CN110845018B - 一种提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,具体为通过将ABTS与漆酶溶液组成漆酶‑ABTS介质溶液然后与己烯雌酚溶液混合于反应体系中,并放入振荡培养箱中反应一段时间后利用乙酸乙酯萃取己烯雌酚终止反应实现对己烯雌酚的降解,本发明通过制备漆酶‑ABTS介质溶液并用于己烯雌酚的降解,使漆酶对己烯雌酚的降解率由原来的44.5%提高到99.9%,这有利于己烯雌酚污水的处理,在污水处理领域有实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及污水处理技术领域,特别涉及一种提高漆酶降解乙烯雌酚降解率的方法。
背景技术
己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)是一种合成的非甾体雌激素或异雌激素,具有比雌二醇更强的雌激素活性。从1938年开始,它曾在畜牧业中被用作于口服避孕药和生长促进剂。后研究发现其是一种内分泌干扰物质,DES暴露对人类和动物有很强的负面影响,甚至于接触这种合成雌激素已经给全世界带来了癌症风险。曾今,美国国家癌症研究所一项研究报告表明,在妊娠期间使用DES,生殖道异常,不孕,妊娠并发症,宫颈上皮内瘤变和明确的细胞腺癌等相对风险增加。因此出于安全原因,一些国家禁止使用DES处方药进行流产预防。虽然,在2002年中国已禁止DES应用于畜牧业。但由于其低成本和药理作用仍然用于临床实践和动物,导致每年连续排放。据报道,DES在中国的几个城市的不同污水和河流中曾达到了11.1ng/L,在饮用水源中也一度达到2.52ng/L。这将带来健康风险,因为DES具有比E2强得多的雌激素性,雌二醇对鱼的影响阈值在1到10ng/L之间。鉴于DES对环境的影响及人类健康的威胁,从废水中快速且有效去除这种化合物显得非常重要。
林等人利用臭氧氧化降解DES,但效果却不显著著(Lin et al.,2009)。徐等人研究了己烯雌酚的紫外光转换及其在阳光下对地表水的持久性污染,发现DES能够被光催化降解,但也发现DES是一种光致变色化合物,其紫外诱导的中间体可以在阳光下转化回DES,这显然减缓了DES的光降解(Xu et al.,2017)。作为一类脂溶性化合物DES在环境中不易被降解。传统的处理方法来降解这类酚类有机污染物不仅费用昂贵且效果不佳。
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,其催化有机底物的单电子氧化是同时将分子氧还原成水。已有研究表明漆酶由于其低氧化还原电位可以催化各种酚。然而,在将其用于DES降解处理污水时,一般需要6h左右才能完成降解,然而在DES的浓度高于50mg/L的污水中,漆酶的处理能力下降,最高降解率也仅仅在70%左右。因此漆酶对于DES污水的降解效率和降解率有待进一步提高。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种提高漆酶降解乙烯雌酚降解率的方法,通过在漆酶降解己烯雌酚的反应体系中加入ABTS以扩展催化底物范围以及氧化效率,从而提高其降解率。
本发明所述的提高漆酶降解乙烯雌酚降解率的方法,通过将ABTS与漆酶溶液组成漆酶-ABTS介质溶液然后用于降解乙烯雌酚;
优选的,包括以下步骤:
(1)配制乙酸-乙酸钠缓冲溶液;
(2)分别将漆酶和ABTS溶于乙酸-乙酸钠缓冲溶液中形成漆酶母液和ABTS溶液;
(3)将漆酶母液和ABTS溶液与己烯雌酚溶液混合于反应体系中,乙酸-乙酸钠缓冲溶液补齐,置于振荡培养箱中恒温振荡反应一段时间后完成降解。
优选的,步骤(1)所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液为乙酸和乙酸钠配制成的pH为5.5的0.01mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
优选的,步骤(2)所述漆酶为彩绒革盖菌所产,酶活为0.94U/mg,漆酶母液的浓度为1mg/mL。
优选的,步骤(2)所述ABTS溶液浓度为0.01mol/L。
优选的,反应体系中漆酶母液的浓度为0.05mg/mL、ABTS溶液的浓度为0.1~1mM。
优选的,恒温振荡箱温度控制在35~55℃,转速120r/min。
优选的,反应时间0.5h。
优选的,己烯雌酚溶液的浓度为10~100mg/L。
与现有技术相比,本发明取得了以下有益效果:
将漆酶用于DES降解时,由于DES的空间位阻导致DES并没有完全进入漆酶的肽链空腔,而是依附在漆酶空腔的凹槽,并且主要被部分残基包围,部分残基与DES的酚羟基结合形成氢键,还有部分残基与DES形成“半包裹”的疏水界面,因此,漆酶与DES能够自行发生反应,且氢键和疏水界面相互作用是形成漆酶-DES复合物的重要作用力。
