CN110845473A

CN110845473A - 一种抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo-乙酸乙酯及其用途

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Publication number: CN110845473A
Application number: CN201910949134.0A
Authority: CN
Inventors: 郑金鑫; 余治健; 邓启文; 陈重; 孙翔; 尚永朋; 林志伟
Original assignee: SHENZHEN CITY NANSHAN DISTRICT PEOPLE'S HOSPITAL
Current assignee: SHENZHEN CITY NANSHAN DISTRICT PEOPLE'S HOSPITAL
Priority date: 2019-10-08
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2020-02-28
Anticipated expiration: 2039-10-08
Also published as: CN110845473B

Abstract

本发明提供了一种抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo‑乙酸乙酯及其用途，所述抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo‑乙酸乙酯的化学结构式如式（1）所示。本发明的抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo‑乙酸乙酯，对金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成具有抑制作用，可用于制备抑制金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的药物，或制备治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物，或制成医疗器械或医疗器具消毒液。

Description

一种抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo-乙酸乙酯及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo-乙酸乙酯及其用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌可感染人体不同部位而导致多种感染性疾病，从常见的毛囊炎、痤疮、麦粒肿等皮肤疾病，到肺炎、心内膜炎、骨髓炎和其他转移性并发症等深度、致命性疾病。金黄色葡萄球菌入侵宿主并诱发宿主感染的过程中，能够分泌多种毒力因子如溶血素、胞外蛋白酶、杀白细胞素和酚溶解性蛋白等,从而协助其对宿主的入侵及损伤，进而诱发疾病的发生。目前随着抗菌药物的广泛使用，耐药菌尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现，给临床治疗带来了困难。万古霉素和利奈唑胺是现在极少数能够治疗MRSA感染的抗菌药物，但国内外已发现越来越多对万古霉素不敏感的金黄色葡萄球菌(VISA/hVISA)和利奈唑胺耐药株，使临床抗菌药物的选择受到严重限制。此外，金黄色葡萄球菌还可粘附在人体组织细胞或医用植入材料的表面形成一个由胞外多糖黏附分子、蛋白质、磷壁酸及胞外DNA(eDNA)等构成的生物被膜结构，降低细菌对抗菌药物的敏感性，并逃避宿主免疫细胞的攻击和吞噬，从而造成慢性感染和迁延不愈。严峻的问题是近年来随着多种导管、透析技术、假体关节等医用植入材料的广泛应用，金黄色葡萄球菌生物被膜相关的医院内感染日趋增多。目前研究发现MRSA等金黄色葡萄球菌耐药株也具有较强的毒力，可使患者发生感染性休克和心内膜炎等严重感染性疾病从而引发较高的病死率，并发现这些耐药株也具有较强的生物被膜形成能力。因此为减少这些菌株感染引起的患者死亡，抑制金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成已成为近年来亟待解决细菌相关的难点和热点问题之一。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo-乙酸乙酯及其用途，具有抑制金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的功能，且对哺乳动物细胞无明显毒性。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo-乙酸乙酯，其化学结构式如下所示：

其中，Lo-乙酸乙酯其分子式为C₂₆H₂₉CIN₂O₄，常温下为无色无臭的透明液体，具有高沸点、热稳定性好、非质子的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物。该Lo-乙酸乙酯为小分子化合物。该小分子化合物Lo-乙酸乙酯在体外及体内能明显抑制金黄色葡萄球菌的毒力和生物被膜形成；该小分子化合物Lo-乙酸乙酯不影响细菌的生长；对哺乳动物细胞无明显毒性，且对人红细胞无明显的溶血作用。

本发明中，所述的小分子化合物Lo-乙酸乙酯可用于配制成医疗器械或医疗器具消毒液，还可进一步进行化学结构的改造，制备抗革兰阳性菌感染的新药物。

本发明还公开了一种抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的药物，其包括如上所述的抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo-乙酸乙酯。

进一步的，所述药物为液体，药物中所述Lo-乙酸乙酯的浓度不小于25μM。

本发明还公开了Lo-乙酸乙酯用于抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的药物中的用途，所述Lo-乙酸乙酯的化学结构式如式(1)所示。

本发明还公开了Lo-乙酸乙酯用于制备治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的用途，所述Lo-乙酸乙酯的化学结构式如式(1)所示。

本发明还公开了Lo-乙酸乙酯用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的药物中的应用，所述药物包括Lo-乙酸乙酯，所述Lo-乙酸乙酯的化学结构式如式(1)所示。

