丁香醛作为漆酶降解已烯雌酚氧化还原介体的应用及其提高
漆酶降解已烯雌酚降解率的方法
技术领域
本发明涉及环境污染处理技术领域,特别是涉及丁香醛作为漆酶降解已烯雌酚氧化还原介体的应用及其提高漆酶降解已烯雌酚降解率的方法。
背景技术
己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)是一种合成的非甾体雌激素或异雌激素,具有比雌二醇更强的雌激素活性(Korach et al.,1978;Shang et al.,2014)。自1938年被英国化学家合成后,最初用于治疗肠胃不适、头晕和皮肤红肿。后来被作为预防流产的处方药而广泛应用于医学界,还被用于治疗晚期前列腺癌、乳腺癌、卵巢功能不全、功能性子宫出血等疾病(Goyal et al.,2001;Grenader et al.,2014;Koong et al.,2014)。在1971年己烯雌酚因被发现可诱发多种女性疾病而遭禁用(He et al.,2002)。但己烯雌酚依然被作为辅助药物及动物生长促进剂广泛应用于临床和畜禽生产中,其中部分DES或DES代谢产物随着动物的粪便、尿液等进入环境,虽然一般浓度较低,甚至是微量的,但在生态系统中,通过生物浓缩、生物积累和生物放大三种途径使其浓度增大,然后进入食物链,同样危害生物体和人类的健康。因此开展己烯雌酚的降解研究工作依然重要,其中林等人曾利用臭氧氧化降解DES,但效果却不显著(Lin et al.,2009)。徐等人研究发现DES能够被光催化降解,但也发现DES是一种光致变色化合物,其紫外诱导的中间体可以在阳光下转化回DES,这显然减缓了DES的光降解(Xu et al.,2017)。DES作为一类脂溶性化合物在环境中不易被降解,传统的处理方法来降解这类酚类有机污染物不仅费用昂贵且效果不佳(Snyder et al.,2003;Tay et al.,2009)。
漆酶是一种典型的生物催化剂,是一种含铜的多酚氧化酶,其催化有机底物的单电子后,同时将其中的氧分子还原成水。已有研究表明漆酶由于其低氧化还原电位可以催化多种酚类化合物(Barrios-Estrada et al.,2018;Catherine et al.,2016;Liu etal.,2019;Divya et al.,2018)。
漆酶氧化酚类和非酚类化合物的能力可以在合适的天然或合成氧化还原介体的存在下增强,并且通过加入介质能够扩展其催化底物范围以及提高氧化效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种丁香醛作为漆酶降解已烯雌酚氧化还原介体的应用及其提高漆酶降解已烯雌酚降解率的方法,寻找合适的氧化还原介体,提高漆酶降解已烯雌酚的降解率。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种丁香醛作为漆酶降解已烯雌酚氧化还原介体的应用。
进一步地,该应用中,所述氧化还原介体的浓度为0.01-1.0mmol/L。
进一步地,该应用中,所述漆酶的浓度为50mg/L,所述已烯雌酚的浓度为100mg/L。
进一步地,该应用中,所述降解的降解条件为:温度55℃,pH5.5,时间0.5-6h。
本发明还提供一种丁香醛提高漆酶降解已烯雌酚降解率的方法,包括以下步骤:
(1)将己烯雌酚溶于甲醇配制己烯雌酚母液,将漆酶溶于醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制漆酶母液,将丁香醛溶于醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制丁香醛溶液;
(2)将丁香醛溶液与漆酶母液混合组成漆酶-丁香醛介体溶液,与己烯雌酚母液混合于反应体系中;
(3)利用乙酸乙酯萃取己烯雌酚终止反应,完成降解。
将己烯雌酚母液稀释成1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L的标准液,利用HPLC检测峰面积制作己烯雌酚标准曲线;在降解完成后,利用HPLC检测剩余己烯雌酚浓度,计算降解率。
进一步地,所述己烯雌酚母液浓度为2.5g/L,所述漆酶母液的浓度为1mg/mL,所述丁香醛溶液的浓度为0.01mol/L。
进一步地,所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的浓度为10mmol/L,pH5.5。