在中性或者碱性的条件下,氢氧根离子的浓度增加,这有助于氢氧根离子与漆酶的T2/T3铜簇内的质子化桥连配体的结合;从而阻止了电子从T1转移到T2/T3中心,降低了酶活性;在较低pH下能够导致酶的完全失活,因此,DES的降解效果也不理想。所以,最佳pH取决于漆酶性质以及基质性质,因为pH可以改变化合物的电荷和酶的构型,这是基质进入或结合活性位点的基础。酶-基质复合物主要通过弱相互作用稳定,例如范德华力和氢键。后者在很大程度上受中等pH的影响,因此将pH值增加或降低到一定范围以下会降低酶的稳定性和活性。pH为5.5是漆酶活性和稳定性之间平衡的值,在这一条件下,DES能够达到最大的转化。
在较低温度(25℃)下降解效率降低是由于反应的活化能降低。另一方面,在较高温度下降解效率降低是由于漆酶的失活,因为当温度超过一定值后,增加的热失活率比反应速率更显著。漆酶降解DES的最佳温度为55℃。
氧化还原介体可以作为漆酶和底物之间的电子穿梭介质,从而克服漆酶的空间位阻和动力学限制,介体可以通过与酶活性位点或蛋白质结构上的其他合适区域进行结合从而产生比漆酶本身对底物具有更高氧化能力的自由基物质,因此,在ABTS存在下,漆酶能更有效的催化转化DES。
附图说明
图1为己烯雌酚标准曲线;
图2为实施例2-6中加入不同浓度ABTS后己烯雌酚降解效果图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
(1)标准溶液配制:将己烯雌酚溶于甲醇形成2.5g/L己烯雌酚母液,将己烯雌酚母液稀分别释成浓度为1、5、10、20、30、50mg/L、100mg/L的标准液,利用HPLC检测峰面积制作己烯雌酚标准曲线。
HPLC检测条件如下:
色谱柱:ZORBAX SB-C18(150mm×4.6mm×5μm);检测条件为:进样体积10μL,以等体积的乙腈和水为流动相等梯度洗脱10min,泵流速为1.0mL/min,柱温:30℃,紫外检测器检测240nm波长处的出峰情况,记录峰面积值。
实施例2
(1)使用乙酸和乙酸钠配制成的pH为5.5的0.01mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液;
(2)使用步骤(1)制备的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制浓度为1mg/mL的漆酶母液,以及浓度为0.01mol/L的ABTS溶液,其中漆酶为彩绒革盖菌所产,酶活为0.94U/mg;
(3)取0.5mL漆酶母液,0mL ABTS溶液和0.4mL的DES母液加入10mL的反应体系中,其余由缓冲溶液补齐,放入55℃振荡培养箱中反应,设置转速120r/min,反应0.5h后使用乙酸乙酯对溶液进行萃取两次,将有机相提取后旋蒸至尽干,使用甲醇定容,利用真空过滤膜取样,通过HPLC对反应后的样品进行浓度测量。
实施例3
同实施例2,区别在于步骤(3)将0.5mL的漆酶母液和0.1mL ABTS和0.4mL的DES母液加入10mL的反应体系中,其余由缓冲溶液补齐。
实施例4
同实施例2,区别在于步骤(3)将0.5mL的漆酶母液和0.3mL ABTS和0.4mL的DES母液加入10mL的反应体系中,其余由缓冲溶液补齐。
实施例5
同实施例2,区别在于步骤(3)将0.5mL的漆酶母液和0.6mLABTS和0.4mL的DES母液加入10mL的反应体系中,其余由缓冲溶液补齐。
实施例6
同实施例2,区别在于步骤(3)将0.5mL的漆酶母液和1.0mL ABTS和0.4mL的DES母液加入10mL的反应体系中,其余由缓冲溶液补齐。
实施例7
同实施例2,区别在于DES母液的用量为0.2mL。
实施例8
同实施例3,区别在于DES母液的用量为0.2mL。
实施例9
同实施例4,区别在于DES母液的用量为0.2mL。
实施例10
同实施例5,区别在于DES母液的用量为0.2mL。
实施例11
同实施例6,区别在于DES母液的用量为0.04mL。
实施例12
同实施例2,区别在于DES母液的用量为0.04mL。
实施例13
同实施例3,区别在于DES母液的用量为0.04mL。
实施例14
同实施例4,区别在于DES母液的用量为0.04mL。
实施例15
同实施例5,区别在于DES母液的用量为0.04mL。
实施例16
同实施例6,区别在于DES母液的用量为0.04mL。
经计算,实施例2-6所述的反应体系中DES的初始浓度C0为100mg/L,实施例7-11所述的反应体系中DES的初始浓度C0为50mg/L,实施例12-16所述的反应体系中DES的初始浓度C0为10mg/L,根据降解率计算公式:
降解率=(C0-C)/C0×100%,其中C0是初始浓度,C是最终浓度。
计算实施例2-6的降解率见表1。
表1
实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | |
C<sub>0</sub>,mg/mL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
降解率,% | 44.5 | 86 | 97.4 | 99 | 99.9 |