本发明还公开了Lo-乙酸乙酯用于制备制成医疗器械或医疗器具的消毒液的应用，所述消毒液包括Lo-乙酸乙酯，所述Lo-乙酸乙酯的化学结构式如式(1)所示。

进一步的，所述Lo-乙酸乙酯采用以下反应路线制备得到，即将地氯雷他定反应物(I)与反应物(II)进行酰胺化反应，脱水得到Lo-乙酸乙酯。优选的，反应温度高不低于150度。

进一步的，地氯雷他定反应物(I)与反应物(II)的摩尔比为1：1～1.5；其中反应物(II)通过常规合成反应得到。

或者采用如下反应路线，即将地氯雷他定反应物(I)与反应物(III)溶于有机溶剂中，在缚酸剂的作用下，在-5～60度下进行反应。

进一步的，其中有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙腈、四氢呋喃、DMF、吡啶或甲苯中的一种。

进一步的，所述缚酸剂为包括三乙胺、砒陡、叔丁醇钾、甲醇钠、乙醇钠、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的至少一种。

进一步的，地氯雷他定反应物(I)与反应物(III)的摩尔比为1：1～1.5。其中反应物(III)通过常规合成反应得到。

尽管本发明的化合物可以不经任何配制直接给药，但所述的各种化合物优选以药物制剂的形式使用，给药途径可以是非肠道途径(如静脉、肌肉给药)及口服给药。

本发明化合物的药物组合物制备如下：使用标准和常规的技术，使本发明化合物与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酷80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

采用本发明的技术方案，通过对氯雷他定的侧链基团进行修饰改造后，获得具有更强抑制活性的新型小分子化合物Lo-乙酸乙酯，经体外及动物体内实验证实，该小分子化合物Lo-乙酸乙酯能有效抑制金黄色葡萄球菌的毒力和生物被膜形成，且不影响细菌的生长，对哺乳动物细胞没有毒性，且对人红细胞无明显的溶血作用。该小分子化合物Lo-乙酸乙酯可用于制备抑制金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的药物，或制备治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物，或制成医疗器械或医疗器具消毒液。

附图说明

图1是本发明实施例2的Lo-乙酸乙酯抑制金黄色葡萄球菌HG003株生物被膜形成的结晶紫染色图。

图2是本发明实施例2的Lo-乙酸乙酯抑制抑制金黄色葡萄球菌HG003株生物被膜形成的OD₅₇₀检测结果图。***与对照比，P<0.001(Student’s t test)。

图3是本发明实施例2的HG003株浮游菌生长检测分析图。

图4是本发明实施例2的Lo-乙酸乙酯抑制16株金黄色葡萄球菌临床株生物被膜形成的检测结果图。与对照比，^*P<0.05；^**P<0.01；^***P<0.001(Student’s t test)。

图5是本发明实施例3的Lo-乙酸乙酯抑制5株金黄色葡萄球菌的色素减弱的结果图。

图6是本发明实施例3的Lo-乙酸乙酯抑制5株金黄色葡萄球菌的金黄色色素生成(OD₄₅₀检测)的结果分析图；^**与对照比，P<0.01(Student’s t test)。

图7是本发明实施例3的Lo-乙酸乙酯抑制5株金黄色葡萄球菌的溶血活性(OD₅₅₀检测)的结果分析图；与对照比，^*P<0.05；^**P<0.01(Student’s t test)。

图8是本发明实施例4的Lo-乙酸乙酯治疗提高金黄色葡萄球菌HG003株肺部感染小鼠的生存率的结果分析图。Lo-乙酸乙酯(140mg/kg totally)；^*:P<0.01(Log-ranktest)。

具体实施方式

下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

实施例1

采用以下步骤制备Lo-乙酸乙酯：

将地氯雷他定反应物(I)溶于有机溶剂中，以三乙胺作为缚酸剂，并添加溶有反应物(III)的有机溶液，其中反应物(I)与反应物(III)的摩尔比为1：1～1.5，两者混合，于-5℃下搅拌反应，得到包含Lo-乙酸乙酯的反应液。其中有机溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙腈、四氢呋喃、DMF、吡啶或甲苯中的一种。其中反应物(III)通过常规合成反应得到。

反应结束后将反应液倒入冷水中，充分震荡分层，提取有机层，连续水洗三次。将有机层干燥，放置。然后过滤，减压蒸尽溶剂，得到化合物Lo-乙酸乙酯。所得产物用硅胶柱层析纯化，用于后续实验。

