CN110882514B - 香草醛作为氧化还原介质在提高漆酶降解己烯雌酚降解率中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了香草醛作为氧化还原介质在提高漆酶降解己烯雌酚降解率中的应用,香草醛浓度为0.01‑1mmol/L。还公开了一种香草醛作为氧化还原介质提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,包括以下步骤:步骤1:将漆酶溶于醋酸‑醋酸钠缓冲液配制漆酶母液;将己烯雌酚溶于甲醇配制成己烯雌酚溶液;将香草醛溶于醋酸‑醋酸钠缓冲液配制成香草醛溶液;步骤2:将配制的漆酶母液和香草醛溶液混合成漆酶‑香草醛溶液后,与所配制的己烯雌酚溶液混合于反应体系中,放入振荡培养箱中反应;步骤3:反应半小时后,利用乙酸乙酯萃取终止己烯雌酚反应,完成降解。本发明以香草醛作为还原介质,可大大提高漆酶降解DES的降解率,降低降解成本。
Description
技术领域
本发明涉及环境污染处理技术领域,特别是涉及香草醛作为氧化还原介质在提高漆酶降解己烯雌酚降解率中的应用。
背景技术
己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)是一种合成的非甾体雌激素或异雌激素,具有比雌二醇更强的雌激素活性(Korach et al.,1978;Shang et al.,2014)。自1938年被英国化学家合成后,最初用于治疗肠胃不适、头晕和皮肤红肿。后来被作为预防流产的处方药而广泛应用于医学界,还被用于治疗晚期前列腺癌、乳腺癌、卵巢功能不全、闭经、子宫发育不全、功能性子宫出血等疾病(Goyal et al.,2001;Grenader et al.,2014;Koong etal.,2014)。在1971年己烯雌酚因被发现可诱发多种女性疾病而遭禁用(He et al.,2002;Tournaire et al.,2015.,2018;Troisi et al.,2016)。但是己烯雌酚作为外敷、或者是临床手术辅助药物及动物的生长促进剂依然被广泛应用于临床和畜禽生产中,其中一部分DES或DES代谢产物随着动物的粪便、尿等进入环境。进入环境中的DES虽然一般浓度较低,甚至是微量的,但在生态系统中,可以通过生物浓缩、生物积累和生物放大三种途径增大浓度,然后进入食物链,同样危害生物体和人类的健康。
林等人利用臭氧氧化降解DES,但效果却不显著(Lin et al.,2009)。徐等人研究了己烯雌酚的紫外光转换及其在阳光下对地表水的持久性污染,发现DES能够被光催化降解,但也发现DES是一种光致变色化合物,其紫外诱导的中间体可以在阳光下转化回DES,这显然减缓了DES的光降解(Xu et al.,2017)。作为一类脂溶性化合物DES在环境中不易被降解,传统的处理方法来降解这类酚类有机污染物不仅费用昂贵且效果不佳(Snyder etal.,2003;Tay et al.,2009)。
漆酶是日本学者从漆树上发现的一种酶。漆酶广泛分布在真核生物和原核生物中:真菌、植物、细菌等。漆酶具有广泛的底物特异性,它可以氧化酚类及芳香族衍生物等。鉴于现有技术降解DES存在的问题,如何用漆酶降解DES并提高DES降解率变得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种香草醛作为氧化还原介质在提高漆酶降解己烯雌酚降解率中的应用,以解决上述现有技术存在的问题,将香草醛作为氧化还原介质,并选择适宜的浓度,以提高漆酶降解DES的降解率。
本发明还有一个目的是提供一种香草醛作为氧化还原介质提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,该方法可以高效将己烯雌酚进行降解。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种香草醛作为氧化还原介质在提高漆酶降解己烯雌酚降解率中的应用,所述香草醛浓度为0.01-1mmol/L。
