤膜的板框过滤至澄清，用50000道尔顿的超滤膜超滤，透过液用500道尔顿膜纳滤至终点为龙胆苦苷含量100～200ppm，电导率≤200μS/cm。

实施例3：一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，包括如下操作步骤：

龙胆药材粉碎成60目，纯化水用量为药材的15倍，闪式提取120S，提取结束后用0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至生药比10:1，100℃保温灭菌30min，冷却至室温(15℃)得到龙胆浓缩母液。接着龙胆浓缩母液和PDA液体培养按0.9:1比例混合，接入目标菌种种子液(制备例3)，恒温搅拌培养3d，至生物总碱含量：总皂苷含量＝80:1，过滤后用25％氢氧化钾调节pH＝8.5，0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至相当于生药比12:1，加入11倍量的1,3-丁二醇，搅拌0.5h，滤液加入纯化水至纯水和丁二醇的比例为5:5。用25％柠檬酸调节pH至6，再经由0.22μm滤膜的板框过滤至澄清，用20000道尔顿的超滤膜超滤，透过液用500道尔顿膜纳滤至终点为龙胆苦苷含量100～200ppm，电导率≤200μS/cm。

三、对比实施例

对比实施例1：一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，与实施例1的不同之处在于：龙胆药材粉碎成40目，纯化水用量为药材的10倍。闪式提取60S，提取结束后用0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至生药比12:1，95～100℃保温灭菌30min，冷却至室温，和PDA液体培养基等比例混合，接入黑曲霉菌株种子液，恒温搅拌培养4d，至生物总碱含量：总皂苷含量＝90:1。过滤后用5v/v％氢氧化钠调节pH＝8，0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至相当于生药比15:1，加入10倍量的1，2-丙二醇，搅拌0.5h，滤液加入纯化水至纯水和丙二醇的比例为4:6。用50v/v％盐酸调节pH至5，0.22μm滤膜的板框过滤至澄清，用10000道尔顿的超滤膜超滤，透过液用1000道尔顿膜纳滤至终点为龙胆苦苷含量100～200ppm，电导率≤200μS/cm。

对比实施例2：一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，与实施例1的不同之处在于：龙胆药材粉碎成10目，纯化水用量为药材的8倍，闪式提取50S，提取结束后用0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至生药比16:1，95～100℃保温灭菌30min，冷却至室温。和PDA液体培养按0.7:1，接入目标菌种种子液，恒温搅拌培养2.5d，至生物总碱含量：总皂苷含量＝110:1。过滤后用4v/v％氢氧化钠调节pH＝7.5，0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至相当于生药比11:1。加入9倍量的1，2-丙二醇，搅拌0.5h，滤液加入纯化水至纯水和丙二醇的比例为3:7，用55v/v％盐酸调节pH至4.5，0.22μm滤膜的板框过滤至澄清，用5000道尔顿的超滤膜超滤，透过液用200道尔顿膜纳滤至终点为龙胆苦苷含量80～100ppm，电导率＞200μS/cm。

对比实施例3：一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，与实施例1的不同之处在于：龙胆药材粉碎成5目，纯化水用量为药材的16倍。闪式提取130S，提取结束后用0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至生药比11:1。95～100℃保温灭菌30min，冷却至室温，和PDA液体培养按1.1:1，接入目标菌种种子液，恒温搅拌培养5.5d，至生物总碱含量：总皂苷含量＝70:1。过滤后用55v/v％氢氧化钠调节pH＝9.5，0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至相当于生药比16:1。加入13倍量的1，3-丁二醇，搅拌0.5h，滤液加入纯化水至纯水和丙二醇的比例为7:3。用4v/v％盐酸调节pH至7.5，0.22μm滤膜的板框过滤至澄清。用100000道尔顿的超滤膜超滤，透过液用200道尔顿膜纳滤至终点为龙胆苦苷含量200～250ppm，电导率＞200μS/cm。