进一步地,所述反应体系的温度为55℃,反应时间为0.5-6h。
进一步地,步骤(3)中,所述漆酶、己烯雌酚和丁香醛混合后的比例为50mg:0.01-1.1mmol:100mg。
进一步地,所述漆酶为彩绒革盖菌所产,酶活0.94U/mg。
进一步地,步骤(2)中,所述HPLC检测条件:色谱柱:ZORBAX SB-C18(150mm×4.6mm×5μm);检测条件为:进样体积10μL,以等体积的乙腈和水为流动相等梯度洗脱10min,泵流速为1.0mL/min,柱温:30℃,紫外检测器检测240nm波长处的出峰情况,记录峰面积值。
步骤(4)中,降解率计算方式为降解率=(C0-C)/C0×100%,其中C0是初始浓度,C是最终浓度。
本发明公开了以下技术效果:
将漆酶用于己烯雌酚降解时,由于己烯雌酚的空间位阻导致己烯雌酚并没有完全进入漆酶的肽链空腔,而是依附在漆酶空腔的凹槽,并且主要被部分氨基酸残基包围,部分氨基酸残基与己烯雌酚的酚羟基结合形成氢键,还有部分氨基酸残基与己烯雌酚形成“半包裹”的疏水界面,因此,漆酶与己烯雌酚能够自行发生反应,且氢键和疏水界面相互作用是形成漆酶-己烯雌酚复合物的重要作用力。
氧化还原介体可以作为漆酶和底物之间的电子穿梭的介质,以克服漆酶的空间位阻和动力学限制。介体可以通过与酶活性位点或蛋白质结构上的其他合适区域进行结合从而产生比漆酶本身对底物具有更高氧化能力的自由基物质。丁香醛是邻甲氧基取代的酚,它能够降低漆酶与DES间的氧化还原电位差,使漆酶与DES能更好的发生反应,对漆酶降解DES都存在促进作用。
本发明利用丁香醛提高漆酶对己烯雌酚降解以达到快速催化降解的目的。本发明效率高、操作简单、成本低,有利于污水的快速处理,在环境污染物处理领域有实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为己烯雌酚标准曲线;
图2为初始浓度100mg/L的己烯雌酚溶液随丁香醛浓度变化的降解曲线;
图3为不同pH对漆酶降解己烯雌酚降解效率的影响;
图4为不同温度对漆酶降解己烯雌酚降解效率的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1绘制己烯雌酚标准曲线
己烯雌酚母液的配制:准确称取己烯雌酚0.125g,用甲醇溶解,并定容于50mL容量瓶,得到2.5g/L的己烯雌酚母液。用甲醇逐级稀释溶液,分别得到1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L的标准溶液。绘制己烯雌酚标准曲线,如图1所示。用无菌注射器分别取1mL,经0.45μm有机膜过滤待测。
实施例2
(1)将0.5ml的1mg/mL漆酶母液、0ml的0.01mol/L丁香醛和0.4ml的2.5g/L己烯雌酚母液加入50mL锥形瓶中,加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液补充至10mL,置于55℃振荡培养箱中反应;
(2)反应0.5h后,使用乙酸乙酯对溶液进行萃取两次,将有机相提取后旋蒸至尽干,加入5mL色谱级甲醇定容,用2mL注射器吸取适量,过0.22μm有机相微孔滤膜至液相进样瓶,最后用HPLC检测峰面积;
(3)根据检测得到的峰面积带入己烯雌酚标准曲线计算出反应体系剩余己烯雌酚浓度。根据公式计算降解率,降解率=(C0-C)/C0×100%计算降解率,其中C0是初始浓度,C是反应后剩余浓度,计算得到降解率为44.56%。
实施例3
(1)将0.5ml的1mg/mL漆酶母液、0.1ml的0.01mol/L丁香醛和0.4ml的2.5g/L己烯雌酚母液加入50mL锥形瓶中,加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液补充至10mL,置于55℃振荡培养箱中反应;
(2)反应0.5h后,使用乙酸乙酯对溶液进行萃取两次,将有机相提取后旋蒸至尽干,加入5mL色谱级甲醇定容,用2mL注射器吸取适量,过0.22μm有机相微孔滤膜至液相进样瓶,最后用HPLC检测峰面积;
(3)根据检测得到的峰面积带入己烯雌酚标准曲线计算出反应体系剩余己烯雌酚浓度。根据公式降解率=(C0-C)/C0×100%计算降解率,其中C0是初始浓度,C是反应后剩余浓度,计算得到降解率为85.76%。