优选的是,所述漆酶浓度为50mg/L,所述漆酶的酶活为0.94U/mg;
所述己烯雌酚的浓度为100mg/L(此己烯雌酚的浓度是经乙烯雌酚母液进行稀释后,在反应体系中的实际浓度)。
优选的是,降解条件为:温度55℃,pH5.5,时间0.5-6h。
本发明还提供一种香草醛作为氧化还原介质提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,包括以下步骤:
步骤1:将漆酶溶于醋酸-醋酸钠缓冲液配制漆酶母液;将己烯雌酚溶于甲醇配制成己烯雌酚溶液;将香草醛溶于醋酸-醋酸钠缓冲液配制成香草醛溶液;
步骤2:将步骤1中配制的漆酶母液和香草醛溶液混合成漆酶-香草醛溶液,并将漆酶-香草醛溶液与所配制的己烯雌酚溶液混合于反应体系中,放入振荡培养箱中反应;
步骤3:反应半小时后,利用乙酸乙酯萃取终止己烯雌酚反应,完成降解。
优选的是,步骤1中所述醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH5.5。
优选的是,步骤1中所述己烯雌酚溶液浓度为2.5g/L(这是配制的己烯雌酚母液浓度,待使用时根据要求进行稀释即可)。
优选的是,步骤2中所述漆酶母液:香草醛溶液:己烯雌酚体积比为0.5:0.1-1:0.4混合。
优选的是,反应条件为:55℃,120rpm振荡培养0.5-6h。
本发明公开了以下技术效果:
在漆酶催化降解已烯雌酚的过程中,由于已烯雌酚可能存在的空间位阻影响,使得已烯雌酚在与漆酶进行结合时不能完全进入漆酶的肽链空腔,而是依附在其空腔凹槽中,这种空间位阻效应导致了漆酶在催化降解已烯雌酚的过程中存在降解效率低的问题。本发明利用香草醛作为氧化还原介质,能够降低漆酶和己烯雌酚间的氧化还原电位差,使其作为催化降解过程中漆酶和底物之间的电子穿梭介质,使得介质可以通过与酶活性位点或蛋白质结构上的其他合适区域进行结合从而产生比漆酶本身对底物具有更高氧化能力的自由基物质,进而克服漆酶的空间位阻和动力学限制,使漆酶能够更好地实现与己烯雌酚结合,显著提高漆酶的降解效率。本发明公开的香草醛作为氧化还原介质提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法,简单易操作,成本低,利于克服现有方法降解己烯雌酚的缺点,具有重要的实用和推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明己烯雌酚溶液标准曲线图;
图2为本发明实施例2-6己烯雌酚溶液随香草醛浓度变化的降解率曲线图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
绘制己烯雌酚标准曲线
将浓度为2.5g/L的己烯雌酚母液进行稀释,分别得到浓度为1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L的己烯雌酚标准溶液,利用HPLC检测法绘制己烯雌酚标准曲线,如图1所示。
HPLC检测条件为色谱柱:ZORBAX SB-C18(150mm×4.6mm×5μm);检测条件为:进样体积10μL,以等体积的乙腈和水为流动相等梯度洗脱10min,泵流速为1.0mL/min,柱温:30℃,紫外检测器检测240nm波长处的出峰情况,记录峰面积值。
实施例2
(1)将0.5mL 1mg/mL的漆酶母液、0mL 0.01mol/L的香草醛溶液和0.4mL 2.5g/L的DES母液混合,并用醋酸-醋酸钠缓冲液补充至10mL,置于55℃,120rpm振荡培养箱中反应。
(2)反应半小时后,使用乙酸乙酯对溶液进行萃取两次,将有机相提取后旋蒸至尽干,使用甲醇定容,利用真空过滤膜取样,通过HPLC对反应后的样品进行浓度测量,计算降解率。
降解率计算公式:降解率=(C0-C)/C0×100%,其中C0是初始浓度,C是最终浓度。
经计算,本实施例的降解率为44.56%。
实施例3
(1)将0.5mL 1mg/mL的漆酶母液、0.1mL 0.01mol/L香草醛溶液和0.4ml 2.5g/L的DES母液混合,并用醋酸-醋酸钠缓冲液补充至10mL,置于55℃,120rpm振荡培养箱中反应。