对比实施例4：一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，与实施例1的不同之处在于：龙胆药材粉碎成40目，纯化水用量为药材的10倍，闪式提取60s，提取结束后用0.45μm滤膜的板框过滤至澄清，减压浓缩至相当于生药比15:1。加入10倍量的1，2-丙二醇，搅拌0.5h，滤液加入纯化水至纯水和丙二醇的比例为4:6。用50v/v％盐酸调节pH至5，0.22μm滤膜的板框过滤至澄清。用10000道尔顿的超滤膜超滤，透过液用1000道尔顿膜纳滤至终点为龙胆苦苷含量100～200ppm，电导率≤200μS/cm。

对比实施例5：一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，与实施例1的不同之处在于：将龙胆草粉碎至80目，置于提取吸附解析集成装置中，加入5倍水进行提取，时间为1.5h，搅拌速度为400转/min，循环速度为5次/h，提取结束将提取液和药渣一并放出。加入4倍量的50v/v％的丙二醇，于95℃解析3h，搅拌速度为500转/min，循环速度为8次/h，期间通入2倍液体量/h的氮气，解析过程结束后通入压缩空气使提取液全部流出，即得。

四、性能检测分析

试验一：理化指标测试

试验对象：将实施例1-3中的制得的脱色龙胆抗刺激因子作为试验样品1-3，将对比实施例1-5中的制得的脱色龙胆抗刺激因子作为对照样品1-5。

试验方法：

①导率用雷磁DDS-11A电导率仪直接测试。

②稳定性考察:4℃、48℃、常温光照、-18～48℃交替，考察的指标为颜色、澄明度、PH值、气味。

③龙胆苦苷参照《中国药典》2015版一部龙胆。

④生物总碱含量采用滴定法。

试验结果：如表1可知：经过微生物培养后，生物总碱的含量大幅提高，与常规工艺(对比实施例4)和龙胆抗刺激因子(对比实施例5)工艺相比，经本发明整个工艺条件处理后，颜色显著降低，稳定性大幅提升，电导率大幅下降，实现各指标和产品性能的提升。

表1理化指标测试结果

试验二：强碱性条件下稳定性测试

试验对象：将实施例1-3中的制得的脱色龙胆抗刺激因子作为试验样品1-3，将对比实施例1-5中的制得的脱色龙胆抗刺激因子作为对照样品1-5。

试验方法：

△活性物＝(稳定性考察后活性物含量-稳定性考察前活性物含量)÷稳定性考察前活性物含量*100％；其中活性物含量＝龙胆苦苷含量+生物总碱含量；

刺激强度Ι：3％含量，按化妆品卫生规范2007进行豚鼠多皮测试；

刺激强度Ⅱ：3％含量，豚鼠皮肤打薄至看见血丝但不出血为止，按化妆品卫生规范2007进行豚鼠多皮测试。

试验结果：如表2-1、表2-2以及表2-3的结果可知，本发明得到的脱色龙胆抗刺激因子，具有极强的耐碱性，在PH＝12的强碱环境中，加速试验3个月，含量只损失约50％，且外观指标都正常，各项指标均显著优于对比实施例方案。

表2-1强碱性条件下稳定性测试结果

表2-2强碱性条件下稳定性测试结果

表2-3稳定性加速试验结果

试验三：安全性和功效性测试

试验对象：将实施例1-3中的制得的脱色龙胆抗刺激因子作为试验样品1-3，将对比实施例1-5中的制得的脱色龙胆抗刺激因子作为对照样品1-5。阳性对照：B组为曲安奈德软膏，C组为氢化可的松。

试验方法：

A、刺激性测试：按《化妆品安全技术规范》2015年版，进行豚鼠皮肤多次刺激性实验，统计刺激强度。

A-1、抗刺激测试：用20％K12和50％浓度的待测药物按《化妆品安全技术规范》2015年版，进行豚鼠皮肤多次刺激性实验，统计药物组与单用20％K12测试组的刺激降低值。