实施例4
(1)将0.5ml的1mg/mL漆酶母液、0.3ml的0.01mol/L丁香醛和0.4ml的2.5g/L己烯雌酚母液加入50mL锥形瓶中,加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液补充至10mL,置于55℃振荡培养箱中反应;
(2)反应0.5h后,使用乙酸乙酯对溶液进行萃取两次,将有机相提取后旋蒸至尽干,加入5mL色谱级甲醇定容,用2mL注射器吸取适量,过0.22μm有机相微孔滤膜至液相进样瓶,最后用HPLC检测峰面积;
(3)根据检测得到的峰面积带入己烯雌酚标准曲线计算出反应体系剩余己烯雌酚浓度。根据公式降解率=(C0-C)/C0×100%计算降解率,其中C0是初始浓度,C是反应后剩余浓度,计算得到降解率为89.65%。
实施例5
(1)将0.5ml的1mg/mL漆酶母液、0.6ml的0.01mol/L丁香醛和0.4ml的2.5g/L己烯雌酚母液加入50mL锥形瓶中,加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液补充至10mL,置于55℃振荡培养箱中反应;
(2)反应0.5h后,使用乙酸乙酯对溶液进行萃取两次,将有机相提取后旋蒸至尽干,加入5mL色谱级甲醇定容,用2mL注射器吸取适量,过0.22μm有机相微孔滤膜至液相进样瓶,最后用HPLC检测峰面积;
(3)根据检测得到的峰面积带入己烯雌酚标准曲线计算出反应体系剩余己烯雌酚浓度。根据公式降解率=(C0-C)/C0×100%计算降解率,其中C0是初始浓度,C是反应后剩余浓度,计算得到降解率为92.45%。
实施例6
(1)将0.5ml的1mg/mL漆酶母液、1.0ml的0.01mol/L丁香醛和0.4ml的2.5g/L己烯雌酚母液加入50mL锥形瓶中,加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液补充至10mL,置于55℃振荡培养箱中反应;
(2)反应0.5h后,使用乙酸乙酯对溶液进行萃取两次,将有机相提取后旋蒸至尽干,加入5mL色谱级甲醇定容,用2mL注射器吸取适量,过0.22μm有机相微孔滤膜至液相进样瓶,最后用HPLC检测峰面积;
(3)根据检测得到的峰面积带入己烯雌酚标准曲线计算出反应体系剩余己烯雌酚浓度。根据公式降解率=(C0-C)/C0×100%计算降解率,其中C0是初始浓度,C是反应后剩余浓度,计算得到降解率为92.13%。
本发明在35℃条件下研究了不同pH漆酶对20mg/LDES降解率的影响。图3显示了反应1h不同pH条件下漆酶对DES降解效率的影响。显然,pH在3-8范围内,pH对DES的生物转化存在二次和线性的影响。在pH5.5-7.0的范围内,DES的降解率达到90%以上,将pH增加至8.0时,降解效率明显下降,这一现象与漆酶在较高pH下的活性降低一致。在中性或者碱性的条件下,氢氧根离子的浓度增加,这有助于氢氧根离子与漆酶的T2/T3铜簇内的质子化桥连配体的结合;从而阻止了电子从T1转移到T2/T3中心,降低酶活性。从图3中还可以观察到在较低pH下DES的降解率并不理想,这是由于在酸性条件下能够导致酶的完全失活。最佳pH取决于漆酶性质以及基质性质,因为pH可以改变化合物的电荷和酶的构型,这是基质进入或结合活性位点的基础。酶-基质复合物主要通过弱相互作用稳定,例如范德华力和氢键。后者在很大程度上受中等pH的影响,因此将pH值增加或降低到一定范围以下会降低酶的稳定性和活性。根据研究结果,pH6将是漆酶活性和稳定性之间平衡的值,在这一条件下,DES能够达到最大的转化。因此,选择pH6来评估催化体系中温度的影响,而在加入氧化还原介体后该pH变为5.5,在这一条件下,DES能够达到最大的转化。
在25-75℃范围内评估温度对40mg/L DES降解率的影响。温度影响反应速率和酶稳定性,在25℃和75℃下观察到DES的降解率分别为64.81%和54.66%。在较低温度(25℃)下降解效率降低是由于反应的活化能降低。另一方面,在较高温度下降解效率降低是由于漆酶的失活,因为当温度超过一定值后,增加的热失活率比反应速率更显著。从图4不难发现漆酶降解DES的最佳温度达到55℃。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。