实施例2

化合物Lo-乙酸乙酯抑制金黄色葡萄球菌的生物被膜形成实验。

菌株生物被膜形成检测：金黄色葡萄球菌株在TSB培养基中37℃，220rpm/min摇菌过夜培养10-12h。用TSBG培养基(TSB培养基+0.5％葡萄糖)将菌液1:200稀释(含或不含Lo-乙酸乙酯)，每孔200ul加入96孔板(Costar 3599)，每株菌设3复孔，37℃静置培养24h。弃去上清，PBS洗脱3次(200ul/孔/次)，室温下干燥后加入甲醇固定15min(200ul/孔)，弃去甲醇室温下干燥后每孔加入0.5％结晶紫染液100ul，室温下染色10min，清水下轻柔洗脱结晶紫染液直至流水无色，室温下干燥后在酶标仪上读取OD₅₇₀值。上述实验操作独立重复3次，数据表示为均数±标准差(mean±SD)。

菌株浮游菌生长检测：菌株在MHB培养基中37℃，220rpm/min摇菌过夜培养10-12h后，用新鲜的MHB培养基1:200稀释(含或不含Lo-乙酸乙酯)，37℃，220rpm/min培养24h，每隔1h在酶标仪上读取OD₆₀₀值。

如图1～图4所示，Lo-乙酸乙酯在25μM浓度下可显著抑制金黄色葡萄球菌标准株HG003和16株临床分离株形成生物被膜，但对浮游菌的生长无影响。

实施例3

化合物Lo-乙酸乙酯抑制金黄色葡萄球菌金黄色色素生成和溶血活性实验。

菌株金黄色色素检测：用TSB培养基在37℃下培养48h(含或不含Lo-乙酸乙酯)，3ml细菌培养物离心并用0.01M磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。菌体沉淀PBS洗涤后，弃上清，向菌体沉淀加入300ul甲醇(100％)，吹打重悬菌液，重悬之后震荡5分钟，离心(12000r/min，离心1-2分钟)，然后把上清萃取液吸到干净EP管里，然后再向菌体沉淀加入300-350ul甲醇(100％)，重复2次，每次均吸出萃取液，最后把这3次吸到一起去的萃取液约1ml充分混匀后，取200ul加到96孔板内(3复孔)，在酶标仪上测OD450值。上述实验操作独立重复3次，数据表示为均数±标准差(mean±SD)。

菌株溶血活性检测：菌株1:200接种于4mL TSB培养基37℃，220rpm，培养12h(活化细菌)，活化后细菌1:200接种至6ml TSB，37℃，220rpm培养12h(含或不含Lo-乙酸乙酯)，4000rpm，4℃离心10min，取上清，经0.22μm过滤器去除上清培养液中的细菌，转移到无菌试管中备用。将菌株上清与1％的兔红细胞各500μl混合于1.5ml EP管中，TritonX-100做为阳性对照(100％溶血)，1×PBS做为阴性对照，37℃孵育15min，离心15min，将100μl上清液移至新的96孔板中，并在550nm处读取吸光度。上述实验操作独立重复3次，数据表示为均数±标准差(mean±SD)。

如图5～图7所示，Lo-乙酸乙酯(25μM)可显著抑制5株金黄色葡萄球菌的金黄色色素生成，并明显降低菌株的溶血活性。

实施例4

化合物Lo-乙酸乙酯治疗提高金黄色葡萄球菌肺部感染小鼠的生存率试验。

构建C57BL/6J小鼠金黄色葡萄球菌肺部感染模型，以评估Lo-乙酸乙酯对金黄色葡萄球菌毒力的抑制作用。方法如下：选择6-8周龄C57BL/6J小鼠(18-20g/只)，每组15只。小鼠经11.8mg/L戊巴比妥钠100ul腹腔注射麻醉，麻醉后1小时，用金黄色葡萄球菌HG003株(2.0x10⁹cfu)进行滴鼻，20ul菌液/只，随后实验组小鼠开始腹腔注射Lo-乙酸乙酯，1天2次，每次剂量10mg/kg,持续1周，累积总剂量达到140mg/kg。每天观察小鼠的存活情况。上述实验操作独立重复至少2次。