实施例7 | 实施例8 | 实施例9 | 实施例10 | 实施例11 | |
C<sub>0</sub>,mg/mL | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
降解率,% | 56.7 | 92.5 | 99.6 | 99.9 | 100 |
实施例12 | 实施例13 | 实施例14 | 实施例15 | 实施例16 | |
C<sub>0</sub>,mg/mL | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
降解率,% | 89.2 | 99.5 | 100 | 100 | 100 |
实施例17
同实施例2,区别在于反应时间4h,计算降解率为55.6%。
实施例18
同实施例2,区别在于反应时间为6h,计算降解率为72.2%。
实施例19
同实施例7,区别在于反应时间4h,计算降解率为68.5%。
实施例20
同实施例7,区别在于反应时间6h,计算降解率为84.7%。
实施例21
同实施例12,区别在于反应时间4h,计算降解率为,99.2%。
实施例22
同实施例12,区别在于反应时间6h,计算降解率为99.9%。
由实施例17-22以及表1数据可以得出,单独的漆酶用于DES降解时,需要6h才能达到降解平衡,并且,在浓度高于50mg/mL以后,漆酶对于DES的降解率下降,在100mg/mL的DES浓度时,漆酶的最高降解率仅仅在72.2%;而ABTS的加入显著提高了漆酶降解DES的降解效率和降解率,在使用了0.1mM ABTS后,反应0.5h,漆酶对己烯雌酚的降解率由原来的44.5%提高到86%,加入1mM ABTS后,反应0.5h,漆酶对己烯雌酚的降解率高达99.9%,基本实现了对DES的完全降解。
Claims (8)
1.一种提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)配制乙酸-乙酸钠缓冲溶液;
(2)分别将漆酶和ABTS溶于乙酸-乙酸钠缓冲溶液中形成漆酶母液和ABTS溶液;
(3)将漆酶母液和ABTS溶液与己烯雌酚溶液混合于反应体系中,乙酸-乙酸钠缓冲溶液补齐,置于振荡培养箱中恒温振荡反应一段时间后完成降解。
2.根据权利要求1所述的提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,其特征在于,步骤(1)所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液为乙酸和乙酸钠配制成的pH为5.5的0.01mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,其特征在于,步骤(2)所述漆酶为彩绒革盖菌所产,酶活为0.94U/mg,漆酶母液的浓度为1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,其特征在于,步骤(2)所述ABTS溶液浓度为0.01mol/L。
5.根据权利要求1所述的提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,其特征在于,步骤(3)所述反应体系中漆酶母液的浓度为0.05mg/mL、ABTS溶液的浓度为0.1~1mM。
6.根据权利要求1所述的提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,其特征在于,恒温振荡箱温度控制在35~55℃,转速120r/min。
7.根据权利要求1所述的提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,其特征在于,反应时间0.5h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,其特征在于,己烯雌酚溶液的浓度为10~100mg/L。
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Application publication date: 20200228 Assignee: Guilin Hengmo Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: GUILIN University OF TECHNOLOGY Contract record no.: X2022450000418 Denomination of invention: A method to improve the degradation rate of diethylstilbestrol by laccase Granted publication date: 20211207 License type: Common License Record date: 20221227 |