积分均值	强度
		0～＜0.5	无刺激性
0.5～＜2.0	轻刺激性
		2.0～＜6.0	中等刺激性
6.0～8.0	强刺激性

B抗敏止痒-1：组胺耐受测试

取豚鼠分组：实验组、醋酸曲安奈德尿素软膏组及蒸馏水阴性对照组，脱毛后各组分别涂抹所试药物4次，每日2次，每次0.025mL，面积约1.1cm2，自然成膜后用纱布包裹，胶布固定，提取物给药组局部贴敷1.2cm2，然后包扎，并固定。第3日将右后足背部脱毛处皮肤用细砂纸轻轻摩擦使之发红，但以不出血为度，然后再向创面涂抹所试药物0.2mL，40min后轻轻除去所试药物，每隔3min依次由低浓度到高浓度向每只豚鼠足背部涂抹组胺0.03mL，当豚鼠出现瘙痒反应时，累积每只豚鼠所给予的组胺量，即为该豚鼠耐受组胺的量。与空白组比较，##P<0.01。

B、抗敏止痒-2：小鼠抓挠测试

取小鼠分组：实验组、醋酸曲安奈德尿素软膏组及蒸馏水阴性对照组，实验时用1％硫化钠将动物背毛脱掉，脱毛皮肤区面积为2cm×2cm，2天后用于实验。实验时各组动物背部脱毛区分别局部涂抹相应药物(0.2ml/只)。连续5天，于末次给药后30min，各小鼠尾静脉注射右旋糖酐0.95mg/kg。以小鼠前爪搔头部、后爪搔躯干、嘴咬全身各部位作为瘙痒指征，记录30分钟内小鼠瘙痒次数，并比较组间差异。与空白组比较，##P<0.01。

C、抗炎消肿-小鼠慢性炎症模型

将小鼠背部去毛，取7％DNCB丙酮溶液100μl涂抹于小鼠背部剪毛区至敏，5天后在鼠右耳内测涂抹0.1％DNCB溶液20μl激发，每3日激发1次，共5次。从至敏当天开始局部外涂给药，每日早晚各一次，每次0.2ml/只，连续给药14d。给药时取各组分溶液和溶剂各100μl和20μl，分别涂抹于背部至敏区和右耳内外表面。每次激发后48h，观察小鼠背部皮肤炎症症状并拍照。末次给药后①选取小鼠背部皮肤3个不同固定部位，用8mm金属打孔器打孔，去除皮下脂肪组织后立即用外径千分尺测量厚度，分析天平称重；末次试验后打孔统计耳肿胀度。②背部皮肤标本4％甲醛固定、石蜡包埋、切片，HE染色和甲苯胺蓝染色，计数淋巴细胞与肥大细胞。注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

试验结果：A组实验对比可以看出，工艺技术对安全性的影响比较大，特别是采用外来菌(对比实施例1)进行培养发酵，安全性反而下降了，即产物本身带有轻度刺激性，因此用内生菌培养是必要的。结合表1和表3，由对比实施例2和对比实施例3可以看出，工艺条件及龙胆苦苷和生物总碱的比例、最终含量对产品的功效有显著的影响。本方案与常规工艺(对比实施例4)相比各方面功效有大幅提升，与龙胆抗刺激因子(对比实施例5)工艺相比，各方面功效也有一定的提升。

综合考虑产品常规稳定性、强碱性环境的稳定性、颜色、电导率、安全性、功效性，本发明得到的脱色龙胆抗刺激因子具有明显的优势，对产品升级有现实指导意义。

表3安全性和功效性测试

四、配方应用实施例

配方应用实施例1：面膜

表4面膜的各组分及用量

其制作的工艺为：

1、主锅内U21润湿后，开启搅拌15min，开启升温至80℃加入A相剩余原料，搅拌至溶解后降温。

2、温度降至60℃，加入B相，搅拌至分散完全，之后加入C相原料，搅拌至溶解完全。

配方应用实施例2：凝胶

表5凝胶的各组分及用量

其制作的工艺为：

1、主锅内U21润湿后，开启搅拌15min，开启升温至80℃加入A相剩余原料，搅拌至溶解后降温

2、温度降至60℃，加入B相，搅拌至分散完全，之后加入C相原料，搅拌至溶解完全。

配方应用实施例3：霜

表6霜的各组分及用量

其制作的工艺为：

1、将A相搅拌状态下依次加入主锅，并升温至85℃。

2、将B相预混2加入油锅，升温搅拌至85℃至完全溶解，加入EMT 10搅拌分散均匀后加入主锅，中速均质3min后加入预混3，继续均质3-5min，开始降温。

3、降温至45℃加入C相原料，搅拌至分散均匀出料。

具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (4)