(2)反应半小时后,使用乙酸乙酯对溶液进行萃取两次,将有机相提取后旋蒸至尽干,使用甲醇定容,利用真空过滤膜取样,通过HPLC对反应后的样品进行浓度测量,计算降解率。
降解率计算公式:降解率=(C0-C)/C0×100%,其中C0是初始浓度,C是最终浓度。
经计算,本实施例的降解率为52.25%。
实施例4
(1)将0.5mL 1mg/mL的漆酶母液、0.3mL 0.01mol/L香草醛溶液和0.4mL 2.5g/L的DES母液混合,并用醋酸-醋酸钠缓冲液补充至10mL,置于55℃,120rpm振荡培养箱中反应。
(2)反应半小时后,使用乙酸乙酯对溶液进行萃取两次,将有机相提取后旋蒸至尽干,使用甲醇定容,利用真空过滤膜取样,通过HPLC对反应后的样品进行浓度测量,计算降解率。
降解率计算公式:降解率=(C0-C)/C0×100%,其中C0是初始浓度,C是最终浓度。
经计算,本实施例的降解率为52.16%。
实施例5
(1)将0.5mL 1mg/mL的漆酶母液、0.6mL 0.01mol/L香草醛和0.4mL 2.5g/L的DES母液混合,并用醋酸-醋酸钠缓冲液补充至10mL,置于55℃,120rpm振荡培养箱中反应。
(2)反应半小时后,使用乙酸乙酯对溶液进行萃取两次,将有机相提取后旋蒸至尽干,使用甲醇定容,利用真空过滤膜取样,通过HPLC对反应后的样品进行浓度测量,计算降解率。
降解率计算公式:降解率=(C0-C)/C0×100%,其中C0是初始浓度,C是最终浓度。
经计算,本实施例的降解率为57.17%。
实施例6
(1)将0.5mL 1mg/mL的漆酶母液、1.0mL 0.01mol/L香草醛溶液和0.4mL 2.5g/L的DES母液混合,并用醋酸-醋酸钠缓冲液补充至10mL,置于55℃,120rpm振荡培养箱中反应。
(2)反应半小时后,使用乙酸乙酯对溶液进行萃取两次,将有机相提取后旋蒸至尽干,使用甲醇定容,利用真空过滤膜取样,通过HPLC对反应后的样品进行浓度测量,计算降解率。
降解率计算公式:降解率=(C0-C)/C0×100%,其中C0是初始浓度,C是最终浓度。
经计算,本实施例的降解率为57.51%。
从上述实施例2-6中,具体分析可以得到:随着香草醛加入量的增加,漆酶对于己烯雌酚的降解效果逐渐增强,当香草醛的浓度为1mM时,降解率最高,可达57.51%,相比不加香草醛提高了29.06%,效果明显。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.香草醛作为氧化还原介质在提高漆酶降解己烯雌酚降解率中的应用,其特征在于,所述香草醛浓度为0.01-1mmol/L;
所述漆酶浓度为50mg/L,所述漆酶的酶活为0.94U/mg;所述己烯雌酚的浓度为100mg/L;降解条件为:温度55℃,pH5.5,120rpm振荡培养0.5h;
所述应用,包括以下步骤:
步骤1:将漆酶溶于醋酸-醋酸钠缓冲液配制漆酶母液;将己烯雌酚溶于甲醇配制成己烯雌酚溶液;将香草醛溶于醋酸-醋酸钠缓冲液配制成香草醛溶液;
步骤2:将步骤1中配制的漆酶母液和香草醛溶液混合成漆酶-香草醛溶液,并将漆酶-香草醛溶液与所配制的己烯雌酚溶液混合于反应体系中,放入振荡培养箱中反应;
步骤3:反应半小时后,利用乙酸乙酯萃取终止己烯雌酚反应,完成降解。
2.如权利要求1所述的香草醛作为氧化还原介质在提高漆酶降解己烯雌酚降解率中的应用,其特征在于,步骤1中所述醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH5.5。
3.如权利要求1所述的香草醛作为氧化还原介质在提高漆酶降解己烯雌酚降解率中的应用,其特征在于,步骤1中所述己烯雌酚溶液浓度为2.5g/L。
4.如权利要求1所述的香草醛作为氧化还原介质在提高漆酶降解己烯雌酚降解率中的应用,其特征在于,步骤2中所述漆酶母液:香草醛溶液:己烯雌酚体积比为0.5:0.1-1:0.4混合。
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