如图8所示，采用Lo-乙酸乙酯治疗1周(累积剂量140mg/kg)，可明显提高金黄色葡萄球菌HG003株肺部感染小鼠的存活率。

实施例5

化合物Lo-乙酸乙酯对金黄色葡萄球菌生长的抑制实验。

本实施例使用美国Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)推荐的标准试管稀释法：

1.将细菌接种于新鲜的MH液体培养基，37℃培养过夜。

2.将菌液用新鲜的MH液体培养基将菌液浓度校正至0.5麦氏比浊标准，再用MH液体培养基按1：200稀释，向每只试管中加入1mL，加入1mL不同浓度梯度的Lo-乙酸乙酯(溶剂DMSO终浓度保持1％)，37℃培养18小时。因Lo-乙酸乙酯溶解于DMSO中，以0.1％DMSO+细菌作为对照，以无菌培养基为空白对照。

3.取出与空白对照比较，细菌不生长的浓度最低的一管即为化合物的最小抑菌浓度。

结果显示Lo-乙酸乙酯对金黄色葡萄球菌生长没有抑制作用。

实施例6

MTT法检测化合物Lo-乙酸乙酯的细胞毒性实验，包括如下步骤：

1.将新鲜培养的Vero细胞接种于96孔板，每孔100μL细胞(约5×10⁴细胞)，37℃，5％CO₂条件下培养24小时，使细胞长成单层。

2.弃去培养基，加入100μL/每孔新鲜的MEM培养基，其中含有不同浓度的化合物Lo-乙酸乙酯(溶剂DMSO终浓度保持0.1％)，每个样品采用6复孔上样，37℃，5％CO₂条件下继续培养24小时。因Lo-乙酸乙酯溶解于DMSO中，因此设0.1％DMSO+细胞为对照。

3.每孔加入10μL MTT标记物，37℃、5％CO₂条件下培养4小时。

4.每孔加入100μL溶解液，37℃、5％CO₂条件下培养过夜。

5.将96孔板取出读取OD₅₇₀值，每个样品读数取6复孔的均值，计算不同浓度的化合物对Vero细胞生长的抑制率：

半数抑制量CC₅₀值采用Logit法计算。表1为化合物Lo-乙酸乙酯对Vero细胞的毒性作用。

表1

结果表明，未观察到对Vero细胞具有毒性。

实施例7

红细胞溶血实验，包括以下步骤：

1.将分离的健康人红细胞用无菌生理盐水洗3遍，并稀释至5％。

2.加入不同浓度的小分子化合物Lo-乙酸乙酯(溶剂DMSO终浓度保持1％)于5％红细胞悬液中，每孔200μl接种于96孔板上，每个样品采用三复孔。因Lo-乙酸乙酯溶解于DMSO中，因此设0.1％DMSO+细胞为阴性对照，设1％细胞穿透液Triton-100+细胞为阳性对照，并设两种常用抗生素头孢唑林和万古霉素作对照。37℃培养箱培养1小时，离心后取100μl上清移入另一块干净的96孔板，OD₅₇₀读数，每个样品读数取三复孔的均值。

表2是化合物Lo-乙酸乙酯对血红细胞的毒性作用结果。

表2化合物Lo-乙酸乙酯对血红细胞的毒性作用

结果表明：该小分子化合物Lo-乙酸乙酯对人红细胞均没有溶血作用。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo-乙酸乙酯，其特征在于：其化学结构式如式(1)所示：

2.一种抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的药物，其特征在于：其包括如权利要求1所述的抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的抑制剂Lo-乙酸乙酯。

3.根据权利要求2所述的抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的药物，其特征在于：所述药物为液体，药物中所述Lo-乙酸乙酯的浓度不小于25μM。

4.Lo-乙酸乙酯用于抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的药物中的用途，其特征在于：所述Lo-乙酸乙酯的化学结构式如下式(1)所示：

5.根据权利要求4所述的Lo-乙酸乙酯用于制备治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的用途，其特征在于：所述药物为液体，药物中，所述Lo-乙酸乙酯的浓度不小于25μM。

6.Lo-乙酸乙酯用于制备治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的用途，其特征在于：所述Lo-乙酸乙酯的化学结构式如下式(1)所示：

7.Lo-乙酸乙酯用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力和生物被膜形成的药物中的应用，其特征在于：所述药物包括Lo-乙酸乙酯，所述Lo-乙酸乙酯的化学结构式如下式(1)所示：

8.Lo-乙酸乙酯用于制备制成医疗器械或医疗器具的消毒液的应用，其特征在于：所述消毒液包括Lo-乙酸乙酯，所述Lo-乙酸乙酯的化学结构式如下式(1)所示：