1.一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：

步骤一、选取龙胆药材，粉碎成20-60目；

步骤二、加入纯化水，经闪式提取法提取出龙胆提取液，板框压滤，减压浓缩，高温灭菌后为龙胆浓缩母液；所述闪式提取条件为：纯化水的体积为龙胆药材粉碎后的体积的10~15倍，提取时间60s~120s至药材颗粒度为≤20目；

步骤三、龙胆浓缩母液和PDA液体培养基混合，接入目标菌种种子液，恒温搅拌培养3~5d，至生物总碱含量：总皂苷含量=（80~100）:1；所述龙胆浓缩母液和PDA液体培养基中混合比例为（0.8~1）:1，目标菌种为龙胆内生真菌；

步骤四、培养液过滤后调节pH至碱性后进行板框压滤，过滤介质为0.45μm滤膜；在步骤四中，用5~50 v/v %的氢氧化钠或氢氧化钾调节pH至8~9；

步骤五、滤液浓缩至生药比（10~15）:1；

步骤六、加入1，2-丙二醇或1,3-丁二醇，搅拌后进行板框压滤，过滤介质为0.22μm滤膜；步骤六中，加入10~12倍量的1，2-丙二醇或1,3-丁二醇，搅拌时间为0.5~1h；

步骤七、加入纯化水，调节pH至5~7，过滤，超滤；过滤方式为板框压滤，过滤介质为0.22μm滤膜，超滤孔径为1~5万道尔顿，取透过液；在步骤七中，纯水和丙二醇的比例为4:6~6:4；纯水和丁二醇的比例为4:6~5:5，调酸用5~50 v/v %的盐酸或者柠檬酸；

步骤八、透过液用孔径为500~1000道尔顿的纳滤膜进行纳滤，取终点为龙胆苦苷含量100~200ppm，电导率≤200μS/cm的截留液，即得脱色龙胆抗刺激因子。

2.根据权利要求1所述的一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤一中，目标菌种种子液获取的具体操作为：

S1、挑选龙胆药材：分别选取云南的云雾龙胆、新疆的三花龙胆、东北的条叶龙胆、巴基斯坦的欧龙胆、西藏的青藏龙胆和粗根龙胆作为培养的龙胆药材；

S2、将S1中的龙胆药材的根用纯水清洗干净；

S3、将S2中龙胆药材的根切成0.5-2cm长的根段后进行消毒处理，依次为75 v/v %乙醇浸泡20-50s、5 v/v %次氯酸钠浸泡20-50s、75 v/v %乙醇浸泡5-20s、无菌水冲洗2-5次；

S4、无菌环境沥干后，用灭过菌的手术刀将根段切成3-7mm厚的薄片，作为培养组织；

S5、在超净工作台中，每个PDA培养皿中接种3-6块龙胆组织，放进25-30℃培养箱中培养5-8天，每天观察培养皿中真菌生长状况，有新的菌丝生长出来时，挑取菌丝接入新的培养皿中培养，继续纯化，获得纯化后的真菌菌种；

S6、将S5中获得纯化后的真菌菌种分别接入装有1000-1500mL PDA液体培养基的2000mL锥形瓶中，摇床发酵10-15天，获得发酵液，过滤后进行浓缩，用乙醇沉淀，过滤后滤液减压浓缩得到真菌代谢产物浸膏；

S7、将真菌代谢产物浸膏进行抗敏功效测试、水解效率比对、皮肤使用的安全性评估后以菌株的次级代谢产物综合效果最佳的作为目标菌株，并以此获得目标菌种种子液。

3.根据权利要求1所述的一种脱色龙胆抗刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤二中，板框压滤的过滤介质为0.45μm滤膜，减压浓缩的压滤终点为生药比的（12~15）:1；灭菌条件为95~100℃保温灭菌30min。

4.一种根据权利要求1-3中任意一项所述的一种脱色龙胆抗刺激因子在日化领域中的应用。